Giám sát

Vi sinh môi trường trong

sản xuất Dược phẩm

Bộ môn Vi Ký sinh
Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM
Mục tiêu
• Trình bày được ý nghĩa và vai trò của giám sát vi sinh
trong môi trường sản xuất dược phẩm
• Trình bày được các yếu tố ảnh hưởng lên thiết lập mức
độ giám sát vi sinh môi trường
• Liệt kê các cấp độ sạch trong sản xuất dược phẩm vô
trùng
• Liệt kê các phương pháp lấy mẫu giám sát vi sinh môi
trường
• Trình bày được nguyên tắc, ưu nhược điểm của
phương pháp lấy mẫu giám sát vi sinh môi trường
• Biết cách lựa chọn phương pháp lấy mẫu giám sát vi
sinh môi trường phù hợp
Một số tài liệu tham khảo về giám sát vi sinh môi trường
Có nhiều hướng dẫn về giám sát vi sinh môi trường phần lớn được quy định
cho sản xuất các dược phẩm vô trùng:
• ISO 14644: Phòng sạch và kiểm soát môi trường liên quan đến phòng sạch
• Các bộ hướng dẫn tốt thực hành sản xuất dược phẩm (Good Manufacturing
Pratice – GMP):
• WHO GMP – phụ lục 6
• EU/PICs/TGA cGMP phụ lục 1
• Hướng dẫn của FDA cGMP
• Chuyên luận <1116> Dược điển Mỹ

Rất ít hướng dẫn cụ thể về giám sát vi sinh môi trường quy định cho sản xuất
các dược phẩm không vô trùng, một số khuyến cáo có thể tham khảo trong:
• Chuyên luận <1115> Dược điển Mỹ
 Vai trò của giám sát vi sinh
trong môi trường sản xuất
• Vi sinh vật trong dược phẩm có thể gây hư
hỏng hoạt chất, làm giảm hoặc mất hiệu quả
của thuốc, thậm chí, có khả năng ảnh hưởng
xấu lên sức khoẻ của người bệnh. Kiểm soát
mức độ nhiễm vi sinh vật trong dược phẩm là
một trong những quy định bắt buộc để đảm
bảo tính an toàn, hiệu quả của dược phẩm.
Mức độ kiểm soát ngoại nhiễm vi sinh vật trong
dược phẩm tùy thuộc vào dạng bào chế, đường
sử dụng và đối tượng bệnh nhân. Có 2 loại:
• Nhóm dược phẩm vô trùng: là các dược phẩm
không được phép có mặt của vi sinh vật kể cả
các mầm sống (bào tử).
• Nhóm dược phẩm không vô trùng: là các dược
phẩm được phép chứa vi sinh vật trong mức
giới hạn (số lượng, chủng loài).
Các yếu tố gây ngoại nhiễm trong quá trình sản xuất dược phẩm

Ngoại nhiễm vi sinh vật có nguy cơ xảy ra ở mọi giai đoạn trong quá trình sản xuất. Việc chỉ
kiểm soát và giám sát vi sinh vật trong sản phẩm cuối là không đủ để đảm bảo giới hạn
nhiễm khuẩn/độ vô khuẩn của dược phẩm đạt được theo quy định
Þ Giám sát vi sinh môi trường là hoạt động cần được diễn ra tại mọi giai đoạn và yếu tố
cấu thành nên quá trình sản xuất dược phẩm
Vai trò của giám sát vi sinh môi trường
Giám sát vi sinh môi trường là một phần quan trọng của
Giám sát môi trường sản xuất, là công cụ để:
• Đánh giá mức độ hiệu quả của các biện pháp kiểm soát
và xử lý vi sinh vật trong môi trường
• Giúp đưa ra quyết định có hay không việc cho xuất
xưởng các lô sản phẩm khi kết quả giám sát môi
trường không được đảm bảo
• Giúp đưa ra các cảnh báo và quyết định hành động dựa
trên vào phân tích trạng thái và chiều hướng thay đổi
trạng thái của môi trường sản xuất
• Giảm nguy cơ ngoại nhiễm trong các lô sản phẩm trong
tương lai nhờ các hành động điều chỉnh trong kiểm
soát môi trường

Vị trí của giám sát môi trường trong kiểm

soát môi trường sản xuất dược phẩm
Mức độ giám sát vi sinh môi trường
Một chương trình giám sát vi sinh môi trường bao gồm các thông số:
• Phương pháp lấy mẫu, phục hồi và xác định vi sinh vật
• Vị trí lấy mẫu
• Số lượng mẫu cần lấy và thời điểm lấy mẫu
• Tần suất lấy mẫu
• Định nghĩa về giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động
ÞMức độ giám sát vi sinh được thiết lập dựa trên việc xác định các thông số trên

Các yếu tố cấu thành khác bao gồm

• Nhân sự và đào tạo nhân sự: lấy mẫu, kiểm nghiệm và phân tích kết quả
• Thiết bị, máy móc và dụng cụ hỗ trợ
• Hồ sơ, sổ sách liên quan
Thiết lập mức độ giám sát vi sinh môi trường
• Mức độ giám sát vi sinh môi trường sản xuất Sản xuất dược phẩm Sản xuất dược phẩm
Đặc điểm
được xác định dựa trên yêu cầu về mức độ vô trùng không vô trùng
kiểm soát trong môi trường sản xuất cụ thể. Tiến trình Tiệt trùng sản phẩm Môi trường sản xuất có
• Không phải quá trình sản xuất dược phẩm sản xuất cuối/ Sản xuất vô trùng kiểm soát
nào cũng cần thiết lập một mức độ kiểm soát Mức độ Vô cùng chặt chẽ
và giám sát như nhau Vừa đủ. Không quy định
kiểm soát ISO 5 (ISO) hoặc cấp
cấp phòng sạch
Chẳng hạn: môi trường sạch A (GMP) trở lên
Được phép có vi sinh
• Mức kiểm soát và giám sát vi sinh môi trường
Mức kiểm vật trong giới hạn quy
trong sản xuất dược phẩm vô trùng phải ở soát vi sinh
Vô trùng (không có sự
định
mức độ cao và nghiêm ngặt hơn so với môi hiện diện của vi khuẩn,
vật trong Không được có mặt
trường sản xuất dược phẩm không vô trùng nấm men và mốc)
sản phẩm một số vi sinh vật gây
• Việc thiết lập kiểm soát quá mức cần thiết bệnh
gây phức tạp quá trình sản xuất, gia tăng chi Thuốc tiêm, tiêm truyền,
Loại dược Thuốc đường uống, sản
phí sản xuất và giá thành sản phẩm mà sự gia phẩm
sản phẩm sử dụng trên
phẩm dùng ngoài...
tăng chất lượng không đáng kể niêm mạc hở
Thiết lập mức độ giám sát vi sinh môi trường
• Thậm chí, trong sản xuất các dược phẩm vô trùng, mức độ kiểm soát và giám sát môi trường trong mỗi giai
đoạn sản xuất cũng không giống nhau. Sự kiểm soát và giám sát được thiết lập ở mức độ cao ở các giai đoạn
trọng yếu (chiết rót, nạp mẫu, đóng gói cấp 1, các giai đoạn phối trộn, khu vực có công nhân vận hành…)
nhưng có thể giảm xuống ở mức độ thấp hơn ở các công đoạn khác (đóng gói cấp 2, các khu vực lưu trữ...)
• Vì vậy, việc thiết lập mức độ giám sát vi sinh môi trường cần dựa trên phân tích rủi ro về ngoại nhiễm trong
các giai đoạn sản xuất.

Biểu đồ xương cá
biểu diễn các yếu
tố gây ngoại
nhiễm trong quá
trình sản xuất
dược phẩm
Các khu vực sạch (phòng sạch) trong sản xuất dược phẩm
• Các khu vực sạch trong sản xuất dược phẩm được phân loại dựa trên số lượng
tiểu phân bụi trong không khí. Theo ISO 14644 hoặc các GMP (bộ hướng dẫn
thực hành sản xuất thuốc)

Cấp độ sạch Hàm lượng tối đa các hạt trong 1 m3 không khí
Không hoạt động Hoạt động
ISO 14644 GMP-WHO
≥ 0,5 µm ≥ 5 µm ≥ 0,5 µm ≥ 5 µm
ISO 5 A 3520 20 3520 20
ISO 7 B 3520 29 352000 2900
ISO 8 C 352000 2900 3520000 29000
- D 3520000 29000 - -
Tại sao phải kiểm soát số lượng tiểu phân trong không khí?
• Tiểu phân trong môi trường sản xuất có nguồn gốc từ:
• Bụi và các hạt lơ lửng trong không khí
• Tiểu phân, giọt bắn từ cơ thể công nhân, người vận hành
• Bụi kim loại từ máy móc, thiết bị khi vận hành
• Tiểu phân thuốc, nguyên liệu, bán thành phẩm thôi ra trong quá trình sản
xuất
...

• Sự có mặt của các tiểu phân gây ô nhiễm chéo trong quá trình sản xuất, làm
thay đổi cảm quan và hoặc không đạt chỉ tiêu về tạp chất trong dược phẩm

• Các tiểu phân còn là nguồn mang vi sinh vật gây ngoại nhiễm và sản phẩm (bụi
trong không khí, tiểu phân từ người...)
Các khu vực sạch (phòng sạch) trong sản xuất dược phẩm
• Các khu vực sạch trong sản xuất dược phẩm được phân loại dựa trên số lượng
tiểu phân bụi trong không khí. Theo ISO 14644 hoặc các GMP (bộ hướng dẫn
thực hành tốt sản xuất thuốc)
Cấp độ sạch Hàm lượng tối đa các hạt trong 1 m3 không khí
Không hoạt động Hoạt động
ISO 14644 GMP FED STD 209E
≥ 0,5 µm ≥ 5 µm ≥ 0,5 µm ≥ 5 µm
ISO 5 A Class 100 3520 20 3520 20
ISO 7 B Class 10,000 3520 29 352000 2900

ISO 8 C Class 100,000 352000 2900 3520000 29000

- D 3520000 29000 - -

- Cấp A:Khu vực cục bộ cho các thao tác có nguy cơ cao, như đóng lọ và làm kín vô trùng
(đóng gói cấp 1)
- Cấp B: Môi trường phụ cận cho khu vực cấp độ A
- Cấp độ C và D: Khu vực sạch để thực hiện các công đoạn ít quan trọng hơn
Các khu vực sạch (phòng sạch) trong sản xuất dược phẩm
• Từ đó, các giới hạn kiểm soát (của mức độ giám sát vi sinh môi trường) được
thiết lập tương ứng
Tiêu chuẩn Giới hạn vi khuẩn trong Tỷ lệ hồi phục vi sinh vật (%)
(cấp kiểm soát) không khí (USP <1116>)

ISO GMP Lắng bụi Hút bụi Lắng bụi (90mm) Hút bụi chủ
14644 WHO (90mm) chủ động trong 4 giờ động
2010 CFU/4 giờ CFU/m3
> ISO 5 Isolator - - < 0.1 < 0.1

ISO 5 A <1 <1 <1 <1

ISO 6 - 3 7 <3 <3
ISO 7 B 5 10 <5 <5
ISO 8 C 50 100 < 10 < 10
- D 100 200 - -
Các khu vực sạch (phòng sạch) trong sản xuất dược phẩm
• Và, tần suất thực hiện lấy mẫu giám sát vi sinh môi trường được thiết lập tương ứng với các
cấp độ kiểm soát của môi trường

Cấp độ Phương pháp giám sát

kiểm Hút bụi chủ
soát Lắng bụi Đĩa tiếp xúc In dấu găng tay
động
1 lần/phiên làm 1 lần/phiên làm 1 lần/phiên làm 1 lần/phiên làm
A
việc việc việc việc
B Hằng ngày Hằng ngày Hằng ngày Hằng ngày

C Hằng tuần Hằng tuần Hằng tuần Không quy định

D Hàng tháng Hàng tháng Không quy định Không quy định
Các khu vực sạch (phòng sạch) trong sản xuất dược phẩm
Vị trí lấy mẫu giám sát vi sinh môi trường cần dựa trên phân tích rủi ro về nguy
cơ ngoại nhiễm như:
• Vị trí tiệm cận với khu vực sản xuất trọng yếu (chiết rót, phối trộn, đóng gói
cấp 1)...
• Nơi có sự thay đổi/ khác thường về lưu tính của không khí như: các khu vực có
lưu lượng khí lưu thông ít (ở các góc phòng) hoặc nhiều (gần các cửa ra vào,
khu vực nơi có nhân viên vận hành, vị trí các chốt gió, nơi chuyển tiếp giữa các
khu vực sạch...)
• Nơi có nguy cơ cao về khả năng phát triển của vi sinh vật: tụ ẩm, nơi có hiệu
quả kém của các phương pháp kiểm soát vi sinh vật, nơi có nguy cơ cao tồn
đọng vết dung môi, môi trường...
• Vị trí lấy mẫu cũng cần được xem xét thêm về các nguy cơ có thể gây ngoại
nhiễm thứ cấp vào quá trình sản xuất: ví dụ lấy mẫu quá gần nơi sản xuất
trọng yếu có thể gây ngoại nhiễm từ người lấy mẫu vào sản phẩm
Ví dụ - Phân tích rủi ro trong dây chuyền sản xuất dược phẩm vô trùng

Initial bioburden
Các nguyên tắc trong giám sát vi sinh môi trường
• Giám sát vi sinh môi trường bao gồm lấy mẫu, đánh giá số lượng (đếm sống)
và định danh vi sinh vật có trong đó.
• Các loại mẫu phải thu thập để kiểm tra gồm:
• Không khí trong các khu vực sạch
• Các bề mặt trong phòng sạch (tường, nền nhà, các khu vực làm việc)
• Bề mặt thiết bị (mặt bên ngoài, các bộ phận tiếp xúc trực tiếp với dược phẩm)
• Dụng cụ và trang phục bảo hộ của công nhân vận hành.
• Các phương pháp phát hiện sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường dựa
trên khả năng hồi phục (khả năng mọc) của vi sinh vật trên đĩa môi trường
thích hợp.
• Ngoài ra, kiểm tra hiệu quả của các chất tẩy rửa và chất sát khuẩn sử dụng để
vệ sinh phòng sạch cũng là một trong những công việc cần thực hiện trong
giám sát vi sinh môi trường.
Các nguyên tắc trong giám sát vi sinh môi trường
• Định danh vi sinh vật trong môi trường sản xuất được thực hiện sau khi hồi
phục và phân lập được vi sinh vật từ môi trường.
• Việc định danh vi sinh vật giúp ích cho việc xác định được nguồn gây ô nhiễm,
tính nhạy cảm với các tác nhân tẩy trùng và biện pháp khử trùng, từ đó giúp
lên giải pháp kiểm soát và khắc phục.
• Việc định danh vi sinh vật có thể ở nhiều mức độ như:
• Định danh đến loài (theo phương pháp kiểu hình hoặc kiểu gen) đối với sản xuất các
dược phẩm vô trùng
• Định danh sơ bộ (nhuộm gram và kiểu hình sinh hoá cơ bản) trong trường hợp sản xuất
các dược phẩm không vô trùng.
Các nguyên tắc trong giám sát vi sinh môi trường
Cần lưu ý rằng
• Đa số các vi sinh vật trong môi trường sản xuất thường ở trong trạng thái tổn
thương (do tác động của các biện pháp kiểm soát); một số khác lại có khả
năng mọc kém, đòi hỏi các yếu tố dinh dưỡng đặc biệt hoặc thậm chí không
thể nuôi cấy trên điều kiện nhân tạo.
Þ Khả năng hồi phục và mọc trong điều kiện của vi sinh vật trong điều kiện nuôi
cấy thiết lập thường không thể dự đoán được.
=> Việc không có vi sinh vật mọc trên các môi trường kiểm soát không có nghĩa
là hoàn toàn không có vi sinh vật trong môi trường sản xuất
Các nguyên tắc trong giám sát vi sinh môi trường
Cần lưu ý rằng
• Không có phương pháp chuẩn quy định việc lấy mẫu giám sát vi sinh môi
trường.
• Bản thân các phương pháp này có độ chính xác, độ đúng và tính lập lại kém;
chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thiết bị lấy mẫu, trạng thái hoạt động
của khu vực lấy mẫu, sự hiện diện ở dạng vết của các hoá chất; cũng như rất
khó đồng nhất thao tác lấy mẫu của kỹ thuật viên giữa các lần thực hiện…
ÞDo vậy, dữ liệu thu được từ giám sát vi sinh môi trường nên được nhìn nhận
trên khía cạnh tần suất phát hiện sự ngoại nhiễm hơn là số lượng (CFU) của vi
sinh vật mọc trên đĩa thử nghiệm.
ÞNgười phân tích kết quả cũng cần có kinh nghiệm trong đánh giá và phân tích
khuynh hướng của tình trạng kiểm soát môi trường sản xuất và đưa ra các
quyết định xử lý môi trường phù hợp.
Ví dụ - Kết quả giám sát VSV trong phòng sạch cấp B

CFU
trung Giới hạn cảnh báo
bình
đếm
được

Ngày
Ngày 11 – Kết quả giám sát vượt giới hạn cảnh
báo nhưng về tổng thể, các ngày còn lại luôn
đạt giới hạn và trong chiều hướng ổn định
=> Kết quả vượt giới hạn ngày 11 có thể là do
sai sót trong khâu lấy mẫu kiểm tra của người
lấy mẫu
Ví dụ - Kết quả giám sát VSV trong phòng sạch cấp B

CFU Giới hạn cảnh báo

trung
bình
đếm
được

Ngày

Tất cả các ngày đều có kết quả giám sát đạt trong giới
hạn nhưng từ ngày 12, lượng vi sinh vật hồi phục được
có khuynh hướng tăng
=> cần kiểm tra một cách có hê thống để phát hiện các
biến cố trong hệ thống kiểm soát môi trường nhằm đưa
kết quả giám sát về trạng thái ổn định
Các phương pháp sử dụng trong giám sát vi sinh môi trường
Do không có phương pháp hoàn hảo, thông thường phải phối hợp nhiều
phương pháp:
Giám sát vi sinh vật trong không khí
• Phương pháp hút bụi chủ động
• Phương pháp lắng bụi
Giám sát vi sinh vật trên bề mặt
• Phương pháp đĩa tiếp xúc
• Phương pháp phếch mẫu bề mặt bằng que bông
• Phương pháp in dấu găng tay
• Phương pháp tráng rửa
...
Phương pháp hút bụi chủ động
• Sử dụng máy hút mẫu không khí chủ động để
thu một lượng thể tích môi trường. vi sinh vật
nếu có trong môi trường sẽ được giữ lại trên
màng lọc hoặc bản thạch.
• Mật độ vi khuẩn sống (CFU/m3) trong không khí
được xác định dựa xác định dựa trên số đơn vị
tạo khóm (CFU) hồi phục trong được trên môi Máy lấy mẫu không khí MAS-100 ECOTM
trường sau khi ủ ở điều kiện thích hợp.
Ưu điểm
• Nhanh, lấy được một lượng mẫu không khí lớn
Nhược điểm
• Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền.
• Sai khác giữa các thiết bị làm ảnh hưởng lên tính
lặp lại của phương pháp
• Cần xem xét vị trí lấy mẫu thích hợp để tránh gây
nhiễm thứ cấp vào quá trình sản xuất
Nguyên tắc hoạt động của thiết bị lấy mẫu chủ động
Cấu tạo máy lấy mẫu không khí chủ động
Phương pháp lắng bụi
• Vi sinh vật trong không khí bám trên các tiểu
phân bụi sẽ lắng xuống theo chiều trọng lực và
được hứng lên bề mặt bản thạch và phát triển
thành khóm. Cách đặt đĩa hứng mẫu vi sinh không khí
• Số khóm vi sinh vật hồi phục trên mặt thạch biểu
thị mức độ nhiễm vi sinh vật của không khí.
Ưu điểm
• Đơn giản, dễ thực hiện
Nhược điểm
• Tốn thời gian
• Kết quả kém lặp lại do phụ thuộc lớn vào tính
chất lưu thông của không khí tại nơi đặt đĩa,
trạng thái hoạt động tại từng thời điểm
Phương pháp lắng bụi
Thời gian đặt bản thạch tùy thuộc vào trạng thái hoạt động của khu vực sản xuất:
• Trong trạng thái vận hành, thời gian đĩa thạch nên được kéo dài trong suốt phiên
hoạt động của quá trình sản xuất nhưng không vượt quá 4 giờ. Khi phiên hoạt động
kéo dài, có thể sử dụng tiếp tục một đĩa thạch khác thế vào đĩa thạch cũ đã đặt trước
đó trong 4 giờ.
• Trong trạng thái nghỉ (không sản xuất), thời gian đặt bản thạch theo tiêu chuẩn cũng
là 4 giờ. Tuy nhiên thời gian thực tế có thể thay đổi nhưng không được ít hơn thời
gian tối thiểu, được xác định theo công thức

T= (h × 100) : (v × 60)
Trong đó, h: chiều cao phòng, V= 1cm/s (vận tốc rơi của bụi theo lực hấp dẫn)
Phương pháp lắng bụi
• Sau thời gian ủ, đếm số khóm trên các đĩa thạch. Xác
định mật độ vi sinh vật trong không khí theo công thức:

Z = (A × 4 × 60) : (n × t) đơn vị: CFU/90mm/ 4 giờ

Trong đó:
• A = số CFU đếm được
• T= thời gian thực tế đặt bản thạch
• n = tổng số bản thạch được đặt
• t = là thời gian tiêu chuẩn Một đĩa lấy mẫu vi sinh không khí theo
• 60 là giá trị qui đổi từ phút sang giờ
phương pháp lắng bụi
Phương pháp đĩa tiếp xúc
• Dùng đĩa RODAC ấn nhẹ lên các bề mặt cần giám sát vi
sinh vật. Ấn nhẹ mặt thạch của đĩa tiếp xúc vào bề mặt
khảo sát. Vi sinh vật (nếu có) trên bề mặt khảo sát sẽ
được chuyển lên mặt thạch và mọc thành khuẩn lạc. Đếm
số khuẩn lạc và biểu thị bằng số lượng CFU/25 cm2.
• Đĩa RODAC (Replicate Organism Detection and Counting)
là kích thước 25 cm2, được thiết kế đặc biệt có phần chứa
môi trường được nhô lên khỏi đáy đĩa giúp dễ dàng cho Đĩa RODAC 25 cm2
thao tác cầm và tiếp xúc mặt đĩa với bề mặt lấy mẫu.
Ưu điểm
• Ít chịu ảnh hưởng bởi các kỹ thuật lấy mẫu
Nhược điểm
• Không thực hiện được khi bề mặt lấy mẫu bị che khuất,
kém bằng phẳng
Lấy mẫu bằng đĩa RODAC
Phương pháp phếch mẫu bề mặt bằng que bông
• Que bông hút vô trùng (được làm ẩm bằng dung dịch đệm)
được phếch xoay tròn trên toàn bộ bề mặt khảo sát có diện
tích từ 24 – 30 cm2 (thông thường là 25 cm2). Sau đó, vi sinh
vật trên que bông được phân tán vào trong ống đệm vô
trùng và thực hiện đếm sống bằng phương pháp lọc hoặc
trải/đổ đĩa trên môi trường thạch thích hợp
• Tính số lượng khuẩn lạc hồi phục theo CFU/cm2 bề mặt
khảo sát Cách thức phếch mẫu bề mặt

Ưu điểm
• Có khả năng lấy mẫu ở các bề mặt khó thực hiện bởi
phương pháp đĩa tiếp xúc
Nhược điểm
• Sai số lớn do ảnh hưởng bởi kỹ thuật lấy mẫu
Phương pháp in dấu găng tay (Glove print /Finger dabs)
• Đầu ngón tay là vị trí thường xuyên tiếp xúc với các khu
vực có nguy cơ cao về ngoại nhiễm vi sinh vật như các
bề mặt làm việc, các thiết bị, vật liệu hoặc từ chính
người vận hành và từ đó có nguy cơ mang vi sinh vật
nhiễm vào sản phẩm.
• Quá trình lấy mẫu cần được thực hiện trước khi vệ sinh
găng tay thường quy với cồn, hoặc trước khi đổi găng
tay ngoài trong trường hợp sử dụng hai lớp găng tay
để làm việc. Mỗi găng tay được thực hiện trên một đĩa
riêng biệt
• Kết quả giám sát thể hiện bằng số CFU mọc trên đĩa
đếm sống sau thời gian ủ

Phương pháp in dấu găng tay

Định danh sơ bộ các vi sinh vật trong không khí
Nhuộm Gram

Gram dương Gram âm

Trực khuẩn hoặc

Trực khuẩn Cầu khuẩn Cầu trực khuẩn
Oxidase
SƠ ĐỒ ĐỊNH DANH KIỂU HÌNH MỘT
Oxidase (+) Oxidase (-) SỐ NHÓM VI SINH VẬT
Pseudomonas sp. THƯỜNG GẶP TRONG KHÔNG KHÍ
OF test
Tìm bào tử,
Catalase O(+)/F(+)
Enterobacteriaceae

Sinh bào tử, catalase (+): Bacillus sp O(+)/F(-)

Catalase Acenitobacter sp.
Không sinh bào tử, catalase (+): Corynebacterium sp.

Không sinh bào tử, catalase (-): Lactobacillus sp.

Phản ứng Oxidase
Mục đích
Phát hiện sự hiện diện của cytochrome C oxidase. Thường dùng để nhận định các Neisseria sp.
(oxidase+ve) hoặc phân biệt các Enterobacteriaceae (oxidase-ve) với Pseudomonadaceae (oxidase+ve).
Nguyên tắc
Cytochrome C oxidase chuyển tetramethyl-p-phenylenediamine dạng khử (không màu) thành dạng
oxy hoá có màu tím

Các bước thực hiện

A. Nhỏ lên giấy thấm 1 giọt thuốc thử Kovac’s oxidase
B. Chuyển 1 khóm vi khuẩn lên vết thuốc thử
C. D. Phản ứng dương tính nếu vết VK xuất hiện màu tím,
âm tính nếu không xuất hiện màu tím.
Phản ứng Catalase
Mục đích
Xác nhận sự hiện diện của enzyme catalase ở vi khuẩn. Thường sử dụng để phân biệt các
Streptococci (catalase-ve) với Micrococci và Staphylococci (catalase+ve) hoặc nhóm Bacillus
(catalase+ve) với Lactobacillus (catalase-ve)
Nguyên tắc
Vi khuẩn sinh catalase chuyển H2O2 thành O2 và H2O, làm sủi bọt khí trong vòng 2-3s.

Các bước thực hiện

A. Nhỏ lên lam kính 1 giọt H2O2
B. Chuyển 1 khóm vi khuẩn vào giọt H2O2 ở trên
C. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí
D. Phản ứng âm tính nếu không xuất hiện bọt khí
Phản ứng O/F
Mục đích
Xác nhận cơ chế chuyển hoá carbohydrate của vi
sinh vật là do quá trình oxi hoá hay lên men.
Nguyên tắc
Cấy vi sinh vật vào 2 ống môi trường chứa glucose
và chỉ thị bromothymol blue, pH 7. Thêm vào 1 ống
một lượng dầu khoáng lên bề mặt để tạo điều kiện
kị khí, ống còn lại không thêm dầu khoáng – điều
kiện hiếu khí. Glucose được sử dụng sẽ tạo ra acid
làm giảm pH và chỉ thị chuyển từ màu xanh lá sang
vàng (+)
• Các vi sinh vật có cơ chế oxi hoá: chỉ có màu vàng
trong ống hiếu khí
• Các vi sinh vật có cơ chế lên men: có màu vàng
trong cả 2 ống
• Các vi sinh vật không thuỷ phân đường: cả 2 ống
âm tính