Điện di mao quản

Điện di mao quản

(Capillary electrophoresis)
(Capillary electrophoresis)
Điện di

Điện di là hiện tượng liên quan đến sự di chuyển của các phần tử tích điện
hòa tan hoặc phân tán trong dung dịch điện giải khi có dòng điện đi qua
1930 Tiselius là người đầu tiên tìm ra phương pháp điện di. Thông dụng nhất
là điện di trên bản gel
1967, Hjérten đã tiến hành quá trình tách trong mao quản
Trong những năm 1970, kỹ thuật điện di mao quản phát triển và thành công
với những mao quản nhỏ (20 - 200µm)
Điện di mao quản
Điện di mao quản

Sơ đồ hệ thống điện di
Điện di mao quản

Dòng điện thẩm

(Electro-osmotic flow – EOF)

Cơ sở lý thuyết

Linh độ điện di

(Mobility - µep)
Dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow – EOF)

EOF là dòng chất lỏng bên trong mao quản, được hình thành do điện tích ở bề mặt bên
trong thành mao quản. Nguyên nhân gây ra dòng EOF là lớp điện tích kép phát sinh giữa
bề mặt trong mao quản và dung dịch điện giải
Dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow – EOF)

Do sự chênh lệch điện thế giữa hai lớp cation nên xuất hiện thế zeta

4e
 

Trong đó  là bề dày lớp khuếch tán, e là điện tích trên một đơn vị diện tích bề
mặt bên trong thành mao quản,  là hằng số điện môi của dung dịch đệm
Chiều dày lớp cation kép sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ dung dịch đệm. Như vậy,
dòng EOF sẽ phụ thuộc pH, nồng độ và bản chất dung dịch đệm; điện thế nguồn;
nhiệt độ.
Dòng điện thẩm

Dòng EOF có thiết diện gần như phẳng nên không tham gia vào việc làm cho
pic bị rộng như trong trường hợp của dòng thủy tĩnh trong sắc ký cột.
Linh độ điện di (Mobility –µep)

Tốc độ di chuyển của ion trong điện trường (tốc độ điện di) tỷ lệ với cường độ
điện trường và linh độ điện di và được biễu diễn bằng phương trình:

  ep E
Trong đó  là tốc độ điện di (m/s), ep là linh độ điện di (m2/V.s), E là cường độ điện
trường (V/m)
Chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn có linh độ lớn. Chất phân tích kích
thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp.

q
 ep 
6r
Nguyên tắc tách

 OBS = ep + EOF

 OBS.cation = cation + EOF

 OBS. anion = EOF - anion

 OBS.trung hòa = EOF

Nguyên tắc tách

 Các ion có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các ion có kích thước
lớn với cùng số điện tích

 Các ion dương có 2 điện tích sẽ di chuyển nhanh hơn các ion dương có 1
điện tích với cùng kích thước

 Ion âm di chuyển về anod

Các kỹ thuật điện di

Capillary Zone Electrophoresis – CZE

(Điện di mao quản vùng)

Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography – MEKC

(Sắc ký mao quản mixen điện động)

Capillary Capillary Isoelectric Focusing – CIEF

electrophoresis (Điện di mao quản đẳng điện)

Capillary Isotachophoresis – CITP

(Điện di mao quản đẳng tiếp xúc)

Capillary Gel Electrophoresis – CGE

(Điện di mao quản gel)
Điện di mao quản vùng - CZE

Dựa theo nguyên lý chung của điện di và dòng EOF

Quá trình tách do sự di chuyển của chất tan với tốc độ khác nhau tạo thành những vùng
riêng rẽ. Các chất tan là anion và cation được tách ra nhờ dòng EOF.
Điện di mao quản vùng - CZE

Linh độ điện di

q
 ep 
6r

Linh độ điện di sẽ bị ảnh hưởng bởi

Ld V
 ep    ep các yếu tố: q, r, L, V, 
tm Lt

Ld / t m
 ep 
V / Lt
Điện di mao quản vùng - CZE

Dòng EOF

ep   app  eof

V
 eof   eof Dòng EOF ảnh hưởng đến thời gian di
Lt chuyển của chất tan

Ld Lt Ld
t 
E  ep   eof  V  ep   eof 
Điện di mao quản vùng - CZE

Dòng EOF

Xác định dòng EOF: dùng các chất trung tính như methanol, aceton, alcol
benzylic, mesityl oxyd
Kiểm soát dòng EOF
Dòng EOF góp phần quan trọng vào thời gian di chuyển thay đổi trong các lần
phân tích. Nếu dòng EOF không tái lặp nghĩa là mao quản đã bị ảnh hưởng bởi
các thành phần mẫu
Dòng EOF bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số: pH đệm, nồng độ đệm, nhiệt độ,
độ nhớt, bề mặt mao quản, cường độ điện trường, dung môi hữu cơ thêm vào
dung dịch điện giải, chất hoạt động bề mặt
Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng pH dung dịch đệm

Ở pH cao nhóm silanol sẽ ion hóa hoàn toàn, tạo độ mạnh của thế zeta và mật độ cao ở
lớp cation kép. Như vậy, dòng EOF sẽ tăng khi pH dung dịch đệm tăng. Dòng EOF có thể
làm đồng thời tách được cation, anion và những phân tử trung hòa về điện
Ở pH thấp dòng EOF giảm, có sự thay đổi điện tích chất tan, chất tan sẽ mang điện tích
dương và di chuyển về phía điện cực âm (cathod). Đối với mao quản không bao thì hầu
như các chất tan di chuyển về phía cathod, trừ khi thêm vào dung dịch đệm một chất hoạt
động bề mặt hoặc sử dụng mao quản có lớp bao trên bề mặt để làm giảm hoặc thay đổi
dòng EOF.
Sự thay đổi pH sẽ ảnh hưởng đến điện tích chất tan, ngoài ra nó còn làm thay đổi dòng
EOF. Điều này cần thiết cho sự tối ưu hóa phương pháp phân tích, phải chọn dung dịch
đệm có pH thích hợp với bản chất của chất phân tích
- Chất phân tích là cation (pKa < 7) nên sử dụng dung dịch đệm có pH < pKa
- Chất phân tích là anion (pKa > 7) nên sử dụng dung dịch đệm có pH > pKa
Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng pH dung dịch đệm

Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng pH dung dịch đệm

 pH cao  Dòng EOF tăng

 pH thấp  Dòng EOF giảm

 pH lựa chọn phải phù hợp với chất phân tích

 Chất phân tích pKa >7  dung dịch đệm có pH > pKa

 Chất phân tích pKa < 7  dung dịch đệm có pH < pKa
Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm

 = (3 x 107)Z(C1/2)

4e
 

Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng của điện thế nguồn

 V tăng  EOF tăng  Thời gian di chuyển giảm  Thời gian

phân tích giảm
 V cao  Cường độ điện trường cao  Tăng hiệu ứng Joule
Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ

- Dung môi hữu cơ có thể làm thay đổi dòng EOF vì nó tác động lên độ nhớt và
thế zeta của dung dịch đệm.
- Methanol, ethanol hoặc isopropanol thường được sử dụng để làm giảm dòng
EOF vì khả năng làm tăng độ nhớt của dung dịch điện giải.
- Acetonitril thì không ảnh hưởng hoặc làm tăng rất nhẹ dòng EOF.
Ngoài ra, dung môi hữu cơ còn được sử dụng để làm tăng độ tan của mẫu.
Điện di mao quản vùng - CZE

Ảnh hưởng của kích thước mao quản

 L tăng  thời gian di chuyển tăng  Độ phân giải tăng

 Đường kính mao quản tăng  Tăng nhiệt bên trong

cột  Giảm độ phân giải
Điện di mao quản vùng - CZE

Hiệu quả tách

Hiệu quả tách có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF, hệ số khuếch tán của chất
tan (D) và được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:

N
 ep   eof V
2D

số đĩa lý thuyết (N), có thể tính trực tiếp từ điện di đồ:

2
 t 
N  5,54 m 
 W1/ 2 
Điện di mao quản vùng - CZE

Hiệu quả tách

Độ phân giải (Rs) giữa hai chất tan là một đại lượng thực tế để xác định hiệu
quả của một quá trình tách

N  epb   epa 
Rs 
4 ep   eof 

Độ phân giải có thể tính:

Rs 

2 t m2  t m1 
W1  W2
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Trong MEKC, có thể tách được ion và cả phân tử trung hòa điện bằng cách thêm
các chất hoạt động bề mặt vào dung dịch đệm làm việc ở nồng độ lớn hơn nồng
độ mixen tới hạn. Các chất phân tích có thể phân bố trong pha tĩnh giả do mixen
tạo thành.
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Hệ thống mixen thích hợp cho MEKC phải đáp ứng các tiêu chuẩn sau: Chất
hoạt động bề mặt tan tốt trong đệm và dung dịch mixen đồng nhất và trong suốt
đối với detector UV.
Độ chọn lọc của hệ thống MEKC chủ yếu tùy thuộc vào bản chất của chất hoạt
động bề mặt.
Dung môi hữu cơ thường thêm vào trong đệm MEKC để điều chỉnh hệ số
dung lượng, tương tự như trong tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
MEKC có thể sử dụng để tách các đồng phân đối quang. Để tách các đồng
phân, trong dung dịch đệm được thêm vào các tác nhân đối quang (chiral
selector) nhứ: -cyclodextrin, muối mật, ….
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Nguyên tắc tách

k   t R / t0  1 Detector response

t0 tmc

tR
t 1 Time
k  0
tR
1
t MC

  t0  
  
tR 
1  k t0   1 
 N    1  k 2    t MC  
Rs     1  k     t  
  t0   4     2
1    1   0 k1 
  t MC    t MC  
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Các chất diện hoạt

Cation
Cetyltrimethylammonium clorid (CTAC) hoaëc bromid (CTAB)
Tetradecyltrimethylammonium clorid (TTAC) hoaëc bromid (TTAB)
Hexyltrimethylammonium clorid (HTAB)
Octatrimethylammonium clorid (OTAB)
Propyltrimethylammonium clorid (PTAB)
Decyltrimethylammonium clorid (DTAC) hoaëc bromid (DTAB)
Trung tính
Polyoxyethylen-23-lauryl ether (Brij-35)
Octyl--D-glucopyranoside (OG)
Nonanoyl-N-methylglucamide (MEGA)
Triton X-100
Anion
Sodium dodecyl sulfat (SDS)
Sodium decyl sulfat (STS)
Sodium taurocholat (STC)
Sodium cholat (SC)
Sodium taurodeoxycholat (STDC)
Sodium deoxycholat (SDC)
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Các chất diện hoạt anion

- Sự biến đổi dây alkyl sẽ làm thay đổi tính không thân nước của dạng mixen
- Chất diện hoạt với dây alkyl ít hơn 8 carbonthì ít dùng vì nồng độ CMC quá lớn.
Tuy nhiên, có thể sử dụng như là một thuốc thử tạo cặp ion để tăng tính chọn lọc
- Nếu dây alkyl lớn hơn 14 carbon sẽ ảnh hưởng đến độ tan
Tốt nhất là sử dụng SDS

Các chất diện hoạt cation

- Các chất cation có khả năng ngược lại với chất mang trên bề mặt thành mao
quản vì thế nó làm đảo chiều dòng EOF
- Thay đổi kích thước dây alkyl không thay đổi dòng EOF, nhưng sẽ làm giảm
linh độ của mixen
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Các chất diện hoạt đối quang

Chất diên hoạt đối quang sử dụng trong tách đồng phân quang học của nhiều
hoạt chất
Các chất thường sử dụng:các alkoxyacylamino acid, các saponin (digitonin,
glycyrrhizic acid, . . .)
Tách đồng phân bằng MEKC có thể phối hợp chất diện hoạt đối quang và các
tác nhân đối quang như cyclodextrin và các dẫn chất của cyclodextrin
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Lựa chọn đệm

Dung dịch đệm sử dụng phải có khả năng đệm tốt trong khoảng pH lựa chọn, ít
hấp thu ở vùng bước sóng phát hiện và có linh độ thấp (ion lớn, điện tích thấp
nhất) để tối thiểu hóa sự phát sinh dòng điện.
Mục đích của đệm là để kiểm tra pH của dung dịch điện giải. Sự thay đổi pH ảnh
hưởng rất quan trọng đến linh độ và dòng điện thẩm. Dung dịch đệm được chọn
phải có độ dẫn tương đương với độ dẫn của mẫu để giảm thiểu sự biến dạng
của pic. Một đệm thích hợp sẽ tăng hiệu quả tách

 Đệm borat Sử dụng chất phân tích có tính acid, carbohydrat

 Đệm phosphat  Sử dụng chất phân tích có tính kiềm, protein

Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC

Lựa chọn đệm

- Các chất có tính kiềm khó tan trong đệm phosphat có thể sử dụng đệm acetat
với pH 4. Khi phân tích các protein để tránh sự bám của protein trên bề mặt
mao quản nên sử dụng đệm có giá trị pH cao
- Đệm phosphat thường sử dụng trong tách protein có pH thấp bởi vì các ion
phosphat làm giảm ảnh hưởng của protein lên các nhóm silanol hóa trên bề mặt
thành mao quản. Do đó, nên rửa mao quản trước bằng đệm phosphat pH 2,5
- Đệm borat thường được sử dụng cho phân tích carbohydrat và catecholamin
vì bản chất hóa học đặc biệt củ nó
Sắc ký mao quản mixen điện động- MEKC
Lựa chọn đệm
Đệm pKa
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) 6,15
N-(2-acetamido)2-aminoethanesulfonic acid (ACES) 6,90
Beta-hydroxy-4-morpholinepropanesulfonic acid (MOPSO) 6,90
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid 7,50
N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2- aminoethanesulfonic acid (BES) 7,16
4-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 6,79
N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-2- ethanesulfonic acid 7,51
N[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine (TRICIN) 8,05
N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine (BICIN) 8,25
Morpholin 8,49
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) 8,30
2-(N-cylohexylamino)ethanesulfonic acid (CHES) 9,50
Acetat 4,76
Borat 9,14
Citrat 3,12 - 6,40
Format 3,75
Phosphat 2,14 - 13,3
Mao quản

Mao quản thông dụng dùng trong CE thường được làm bằng silica nung chảy
không có lớp bao bên trong và bên ngoài được bảo vệ bằng lớp polyimid.
Ngoài ra, còn có loại mao quản với lớp bao bên trong. Các chất bao bên trong mao
quản có thể được sử dụng để thay đổi cường độ hay làm đảo chiều dòng EOF, làm
giảm sự hấp phụ của mẫu
Sự ổn định về thời gian di chuyển và độ phân giải có thể thu được nếu tuân theo
quy trình rửa cột mao quản nhất định. Quy trình rửa và cân bằng mao quản phải
phù hợp với các chất phân tích, các nền mẫu (matrix), phương pháp phân tích và
bản chất cột
Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu

 Kiểu di chuyển điện  Kiểu điện động

 Tiêm áp suất âm và áp suất dương  Kiểu thủy tĩnh

Mỗi một phương pháp tiêm mẫu có những ưu và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào
thành phần của mẫu, kiểu tách và áp dụng phương pháp
Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu

Tiêm kiểu điện động

Mẫu đi vào mao quản bằng sự phối hợp của điện di và dòng EOF. Bởi vậy, các chất phân
tích có linh độ khác nhau đi vào trong mao quản ở mức độ khác nhau. Độ dẫn của mẫu
thử và chất chuẩn cũng ảnh hưởng đến dòng EOF và thể tích tiêm
Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu

Tiêm kiểu thủy tĩnh

Tiêm áp suất có thể đưa tất cả các thành phần của mẫu vào trong mao quản ở
cùng một mức độ, nói chung là cho độ tái lặp tốt nhất và là cách tiêm thường
được áp dụng nhất. Thể tích mẫu phụ thuộc vào chiều dài và đường kính trong
của mao quản và điện thế hay áp suất áp đặt. Thể tích mẫu đặc trưng được
tiêm vào trong mao quản khoảng từ 1 - 20 nL
Detector

Detector dãy diod quang là loại thông dụng nhất. Sự ghép nối với khối phổ cho
phép thu được những thông tin về cấu trúc kết hợp với các dữ liệu điện di.
Detector huỳnh quang được sử dụng để làm tăng độ nhạy phát hiện và áp dụng
cho những chất có khả năng phát quang. Các chất không hấp thu tử ngoại hoặc
không có phát quang có thể được phát hiện bằng cách thêm trực tiếp vào dung
dịch đệm các chất tạo màu hay chất phát quang.
Detector đo độ dẫn, đo amper có thể sử dụng nhưng nói chung không thông
dụng.
Ứng dụng

- Phân tích acid amin, carbohydrat, peptid, protein, ….

- Môi trường: phân tích sulfonic, benzidin, nitrosamin, thuốc trừ cỏ,…

- Thực phẩm

- Phân tích các ion vô cơ

- Phân tích nucleotid, nucleosid, oligonucletid, ….

- Phân tích các chất hữu cơ có phân tử lượng thấp: alcol, chất chống oxy hóa, amin,

acid carboxylic, catechol, phenol, flavonoid, thuốc trừ sâu,….

- Dược phẩm: phân tích các thuốc giảm đau, kháng sinh, kháng viêm, vitamin,..

- Tách các đồng phân đối gương

Carbohydrat

Điện di đồ của hỗn hợp carbohydrat: (1) cellobiose, (2) xylose, (3) glucose, (4) mannose, (5)
arabinose và (6) galactose. Dung dịch điện ly nền: đệm borat 450 mM (pH 9,94), điện thế + 28 kV,
20 oC, bước sóng 305 nm.
Các ion vô cơ
Các acid hữu cơ
Các ion hữu cơ

Điện di đồ của hỗn hợp chuẩn anion hữu cơ và điện di đồ của mẫu rượu trắng và mẫu rượu
đỏ. Dung dịch điện ly nền: đệm 200 mM phosphat (pH 7,5, cột mao quản bao
polyacrylamid, điện thế: - 14 kV, 200 nm. Thứ tự pic: nitrat, oxalat, sulfite, fumarat, succinat,
tartrat, maleat, citrat, phthalat, acetat, lactat
Các acid nucleic

Điện di đồ của hỗn hợp 16 dẫn chất acid nucleic phân tích với kỹ thuật MEKC. Dung dịch
điện ly nền: 25 mM natri phosphat (pH 6,9), 100 mM SDS
Các oligoshaccaride

Điện di đồ của Dextrin 10(DE 10) và Maltrin M040 (DE 5). Phát hiện bằng detector huỳnh
quang. Cột mao quản bao polyacrylamid. Dung dịch điện ly nền: 100 mM Tris-borat (pH 8,0)
Các chất kháng viêm không steroid
Các acid amin

Điện di đồ của hỗn hợp 12 dẫn chất của acid amin với thuốc thử OPA. Dung dịch điện ly nền: 20
mM natri tetraborat và 15 mM acid boric (pH 9,2) và 102,5 mM SDS. Cột mao quản silica nung
chảy có chiều dài hiệu quả 72 cm. Điện thế 20 kV. Býớc sóng 215 nm.
Điện di đồ phân tích các thuốc hạ nhiệt giảm đau paracetamol, phenylpropanolamin, pseudoephedrin,
clopheniramin maleat. Dung dịch điện ly nền: 10 mM natri tetraborat và 10 mM di kalihydrogen
phosphat (pH 9,2), 50 mM SDS, 5 % acetonitril
Các đồng phân quang học

b
a

c
Điện di đồ hỗn hợp racemic của propranolol. Cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 m, 25oC, 20 kV, 50
mbar x 5 giây, 214 nm. Dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM giá trị pH 2,5 và 20% methanol
với sự hiện diện của HP -CD; (a) 10mM HP -CD, (b) 20 mM HP -CD, (c) 30 mM HP -CD.