ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent

Assay

‫التحاليل المناعية المرتبطة‬

 ‫تعريفات عامة‬
‫ما هي األجسام المضادة ‪Antibody‬‬
‫هي مركبات موجودة ضمن الجهاز المناعي للجسم‬
‫وتصنع بشكل خاص عند تعرض الجسم ألجسام‬
‫غريبة‬
 ‫تابع‪ -‬تعريفات عامة‬

‫‪Antigen ‬‬
‫ه<و جس<<م مس<ؤول ع<ن اثارة الجهاز< المناع<ي للجس<م وبالتحدي<د‬
‫اثارة األجسام المضادة‬

‫‪ ‬التحاليل المناعية ‪Immunoassay‬‬

‫ه<ي اختبارات بيوكيميائي<ة لقياس مس<توى مادة معين<ة ف<ي الس<ائل‬
‫الحيوي (س<<<<<<يرم‪ ,‬بول‪,‬لعاب‪ ,‬دموع) بواس<<<<<<طة ارتباط‬
‫‪ Antigen‬مع ‪ Antibody‬المخصص له‬
 ‫تابع‪ -‬تعريفات عامة‬

‫‪Analyte ‬‬
‫ه<ي المادة الحيوكيميائي<ة الت<ي يت<م قياس<ها وف<ي التحالي<ل المناعي<ة‬
‫يكون ‪ Analyte‬إما ‪ Antibody‬أو ‪antigen‬‬
 ‫حاالت ‪Antigen‬‬
‫يكون ‪ Antigen‬إما‪:‬‬
‫‪ ‬موجود في الجسم بشكل طبيعي مثل الهرمونات‬
‫‪ ‬يت<<م تص<<نيعه ف<<ي الجس<<م ف<<ي حاالت مرضي<<ة مثال‪:‬‬
‫هرمون‪ HCG‬الذي يفرز م<ن المشيم<ة بشك<ل ط<بيعي‬
‫أثناء الحم<ل يمك<ن افرازه ف<ي بع<ض أنواع الس<رطانات‬
‫حتى عند الرجال‬
‫‪ ‬غير موجود في األحوال العادية مثل المخدرات‬
 ‫مقدمة‬

‫‪ ‬يتم تصنيع األجسام المضادة ‪ Antibodies‬في حال‬

‫التعرض ألجسام غريبة ‪Antigens‬وتكون هذه‬
‫األجسام المضادة ذات تخصصية وألفة ‪Specific‬‬
‫‪ Affinity‬لألجسام الغريبة التي أثارت تصنيعها مثل‬
‫البروتينات والسكريات العديدة و األحماض النووية‬
 ‫تابع‪ -‬مقدمة‬

‫‪ ‬تتعرف األجسام المضادة على الجزء‪antigenic‬‬

‫‪determinant‬‬

‫‪ ‬يحتوي الجسم على خاليا مصنعة لألجسام المضادة‬

Shortcut to image004.lnk
 ‫طرق تصنيع األجسام المضادة الخاصة‬
‫بالتحاليل المناعية‬
‫هناك أكثر من طريقة لتصنيع األجسام المضادة و أحد أكثر‬
‫هذه الطرق شيوعا لتصنيع ‪ Antibody‬مخصص لجسم‬
‫ما (‪)Antigen‬هو حقن هذا الجسم مرتين متباعدة فترة‬
‫‪ 3‬أسابيع ألرنب وبعد عدة أسابيع من الحقن يتم سحب دم‬
‫من األرنب وعمل طرد مركزي للحصول على السيرم‬
‫المحتوي على ‪ Antibody‬المطلوب‬
‫ولكن هذا ‪ Antibody‬يسمى ‪ polyclonal‬ألنه ن<اتج‬
‫تصنيع عدة خاليا‬
 ‫تابع‪ -‬طرق ت‪+‬صنيع األجسام ا‪+‬لمضادة‬
‫الخاصة بالتحاليل المناعية‬

‫هناك طريقة لتصنيع أكثر ‪ Antibody‬تخصصا‬

‫‪ monoclonal‬وهو ناتج تصنيع مجموعة خاليا‬
‫متماثلة تماما ‪ cell line‬ونحصل على هذه الخاليا‬
‫بدمج خلية مصنعة للجسم المضاد مع خلية سرطانية‬
‫لها القدرة على االنقسام الى ماال نهاية‬
 ‫ما هي تقنية ‪ELISA‬‬

‫هذه التقنية تستخدم لقياس تركيز مادة جزيئية مثل‬

‫الهرمونات والعقاقير في السائل الحيوي كالسيرم ‪ .‬هذه‬
‫المادة الجزيئية تقاس عن طريق معرفة كمية األجسام‬
‫المضادة ‪ Antibody‬التي ارتبطت ب ‪Antigen‬‬
 ‫استخدامات تقنية‪ELISA‬‬

‫استخدامات‬
‫‪ELISA‬‬

‫للكشف عن وجود‬ ‫للكشف عن تركيز‬

‫في الصناعات الغذائية‬
‫األنتيجينات‬ ‫األجسام المضادة‬
 ‫تقنية ‪ELISA‬‬

‫تنقسم إلى‪:‬‬
‫‪ -1‬قياسات مناعية تنافسية ‪Competitive ELISA‬‬
‫‪ -2‬قياسات مناعية غير تنافسية ‪Sandwich ELISA‬‬
 ‫‪Competitive ELISA‬‬

‫في هذه الحالة يتنافس ‪Antigen‬المطلوب قياسه في‬

‫العينة مع‪ Labeled Antigen‬لالرتباط بالجسم‬
‫المضاد وفي هذه الحالة تكون العالقة عكسية بين كمية‬
‫‪ Antigen‬المطلوب قياسه مع ‪labeled Antigen‬‬
 ‫‪Sandwich ELISA‬‬
‫هناك حالتين‬
‫أ‪ -‬إم<ا أ<ن يكون المطلوب الكش<ف ع<ن ‪ Antigen‬وقياس تركيزه‬
‫ف<<ي العين<<ة فف<<ي هذه الحال<<ة يكون طب<<ق االليزا مغط<<ى‬
‫بالجسم المضاد ‪Antibody‬‬
‫يرتبط ‪ Antigen‬في العينة مع الجسم المضاد وبعد ذلك ير<تبط‬
‫الجسم المضاد بجسم مضاد آخر ويكون الجسم المضاد اآلخر‬
‫مر<تبط بإنز<يم ثم تضاف المادة األساس لإلنزيم ويتم حساب‬
‫كمية ‪Antigen‬عن طريق قياس كمية ناتج التفاعل‬
‫ب‪ -‬الحال<ة الثاني<ة أ<ن يكون المطل<ب الكش<ف ع<ن ‪ Antibody‬وقياس‬
‫تركيزه ف<ي العين<ة فف<ي هذه الحال<ة يكون طب<ق االليزا مغطى ب‬
‫‪Antigen‬‬
‫يرتب<ط ‪ Antibody‬ف<ي العين<ة م<ع ‪ Antigen‬الموجود ف<ي الطب<ق‬
‫وبع<د ذل<ك يرتب<ط الجس<م المضاد بجس<م مضاد آخ<ر ويكون الجس<م‬
‫المضاد اآلخ<<ر مرتب<<ط بإنزي<<م ث<<م تضاف المادة األس<<اس لإلنزي<<م‬
‫ويت<<م حس<<اب كمي<<ة ‪ Antibody‬ع<<ن طري<<ق قياس كمي<<ة نات<<ج‬
‫التفاعل‬
 ‫مثال على طريقة عمل‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬

‫قبل الشروع في العمل يجب قراءة التعليمات بدقة‬

‫شديدة ألن أي خطأ قد يؤدي الى فساد التجربة‬
‫وخسارة قيمة ‪ Kit‬وهي مكلفة جدا‬

‫نستخدم ‪( Kit‬مجموعة المحاليل المستخدمة في التحاليل‬

‫المناعية ) حيث أن لكل جسم مطلوب الكشف عنه‬
‫‪ Kit‬مخصوص‬
 ‫تابع‪ -‬مثال على طريقة عمل‪Sandwich‬‬
‫‪ELISA‬‬
‫‪ -1‬يتم ترقيم الطبق الخاص المكون من ‪ 96‬خانة‬
‫(‪ ) wells‬بدقة وتستخدم الخانات ‪ wells‬األولى لرسم‬
‫المنحنى القياسي ‪Standard curve‬‬
 ‫تابع‪ -‬مثال على طريقة عمل‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬
‫‪ -2‬ث<م يت<م وض<ع العين<ة المراد فحص<ها ف<ي الطب<ق ويفض<ل‬
‫تكرار ك<ل عين<ة مرتي<ن أو ثالث مرات ‪Duplicate or‬‬
‫‪Triplicate‬‬
‫وبعد ظهور النتائج يؤخذ المتوسط‬
‫‪ -3‬تستخدم عينة ضابطة ‪Quality control sample‬‬
‫وهذه العينة تأتي مع مجموعة المحاليل (‪ )Kit‬وهي ذات‬
‫تركيز محدد من قبل الشركة المصنعة وتعامل تماما مثل‬
‫العينة المفحوصة‬
 ‫تابع‪ -‬مثال على طريقة عمل‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬
‫‪ -4‬تترك العينات لفترة زمنية محددة حتى يلتصق ‪Analyte‬‬
‫بالطبق بعد ذلك يغسل الطبق إلزالة ما تبقى من العينة‬

‫‪ -5‬تتم اضافة محلول يحتوي على أجسام مضادة للبر<وتين‬

‫المطلوب الكشف عنه وهذه األجسام تسمى األجسام المضادة‬
‫األولية ‪Primary Antibodies‬‬
 ‫تابع‪ -‬مثال على طريقة عمل‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬
‫‪ -6‬تتم اضافة أجسام مضادة ثانية ‪Secondary‬‬
‫‪ Antibodies‬لألجسام المضادة األولية ‪Primary‬‬
‫‪Antibodies‬وهذه يمكنها االرتباط بالطبق فقط في‬
‫حال ارتباط األجسام المضادة األولية بالعينة (هذه‬
‫األجسام المضادة الثانية يرتبط بها انزيم)‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬
 ‫تابع‪ -‬مثال على طريقة عمل‬
‫‪Sandwich ELISA‬‬
‫ي<<تم< ا<ضافة ا<<لمادة ا<<ألساسل <إلنزيم< ا<<لمرتبط ب<<<ا<<ألجسام< ‪7-‬‬
‫ا<<لمضادة ا<<لثانية ف<<<يق<وم< ا<<إلنزيم< ب<<<تحويلا<<لمادة ا<<ألساسا<<لى‬
‫ن<<اتج< ملون‬

‫ت<<<حسبك<مية ن<<اتج ا<<لتفاعلض<<وئيا ب<<<استخدا<م< جه<از ا<<لحاسوب‪8-‬‬

‫وتكونك<مية‬
‫ناتج التفاعل متناسبة طرديا مع كمية ‪ Analyte‬في العينة‬
 ‫النتائج‬

‫بع<<د قراء<<ة نتائ<<ج االمتص<<اص ف<<ي جهاز قارئ االليزا نقوم برس<<م‬
‫المنحن<ى القياس<ي عل<ى ورق الرس<م ال<بياني بحي<ث نس<تخدم المحور‬
‫الس<يني ‪x-axis‬للتركي<ز ‪ concentration‬والمحور الصادي‬
‫‪ y-axis‬لالمتصاص ‪Absorption‬‬
‫‪Absorption‬‬
‫‪nm‬‬

‫‪Concentration ng/ml‬‬
 ‫تابع‪-‬النتائج‬

‫نقوم بتحدي<د تركيزات المحالي<ل القياس<ية ‪standards‬عل<ى المنحن<ى‬

‫الس<يني ‪ x-axis‬ث<م نحدد قراء<ة ك<ل محلول قياس<ي عل<ى المنحن<ى‬
‫الصادي ‪ y-axis‬ونرسم المنحنى القياسي‬
 ‫تابع‪-‬النتائج‬

‫يستخدم هذا المنحنى لقياس تركيز كل عينة بحيث نأتي عند قراءة‬
‫االمتصاص على المحور الصادي ونحدد النقطة المقابلة لها على‬
‫المنحنى وبعد ذلك نحدد التركيز على المنحنى السيني‬

‫‪Absorption‬‬
‫‪nm‬‬

‫‪Concentration ng/ml‬‬
 ‫تابع‪-‬النتائج‬

‫نحس<<ب تركي<<ز العين<<ة الضابط<<ة م<<ن المنحن<<ى وإذا كان ف<<ي الحدود‬
‫الطبيعي<<ة المحددة م<<ن الشرك<<ة المص<<نعة فهذا يعن<<ي أ<<ن التجرب<<ة‬
‫ناجحة ويمكن اعتماد النتائج‪.‬‬
 Related web site
 http://www.edumedia-sciences.com/en/a543-
direct-enzyme-linked-immunosorbent-assay-
elisa
 http://www.sumanasinc.com/webcontent/ani
mations/content/ELISA.html
 http://www.biology.ualberta.ca/facilities/multi
media/uploads/procedures/elisa-sound.swf