UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR

METODE ZA DETEKCIJU PATOGENA

IZ HRANE

Vera Knežević
UVOD
• Metode utemeljene na kulturi smatraju se zlatnim standardom u mikrobiologiji hrane, ali
imaju nekoliko ograničenja kao što su dugotrajnost i do određene mjere subjektivnost.
Molekularne metode su se već dugo pokazale kao pouzdana alternativa klasičnoj
mikrobiologiji. Od različitih pristupa, najčešće je prihvaćena lančana reakcija polimeraze
(PCR), koju je razvio Kary Mullis.
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Među tehnikama baziranim na PCR-u, PCR u stvarnom vremenu (Real-time) ili kvantitativno (qPCR)
omogućava mjerenje nakupljanja DNK proizvoda nakon svakog kruga PCR amplifikacije i stoga za
praćenje amplifikacije ciljnog fragmenta u isto vrijeme kao i proizvodi se u “realnom vremenu”. qPCR,
kada se usporedi s krajnjom tačkom ili tradicionalnom PCR, osigurava veću osjetljivost, brže rezultate,
zahtijeva manje rada, smanjuje rizik od unakrsne kontaminacije i omogućuje kvantifikaciju početne ciljne
DNK.
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Predložena metodologija pokazala se kao vrlo pouzdana i sposobna detektovati niske koncentracije
bakterija (ispod 10 cfu / 25 g). Dodatna validacija u odnosu na referentne metode (tj. ISO 6579-1: 2017 i
ISO 11290-1: 2017, odnosno) prema normi ISO 16140-2: 2016 omogućiće procjenu karakteristika vrste i
primjene u prehrambenoj industriji i kontrolne laboratorije.
• Za istovremeni oporavak Salmonella spp. prijavljeni su različiti mediji. i L. monocytogenes. Popis nekih od
tih medija nalazi se u tabeli 4.
Različiti mediji
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Za ovaj primjer odabran je mTA10, za koji je utvrđeno da je prikladan za mnoge različite tipove hrane,
osim što je prikladan za obogaćivanje drugih patogena, što bi takođe moglo biti od interesa za druge
primjene. Sastav ove smjese je: 10 g triptoze, 5 g ekstrakta govedine, 5 g ekstrakta kvasca, 5 g NaCl, 3,4 g
KH2P04, 19,3 g Na2HP04, 1000 ml Milli-Q vode. Krajnji pH 0.2 7,4 0,2.
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Hemikalije:
• 1. Fosfatni pufer s Tween 20 (PBST): 155.7 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 2.97 mM Na2HP04, 1.06 mM KH2P04,
0.5 g Tween 20, 1000 mL Milli-Q voda. Krajnji pH 0.2 7,4 0,2.
• 2. Tris-EDTA otopina (TE 1): 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Konačni pH 8,0 0,2.
• 3. Enzimatska otopina: 1 mg / ml lizozima i 1 mg / ml ahromopeptidaze, otopljena u TE1.
• 4. Otopina gvanidijevog izotiocijanata (GuSCN): 4 M gvanidij izotiocijanat, 2% m / v Tween 20, otopi se u
TE1 (otopina se može zagrijati do 50°C da se pomogne otopiti komponente).
• 5. Izopropanol: čist i razrijeđen (100 i 70%).
• 6. Prajmeri (vidi tabelu 5).
• 7. Komponente glavnog mješavine za qPCR reakciju (vidi tabelu 6).
Prajmeri i probe / Priprema Multiplex qPCR
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Oprema:
• 1. Real-time PCR mašina u stvarnom vremenu s najmanje 3 različita kanala. U opisanoj metodologiji
korišten je Stratagene Mx3005p termocycler.
• 2. Centrifugirajte s rasponom brzine od 380 do 16,000 g. Takođe mora imati rotor prikladan za cijevi od
1,5–2 ml.
• 3. Stomacher® ili drugi tip homogenizatora uzorka (npr. Smasher®), s kompatibilnim filter vrećicama.
• 4. Thermomixer (suha kupka) koji se može tresti i grijati. U opisanoj metodologiji korišten je
Thermomixer 5436.
• 5. Skala pogodna za raspon težine od 25 g do 2 kg.
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Obogaćivanje uzorka
• 1. Težina X g uzorka (tipično 25 g) u sterilnoj vrećici (vrećice s filterom su poželjne da se reduciraju čestice
hrane u alikvotima za analizu) i dodaju 9 mL diluenta (tj. 225 mL). Prijavljeni su i drugi pristupi za ovaj
korak.
• 2. Homogenizujte matricu 30-120 s u laboratorijskom homogenizatoru (tj. Stomacher).
• 3. Inkubirajte smjesu na temperaturi od 35°C najmanje 24 sata (u vremenu inkubacije nije prošireno
štetno djelovanje na vrstu metode).
• 4. Nakon inkubacije, uzmite alikvot (1-2 mL) za ekstrakciju DNK.
UPOTREBA VIŠESTRUKE PCR METODE ZA DETEKCIJU
PATOGENA IZ HRANE
• Ekstrakcija DNK
• 1. Centrifugirajte uzorke na 380 g (2000 okr / min) tokom 2 minute kako biste uklonili ostatke hrane koje filter
ne zadržava u vrećici za homogenizaciju.
• 2. Prenesite supernatant u čistu epruvetu i centrifugirajte na 16,000 g (13,000 rpm) 5 minuta.
• 3. Uklonite supernatant, resuspendirajte bakterijsku kuglicu u 1 ml PBST-a i ponovno centrifugirajte u istim
uslovima.
• 4. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 200 μL enzimske otopine (vidi napomenu 5) i inkubirajte na
37°C tokom 1 h i konstantno miješanje (1000 rpm).
• 5. Nakon enzimske lize, dodati 300 μL GuSCN-a i miješati snažno (može se koristiti vrtlog). Prenesite 400 µL u
epruvetu koja sadrži 400 μL 100% izopropanola. Centrifugirajte na 16,000 g (13,000 obrtaja u minuti) tokom 10
minuta.
• 6. Uklonite supernatant i isperite talog s 1 ml izopropanola 70%. Ako se radi pažljivo, nema potrebe za
centrifugom. Ako je talog resuspendiran, ponovite centrifugiranje kao što je spomenuto u prethodnom koraku.
• 7. Uklonite 70% izopropanola i resuspendirajte talog u 160 μL sterilne Milli-Q vode. U ovom koraku stavite
uzorak u termo mješalicu na 70°C, uz miješanje na 1400 obrtaja u minuti tokom 3 min.
• 8. Konačno, uzorak centrifugirajte na 16,000 g (13,000 rpm) 5 minuta, na 4°C. Prenesite supernatant koji sadrži
DNK u čistu epruvetu.
• 9. Za kratkoročno skladištenje uzorci DNK mogu se čuvati u hladnjaku (4°C). Ako se očekuje da će se uzorci
skladištiti dugo vremena prije nego što se provedu analize, preporučuje se zamrzavanje (20°C).
ZAKLJUČAK
• Dakle, bolje dešifriranje ekologije patogena koji se prenose hranom i bakterijskih strategija razvijenih kao
odgovor na uslove proizvodnje hrane od uzgajališta do tanjira, apsolutno je potrebno kako bi se dobila
realna vizija rizika i razvilo učinkovito upravljanje sigurnošću hrane kroz pristup zdravlja. Nedavno su
nevjerovatna poboljšanja analitičkih metoda i tehnologija molekularne biologije, kao što su
sekvenciranje sljedeće generacije (NGS), omogućila pristup novim i vrijednim podacima i omogućila
razvoj originalnih integrativnih pristupa koji hranju holističku viziju u toj perspektivi.
HVALA NA PAŽNJI!