Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

2. Каталитични свой ства на белтъците

ПРОСТИ И СЛОЖНИ ЕНЗИМИ

Ензимите се дефинират като разтворими глобуларни белтъци, притежаващи каталитични свойства,

респективно като белтъчни катализатори на клетката. Те се биосинтезират във всяка жива клетка и взимат
участие в изграждането на функционалния ù апарат.
По химичен строеж, ензимите могат да се разделят подобно на белтъците в две основни групи: прости
ензим-протеини и сложни ензим-протеини.
Простите ензим-протеини, наричани още едно- компонентни ензими, са изградени изцяло от белтък и
при хидролизата им се доказват само α-аминокиселини. Към тази група спадат много хидродазни ензими, като
пепсин, трипсин, папаин и други.
Сложните ензим-протеини, наричани още ензим-протеиди, дву- или многокомпонентни ензими, са
изградени от белтък и от вещества (органични или неорганични) с небелтъчен характер – кофактори:
ензим = белтък + кофактор
На отделните компоненти, изграждащи сложните ензим-протеини, са били давани в миналото различни
наименования, някои от които се използуват и до днес от различни автори. Така например Ханс фон Ойлер и
неговата школа предложиха за обозначаване на двукомпонентните ензими наименованието холоензим, за
белтъчната компонента – апоензим, а за кофактора – коензим:
ХОЛОЕНЗИМ = АПОЕНЗИМ + КОЕНЗИМ
За обозначаването на двукомнонентния ензим Ото Варбург използува наименованието ензим-протеид,
а за коензима – простетична група.
Сложните ензим-протеини са повече на брой, отколкото простите ензим-протеини. В структурата им
връзката между белтъчната и небелтъчната компонента може да бъде различно „здрава”. Различават се две
крайни състояния, между които съществуват цял ред преходни такива.
1. При ковалентна връзка между компонентите. В този случай константата на дисоциация на сложния
ензим-протеин е практически равна на нула. Такъв характер на „здрава" връзка е установен между
хеминовата група и белтъчната компонента в редица ензими, като каталаза, пероксидаза и др.
2. При „временна” връзка между компонентите, която може да се създаде в момента на каталитичния
акт. В този случай константата на дисоциация на сложния ензим-протеин има висока стойност, респективно
последният лесно може да се разгради на компонентите си. Такъв характер на „временна" връзка е установен
между НАД или НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) и белтъчната компонента в различните
дехидрогеназни ензими напр. лактатдехидрогеназа — ЛДХ, алкохолдехидрогеназа — АДХ.
глицералдехидфосфатдехидрогеназа — ГАФДХ, и др.). При двукомпонентните ензими, изхождайки от
характера на връзката между компонентите, някои изследователи използват следните наименования за
кофактора: при ковалентна връзка го наричат простетична група, а при възникване на „временна” връзка —
коензим.
При сложните ензим-протеини, за да се прояви каталитичната активност, е необходимо
съставляващите ги компоненти да бъдат взаимносвързани.
Специфичните функции на простите и сложните ензим-протеини се определят винаги от строежа на
белтъчната им компонента, но не и от строежа на кофактора. Така например двукомпонентните ензими
каталаза и пероксидаза, както и кислородпренасящият белтък хемоглобин, независимо че притежава една и
съща простетична група (ферипротопорфирин IX), имат различни специфични функции. Каталазата и
пероксидазата имат каталитична функция, а хемоглобинът - транспортна.

1
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

КОФАКТОРИ НА ЕНЗИМИТЕ

Каталитичното действие на сложните ензим-протеини (дву- и многокомпонентни ензими) се проявява

само в присъствието на определени органични или неорганични вещества, наречени кофактори.

Органични кофактори
Към органичните кофактори се отнасят вещества с разнообразен строеж, спадащи към групите на
непръстенните (алифатните) и пръстенните карбопръстенните (алициклените и ароматни) и
хетеропръстенните органични съединения.
Органичните кофактори притежават редица общи свойства и характерни особености:
 Органичните кофактори нямат белтъчен строеж, имат ниска молекулна маса, способни са да
диализират и обикновено са термостабилни вещества.
 Много органични кофактори са структурни производни на витамините, поради което не могат да се
биосинтезират в организмите на бозайниците, а се набавят с храната им.
 За разлика от субстратите кофакторите не променят химичната си структура след завършването
на ензимната реакция.
 При много биохимични процеси органичните кофактори изпълняват функцията на преносители
(транспортни метаболити косубстрати).
 В много случаи при свързването на ензима с кофактора се променя конформацията на ензима, в
резултат на което той преминава в каталитично активното състояние.
Органичните кофактори могат да се класифицират по функционален признак в няколко групи: редокси -
преносители, преносители на фосфатни групи, преносители на ацилни групи, преносители на аминогрупи,
преносители на едновъглеродни групи, преносители на въглероден двуокис и преносители на алдехидни
групи.

I. Редокси-преносители (кофактори, преносители на водородни атоми и

електрони).
Групата на редокси-преносителите е най-голяма. Към нея се отнасят кофакторите на оксиредуктазните
ензими, които без изключение са двукомпонентни. Тези ензими катализират процесите на биологично
окисление. Към тази група могат да се отнесат никотинамидните кофактори, флавиновите кофактори,
липоевата киселина, глутатионът, железопорфириновите кофактори и хинон – убихононът.
Никотинамидни кофактори.
Никотинамидните кофактори са два: никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамид-
адениндинуклеотидфосфат (НАДФ).
В структурните формули и на двата кофактора се съдържа молекулата на никотиновата киселина
(витамин В5) като никотинамид.

НАД НАДФ
О. Варбург и В. Християн установиха, че активната част и на двата кофактора е никотинамидният
пръстен, който търпи промяна при окисление и редукция.
Присъствието на втори максимум на абсорбция при 340 nm даде възможност на Варбург да предложи

2
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

своя оптичен тест. Последният се основава на факта, че докато абсорбционните спектри на редуцираните
форми на НАД и НАДФ имат максимум при 340 nm, то окислените им форми не показват абсорбция между 300
и 400 nm. С помощта на оптичния тест всяка дехидрогеназна реакция, при която НАД+ и НАДФ+ се редуцират
или [НАДН+Н+] и [НАДФН+Н+] се окисляват, може да бъде количествено измерена чрез регистриране на
повишаването, респективно понижаването на абсорбцията при 340 nm, респективно при някоя близкостояща
до последната дължина на вълната. С оптичния тест може да се изследва активността на онези ензими, които
имат за кофактор НАД (напр. лактатдехидрогеназа, малатдехидрогеназа, глицералдехидфосфатдехидрогеназа
и др.) или НАДФ (напр. Г6ФД). Така например за определяне активността на ензима лактатдехидрогеназа
(ЛДХ), катализиращ обратимо реакцията:
пируват + [НАДН + Н+] лактат + НАД+,
се инкубира разтвор на ЛДХ или с пируват и [НАДН+Н+] при PH = 7,5, или с лактат и НАД+ при рН=8,9.
Параметърът за определяне на ензимната активност в първия случай е понижението, а във втория случай —
повишението на абсорбцията при 340 nm. Така описаният тест е познат още като едностъпален оптичен тест.
В резултат на изследвания, проведени с ензима алкохолдехидрогеназа и субстрата 1.1-
дидеутероетанол, се установи, че водородът от субстрата се свързва директно (т. е. без да се пренася от
други групи или да се обменя с водната среда) и стереоспецифично (по отношение плоскостта на
никотинамидния пръстен) с кофактора.
По стереоспецифичността на водородния пренос от субстрата върху НАД(Ф) + могат да се различат два
типа ензими: тип А () и тип В (). Специфичност от тип А притежават ензимите алкохолдехидрогеназа,
лактатдехидрогеназа, малатдехидрогеназа и др., а от тип Б — глицералдехидфосфатдехидрогеназа,
глутаматдехидрогеназа и др.

Флавинови кофактори
Флавиновите кофактори са два: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). В
структурните формули на двата кофактора се съдържа молекулата на витамин В2 (6,7-диметил-9-[1'-D-
рибитил] изоалоксазин). Активната част и на двата кофактора се явява изоалоксазиновият пръстен, който се
променя при окисление и редукция. Тези обратими промени засягат двата азотни атоми (1 и 10) на
изоалоксазиновия пръстен.

ФАД ФМН

Окислена и редуцирана форма

Окислената форма на ФАД е с жълтооранжев цвят, има зелена флуоресценция, а абсорбционният ú

спектър има два максимума (при 370nm и при 470nm). След редукция се загубва жълтооранжевият цвят,
изчезва флуоресценцията, както и абсорбционният максимум при 470nm.
Флавиновите кофактори могат да се свързват нековалентно или ковалентно с ензимния белтък, като
образуват флавопротеидни ензими. Това свързване обикновено променя свойствата на ФАД. Така например в

3
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

много флавопротеиди ФАД не флоуресцира в окислена форма или пък флуоресценцията му е съвсем слаба
(около 1 до 2%).

Липоева киселина

Липоевата киселина е открита от Ф. Дюй през 1941 г. Наименованието ú липоева киселина идва от
факта, че тя се разтваря в органични разтворители. Липоевата киселина се намира в две форми: окислена и
редуцирана. Липоевата киселина е растежен фактор за някои микроорганизми. Тя участва в окислително-
редукционните процеси в организмите, както и при преноса на ацилни групи.

Глутатион
Глутатионът е широко разпространен трипептид: γ- L- глутамил- L- цистеинилглицин . Познати са две
форми на глутатиона: редуцирана и окислена.

Въпреки че глутатионът е открит сравнително отдавна, все още не е напълно изяснена неговата
биологична роля. Той изпълнява вероятно в организма функцията на водороден преносител.

Желязо-порфиринови кофактори
Порфириновите съединения се разглеждат като порфин, в чиято молекула водородните атоми (1—8)
са заместени с различни химични групи, като метилова, етилова, винилова, ацетатен остатък, пропионатен
остатък и др.

Хем
Порфирините образуват с железните атоми хелатни комплексни съединения, които се обозначават с
наименованието хем. Когато петото и шестото място в координационната сфера на железния атом от хема се
заемат от лиганди със силно поле (напр. N-хетероцикли), то се получава нискоспинов комплекс, който се
нарича хемохром. Различаваме ферохемохром (Fe2+) и ферихемохром (Fe3+). Протеидът, съдържащ хем в
качеството си на простетична група, се нарича хемопротеид.
В организмите са доказани и изучени голям брой хемопротеиди, като хемоглобини и аналогични
хемопротеиди (те се свързват обратимо с молекулния кислород, имат транспортна функция, но нямат

4
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

каталитична активност), хемопротеиди с каталитични свойства (напр. ензимите каталаза, пероксидаза и др.) и
останалите вътрешноклетъчни хемопротеиди, които образуват цитохромната система. Цитохромите се
класифицират в четири главни групи в зависимост от структурата на хема: a, b, c и d.
Интересни и типични са спектрите на поглъщане на цитохромите в редуцирано и окислено състояние.
В редуцирано състояние се наблюдават три абсорбционни максимума: α - при 550nm, β - при 530nm и γ - при
400 nm. При тoва най-интензивен e γ-максимумът на поглъщане. В окислено състояние се наблюдава само
един абсорбционен максимум в ултравиолетовата област на спектъра (γ-максимумът на поглъщане).
Биологичната роля на цитохромите се състои в това, че те взимат непосредствено участие при
окислителните процеси в клетката, т.е. те са съставна част на дихателните вериги.
Хинон- убихинон
Убихинонът е доказан в животни, растения и микроорганизми. В
зависимост от произхода, броят (n) на изопреновите звена се е оказал
различен. Така например в тъкани от животни и от висши растения n = 10,
докато в микроорганизми n = 6 - 9. Окислената и редуцираната форма на
убихинона не са свързани със специфичен белтък. Сега се приема, че
убихинонът влиза като необходим компонент в дихателната верига на
митохондриите.

II. Преносители на фосфатни групи.

Спадащите към тази група нуклеотидни кофактори обхващат моно-, ди- и трифосфатите на аденозина,
гуанозина, уридина, цитидина и тимидина. Те влизат в състава на специфични ензими, катализиращи
пренасянето на фосфатни групи, спадащи към класа трансферази.
Аденозин 5'-монофосфат (АМФ), аденозин 5'-дифосфат (АДФ) и аденозин 5'-трифосфат (АТФ),
наречени още “система на адениловата киселина”, са особено необходими кофактори при пренасянето на
фосфатни групи във всички живи организми.

АТФ

АТФ съдържа две киселинно- анхидридни връзки (богати на енергия връзки или макроергични връзки),
които лесно се хидролизират, при което се освобождава значително количество енергия. АТФ взима участие в
извънредно много реакции, катализирани от разнообразни ензими. Последните катализират специфично
разкъсването (хидролизата) на една или друга връзка в молекулата на АТФ.
Активират се разнообразни съединения за сметка на енергията, освободена от макроергичните връзки.
Отцепването на крайния фосфатен остатък от молекулата на АТФ и пренасянето му върху различни
съединения се катализират от специфични ензими, наречени фосфотрансферази.
Отцепването на пирофосфатен остатък от молекулата на АТФ и пренасянето му върху различни
съединения се катализират от специфични ензими, наречени пирофосфотрансферази.
Отцепването на АМФ от молекулата на АТФ и пренасянето му върху различни съединения е доказано
при голям брой ензимни реакции, катализирани от различни ензими, изречени нуклеотидилтрансферази
(напр. аминоацил-тРНК-лигази и др.).
Отцепването на аденозилов остатък от молекулата на АТФ и пренасянето му върху аминокиселината L-
метионин е доказано при процеса на биологичното метилиране, респективно активиране и пренасяне на
метилови групи.

5
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

При разнообразните биохимични процеси важна роля наред с АТФ играят и някои други
нуклеотидфосфати, като уридин 5'- трифосфат (УТФ), цитидин 5'- трифосфат (ЦТФ) и др.

III. Преносители на ацилни групи.

Към тази група спада коензим А. Коензим А влиза като кофактор в състава на редица ензими, които
катализират пренасянето на ацилни групи (R—СО—). Последните се присъединяват към тиоловата група на
коензим А, при което се образува макроергична ацилтиоестерна връзка (КоА-S-ОС-R).

Коензим А взима участие в няколко

типа ензимни реакции:
а) ацил-донорни, при които се био-
синтезират ацетил-КоА и производните му
(напр. при процесите на окислително
декарбоксилиране, активиране на висшите
мастни киселини и др.).
б) ацил-акцепторни, при които
ацетил-КоА служи като донор на ацилни
групи (напр. при метаболизма на висшите мастни киселини и др.).
в) тип алдолна кондензация, в която активният център на ацетил-КоА е въглеродът от метиловата група
(напр. първия етап от цикъла на лимонената киселина и др.).

IV. Преносители на аминогрупи.

В тази група спадат кофакторите, производни на витамин В6 (Пиридоксин), като пиридоксалфосфат
(ПЛФ) и пиридоксаминфосфат (ПМФ). Фосфорилираните производни на пиридоксала и на пиридоксамина
влизат като кофактори в състава на разнообразни ензими, наречени ПЛФ-зависими.

Пиридоксин Пиридоксалфосфат Пиринадоксамин

Пиридоксалфосфатът представлява кофактор с извънредно многостранни функции. Той взима участие

в разнообразни реакции, като преаминиране, елиминиране на хидроксилна група на β-място в
аминокиселини, реакции на β-заместване, декарбоксилиране на аминокиселини, отцепване на странична
верига в аминокиселини, рацемизираве на аминокиселини и др.
Участието на един и същ кофактор в толкова разнообразни реакции може да се разбере, ако се
изходи от общата теория за механизма на пиридоксаловата катализа . Съгласно тази теория при
присъединяването на пиридоксалфосфата кьм α-аминокиселината се получава съединение, наречено
Шифова база, което по-нататък се тавтомеризира.
По-важните реакции, в които участвува кофакторът ПЛФ, са следните:
1. Преаминиране или трансаминиране. Ензимите, които катализират този процес, се наричат
аминотрансферази или трансаминази.
2. Елиминиране на хидроксилна група на β-място в амино киселините. Например превръщането на L-
серин в пируват (ензим: сериндехидратаза):
L-серин + Н2О ↔пируват + NH3 + H2O
3. Реакции на β-заместване в аминокиселини. Например последният етап от биосинтезата на L-
триптофана (ензим: триптофансинтаза):

6
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

L-серин + индол-3-глицеролфосфат ↔L-триптофан + ГАTФ

4. Декарбоксилирале на аминокиселини. Например декарбоксилирането на L-глутамат до 4-
аминобутират (γ-аминомасленакиселина, ГАМК) (ензим глутаматдекарбоксилаза):
L-глутамат ↔ 4-аминобутират + C02
5. Отцепване на странична група в аминокиселините . Например превръщането на L-серин в глицин и
формалдехид.
6. Рацемизиране на оптично активни аминокиселини. Например превръщането на L-аланин в D-
аланин, (ензим: аланинрацемаза):
L-аланин ↔ D-аланин

V. Преносители на едновъглеродни групи

При метаболизма на веществата се извършват
превръщания и премествания на активирани едновъглеродни
групи (фрагменти, отломки). Като преносител на метилови (СН 3-),
хидроксиметилови (СН2ОН), формилни (-CHO) и формиминни (-
СН=NН) групи се явява кофакторът тетрaхидрофолиева киселина
(ФК.Н4). С ензимния белтък ФК.Н4 се свързва посредством
ковалентна връзка. В образуването на последната взима участие
карбоксилната група на глутаминовата киселина от кофактора.
Етилендиаминната група е активната част в молекулата на ФК.Н 4. Към тази група се присъединяват (в
положение 5 или 10) едновъглеродните групи, за да могат да бъдат
пренесени до съответния акцептор.
Биохимичното значение на ФК.Н4 е голямо, тъй като от нея зависят
биосинтезите на разнообразни вещества, като пурини, пиримидини,
аминокиселини, алкалоиди и др.
При някои етапи от взаимните превръщания на едновъглеродните групи
взима участие витамин В12 коензим, който спада към т.нар. кобамидни
кофактори. Освен при редукция и пренасяне на метилови групи
кобамидните кофактори участвуват в ензимни реакции на
вътрешномолекулни прегрупирания.

VI. Преносители на СО2

Представител на тази група се явява биотинът или витамин Н
(или витамин В7). Още в 1931 г. е установено, че за растежа на дрожди е
необходимо „някакво непознато вещество", което било наречено биос. В
организмите биотинът е свързан ковалентно с лизин като биоцитин ( ε-N-
биотинил-L-лизин). Биологичната роля на биотина се свежда до
участието му като кофактор в реакциите за пренасянето на СО 2 и
включването му в органични молекули (карбоксилиране). Този процес се
спряга с разграждането на АТФ. Ензимите, които го катализират, спадат
към класа лигази.

VII. Преносители на алдехидни групи.

Представител на тази група е тиаминпирофосфатът (ТПФ), витамин
В1-пирофосфат. Това вещество е необходимо за действието на ензима
пируватдекарбоксилаза. Пируватдекарбоксилазата представлява сложен
ензим- протеин, съдържащ като кофактор ТПФ. Активният център в моле-
кулата на ТПФ е С-2 от съдържащия сяра тиазолов пръстен:

7
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

 Водородният атом на С-2 в тиазолов пръстен се обменя лесно с деутерий.

 След отделянето на протона в алкална среда тиазоловият пръстен се превръща в биполярен йон,
съдържащ анионен и катионен център.
 Анионният център на биполярния йон може да реагира с различни субстрати.
Като кофактор ТПФ взима участие в реакциите на неокислително и окислително декарбоксилиране на
α-оксокиселини, в транскетолазни реакции и др. От всички кофактори ТПФ има непосредствено медицинско
приложение (при лекуването на диабет, сърдечно-съдови заболявания и др.).

Неорганични кофактори

Към неорганичните кофактори спадат редица метални катиони, а така също и някои аниони. При това
влиянието на катионите (Nа+, К+, Rb+, Сs+, Мg2+, Са2+, Zn+, Сd2+, Мn2+, Fе2+, Со2+, Ni2+, Сr3+, Мо6+ и др.) е по-
специфично изразено от това на анионите (напр. Сl- и др.).
Ензимите, при каталитичното действие, на които е необходимо участието на метални катиони, условно
се разделят на две групи: металактивируеми ензими и истински металоензими.
Металактивируемите ензими, за да проявят своята каталитична активност, се нуждаят от прибавянето
на определени метални йони. При отделянето на последните от ензимния белтък (напр. чрез диализа,
обработване с катионити, третиране с дитизон и др.) активността на ензимите рязко се понижава. В
металактивируемите ензими металните йони не се свързват с ензимния белтък в строго определени
стехиометрични отношения.
В някои случаи металните йони могат да бъдат абсолютно специфични за действието на даден ензим.
Такъв е случаят с ензима неорганична пирофосфатаза, който се активира само от Мg2+.
В други случаи един ензим може да бъде активиран от йони на няколко метала. Така например ензимът
енолаза се активира от следните йони: Мg2+, Сd2+, Мn2+, Fе2+, Со2+, Ni2+. Понякога за активирането на един
ензим е нужно едновременното действие на два метални катиона, имащи различна валентност.
Анионите се отличават с по-малко изразена специфичност спрямо действието на ензимите. Класически
пример за проявено специфично действие на анионите е активирането на ензима α-амилаза с хлорни аниони.
Истинските металоензими съдържат в активния център на молекулата си определени метални йони
(железни, цинкови, медни и др.). Последните са свързани в строго определени стехиометрични отношения с
ензимния белтък или със съответния кофактор.
Разделянето на металактивируемите ензими от истинските металоензими е до голяма степен условно.
В последните години се предлага като условен разделителен критерий между тези две групи стойността на
стабилитетната константа (Kc = 107-108 M-1). Колкото стойността на стабилитетната константа е по-голяма,
толкова равновесието е по-силно изтеглено към образуването на истинския металоензимен комплекс.

ЕНЗИМНА СПЕЦИФИЧНОСТ

Високата специфичност на ензимното действие е характерно свойство на ензимите, по което те се

различават от неорганичните и от някои органични катализатори. Вследствие на него се осигурява: а)
„разпознаване” между ензимите и съответните им субстрати, които са точно определени вещества или пък
малък брой структурно сродни такива (т. нар. субстратна специфичност); б) „висока избирателност” за
протичането на дадени ензим-субстратни реакции при едновременно извършващите се многобройни процеси в
живата клетка (т.нар. реакционна специфичност).
Ензимната специфичност е била наблюдавана за първи път през 1894 г. от Е. Фишер. Като изследвал
хидролизата на два метилгликозида (α и ß), той установил, че в зависимост от стереохимичната конфигурация
на С-1 хидролизата на тези съединения може да се катализира от два различни ензима: α-гликозидаза
(малтаза), съдържаща се във воден извлек от прораснал ечемик, и β-гликозидаза (емулзин), съдържаща се
във воден извлек от бадеми.
Въз основа на тези свои опити Фишер предложил хипотезата за ключ-ключалка, според която, за да се

8
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

извърши съответната ензимна реакция, субстратът подобно на ключ е трябвало да прилегне към ензима,
схващан като ключалка. Следователно трябва да съществува стерично и структурно съответствие между
реагиращите молекули на ензима и субстрата.
Различават се няколко вида ензимна специфичност: абсолютна, групова, по отношение на определени
типове реакции- реакционна и стереохимична.

АБСОЛЮТНА СПЕЦИФИЧНОСТ
Този вид специфичност притежават ензими, които катализират само
една реакция, в която участва определен субстрат. Като класически пример за абсолютна специфичност се
посочва действието на ензимите уреаза, сукцинатдехидрогеназа, аргиназа и др.
В последните години ензимолозите оспорват абсолютната специфичност. Бе установено, че уреазата
може да катализира, макар и с много по-ниска начална скорост, хидролизата на хидроксикарбамида до
въглероден двуокис, амоняк и хидроксиламин:
НО—NH—СО— NН2 + Н2O ↔ СО2 + NН3 + NН2—ОН
хидроксикарбамид хидроксиламин
Подобен случай бе установен и при ензима сукцинатдехидрогеназа. С тези примери сега се поставя
под съмнение изградената представа за абсолютната ензимна специфичност.

ГРУПОВА СПЕЦИФИЧНОСТ
Този вид специфичност, притежават ензими, катализиращи един и същи тип реакция, при която се
засяга еднотипна връзка, в образуването, на която участва строго определена химична структура. Групова
специфичност притежават голям брой ензими като карбоксипептидази, някои дехидрогенази (напр.
алкохолдехидрогеназа, катализираща окислението само на алкохоли, и др).

СПЕЦИФИЧНОСТ ПО ОТНОШЕНИЕ НА ОПРЕДЕЛЕН ТИП РЕАКЦИЯ

Този вид специфичност притеважат ензимите, катализиращи промените на един и същ тип химична
връзка, без да се държи сметка за групировките, които стоят непосредствено до нея. Специфичност по
отношение на определен тип реакция притежават голям брой ензими, като триацилглицероллипаза,
карбоксиестераза и др.

СТЕРЕОХИМИЧНА СПЕЦИФИЧНОСТ
Този вид специфичност притежават ензими, катализиращи промените на оптични и на геометрични
изомери. Тя обикновено е абсолютна.
В своите класически изследвания върху оптично активните съединения Л. Пастьор е наблюдавал, че
гъби или бактерии, отглеждани в разтвори съдържащи два оптични изомера, използват за своето развитие
само едната от двете форми, без да засягат другата. Използувайки този феномен, Пастьор разработил метод
за разделяне на рацемични смеси. Недостатъкът на този метод се заключава в това, че при него се загубва
половината вещество (т. е. един от двата антипода).
Стереохимична специфичност се наблюдава и в случаите, когато субстратът представлява смес от два
геометрични изомера: цис (Z) и транс (Е). Например такъв е случаят при съединенията фумарат (транс-форма)
и малеинат (цис-форма). Ензимът фумаратхидратаза катализира присъединяването на една молекула вода
само към двойната връзка на фумарата, но не и към тази на малеината. Същият ензим проявява още един тип
стереоспецифичност. Той катализира реакцията на дехидратиране (обратната реакция) само на L-малата до
фумарат, но не и на D-малата.

9
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

За обяснение на стереоспецифичното превръщане на органичните съединения редица учени са

приели, че за да се осъществи ензимната реакция, е необходим контакт най-малко в три различни точки между
молекулите на субстрата и на ензима. На фигурата по долу, молекулата на субстрата е изобразена във вид на
тетраедър, по ъглите, на който са разположени групите а, а', б и в. В кръгове с А, Б и В са представени
специфичните групировки в ензимната
молекула, където се присъединява
субстратът. Активната група на ензима
представлява буквата А поставена в кръг с
чертички. Тя активира групата а' в
субстратната молекула. От фигурата е ясно,
че тъй като всяка група от субстратната
молекула трябва да се свърже с определена
група от ензимната молекула (т. е. а с А; б с Б;
в с В), то при всяко ново положение на
субстратната молекула спрямо ензимната
молекула с активната група от ензима може
да се свърже само определена група а' от
субстратната молекула.

Изучаването на ензимната специфичност доведе до офoрмянето на концепцията за „ многоточковото

свързване" на ензима със субстрата („множествено сродство", „полиафинитет"). Според тази концепция в
образуването на междинните ензим- субстратни комплелекси взимат участие няколко функционални групи от
ензима и субстрата. В сила е принципът на комплементарността, според който „две молекули, повърхностите
на които са комплементарни, се стремят да си взаимодействат една с друга ", респективно „молекулите,
несъдържащи комплементарни повърхности, не си взаимодействат ". При това, ако групата от едната молекула
е положително заредена, то групата от другата молекула ще бъде отрицателно заредена. Ако групата от
едната молекула е способна да отдава протони, то комплементарната група съдържа свободна електронна
двойка, при което се образува водородна връзка, и т. н.

ЕНЗИМ-СУБСТРАТНИ МЕЖДИННИ КОМПЛЕКСИ

Възможността за свързването на ензима със субстрата под формата на междинен ензим- субстратен
комплекс (ЕS) бе допусната в началото на настоящия век. Около 1902 г. независимо един от друг А. Браун и В.
Анри, като изучавали влиянието на концентрацията на субстрата захароза върху активността на ензима
β-фруктофуранозидаза, се натъкнали на особеността, че скоростта на ензимната реакция се влияе
чувствително при ниски захарозни концентрации и практически никак при високи. За обяснение на получените
експериментални резултати Анри предположил, че действието на ензима се осъществява само благодарение
на образуването на междинни комплекси между него и субстрата, които той нарекъл ензим-субстратни.
Така възникнал въпросът, дали тези предполагаеми комплекси са обективна реалност или пък са само
плод на въображение. Преди всичко предполагаемите ЕS междинни комплекси се оказали толкова нестабилни
и с такъв къс живот, че просто не могли да бъдат регистрирани от аналитичните методи, с които тогава се
разполагало. От друга страна, все още липсвали хомогенни ензими, а и апаратурите не били пригодени за
такъв вид изследвания.
През 1937г. Д. Кейлин и Т. Ман показали, че ензимът пероксидаза променя своя абсорбционен спектър
при съединяването си с водороден пероксид, представляващ неговия субстрат. С помощта на специално
конструиран спектрофотометър Б. Чанс проследява процеса на образуване и разпадане на междинния
комплекс между пероксидазата и водородния перокис:
(а) пероксидаза + H2O2 ↔ ЕS (пероксидаза - H2O2).
Избраният модел се оказал благоприятен за изследване, т.к. в отсъствие на донор на водород (АН 2)
образуваният ЕS-междинен коплекс съществувал без протичане на пероксидазна реакция:

10
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

(б) ЕS (пероксидаза - H2O2) + AH2 ↔ пероксидаза + А + 2H2O.

Благодарение на тази особеност ЕS-комплекс е бил изучен от Чанс както в състояние на равновесие
(а), така и в условия протичане на реакцията (б).
За изучаване образуването на ЕS-комплекс е бил приложен методът на седиментация в
ултрацентрофуга. Според този метод ЕS- комплекси като по- тежки могат да се утаят на дъното на
центрофужната епруветка при достигане на определена скорост, а субстратните молекули като по-леки да
останат в супернатанта. Методът е бил приложен за изучаване на комплекса алкохолдехидрогеназа— етанол.
През 1962 г. К. Яги и Т. Озава са успели да получат в кристална форма ЕS-комплекс между субстрата
D-аланин и ензима оксидаза на D-аланин. Опитът е бил проведен в азотна атмосфера, тъй като в
присъствието на кислород ензимът катализира окислителното дезаминиране на D- аланина до пируват и
амоняк.
С помощта на електронна микроскопия бе локализиран ЕS- комплекс на ензима ДНК- директна ДНК
полимераза с нишковидна синтетична ДНК- матрица.
В последните години се изследват много интензивно ЕS-и ЕI-комплекси с помощта на
рентгеноструктурен анализ. Още в 1965 г. Филипс установи третичната структура на лизозима, активният
център на който бе локализиран след въвеждането на инхибитора ди-N-ацетилхитобиоза.

АКТИВЕН ЦЕНТЪР НА ЕНЗИМИТЕ

Представата за активния център на ензимите бе породена от:
 концепцията за „множественото сродство" между ензима и субстрата;
 разсъжденията за несъразмерността в молекулната маса и формата на ензима и субстрата.
Активният център се дефинира понастоящем като пространствена структурна област от ензимната
молекула, имаща определена степен на сложност. В активния център се осъществява специфичното
пространствено комплексообразуване между ензима и субстрата, с участието на евентуален кофактор, както
се извършва и ензимната реакция.
Условно се приема, че активният център на ензимите е съставен от определени участъци или области.
Според Д. Кошланд активният център на ензимната молекула е съставен от два участька: контактен или котвен
участък, в който се реализира специфичното сродство и връзката между ензима и субстрата., и каталитичен
участък, в който протичат процесите на ензимната катализа. Тези представи за строежа на активния център
бяха допълнени в последните години с представата за съществуването абсорбционен участък, осигуряващ
достъпа на ограничен брой избрани субстратни молекули до каталитичния участък. Данните от
рентгеноструктурния анализ потвърждават присъствието на „ вдлъбнатина” („цепнатина”, „бразда”, „джоб”) в
тримерната структура на редица изследвани ензими. В нея е разположен активният център със своите
участъци. Без такава представа за строежа на активния център и пространствено контролиращата и
ограничаваща роля на адсорбционния участък е невъзможно да се разберат въпросите, свързани с проблема
за субстратната специфичност и инхибирането на ензимните реакции.
Общият характер на взаимодействие и данните по специфичността говорят за това, че в активния
център трябва да участват различни функционални групи, ориентирани по определен начин в пространството,
така че да си взаимодействат с групи от субстратната молекула.
Изхождайки от предпоставката за тясна връзка и взаимодействие между функционалните групи от
активния център и от останалата част на ензимната молекула, Д. Кошланд различава три типа функционални
групи: каталитични, спомагателни и способствуващи.
 Каталитичните функционални групи участвуват пряко в реакциите на превръщане на субстрата в
продукт. Те се намират в каталитичния участък на активния център.
 Спомагателните или контактните функционални групи се схващат като топографски съседни на
каталитичните групи, върху чиято реакционна способност и ориентация те повлияват.
 Способстващите или помощните функционални групи се схващат като топографски отдалечени от
каталитичните групи. Ролята им се състои в осигуряване на конформацията, а така също и на
някои други физични свойства на цялата ензимна молекула, респективно на активния център.
Функционалните групи, локализирани в активния център на ензимите, спадат към различни части на
полипептидната верига на молекулата, понякога много отдалечени една от друга, но пространствено сближени

11
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

и контактиращи помежду си при изграждането на третичната белтъчна структура. Като изключение могат да се
споменат ензимите фосфоглюкомутаза и някои фосфатази, в които редица групи от активния център са
разположени върху един участък от полипептидната верига и се намират в непосредствена близост помежду
си.
Даниел Кошланд замени представите на Е. Фишер (за шаблонното съответствие между структурите на
ензима и субстрата) с хипотезата за индуцираното или принудителното структурно съответствие между ензима
и субстрата. В основата на тази хипотеза залегна предположението, че образуването на ЕS-комплекс е
свързано с дълбоки динамични промени в пространствената и електронната конформация на комплекса,
респективно със съответни геометрични деформации на отделните ковалентни връзки. Самата хипотеза има
качествен характер и може да се формулира по следния начин:
 Субстратът, след като проникне в активния център на ензима, предизвиква съществени изменения в
геометрията му.
 За ензимното действие е необходимо каталитично активните групи да бъдат ориентирани спрямо
субстрата по определен начин.
 Когато проникне в активния център на ензима, субстратът индуцира определено ориентиране на
каталитичните групи, както една спрямо друга, така и спрямо връзката, която подлежи на
разграждане. Образува се активен ЕS-комплекс. Под влияние на ензима, субстратът също би могъл
да претърпи известни конформационни промени.
Когато вместо нормален субстрат в ензимната реакция участват негови аналози (т.е. молекули с по-
големи или по-малки размери), настъпилите геометрични (конформационни) промени в ензимната молекула са
от такъв характер, че не водят до образуване на активен ЕS-комплекс.
Развитата от Д. Кошланд хипотеза заменя представите на Е. Фишер за шаблонното или предварително
съответствие в структурите на ензима и субстрата с представите за динамичните активни центрове на
ензимните молекули.
В последните години бяха дадени голям брой доказателства за наличието на конформационни
промени, засягащи ензимната молекула при взаимодействието ù със субстратната молекула. Понастоящем се
приема, че динамичната структура на белтъчната глобула е причина за усилване на субстратната
специфичност. Тя позволява да се запази каталитичната активност само за избрани субстратни молекули,
строежът, на които се определя от цялата третична структура на ензимната глобула. За да се обясни
различната субстратна специфичност на ензими, имащи еднакъв строеж на активния център, се приема
съществуването на разлики в строежа на техните адсорбционни участъци, както и настъпването на дълбоки
промени в третичната им структура под действието на постъпилата в активния център субстратна молекула.
Вероятно като резултат от тези промени в областта на активния център се извършва стерично преустройство
на страничните групи на аминокиселините, явяващо се благоприятно за самия каталитичен акт. Динамичната
структура на ензимите обуславя също различните алостерични ефекти, както и образуването на ензими от
техни предшественици (преензими).
В различните ензими броят на активните центрове е различен. Не съществува корелация и с броя на
субединиците при ензими с четвъртична структура. В едни случаи броят на активните центрове е равен на
броя субединици, а в други той е по-малък. Поради това съществен въпрос при изучаването на активния
център е определянето на броя на активните центрове в ензимната молекула. За тази цел съществуват
различни методи, като определяне броя на кофакторите в ензимната молекула, определяне на субстрат-
свързващите участъци в ензимната молекула и др.
Ако в състава на ензима влизат някакви кофактори, които взимат участие в каталитичния акт, приема
се, че броят на активните центрове не е по-голям от този на тези кофактори. Методите за определяне на
кофакторите могат да бъдат химични, физични, биологични, микробиологични и др.
Количеството на свързания субстрат може да се определи по химичен или физичен път. Най-често се
използуват два метода, основаващи се на измерване количеството свободен субстрат, намиращо се в
равновесие с ензима: равновесна диализа и ултрацентрофугиране.
Ако малък брой молекули от някакъв специфичен реактив (напр. диизопропилфлуорфосфат, р-
хлормеркурибензоат и др.) инхибират ензимната активност, може да се приеме, че техният брой отговаря на
максималния брой активни центрове в ензимната молекула.

12
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

ФУНКЦИОНАЛНИ ГРУПИ В АКТИВНИЯ ЦЕНТЪР НА ЕНЗИМИТЕ

В изградените съвременни представи за строежа на активния център на ензимите важно място и роля
се отрежда на различните функционални групи, някои от които непосредствено взимат участие в каталитичния
акт като каталитични групи.
В белтъчната компонента на ензимите се намират следните функционални групи:
1. карбоксилни групи от аспаргинова и глутаминова киселина (ω - СООН), както и такива в края на
полипептидните вериги (α - СООН);
2. аминогрупи от лизин (ε - NН2), както и такива в края на полипептидните вериги (α - NН2);
3. имидазолни групи от хистидин;
4. гуанидинови групи от аргинин;
5. фенолни хидроксилни групи от тирозин;
6. алифатни хидроксилни групи от серин и треонин;
7. индолни групи от триптофан;
8. тиолови (сулфхидрилни) групи от цистеин;
9. дисулфидни мостове от цистеин;
10. циклични остатъци от фенилаланин и пролин;
11. алифатни странични вериги от глицин, аланин, валин, левцин и изолевцин.
Групите от първа до четвърта въз основа на техния електричен заряд могат да взимат участие в ЕS-
комплекси и във формиране на третичната структура на ензимите. Групите от първа до осма могат да
участвуват в образуване на водородни връзки като донори или акцептори, а също така и в комплексни
съединения с метални йони. Дисулфидните мостове играят съществена роля при нагъването на белтъчната
молекула и т. н. Групите десета и единадесета могат да участвуват преди всичко в изграждане на т. нар.
„хидрофобни области” и могат значително да повлияват солватацията в тези части от ензимната молекула.
Съществуват няколко подхода за идентифициране на функционалните групи в активния център на
ензимите: рентгеноструктурен анализ, избирателно модифициране на определени аминокиселинни остатъци ,
определяне константата на дисоциация и др.

Избирателно модифициране на определени аминокиселинни остатъци

За да се идентифицират аминокиселините, респективно техните странични функционални групи,
участващи в акта на ензимната катализа, се извършва избирателното им модифициране с помощта на
химични методи.
По-нататък изследването на каталитичната активност при високи субстратни концентрации (т. е. при
максимални скорости) позволява да се оцени в каква степен е изменено сродството на модифицирания ензим
към субстрата (т. е. субстратната константа) и дали той е инактивиран. В последния случай е интересно да се
изясни дали причината за инактивирането е нарушаване целостта на каталитичния участък, или то се дължи
на структурни изменения в адсорбционния участък и третичната структура.
Съединенията, използувани за избирателното модифициране на аминокиселини, влизащи в активния
център на ензимите, трябва да отговарят на някои изисквания:
 да реагират със страничните функционални групи на малък брой аминокиселини (желателно дори
само на една);
 да реагират в условия, при които белтъчните молекули, не се денатурират (например при стайна
температура и неутрална рН-стойност);
 да притежават умерена реакционна способност (т. е. да встъпват в реакция със свободни или
достъпни за разтворителя остатъци, а да не реагират с маскирани остатъци или със свързани
странични вериги);
 да не изискват сложни методи, нужни за контролиране хода на реакцията ;
 белязаните със съединението остатъци да могат лесно да се идентифицират в пептидите, получени
след разграждането на белтъка (това не е сложно изпълнимо, когато е използвано радиоактивно
или флуоресциращо съединение).
По принцип използуваните съединения могат да реагират със страничните функционални групи на
различни типове аминокиселини, а така също и с тези на еднотипни аминокиселини, но не винаги влизащи в
активния център на ензима. За постигането на желаната цел се подбират специални условия, при които

13
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

реакцията на модифициране протича строго избирателно, засягайки аминокиселината, влизаща в активния

център.
Серилови остатъци
Модифицирането на сериловите остатъци е сравнително добре изучено при редица ензими, т. нар.
серилови хидролази. В активният център на последните присъстващият серилов остатък се означава като
активен серин. Сериловите остатъци в активния център на ензимите притежават необикновена чувствителност
към модифициращи съединения от групата на фосфоорганичните съединения – ФОС
(диизопропилфлуорфосфат-ДФФ, тетраетилпирофосфат-ТЕФФ, зарин, табун,зоман и др.), с които обаче те не
могат да реагират, ако белтъкът е денатуриран, по което се различават от останалите серилови остатъци в
молекулата. След свързването на ФОС чрез ковалентна връзка със сериловия остатък от активния център
ензимът се инактивира.
Ако такъв фосфорилиран ензим се хидролизира и сместа от образуваните пептиди се фракционира,
може съвсем точно да се определи към кой аминокиселинен остатък от даден пептид е присъединено
модифициращото съединение. За модифицирането на сериловите остатъци се използват още съединенията
метансулфофлуорид (CH3-SO2F), бензилсулфофлуорид (C6H5-CH2-SO2F) и др.

Хистидилови остатъци
За модифициране на серилови остатъци се прилагат следните по-важни съединения:
 5-диазо-1Н-тетразол (ДНТ). Прилага се за модифициране на хистидилови и тирозилови остатъци,
при което се получават моно- и бис- азопроизводни. В сухо състояние ДНТ представлява силно
взривоопасно вещество. Той се прилага при ензимите трипсин, химотрипсин, карбоксипептидаза А,
лизозим, панкреатична РНК-аза и др.
 фотоокисление – в присъствието на метиленово синьо (МС), при химотрипсин, лизозим,
панкреатична РНК-аза; бенгалска роза (БР), при фруктоза бисфосфаталдолаза и др.
 специфични инхибитори на химотрипсин и трипсин, като N- тозил- L-фенилаланилхлор-метилкетон
(ТФХК) и N- тозил- L- лизилхлорметилкетон (ТЛХК).

МОЛЕКУЛНИ МЕХАНИЗМИ НА ЕНЗИМНИТЕ

РЕАКЦИИ

Изясняването на молекулните механизми, по които протичат ензимните реакции, представлява един от

най-актуалните проблеми на съвременната ензимология. Постигнатите успехи в това направление се
свързват:
 с развитието на теоретичните представи в органичната химия;
 с разработването на редица физикохимични въпроси и механизми на неензимно катализираните
реакции във водни разтвори;
 със създаването на моделни ензимни системи, в които без ензим се реализира същата химична
реакция;
 с разработването на нови физични подходи, обясняващи елементарния акт на ензимната катализа,
и т. н.
В съвременния етап, на който се намира ензимологията, е съвсем ясно, че молекулните механизми, по
които протича ензимното действие, не се различават принципно от тези, по които се извършват химичните,
респективно органичните реакции. Те могат да се смятат за повече или за по-малко установени, ако е изяснена
природата на химичните групи, участвуващи в активните центрове на ензимите, или ако е определен
химичният тип на междинните ЕS-комплекси. Установеният ковалентен характер на ЕS, позволи да бъдат
използвани при изследване механизмите на ензимните реакции, както редица физикохимични методи (напр.
спектроскопски, изотопни, дисперсия на оптично въртене, ядрено-магнитен резонанс, протонен магнитен
резонанс, електронен парамагнитен резонанс - ЕПР, рентгеноструктурен анализ и др.), така и някои химични
подходи, оказали се твърде целесъобразни за обясняване молекулния механизъм на неензимните реакции.

14
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

Mолекулни механизми с участието на имидазолова група от хистидин и

хидроксилна група от серин
Експерименталните изследвания в много лаборатории
по света показаха, че хистидинът влиза в активния център и е
отговорен за каталитичната активност на много ензими, като
химотрипсин, трипсин, ацетилхолинестераза- холинестераза,
панкреатична РНК-аза и др.
Съдържащият се в хистидина имидазолов пръстен
притежава следните по-важни свойства:
 Самият имидазол представлява най- силната основа,
която може да съществува в свободен вид при
неутрално значение на рН (рК на имидазола е около
7). Във водни разтвори единият азотен атом N1 на
имидазола придобива киселинни (електрофилни)
свойства, а другият азотен атом N3 - основни
(нуклеофилни) свойства. Имидазолът може да се разглежда като амфотерно съединение, т. е. той е
способен да присъединява или да отдава протон от молекулата си, при което се получава
положителен или отрицателен имидазолов йон. Отрицателно зареденият имидазолов йон се
образува в силно алкална среда и
тази част от реакция не представлява
интерес за биохимията.
 При атака с протон или с някаква
положително заредена група
имидазолът може да претърпи
тавтомерно превръщане:

При тавтомеризацията двата азотни атоми (N1 и N3) в крайната структура са с разменени свойства, т.
е. азотният атом N1 е придобил основни (нуклеофилни) свойства, а азотният атом N3 - киселинни
(електрофилни).

РНАза А
Би могло да се очаква, че благодарение на тези свои свойства имидазоловата група на хистидина в
активния център на по- горе споменатите ензими ще се отнася като силна нуклеофилна група в ензим-
субстратната реакция при образуването на междинните ковалентни продукти (напр. при химотрипсина е
установено образуването на ацилензим и т.н.). Това предположение не бе потвърдено експериментално в нито
един случай. Многобройните изследвания, проведени върху каталитичното действие на химотрипсина и
сродните му ензими показаха, че в образуването на междинния продукт (ацилензим) като нуклеофилна група
участва хидроксилната група на сериловия остатък (Сер-195). Повишената нуклеофилност на последната се
дьлжи именно на имидазоловата група от хистидина (Хис-57). Двете групи са сближени пространствено в
активния център на ензима. Разстоянието между кислорода на Сер-195 и азотния атом N на Хис-57 е 3,0 Å.
Формирал се е хистидин- серинов каталитичен комплекс.

15
Молекулярна биология- ДЪРЖАВЕН ИЗПИТ Ензими

Химотрипсин- механизъм на ензимна катализа

В химотрипсина този комплекс е разположен близко до повърхността на молекулата в област с ниска
електронна плътност. Рентгенографските изследвания са показали, че тази област в третичната структура на
ензима представлява цепнатина или джоб (нарича се още тозилна яма). В нея се разполага и свързва
страничната ароматна верига на тирозина, фенилаланина и триптофана на ацилираните или на тозилираните
при Сер-195 производни на ензима. С присъствието на тази дълбока цепнатина се обяснява също
специфичността на химотрипсина при катализиране хидролизата на пептидните връзки, образувани от
карбоксилната група на споменатите ароматни аминокиселини. Пример за такъв тип действие е хидролизата
на субстрата бензилоксикарбонил-L-тирозил-глицинамид, катализирана от химотрипсин.
По-натaтъшните рентгенографски изследвания установиха, че съществува
пространствена близост между аспарагиновата киселина ( Асп-102) и хистидин- сериновия каталитичен
комплекс в третичната структура на тозил- химотрипсина. Това позволи да се формулира хипотеза за
активирането на хидроксилната група на Сер-195 чрез образуването на водородни връзки между трите
споменати аминокиселини и пренасянето на протон от Сер-195 да Асп-102.
Взаимодействието между Асп-102, Хис-57 и Сер-195, осигуряващо пренасянето на отрицателен заряд
от Асп-102 до Сер-195, бе наречено от Блоу: релейна система за пренасянето на заряд. Понастоящем тази
хипотеза се критикува и поставя под съмнение от много изследователи. Други автори отричат разгледаната
функция на Асп-102. Те приемат, че ролята на Асп-102 се заключава в стабилизирането на положителния
имидазолов йон, който се образува в хода на ензимната реакция.
Въз основа на рентгенографски, спектроскопски, кинетични и химични данни се предлага следният
възможен молекулен механизъм за каталитичното действие на химотрипсина. Когато субстратът навлезе в
активния център на химотрипсина, след съответни конформационни промени в последния се образува ЕS-
комплекс. Намиращият се в протонирано състояние Сер-195 притежава ниска нуклеофилност. Бе прието, че
Хис-57 действува като общ основен катализатор и откъсва протон от хидроксилната група на Сер-195,
намираща се в непосредствена близост до него. Повишава се силно нуклеофилността на кислородния атом в
серина, като се получава алкоксидна форма на последния, докато имидазолната група в хистидина се
превръща в положително зареден имидазолов йон. По-нататък активираният кислороден атом в Сер-195
извършва фина атака върху въглеродния атом от карбонилната група на субстрата, която води до
образуването на тетраедричен междинен продукт. Реализира се ковалентна катализа. Тетраедричният продукт
се разгражда по-нататък до ацилензим, възстановен имидазолов остатък и първи реакционен продукт (амин
или алкохол, ако субстратът съдържа естерна връзка), който напуска активния център на ензима. Завършва
етапът ацилиране на реакцията, при който се е образувал ацилензим (при Сер-195). В присъствието на вода
ацилензимът се хидролизира по механизъм, наречен деацилиране. Получава се изходният ензим, готов за
следващия каталитичен цикъл и втория реакционен продукт - органичната киселина.
Приема се, че по аналогичен механизъм действуват и други ензими, имащи в активния си център
хистидин- серинов каталитичен комплекс, като например трипсин, тромбин и др. Важно условие при описания
каталитичен механизъм е субстратите да съдържат атакуема карбонилна група.

16