DIREKTNA ILI BEZ DNK EKSTRAKCIJE, AMPLIFIKACIJA I

KVANTIFIKACIJA PATOGENA IZ HRANE;

UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU

PATOGENA IZ HRANE

(Seminarski Rad)

Predmet: Tehnike molekularne biologije u sanitarnoj mikrobiologiji

Student: Mentor:
Knežević Vera Prof. dr Miroslav Petkovićić

Prijedor, maj, 2019.

Seminarski rad

SADRŽAJ

DIREKTNA ILI BEZ DNK EKSTRAKCIJE, AMPLIFIKACIJA I KVANTIFIKACIJA

PATOGENA IZ HRANE............................................................................................................3

1. UVOD.................................................................................................................................3

2. PATOGENI UZROKOVANI HRANOM...........................................................................3

3. ZAKLJUČAK.....................................................................................................................8

4. LITERATURA....................................................................................................................9

UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU PATOGENA IZ HRANE....10

1. UVOD...............................................................................................................................10

2. TEHNIKE BAZIRANE NA PCR-U.................................................................................10

3. ZAKLJUČAK...................................................................................................................16

4. LITERATURA.................................................................................................................17

Stranica 2 od 17
Seminarski rad

DIREKTNA ILI BEZ DNK EKSTRAKCIJE,

AMPLIFIKACIJA I KVANTIFIKACIJA PATOGENA IZ
HRANE

1. UVOD

Osiguravanje sigurnosti hrane trajni je izazov zbog kontinuiranog razvoja proizvodnih

razmjera i tehnika, globalizacije prehrambene industrije i želje za razvojem održive
prehrambene budućnosti. I pored poboljšanja politike upravljanja i provođenja regulatornog
standarda za garanciju sigurnosti i kvaliteta hrane, bolesti koje se prenose hranom ostaju
važan uzrok morbiditeta i smrtnosti širom svijeta i imaju značajan socioekonomski efekat.

Poboljšanje nadzora bakterijskih patogenih sojeva u prehrambenom lancu, kroz

poboljšanje metoda detekcije, identifikacije i kvantifikacije, ključno je za poboljšanje
mikrobiološkog kvaliteta hrane i na taj način osiguravanje zdravlja potrošača.

2. PATOGENI UZROKOVANI HRANOM

Patogeni uzrokovani hranom, koji uzrokuju bolesti, glavna su prijetnja javno zdravlje
širom svijeta, posebno za djecu, starije osobe i imunokompromitirane pojedince. Broj
potencijalno štetnih bakterija je veliki i specifičan za određene izvore hrane.

Listeria monocytogenes, na primjer, ima jednu od najvećih smrtnosti među

patogenima koji se prenose hranom i lako kontaminiraju mlijeko i meso. Vibrio vulnificus je
takođe prepoznat kao vodeći uzrok smrti povezanih s morskom hranom. Zaražena živina je
smatra se primarnim izvorom infekcije Campylobacter jejuni, za koju se procjenjuje da zarazi
2,4 miliona Amerikanaca godišnje. Salmonela je možda jedan od najčešćih patogena koji se
prenose hranom, 11% svih bolesti koje se prenose hranom u SAD-u.

Konvencionalne metode za detekciju ovih organizama u. \ T hrana obično zahtijeva

kulture koje oduzimaju vrijeme (koje zahtijevaju 1 do 7 dana, ovisno o bakteriji).

Stranica 3 od 17
Seminarski rad

Pristupi koji se baziraju na nukleinskoj kiselini brži su, ali se oslanjaju na

centralizovane laboratorije za izolaciju nukleinske kiseline i koncentraciju uzoraka. Sada je
dostupno nekoliko izotermnih pristupa koji se razlikuju u pristupima tipa polimeraze ili
dizajna temeljnog uzorka, a načela koja se koriste za detekciju produkta (a) amplifikacije. To
uključuje petlju-posredovanu izotermnu amplifikaciju (LAMP), inteligentnu procesnu verziju
2 (SMAP2), amplifikaciju kružnog kruga (RCA), pojačanje pojačanog kruga valjanja (RAM),
pojačanje lanca (SDA), amplifikaciju rekombinaze polimeraze (RPA), nukleinske
amplifikacije zasnovane na kiselinskoj sekvenci (NASBA) i amplifikaciji ovisnoj o helikazi
(HDA). Ove metode mogu se koristiti s različitim polimerazama uključujući Bst polimerazu
(New England Biolabs, Ipswich, MA), Bst 2.0 WarmStart ™ (New England Biolabs,
Ipswich, MA), polymer Ф 29 polimeraza (New England Biolabs, Ipswich) MA) i OmniAmp
™ (Lucigen, Middleton, WI).

Metodologije su takođe predložene za amplifikaciju patogena koji se prenose hranom

direktno u matricama hrane bez izolacije DNK. Primjeri uključuju lančanu reakciju
polimeraze (PCR) i izotermno pojačanje s petljom (LAMP). Uopšteno, za izotermne
polimeraze (kao što je Bst polimeraza) pokazalo se da su manje pod uticajem inhibitora PCR-
a, iako je izravna detekcija korištenjem PCR-a moguća korištenjem Pfu DNK polimeraze
(koja je manje pod uticajem inhibitora od drugih PCR-a). polimeraze), dodavanje goveđeg
serumskog albumina (BSA) i priprema sirovog uzorka. Osim toga, predloženi su i brzi
postupci odvajanja ili izolacije DNK, uključujući filtraciju i magnetnu izolaciju nakon čega
slijedi direktna PCR amplifikacija. Obogaćivanje bakterija u uzorcima hrane takođe je
provedeno prije direktnog pojačanja kako bi se povećala detekcija na malim količinama.

Sve otopine treba pripremiti s sterilnom vodom PCR kvaliteta. Reagensi trebaju biti
slobodni od RNaze i DNaze.

1. PCR-ocjena vode. Čuvati na sobnoj temperaturi ili 20°C.

2. 10x izotermni pufer. Pufer u koncentraciji od 10x sadrži 200 mM Tris-HCl, 100
mM (NH4) 2S04, 500 mM KCl, 20 mM MgS04, i 1% Tween® 20 pripremljen na 8.8 na 25°C.
Čuvati na -20°C.

3. 100 mM dNTP skup. Čuvati na -20°C.

4. 5 M otopina betaina. Čuvati na 2-8oC.

5. 100 mM magnezijumovog sulfata. Čuvati na 20°C.

6. Bst polimeraza 2.0WarmStart. Čuvati na -20 ° C.

7. 20 mg / ml albumina goveđeg seruma. Čuvati na -20 ° C.

8. 100 Pluronic F-68 (Invitrogen). Čuvati na sobnoj temperaturi.

9. 5 mM SYTO ™ 82 interkalacijska cijaninska boja (Invitrogen). Čuvati na -20°C.

Pripremite 500 μM otopinu za upotrebu s navedenim protokolom. Za 1000 μl otopine dodajte
100 μl 5mMSYTO ™ 82 do 900 μl vode PCR-kvaliteta. Čuvati na -20°C. 10. 25 nmol DNK

Stranica 4 od 17
Seminarski rad

oligosama. Prije prve upotrebe, prajmeri trebaju biti hidrirani do koncentracije od 100 μM.
Ukratko centrifugirajte oligo prije prvog otvaranja epruvete. Da bi se hidratizovala 25 nmol
oligo do 100 μM, u epruvetu treba dodati 250 µl vode PCR-kvaliteta. Jednom hidriran, čuvati
na -20°C. Za detekciju E. coli korišteni su prajmeri za uidA gen (sekvence dostupne u Tabeli
1).

Tabela 1: Detekcija E. Coli, sekvence

11. Uzorak za direktno pojačanje. Ovdje predstavljeni protokol koristi umnožavanje

ćelija Escherichia coli direktno u mlijeku bez obrade ili ekstrakcije DNK.

12. Real-time PCR mašina (npr., Loopamp Realtime Turbidimeter, Eiken Chemical
Company).

1. Fosfatno puferirana slana otopina (PBS). Čuvati na sobnoj temperaturi.

2. Pufirana peptonska voda (BPW).

3. 25 nmol DNK oligosaharida. Prije prve upotrebe, prajmeri trebaju biti hidrirani do
koncentracije od 100 μM. Ukratko centrifugirajte oligo prije prvog otvaranja epruvete. Da bi
se hidratizovala 25 nmol oligo do 100 μM, u epruvetu treba dodati 250 µl vode PCR-
kvaliteta. Nakon hidriranja, čuvajte na -20°C. Za detekciju salmonele, korišteni su prajmeri
za hilA, fliC, sdf i sefA gene (sekvence dostupne u Tabeli 2).

4. PCR pufer za ljudske uzorke Phusion® (Thermo Fisher Scientific). Čuvati na

-20°C.

5. Phusion® humani uzorak DNA polimeraze (Thermo Fisher Scientific). Čuvati na

-20°C.

6. Uzorak za izravno pojačanje. Ovdje predstavljeni protokol koristi uzorke svinjskog

mesa za otkrivanje salmonele.

7. Real-time PCR mašina.

Tabela 2: Detekcija Salmonele, sekvence.

Stranica 5 od 17
Seminarski rad

Prikupljanje i analiza sekvenci na osnovu ciljnog organizma i cilja prvi je korak u

razvoju testova. GenBank (www. Ncbi.nlm.nih.gov/genbank), baza DNK sekvenci koje su
javno dostupne iz Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i mnoge druge
online baze podataka su dostupne. Veze s odabranim bazama podataka navedene su u tabeli
3.

Izotermalna amplifikacija posredovana petljom (LAMP) je tehnika amplifikacije

DNK ili RNK koja koristi 6 različitih početnica koje ciljaju 8 regija duž ciljnog lanca i
polimerazu koja istiskuje lanac kao što je Bst Polymerase.

Tabela 3: Linkovi baza podataka

Primjer za LAMP je za direktno pojačanje Escherichia coli u uzorcima mlijeka. Slične

metode mogu se primijeniti za druge ciljeve i matrice hrane.

1. Smjesa 10 primera može se stvoriti i čuvati na 20°C do upotrebe. Koncentracije

zaliha za FIP i BIP trebale bi iznositi 16 μM, LF i LB 8 μM, a F3 i B3 2 μM. Za volumen od
500 μl dodajte po 80 μl FIP i BIP, po 40 μl LF i LB, te po 10 μl F3 i B3.

Stranica 6 od 17
Seminarski rad

2. A 2 Reakcijska smjesa treba stvoriti za zapreminu od 1000 μl. U centrifugu od 1,5

ml dodajte 200 μl izotermnog pufera (konačna koncentracija 2), 320 μl otopine betaina
(konačna koncentracija 1,6 M), 28 μl svakog dNTP-a (konačna koncentracija 2,8 mM), 120
μl MgS04 (konačna koncentracija 12 mM), i 248 µl vode PCR-kvaliteta.Centrifugirajte.
Čuvati na 20°C do upotrebe.

3. Za dobijanje 10 μl konačne smjese za umnožavanje upotrijebite 100 μl epruvete za

centrifugiranje ili reakcijske ploče sa 96 polja, ovisno o opremi koja se koristi za detekciju
produkata amplifikacije u stvarnom vremenu. U svako polje dodajte 5 μl 2 reakcijske smjese
(konačna koncentracija 1), 0,8 μl Bst 2,0 WarmStart, 0,4 μl 500 μM SYTO82 (konačna
koncentracija 50 μM), 1 μl 10 mješavina prajmera (konačna koncentracija 1X), 0,5 μl BSA
(konačna koncentracija 1 mg / ml), 0,4 μl Pluronica F-68 (konačna koncentracija 4), 0,25 μl
uzorka mlijeka, i 1,65 μl vode za određivanje PCR-a.

4. Inkubirajte reakcijske epruvete na 60-65°C tokom 1 h pomoću PCR mašine u

stvarnom vremenu, turbidimetra ili uređaja za određivanje mjesta upotrebe. Poželjno je da se
fluorescencija mjeri svake minute.

Sljedeći primjer služi za direktno pojačavanje salmonele u uzorcima svinjskog mesa.

Slične metode mogu se primijeniti za druge ciljeve i matrice hrane.

1. Uzorak svinjskog mesa treba najprije razrijediti dodavanjem PBS-a u omjeru 1:10
w / v.

2. Smjesa prajmera može se stvoriti i čuvati na 20°C do upotrebe. Koncentracije

zaliha prednjeg primera (F) i obrnutog primera (R) trebale bi biti po 8 μM svaka. Za
zapreminu od 100 μl dodajte 2 μl hilA prajmera, 3 μl fliCa, 1 μl sdf i 1 μl sefA i 93 μl vode
za PCR.

3. U konačnoj reakcijskoj smjesi dodajte 2 μl razrjeđenja svinjskog mesa, 1 μl

mješavinu prajmera (za konačne koncentracije: 0,2 μM za hilA, 0,3 μM fliC, 0,1 μM sdf i 0,1
μM sefA), 5 μl Pufer (za konačnu koncentraciju od 1), 0.4 U Phusion® humani uzorak DNK
polimeraze, i PCR-ocjena vode do 10 μl.

4. Inkubirati u PCR stroju u stvarnom vremenu pri 98°C tokom 2 minute, nakon čega
slijedi 38 ciklusa od: 98°C tokom 15 sekundi, 60°C tokom 15 sekundi i 72°C tokom 1
minute.

5. Amplifikacija se može potvrditi elektroforezom na gelu ili provođenjem PCR

protokola u stvarnom vremenu s interkalacijskom bojom (npr. SYBR Green I) i dodavanjem
ploče očitane u svakom ciklusu. Ako se provodi PCR Real-time, prajmeri se mogu dodati
pojedinačno umjesto svih zajedno u jednu cijev.

Stranica 7 od 17
Seminarski rad

3. ZAKLJUČAK

Korištenje direktne amplifikacije nukleinskih kiselina patogena iz matriksa hrane ima

potencijal smanjiti vrijeme do rezultata nad pristupima baziranim na ekstrakciji DNK, kao i
na pristupima koji se zasnivaju na tradicionalnoj kulturi. Ovdje sam opisala protokole za
dizajn testova i eksperimente za direktno pojačavanje patogena koji se prenose hranom u
matricama uzoraka hrane koristeći izotermičku amplifikaciju (LAMP) i lančanu reakciju
polimeraze (PCR). Navedeni primjeri uključuju otkrivanje Escherichia coli u uzorcima
mlijeka i salmonele u uzorcima svinjskog mesa. Ovaj protokol uključuje relevantne reagense
i metode, uključujući dobijanje ciljnih sekvenci, dizajn testa, obradu uzoraka i amplifikaciju.
Ove metode, iako se koriste za specifične primjere matrica, mogu se primijeniti na mnoge
druge patogene i vrste uzoraka koje se prenose hranom.

Stranica 8 od 17
Seminarski rad

4. LITERATURA

1. Va´zquez-Boland JA, Kuhn M, Berche P, Chakraborty T, Domi G, Gonza´lez-zorn

B, Wehland J (2001) Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin
Microbiol Rev 14:584–640

2. Jones MK, Oliver JD (2009) Vibrio vulnificus: disease and pathogenesis. Infect
Immun 77:1723–1733

3. Skarp CPA, H€anninen ML, Rautelin HIK (2016) Campylobacteriosis: the role of
poultry meat. Clin Microbiol Infect 22:103–109

4. Friedman CR, Neimann J, Wegener HC, Tauxe RV (2000) Epidemiology of

Campylobacter jejuni infections in the United States and other industrialized nations. In:
Nachamkin I, Blaser MJ (eds) Campylobacter, 2nd edn. ASM Press, Washington, DC

5. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones
JL, Griffin PM (2011) Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens.
Emerg Infect Dis 17:7–15

6. Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C (2015) Isothermal amplification of nucleic

acids. Chem Rev 115:12491–12545

7. Hiett KL, Cox NA, Stern NJ (2002) Direct polymerase chain reaction detection of
Campylobacter spp. in poultry hatchery samples. Avian Dis 46:219–223

8. Winters DK, O’Leary AE, Slavik MF (1997) Rapid PCR with nested primers for
direct detection of Campylobacter jejuni in chicken washes. Mol Cell Probes 11:267–271

9. Wang F, Jiang L, Ge B (2012) Loop-mediated isothermal amplification assays for

detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli in ground beef and human stools. J Clin
Microbiol 50:91–97

10. Han F, Ge B (2008) Evaluation of a loopmediated isothermal amplification assay

for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis 5:311–320

Stranica 9 od 17
Seminarski rad

UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU

PATOGENA IZ HRANE

1. UVOD

Metode utemeljene na kulturi smatraju se zlatnim standardom u mikrobiologiji hrane,

ali imaju nekoliko ograničenja kao što su dugotrajnost i do određene mjere subjektivnost.
Molekularne metode su se već dugo pokazale kao pouzdana alternativa klasičnoj
mikrobiologiji. Od različitih pristupa, najčešće je prihvaćena lančana reakcija polimeraze
(PCR), koju je razvio Kary Mullis.

2. TEHNIKE BAZIRANE NA PCR-U

Među tehnikama baziranim na PCR-u, PCR u stvarnom vremenu (Real-time) ili

kvantitativno (qPCR) omogućava mjerenje nakupljanja DNK proizvoda nakon svakog kruga
PCR amplifikacije i stoga za praćenje amplifikacije ciljnog fragmenta u isto vrijeme kao i
proizvodi se u “realnom vremenu”. qPCR, kada se usporedi s krajnjom tačkom ili
tradicionalnom PCR, osigurava veću osjetljivost, brže rezultate, zahtijeva manje rada,
smanjuje rizik od unakrsne kontaminacije i omogućuje kvantifikaciju početne ciljne DNK.

Dodatna implementacija u PCR / qPCR je razvoj multipleksnih metoda. U jednoj

reakciji moguće je otkriti, na primjer, prisutnost nekoliko patogena. Ovaj multipleksni pristup
dodatno pomaže u smanjenju radnog opterećenja laboratorije, smanjujući troškove povezane
s analizama (posebno relevantno ako se provodi jedan korak obogaćivanja uzorka), te
dopušta da se izvrši analiza visokog protoka. Multipleksna analiza ima smisla u
mikrobiologiji hrane jer mnoge namirnice mogu biti kontaminirane s više od jednog
patogena.

Predložena metodologija pokazala se kao vrlo pouzdana i sposobna detektovati niske

koncentracije bakterija (ispod 10 cfu / 25 g). Dodatna validacija u odnosu na referentne
metode (tj. ISO 6579-1: 2017 i ISO 11290-1: 2017, odnosno) prema normi ISO 16140-2:

Stranica 10 od 17
Seminarski rad

2016 omogućiće procjenu karakteristika vrste i primjene u prehrambenoj industriji i

kontrolne laboratorije.

Za istovremeni oporavak Salmonella spp. prijavljeni su različiti mediji. i L.

monocytogenes. Popis nekih od tih medija nalazi se u tabeli 4.

Tabela 4: Mediji

Za ovaj primjer odabran je mTA10, za koji je utvrđeno da je prikladan za mnoge

različite tipove hrane, osim što je prikladan za obogaćivanje drugih patogena, što bi takođe
moglo biti od interesa za druge primjene. Sastav ove smjese je: 10 g triptoze, 5 g ekstrakta
govedine, 5 g ekstrakta kvasca, 5 g NaCl, 3,4 g KH2P04, 19,3 g Na 2HP04, 1000 ml Milli-Q
vode. Krajnji pH 0.2 7,4 0,2.

Hemikalije:

1. Fosfatni pufer s Tween 20 (PBST): 155.7 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 2.97 mM

Na2HP04, 1.06 mM KH2P04, 0.5 g Tween 20, 1000 mL Milli-Q voda. Krajnji pH 0.2 7,4 0,2.

2. Tris-EDTA otopina (TE 1): 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Konačni pH 8,0 0,2.

3. Enzimatska otopina: 1 mg / ml lizozima i 1 mg / ml ahromopeptidaze, otopljena u

TE1.

4. Otopina gvanidijevog izotiocijanata (GuSCN): 4 M gvanidij izotiocijanat, 2% m / v

Tween 20, otopi se u TE1 (otopina se može zagrijati do 50°C da se pomogne otopiti
komponente).

5. Izopropanol: čist i razrijeđen (100 i 70%).

6. Prajmeri (vidi tabelu 5).

Stranica 11 od 17
Seminarski rad

7. Komponente glavnog mješavine za qPCR reakciju (vidi tabelu 6).

Tabela 5: Prajmeri i probe

Tabela 6: Priprema Multiplex qPCR Master Mixa

Stranica 12 od 17
Seminarski rad

Oprema:

1. Real-time PCR mašina u stvarnom vremenu s najmanje 3 različita kanala. U

opisanoj metodologiji korišten je Stratagene Mx3005p termocycler.

2. Centrifugirajte s rasponom brzine od 380 do 16,000 g. Takođe mora imati rotor

prikladan za cijevi od 1,5–2 ml.

3. Stomacher® ili drugi tip homogenizatora uzorka (npr. Smasher®), s kompatibilnim

filter vrećicama.

4. Thermomixer (suha kupka) koji se može tresti i grijati. U opisanoj metodologiji

korišten je Thermomixer 5436.

5. Skala pogodna za raspon težine od 25 g do 2 kg.

Metode:

Obogaćivanje uzorka

1. Težina X g uzorka (tipično 25 g) u sterilnoj vrećici (vrećice s filterom su poželjne

da se reduciraju čestice hrane u alikvotima za analizu) i dodaju 9 mL diluenta (tj. 225 mL).
Prijavljeni su i drugi pristupi za ovaj korak.

2. Homogenizujte matricu 30-120 s u laboratorijskom homogenizatoru (tj.

Stomacher).

3. Inkubirajte smjesu na temperaturi od 35°C najmanje 24 sata (u vremenu inkubacije

nije prošireno štetno djelovanje na vrstu metode).

4. Nakon inkubacije, uzmite alikvot (1-2 mL) za ekstrakciju DNK.

Ekstrakcija DNK

1. Centrifugirajte uzorke na 380 g (2000 okr / min) tokom 2 minute kako biste
uklonili ostatke hrane koje filter ne zadržava u vrećici za homogenizaciju.

2. Prenesite supernatant u čistu epruvetu i centrifugirajte na 16,000 g (13,000 rpm) 5

minuta.

3. Uklonite supernatant, resuspendirajte bakterijsku kuglicu u 1 ml PBST-a i ponovno

centrifugirajte u istim uslovima.

4. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 200 μL enzimske otopine (vidi

napomenu 5) i inkubirajte na 37°C tokom 1 h i konstantno miješanje (1000 rpm).

5. Nakon enzimske lize, dodati 300 μL GuSCN-a i miješati snažno (može se koristiti
vrtlog). Prenesite 400 µL u epruvetu koja sadrži 400 μL 100% izopropanola. Centrifugirajte
na 16,000 g (13,000 obrtaja u minuti) tokom 10 minuta.

Stranica 13 od 17
Seminarski rad

6. Uklonite supernatant i isperite talog s 1 ml izopropanola 70%. Ako se radi pažljivo,

nema potrebe za centrifugom. Ako je talog resuspendiran, ponovite centrifugiranje kao što je
spomenuto u prethodnom koraku.

7. Uklonite 70% izopropanola i resuspendirajte talog u 160 μL sterilne Milli-Q vode.

U ovom koraku stavite uzorak u termo mješalicu na 70°C, uz miješanje na 1400 obrtaja u
minuti tokom 3 min.

8. Konačno, uzorak centrifugirajte na 16,000 g (13,000 rpm) 5 minuta, na 4°C.

Prenesite supernatant koji sadrži DNK u čistu epruvetu.

9. Za kratkoročno skladištenje uzorci DNK mogu se čuvati u hladnjaku (4°C). Ako se

očekuje da će se uzorci skladištiti dugo vremena prije nego što se provedu analize,
preporučuje se zamrzavanje (20°C).

Multiplex qPCR

1. Otkrivanje Salmonella spp. može se izvesti ciljanjem invA gena s početnicama i

sondom koju su dizajnirali Cheng et al.. Što se tiče detekcije L. monocytogenes, prajmeri
koje je dizajnirao Simon et al., S probe dizajniranog od Rossmanith et al., Koje se mogu
koristiti prfA. Konačno, IAC koji je osmislio Calvo´ et al. uključen je u multipleks sustav
kako bi odbacio lažno negativne rezultate zbog inhibicije reakcije.

2. Pripremiti reakcijsku smjesu. Pripremiti dovoljno master mješavine za analizu

svakog uzorka, barem u duplikatu (tehničke duplikate), kao i pozitivnu i negativnu kontrolu.
Preporučljivo je uvijek pripremiti neki višak, tj. 1 dodatnu reakciju.

Stratagene Mx3005p termocycler je korišten za ovaj postupak, ali i drugi termocikleri

koji su sposobni detektirati tri različite fluorofore su takođe dostupni na tržištu. Primijetite da
korak “aktivacije” ili “vrućeg starta” može varirati od jednog Master Mixa do drugog, u
smislu temperature i trajanja koraka.

4. Ova metodologija pokazala se pouzdanom kada su niski nivoi (<10 cfu / 25 g) oba
cilja ubačene u pred-obogaćeni bujon. Čak i kod tako niske početne koncentracije bakterija
očekuje se da vrijednosti Cq za pozitivne uzorke budu ispod 35.

5. Negativni uzorci će imati vrijednost “No Cq” za ciljeve, invA i / ili prfA, dok su
pozitivni za IAC. Očekuje se da pozitivni uzorci imaju Cq vrijednost nižu od 35 za ciljne
gene i mogu biti negativni za IAC. Ako nema pojačanja za ciljne gene kao i za IAC, tada se
uzorak mora ponovno analizirati.

6. Ako se veliki broj uzoraka pokreće zajedno i iscrtava u konvencionalnom

linearnom pojačanju, može doći do stvarnog uvida tačaka prijelaza. U ovoj situaciji,
promjena formata crtanja u logaritamski je lakši način za vidjeti date vrijednosti, kao što je
prikazano na slici 1b.

Stranica 14 od 17
Seminarski rad

7. Opisana je metodologija prikladna za otkrivanje većeg broja patogenih

mikroorganizama u različitim namirnicama. U tom smislu, glavno ograničenje se oslanja na
broj fluorofora koji se mogu detektovati korištenjem PCC termo-ciklera u realnom vremenu.

Na primjer, opisano je da je mTA10 prikladan za obogaćivanje Shigella spp. i E. coli

O157, ali pri pokušaju njihove detekcije, u kombinaciji sa Salmonella spp., L.
monocytogenes i IAC, bio bi potreban termocycler sposoban razlikovati 5 fluorofora.
Moguće rješenje bilo bi označiti fluorescentne sonde Shigella spp. i E. coli O157 s istim
fluoroforom. Za ova dva mikroorganizma, qPCR bi bio samo alat za probiranje. U slučaju
pozitivnog signala to će značiti prisutnost Shigella spp. / E. coli O157, i drugi qPCR bi se
trebalo napraviti kako bi se otkrilo koji je od 2 patogena prisutan u uzorku.

Stranica 15 od 17
Seminarski rad

3. ZAKLJUČAK

Dakle, bolje dešifriranje ekologije patogena koji se prenose hranom i bakterijskih

strategija razvijenih kao odgovor na uslove proizvodnje hrane od uzgajališta do tanjira,
apsolutno je potrebno kako bi se dobila realna vizija rizika i razvilo učinkovito upravljanje
sigurnošću hrane kroz pristup zdravlja. Nedavno su nevjerovatna poboljšanja analitičkih
metoda i tehnologija molekularne biologije, kao što su sekvenciranje sljedeće generacije
(NGS), omogućila pristup novim i vrijednim podacima i omogućila razvoj originalnih
integrativnih pristupa koji hranju holističku viziju u toj perspektivi.

Stranica 16 od 17
Seminarski rad

4. LITERATURA

1. Jadhav S, Bhave M, Palombo EA (2012) Methods used for the detection and
subtyping of Listeria monocytogenes. J Microbiol Methods 88:327

2. Rohde A, Hammerl JA, Boone I et al (2017) Overview of validated alternative

methods for the detection of foodborne bacterial pathogens. Trends Food Sci Technol
62:113–118

3. Saiki RK, Scharf S, Faloona F et al (1985) Enzymatic amplification of Beta-globin

genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science
230:1350–1354

4. Mullis K, Faloona F et al (1986) Specific enzymatic amplification of DNA In vitro-

the polymerase chain-reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51:263–273

5. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS et al (1992) Simultaneous amplification and

detection of specific DNA-sequences. Biotechnology (N Y) 10:413–417

6. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G et al (1993) Kinetic PCR analysis—real-time

monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 11:1026–1030

7. Postollec F, Falentin H, Pavan S et al (2011) Recent advances in quantitative PCR

(qPCR) applications in food microbiology. Food Microbiol 28:848–861

8. Kim HC, Bhunia AK (2008) SEL, a selective enrichment broth for simultaneous
growth of Salmonella enterica, Escherichia coli O157: H7, and Listeria monocytogenes. Appl
Environ Microbiol 74:4853–4866

9. Chapela M, Garrido-Maestu A, Cabado AG (2015) Detection of foodborne

pathogens by qPCR: a practical approach for food industry applications. Cogent Food Agric
1:1–19

10. Ruiz-Rueda O, Soler M, Calvo L (2010) Multiplex real-time PCR for the
simultaneous detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in food samples. Food
Anal Methods 4:131–138.

Stranica 17 od 17