PRÀCTICA 1.

DETERMINACIÓ DE L’ESTABILITAT DE LA MIOGLOBINA

MITJANÇANT L’ESPECTROSCÒPIA DE DICROISME CIRCULAR

Les proteïnes són biopolímers constituïts per cadenes lineals d’aminoàcids (cadena
polipeptídica) que s’encarreguen de la majoria de les funcions vitals en les cèl·lules de tots els
éssers vius. Per exemple, formen part de l’estructura bàsica dels teixits (músculs, tendons,
cabell, etc.), són responsables de funcions metabòliques i reguladores (assimilació de
nutrients, transport d’oxigen i de grasses en la sang, etc.) i, també, constitueixen els elements
que defineixen la identitat de cada ésser viu (són la base de l’estructura del codi genètic i dels
sistemes de reconeixement d’organismes estranys en el sistema immunitari). Cada proteïna té
la seva funció biològica particular i aquesta ve regida sovint pel tipus d’estructura que
presenta. L’estructura de les proteïnes és d’una complexitat extraordinària i pot ser analitzada
des de quatre nivells diferents coneguts com: estructura primària (seqüència d’aminoàcids),
secundària (plegament de la cadena polipeptídica mitjançant ponts d’hidrogen donant lloc a
estructures de tipus hèlix  o làmina ), terciària (disposició de l’estructura secundària al
doblegar-se sobre si mateixa, originant una conformació globular) i quaternària (unió
mitjançant enllaços dèbils de diverses cadenes polipeptídiques amb estructura terciària).

Conèixer i determinar l’estructura de les proteïnes és, per tant, de gran importància i
existeixen diferents tècniques instrumentals que ens ajuden a aconseguir-ho. El Dicroisme
Circular és una d’aquestes tècniques i s’utilitza per estudiar, d’una manera fàcil i ràpida,
l’estructura globular de les proteïnes així com la seva estabilitat. El Dicroisme Circular és una
tècnica d’espectroscòpia d’absorció electrònica en la que un feix de llum polaritzada en un pla,
format per dos components polaritzats circularment (un a l’esquerra i l’altre a la dreta) en fase
i amb la mateixa amplitud, es fa passar per una mostra òpticament activa. A l’incidir la radiació
sobre la mostra, el raig circularment polaritzat a la dreta és absorbit d’una forma diferent al
raig circularment polaritzat a l’esquerra, fet que provoca que el pla de polarització roti un
determinat angle i es distorsioni generant una el·lipse. La diferència d’absortivitat molar entre
els dos components circularment polaritzats de la llum s’expressa com el·lipticitat molar (θ) i
varia amb la longitud d’ona (), podent obtenir espectres del tipus θ vs . Aquests espectres
s’obtenen generalment en les regions de l’ultraviolat proper (250-350 nm) i llunyà (180-250
nm) de la radiació electromagnètica.

Les proteïnes amb els seus centres asimètrics (òpticament actius) en la cadena
polipeptídica mostren, en la regió de l’UV llunyà, diferents absorcions per als rajos de llum
polaritzats a l’esquerra i a la dreta. Aquesta diferència d’absorció dóna lloc a un valor
d’el·lipticitat molar (θ) característic que és diferent en funció del tipus d’estructura secundària
que presenta la proteïna.

OBJECTIU

S’estudiarà l’estabilitat estructural de la mioglobina mitjançant Espectroscòpia de

Dicroisme Circular. La mioglobina és una proteïna que, fins a 50ºC, presenta un elevat
percentatge d’hèlix Figura 1) i dóna lloc a una forta absorció de dicroisme (θ) al voltant de
208 i 222 nm. Però, a mesura que la temperatura augmenta, aquests valors característics
d’el·lipticitat van variant. Es pretén analitzar quines poden ser les causes d’aquests canvis en
l’absorció i quina relació poden tenir amb l’estructura de la proteïna.

Figura 1. Model de dominis hel·licoidals en la mioglobina

PROCEDIMENT EXPERIMENTAL

A partir d’una dissolució tampó de fosfat 0.05 M a pH 7.0 (filtrada i degasificada), es

prepara una dissolució aquosa de mioglobina 2 mg/mL. Una alíquota (1.5 mL) d’aquesta
disolució es centrifuga a 14000 rpm durant 15 min a 20º C per eliminar partícules sòlides en
suspensió. Finalment, es dilueix la mostra fins a una concentració final 0.4-0.2 mg/mL
utilitzant, novament, el tampó de fosfat.

Les dissolucions finals preparades es transvasen a cubetes de quars d’1 mm de pas de

llum i es mesuren en un equip de Dicroisme Circular JASCO amb una llum de Xènon i proveït
d’una cel·la de tipus Peltier que permet controlar la temperatura acuradament (entre 0ºC i 110
ºC).

Les mostres es mesuraran a tres temperatures diferents: primer a 50ºC, després a 96º C i
finalment es tornarà a mesurar a 50ºC. S’observarà quin tipus d’espectres θ vs.  s’obtenen
en els tres casos i quines diferències presenten entre ells.

QÜESTIONS FINALS

1.- A partir de Na2HPO4 i NaH2PO4, explica com prepararies 100 mL d’una disolució tampó de
fosfat de sodi 0.05 M a pH = 7.00 (per H2PO4-, Ka = 6.2×10-8).

2.- Quina creus que és la causa de la diferència observada entre els espectres de dicroisme
obtinguts a 50ºC i a 96ºC?

3.- Pots treure alguna conclusió a l’observar l’espectre de dicroisme inicial a 50ºC i el final,
també a 50ºC, un cop s’ha pujat i baixat la temperatura?

4.- Quina és la raó de la mala lectura de l’el·lipticitat a longitud d’ones inferiors a 200 nm?
Proposa alguna possible solució per tractar de millorar aquest fet.