KHOA DƯỢC - ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN VI KÝ SINH
NGUYÊN TẮC
 Enzym amylase:
TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINATE  Ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y dược...
 Amylase được sử dụng trong y học để sản xuất glucose làm dịch
tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá
dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc.
 Amylase có thể thu nhận từ động vật, vi sinh vật và thực vật 
enzym để có thể ứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh
chế từ enzym thô.

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 2

Nguyên tắc NỘI DUNG CÔNG VIỆC

 Alginate: (1,4)- β-D-mannuronate (M)  Thu enzym amylase từ khoai lang
và α-L-guluronate (G)
 Gel Ca-alginate giúp tách enzyme ra  Tinh chế amylase bằng alginate
khỏi dung dịch
 Xác định hoạt lực và lượng protein của enzyme thu được
 Amylase không phân hủy alginate

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 3 Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 4
 BỐ TRÍ THỰC HÀNH Tinh chế amylase từ khoai lang
 Thực hiện bước 4, mục 4.4.2.2 để thu enzym tinh chế
của nhóm trước
Thêm 10 ml
 Tiến hành tinh chế enzym bước 1-3, mục 4.4.2.2, nộp Alginate dịch khoai
30 ml lang Úp ngửa 10 lần Cho vào becher
sản phẩm tinh chế cho GV.
Ủ 45 phút, úp
 Xác định hàm lượng protein của enzym thô và enzym ngửa 5 lần mỗi 5
tinh chế, mục 4.5 phút

 Xác định hoạt tính của enzym thô và enzym tinh chế,
Lọc glucose Lọc
mục 4.6. Cho từ từ lấy 2% lọc bỏ
20 ml tủa 20 ml tủa Amylase
CaCl2 tinh chế
0,7M, 4oC
khuấy đều trong
12 giờ

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 5 Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 6

Xác định hàm lượng protein bằng OD 280
 Lấy 2 eppendorf chứa 1,5 ml enzym thô và 1,5 ml enzym tinh chế, ly
tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau ly tâm: enzym thô pha loãng
20 lần với đệm phosphat, enzym tinh chế không pha loãng.
 Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm (A<2,5), nếu A>2,5, pha loãng
thêm 10 lần.
 Tính tổng lượng protein trong mẫu như sau:
 Lượng Protein (A280nm) = OD280 x V (ml), với enzym thô có thể
tích V=10 ml, enzym tinh chế V=Vtinh chế.
Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Heinkel
 Nguyên tắc
 Xác định hoạt độ của amylase thông qua lượng tinh
bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm
cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch
Iode.
Đơn vị hoạt độ là lượng enzym có khả năng phân giải 1
mg tinh bột sau 15 phút ở 30oC

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 7 Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 8
 Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Heinkel Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Heinkel

 Tiến hành  Lập đồ thị chuẩn

 Đối với enzym thô: pha loãng 100 lần với đệm phosphat.
Ống thử nghiệm 0 1 2 3 4 5
 Đối với enzym tinh chế pha loãng 10 lần với đệm phosphat.
 Xác định hoạt tính của enzyme thô và enzym tinh chế, mỗi mẫu Tinh bột 1% (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
thực hiện trên 2 eppendorf: ống thử và ống chứng. Nước cất 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Ống thử Ống chứng
Hút 0,1 ml từ các ống sang eppendorf mới
Tinh bột 1% (ml) 0,1 0,1
A. sulfosalicylic 20% 0 0,5 Dung dịch đệm 0,4
0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Đệm phosphat (ml) 0,3 0,3 (ml)
Enzym (ml) 0,1 0,1 A.sulfosalicylic 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
Hút 0,1 ml từ các ống sang eppendorf mới
A.sulfosalicylic 20% 0,5 0
Hút 0,1 ml từ các ống sang eppendorf mới TT Iode 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9
TT Iode 0,9 0,9
Đo OD 560 nm
Đo OD 560 nm

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 9 Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 10

Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Heinkel Thu thập kết quả
 Tính hiệu số số đọc được trên máy giữa mẫu chứng và mẫu thử.  Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
 OD = ODC - ODT.
Ống 1 2 3 4 5
 Từ OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột bị thủy phân U/ml 0,2 0,4 0,6 0,8 1
tương ứng, từ đó tính hoạt tính của enzym (HTE)
OD
 Hoạt tính chung của enzym thô: HTCenzym thô = HTE x N x Venzym thô
 Hoạt tính chung cue enzym tinh: HTCenzym tinh = HTE x N x Vtinh chế.  Thông số qui trình tinh chế
(N: hệ số pha loãng của enzym)
 Hoạt tính riêng của enzym: HTR = HTC/lượng protein (U/A280nm) Tổng Tổng Hoạt Hoạt tính Hiệu Mức tinh
 Hiệu suất cố định: HS = HTCenzym tinh/HTCenzym thô Thông số qui protein tính (U) riêng suất (%) chế (lần)
trình tinh chế (A280nm) (U/A280nm)
 Mức tính chế: HTRenzym tinh/HTRenzym thô.
Enzym thô
Enzym tinh chế

Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 11 Thực hành Công nghệ sinh học Dược Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. HCM 12