Professional Documents
Culture Documents
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА
- практична настава -
за магистри по фармација
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 2
-Практична настава-
Обврски и задачи на студентот:
Секој студент во рамки на предметот Базична имунологија ќе биде задолжен да:
Редовно ги посетува лабораториските вежби. Дозволено отсуство од максимум
еден термин на лабораториски вежби, што повлекува намалување на освоените
поени предвидени за практична настава.
Однесувањето во лабораторија мора да е во рамки на предвидените правила на
работење во лабораторија.
Практикум во кој се запишуваат сите чекори од лабораториската вежба,
протоколот на истата, цртање и означување на графичките прикази. практикумот
се доставува на преглед кај асистентот по секоја завршена вежба.
Активно учество во тек на изработката на вежбата. Задолжението кое студентот
го добива во тек на вежбата треба да го одговори (изведе, припреми, нацрта) во
предвидениот термин на вежбата. За истото е задолжен да го води дненикот и за
тоа е соодветно оценет.
Пред почетокот на вежбата и по завршување на истата предвидени се кратки
тест прашања кои се во однос на проблематиката која ја обработува тековната
вежба.
Завршната вежба е задолжителна за секој студент, и со нејзино успешно
совладување студентот се стекнува со право за завршен испит.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 3
-Практична настава-
Мерките на претпазливост се поделени и дефинирани како:
СТАНДАРДНА ЛАБОРАТОРИСКА ПРАКСА
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 4
-Практична настава-
ЛАБОРАТОРИСКИ ПРАВИЛА И БЕЗБЕДНОСНИ ПОСТАПКИ
Пред започнување со лабораториска работа...!!!
За време на вежбата...
Во практикумот да се забележуваат сите чекори од вежба, цртаат слики и шематски
прикази кои се објаснуваат во тек на вежбата.
Неопходно е придржување кон сите мерки за предпазливост:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 5
-Практична настава-
ХАЗАРДНИ СИМБОЛИ
E EXPLOSIVE
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 6
-Практична настава-
Матерјалот е потенцијално фатална токсична
супстанца
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 7
-Практична настава-
ВЕЖБА 1
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 8
-Практична настава-
2. Изолација на лимфоцити од цврсти ткива и органи:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 9
-Практична настава-
3. Panning метода
Оваа техника се базира на селективна адхезија на Б- или Т- лимфоцитите на колона
обложена со високомолекуларни партикли на кои со хемиска реакција, специфичните
имуноглобулини се фиксирани со Fc фрагментот, така да им се слободни Fab фрагментите и
наликуваат на трапез- акробати со раширени раце, со кои можат да интереагираат со
различниот антигенски репертоар на Б- или Т- клетките. Како високомолекуларни партикли
се користат декстран (Sephadex), агароза (Sepharose), полиакриламид или стаклени топчиња.
Селективно нафатените лимфоцити треба да се елуираат најчесто со промена на рН на
средината, која треба да ги ослободи од специфичните антитела. Но, ова оди толку тешко,
што е рамно на постапката на измивање во “тавче” (англ. pan) на златото за отстранување на
земјата што го практикувале поранешните трагачи по злато. Оттаму и целата метода го носи
називот Panning.
4. Техниката на розетирање
Ова техника претставува основа за сепарација на Т од Б лимфоцити од лимфоцитна
суспензија. Се базира на присуството на неспецифични рецептори за необработени овчи
еритроцити кои ги поседуваат само хуманите Т-лимфоцити. Т-лимфоцитите преку овие
рецептори се врзуваат за овчите еритроцити и создаваат розети (т.н. директни или Е-розети).
Розетите се создаваат спонтано во тек на 1-2 часа од мешањето на хуманите лимфоцити со
овчите еритроцити на собна температура. Препаратот обично се третира со Гимза или друга
техника на боење, а потоа се набљудува под микроскоп. Розетите обично се дефинираат како
формации од централно поставен лимфоцит, опкружен со 5 или повеќе еритроцити.
Покрај директните розети, познати се и методите за формирање на индиректни розети од
типот ЕА (еритроцит-антитело) како и ЕАЦ (еритроцит-антитело-комплемент).
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 10
-Практична настава-
ПРАКТИЧНА РАБОТА: Изолација на лимфоцити од полна крв со
употреба на центрифугирање со градиент на густина
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 11
-Практична настава-
2. Сепарација на Т-лимфоцитите со розетна техника
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 12
-Практична настава-
ВЕЖБА 2
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 13
-Практична настава-
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 14
-Практична настава-
ПРАКТИЧНА РАБОТА:Сепарирај смеса на бовин серум албумин и казеин
Протокол за работа
Користејќи ја долната табела можеш да одредиш колку грами цврст амоиниум сулфат е
потребен да се додаде во 1 mL раствор на протеинска смеса (казеин и бовин серум
албумин) за да се добие посакуваниот % на заситување.
Овие два проетини имаат различна молекуларна маса: казеинот има молекулска маса
од 20000Dа, а бовин серум албуминот од 55000 Dа. Со помош на SDS-PAGE техниката
(Вежба бр:3) можеме да ги раздвоиме овие два протеини врз основа на нивната
молекуларна маса и со тоа да одредиме кој протеин се исталожил во која фракција
(заситување) на амониум сулфат.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 15
-Практична настава-
Резултати:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 16
-Практична настава-
ВЕЖБА 3
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 20
-Практична настава-
мембраната по пат на електрофореза во рок од само 30 мин до неколку часа. Гелот и
мембраната се поставуваат во вертикален систем потопен во трансферен пуфер. Под
дејство на електрично поле сепарираните протеини излегуваат од гелот и навлегуваат
во мембраната. Алтернативно, пуферскиот систем може да се замени со филтерна
хартија потопена во транферен пуфер. Ова е т.н. хоризонтален “полусув”
елекрофоретски блотинг.
По транферот протеинсите фракции, сега веќе поврзани за мембраната, можат да се
детектираат или преку врзување со специфични антитела или неспецифично со
употреба на различни техники на боење. Детекцијата со антитела се изведува на тој
начин што нитроцелулозната мембрана се третира со антитела специфично вперени
против одреден протеин, а потоа се воведуваат секундарни антиимуноглобулински
антитела кои се коњугирани со ензим. Со употреба на хромоген супстрат специфичен
за ензимот со кој е маркирано антителото се јавува обојување на мембраната.
Компонента Количина
акриламид 146 g
N,N`- метилен бисакриламид 4g
дестилирана вода до 500 ml
Готовиот раствор се чува на 4°С, во темно шише.
Компонента Количина
Трис база 54,45g
дестилирана вода 150 mL
pH на растворот се подесува до 8.8 со додавање на HCl. Готовиот раствор се чува на 4C.
Компонента Количина
Трис база 6g
дестилирана вода 60 mL
pH на растворот се подесува до 6.8 со додавање на HCl. Готовиот раствор се чува на 4C.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 21
-Практична настава-
1.2. Протокол за работа
А) Подготовка на гел:
Подготовка на 12% сепарациски гел (вкупен волумен 100 ml)
Компонента Волумен
акриламид/бисакриламид (30%Т, 2.67 %C) 40.0 mL
дестилирана вода 33.5 mL
1.5 M Tris HCl pH 8.8 25.0 mL
10 % натриум додецил сулфат (w/v) 1.0 mL
10 % амониум персулфат (свежо подготвен) 500 µL
N,N,N’,N’-тетраметилетилендиамин (TEMED) 50 µL
Компонента Волумен
акриламид/бисакриламид (30%Т, 2.67 %C) 1.3 mL
дестилирана вода 6.1 mL
0,5 M Tris HCl pH 6.8 2.5 mL
10% натриум додецил сулфат (w/v) 100 µL
10 % амониум персулфат (свежо подготвен) 50 µL
N,N,N’,N’-тетраметилетилендиамин (TEMED) 10 µL
Геловите се подготвуваат по дадениот редослед. Во веќе склопен систем на плочи прво се излева
сепарацискиот гел, кој треба да исполни мин ¾ од вкупниот волумен на системот за електрофореза
(види Слика 5). Откако ќе се стврдне сепарацискиот гел, се приготвува и излева апликацискиот гел.
Б) Подготовка на примероците:
Примероците се разредуваат во пуферот за примероци во однос 1:2 и се загреваат 4 min на 95ºC.
Потоа се аплицираат во бунарчињата на апликацискиот гел. На првата позиција (во првото бунарче)
секогаш се аплицира протеински маркер на големини кој претставува комерцијална смеса на
протеини со познати молекуларни маси. Маркерот ќе ни овозможи одредување на моларната маса на
непознатите протеини кои ги испитуваме.
В) Електрофореза:
Гелот со аплицирани примероци се вклопува во системот за електрофореза кој се исполнува со 10
пати разреден пуфер (Tris Glycine Native Running Buffer). Електрофорезата се изведува при
стандарден напон на струја. Додека фракциите патуваат во апликацискиот гел исправувачот се
подесува на 20 mA, а откако ќе навлезат во сепарацискиот гел на 40 mA.
Г) Боење на гелот
По електрофоретското сепарирање, визуелизацијата на протеините на гелот се врши преку боење со
протеинска боја Coomassie Briliant Blue. Гелот се потопува во затворена комора исполнета со раствор
за боење кој се состои од 0.1% Coomassie Briliant Blue во 40% метанол и 10% оцетна киселина и се
инкубира преку ноќ на собна температура. Одбојувањето се врши со раствор за одбојување кој се
состои од 30% метанол и 10% оцетна киселина.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 22
-Практична настава-
Резултат:
Коментар:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 23
-Практична настава-
ВЕЖБА 4
РЕАКЦИИ НА АГЛУТИНАЦИЈА
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 24
-Практична настава-
Тестовите на активна аглутинација се делат на тестови на брза аглутинација, кои се
изведуваат на предметни стакла и тестови на спора (класична) аглутинација кои се
изведуваат во епрувети. Тестовите на брза аглутинација се квалитативни тестови (+/-).
Одредувањето на крвните групи претставува класичен пример на брза директна
аглутинација. Се испитува присуство на аглутинат по инкубација на еритроцитите од
испитуваното лице со анти-А, анти-Б и анти-АБ серум.
Слика 10. (а) Изведба на тест на брза аглутинација; (б) негативен и позитивен
разултат.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 25
-Практична настава-
Тестовите на спора аглутинација можат да послужат за квантификација на
аглутинините во серумот. Одредувањето се врши во епрувети или микротитарски
плочи со употреба на константна количина на аглутиногени додека серумот се додава
во различни разредувања. Најчесто се работи со двојни разредувања на серумот (1:20,
1:40, 1:80…). Најголемото разредување на серумот со кое сеуште се постигнува
аглутинација го дава титарот на аглутинините. При позитивна реакција аглутинатите се
таложат на дното на епруветата а преостаната течност е бистра, при што талогот е со
нерамни рабови. При негативната реакција, содржината во епруветата има едномерно
заматување, можна е појава на талог со мазни рабови кој со протресување хомогено се
суспендира.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 26
-Практична настава-
Тестот се изведува со додавање на антиглобулински антисерум кој се врзува за Fc
фрагментот на аглутинините и доведува до појава на аглутинација на еритроцитите.
Позитивната реакција на аглутинација упатува на присуството на аглутинини во
серумот на мајката. Овие аглутинини ги опкружуваат еритроцитите на новороденчето
но без учеството на антиимуноглобулински антитела не можат да извршат
аглутинација на еритроцитите на новороденчето ин витро.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 27
-Практична настава-
ПРАКТИЧНА РАБОТА: Реакција на брза директна аглутинација (розе
бенгал тест) според протоколот на производителот.
Интерпретација на резултатите::
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 28
-Практична настава-
ВЕЖБА 5
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 29
-Практична настава-
Слика 14. Реакција на врзување на комплемент: тест систем (десно) и индикаторски
систем (лево).
Во првата фаза на тестот се изведува главната (тест) реакција на тој начин што во
серумот од пациентот, кај кого го одредуваме присуството на специфични антитела, се
додава стандарден (комерцијален) антиген и точно определена (константна) количина
на комплемент добиен од заморче (guinea pig). Серумот добиен од пациентот
претходно се инкубира 30 минути на 56C со што доаѓа до инактивација на
автологниот комплемент, поради што единствениот комплемент кој може да се
употреби во тек на реакцијата антиген-антитело која се очекува е оној кој е додаден во
текот на изведувањето на тестот.
По завршената инкубација на тест системот (30 минути на 37C) се изведува втората
фаза од тестот со додавање на индикаторскиот (хемолитичен) систем на претходната
реакција и инкубација под истите услови (30 минути на 37C). Доколку во серумот од
пациентот биле присутни антитела за испитуваниот антиген, ќе настане реакција на
образување на имунолошки комплекси помеѓу нив при што додадениот комплемент ќе
биде конзумиран (врзан). Бидејќи комплементот е исто така потребен и за
интеракцијата помеѓу овчите еритроцити и хемолизинот, додавањето на
индикаторскиот систем всушност го детектира присуството на преостанат комплемент.
Позитивна реакција (присуство на антитела во серумот на пациентот) ќе биде
детектирана како отсуство на лиза на овчите еритроцити, и обратно, негативна
реакција (отсуство на антитела во серумот на пациентот) ќе биде визуализирана како
лиза на овчите еритроцити од индикаторскиот систем.
Иако тестот на врзување на комплемент се смета за релативно едноставен тест,
неговото изведување е комплицирано и одзема многу време поради тоа што во него се
вклучени 5 варијабли. Со цел да се одреди титарот на антителата во серумот на
пациентот потребно е сите останати варијабли кои влијаат на тестот да бидат строго
контролирани. При секое изведување на тестот треба да се користи оптимална
концентрација на хемолитичкиот систем, антигенот и комплементот која се одредува
со титрација на секоја компонента посебно. На тој начин, со стандардизирање на
условите на реакцијата, секоја промена на концентрацијата на антителата ќе доведе до
промена на интензитетот на хемолиза. Титарот на антителата се одредува со правење
на сериски разредувања на серумот на пациентот, при што се забележува најголемото
разредување при кое сеуште не се јавила хемолиза (Слика 16).
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 30
-Практична настава-
Слика 15. Реакција на врзување на комплемент: изведување на тестот (а) и принцип на
одредување на титар на антитела во серум на пациент (б).
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 31
-Практична настава-
ПРАКТИЧНА РАБОТА: Изведување на реакција на врзување на
комплемент според протоколот на производителот.
Резултати:
Интерпретација на резултатите:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 32
-Практична настава-
ВЕЖБА 6
ОДРЕДУВАЊЕ И КВАНТИФИКАЦИЈА НА
РАСТВОРЛИВИ АНТИГЕНИ И АНТИТЕЛА СО МЕТОД
НА ЕЛИСА
Освен како квалитативен тест ЕЛИСА може да се користи и како квантитативен тест.
Интензитетот на обојувањето се одредува спектрофотометриски, а од добиената
вредност на апсорбанца на примерокот може да се одреди концентрацијата преку
екстраполација на стандардна крива. Титарот на антителата може да се одреди и со
правење на сериски разредувања на серумот на пациентот, при што како вредност се
зема најголемото разредување при кое сеуште се развива боја.
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 33
-Практична настава-
1. Некомпетитивна ЕЛИСА
Индиректна ЕЛИСА
Директна ЕЛИСА
Сендвич ЕЛИСА
2. Компетитивна ЕЛИСА
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 35
-Практична настава-
ПРАКТИЧНА РАБОТА: Индиректен ELISA метод за утврдување на
присуство на специфични антитела против Бруцела липополисахариден
(ЛПС) антиген
Потребни реагенси:
- Микротитарски плочи облочени со антиген на Бруцела
- 10х концентриран пуфер за промивање
- Пуфер за разредување 1
- Пуфер за разредување 2
- Позитивна и негативна контрола
- Раствор кој содржи моноклонално антитело IgG коњугирано со пероксидаза
- Реагенс за развивање на боја
- Реагенс за стопирање на реакцијата ензим-супстрат
- Дестилирана вода
Потребна апаратура:
- микротитарски читач
- центрифуга
- вортекс
- микропипетори (едноканални и мултиканални)
- наставци за микропипетори
- алуминиумска фолија за прекривање на плочите
Протокол за работа:
1. Нанеcување на примероците
2. Промивање
4. Промивање
5. Развивање на боја
6. Детекција
Ако S/P% ≤ 110% се смета дека во примерокот нема присуство специфични антитела за
Бруцела ЛПС
Ако S/P% е помеѓу 110%-120% резултатот се смета за сомнителен и треба да се
повтори
Ако S/P% ≥120% се смета дека во примерокот се присутни специфични антитела за
Бруцела ЛПС
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 37
-Практична настава-
Резултати и заклучок:
БАЗИЧНА ИМУНОЛОГИЈА 38
-Практична настава-