Cursus Hematologie en Immunologie Labo ML 2 2022-2023 PDF

Hematologie en Immunologie labo ML 2
Auteur en titularis: Katrien Wachters
Professionele Bachelor
Biomedische Laboratoriumtechnologie
Medische Laboratoriumtechnologie
2PB-ML
Onderwijsgroep Wetenschappen en Technologie

Academiejaar 2022-2023
CURSUSINFORMATIE
Docent(en)
Katrien Wachters; katrien.wachters@kdg.be; A.01.17; 03.502.22.24
Vereiste voorkennis
In de ECTS-fiche vind je voor welke opleidingsonderdelen je geslaagd moet zijn om dit

opleidingsonderdeel te mogen volgen: http://ects.kdg.be/.
Doelstellingen
In de ECTS-fiche vind je de doelstellingen van dit opleidingsonderdeel: http://ects.kdg.be/.
Leerinhoud
In de inhoudstafel en ook in de ECTS-fiche vind je de beschrijving van de leerinhoud van

dit opleidingsonderdeel: http://ects.kdg.be/.
Planning
Er worden zes labodagen ingericht tijdens periode 3 en 4.
Studiemateriaal
De gebruikte studiematerialen vind je in de ECTS-fiche: http://ects.kdg.be/.
PowerPointpresentaties die in het labo gebruikt worden staan op de Elektronische

Leeromgeving.
EVALUATIE
Evaluatiemomenten
In de ECTS-fiche vind je de evaluatiemomenten http://ects.kdg.be/.
Evaluatievorm
In de ECTS-fiche vind je de evaluatievorm(en) http://ects.kdg.be/.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 I

Studeertips
Na elk labo worden een aantal inzichtvragen getoetst via de Elektronische Leeromgeving
(Canvas).
Op het einde van alle labosessies volgt er een schriftelijke test. Bij de test wordt vooral
gepeild naar je inzicht in de verschillende uitgevoerde laboproeven.
LABORICHTLIJNEN
1 VOORBEREIDING VAN DE LABOPROEF
Een grondige voorbereiding is noodzakelijk om de labo's zelfstandig, veilig en met

inzicht te kunnen uitvoeren binnen de gestelde tijd.
Voorafgaand aan elk labo worden :
• Inleidingslessen georganiseerd
of
• ingesproken PowerPointpresentaties ter beschikking gesteld
Op die manier kunnen de labo’s door de student goed voorbereid worden.
De voorbereiding gebeurt voorafgaand aan het practicum en steeds in het

laboschrift. Aan het begin van elke labozitting kan deze voorbereiding gecontroleerd (en
gequoteerd) worden door de docent. Een student die de laboproef niet of onvoldoende
heeft voorbereid, kan de toegang tot het labo ontzegd worden. Hij behaalt in dat geval een
score van 0 voor die laboproef.
2 LABOSCHRIFT
Je moet een laboschrift met vaste en genummerde pagina’s hebben. Per

academiejaar heb je één laboschrift voor ál je labo’s (enkel voor “Analytische chemie en
Instrumentele analyse labo” wordt een apart laboschrift gebruikt). Is je schrift vol dan
begin je aan een nieuw. Breng dit schrift steeds mee naar de labozitting, het kan op elk
moment ter controle gevraagd worden. In geval van discussie of twijfel over bepaalde
resultaten is het laboschrift het belangrijkste bewijsmateriaal. Wat er niet duidelijk in
vermeld staat, heb je niet uitgevoerd.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 II

Wat staat er in het laboschrift?
2.1 Voorbereiding van het labo:
 titel van de proef + datum van uitvoering

 doel van de proef
 schematische werkwijze
 bepaalde gegevens die je hebt moeten opzoeken om achteraf berekeningen te
kunnen uitvoeren
 tabel waarin je alle waarnemingen, bij het aflezen van testresultaten, kan invullen;
 vragen die je bij het voorbereiden te binnen schieten.
2.2 Extra info die je van de docent krijgt
Tijdens het labo worden vaak tips gegeven die belangrijk kunnen zijn bij het maken van
een verslag.
2.3 Alle experimentele gegevens:
 noteer alle waarnemingen onmiddellijk: noteer slechts wat je werkelijk waarneemt en

dit zo kort, accuraat en overzichtelijk mogelijk;
 noteer alle meetresultaten onmiddellijk: afgewogen hoeveelheden, volumes…
2.4 Eindresultaat van de proef:
 schematische berekening.
3 HET VERSLAG VAN EEN LABOPROEF
Een verslag is een ordelijke, schematische weergave van hoe je proef verlopen is. Aan de
hand van je verslag zou iemand in staat moeten zijn de proef over te doen. Op elk verslag
vinden we: datum van uitvoering, naam (eventueel ook van medestudenten, indien de
proef in groep werd uitgevoerd), en titel. Je geeft het verslag af op papier, tenzij anders
afgesproken met de docent.
Je maakt enkel een volledig verslag voor de proeven die door de betrokken docent worden
aangegeven. Doorgaans zal dat slechts voor een 3-tal labozittingen zijn. Je uploadt het
verslag op de voorziene plaats in de Elektronische leeromgeving Canvas tegen de
vooropgestelde datum.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 III

Voor de proeven waarvoor je geen uitgebreid verslag hoeft te maken, zal de docent je
vertellen wat er als verslag verwacht wordt. Doorgaans zal dat een korte weergave van de
resultaten of een beknopte berekening zijn dat in het laboschrift wordt genoteerd.
De belangrijkste onderdelen van een verslag zijn:
3.1 Inleiding
Leg het doel en het principe van de proef kort (op een ½ bladzijde) en met eigen
woorden uit. Het heeft geen zin om hier de beschrijving van de proef die je in de
labonota’s vindt, over te schrijven.
Voor de immunologische testen geef je ook steeds een schematische voorstelling van het
principe voor een positieve reactie.
Noteer welke reactiedeelnemer (antigeen of antistof) in het monster aanwezig is en welke

in het testreagens.
3.2 Monster
Welk monster (volbloed, serum, plasma,…) ga je onderzoeken? Werd er een anticoagulans

gebruikt en zo ja, welk?
3.3 Werkwijze
Geef de proef weer zoals je ze uitgevoerd hebt (voor het letterlijk overnemen van de
werkwijze uit de labonota’s krijg je geen punten). Typische onderdelen zijn:
 bereidingen van alle nodige oplossingen, reagentia, andere benodigdheden;

 een schematische of korte voorstelling van de werkwijze (indien je een gewijzigde
werkwijze hebt toegepast geef je dit duidelijk weer, met een korte argumentatie van
de wijzigingen);
 een figuur van de opstelling (indien gevraagd). De opstelling geef je weer in een
duidelijke en verzorgde figuur. Duid belangrijke onderdelen met een pijl aan en
geef kort de nodige informatie. Indien nodig bespreek je de figuur kort.
3.4 Resultaten
Geef de resultaten van de proef weer zoals afgesproken met de docent. De verwerking van
de resultaten, eventuele berekeningen of grafische weergaven noteer je hier. Indien je een
onzekerheidsanalyse maakt, dan integreer je die in je berekeningen.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 IV

Noteer zorgvuldig wat je echt waarneemt en zet de resultaten waar mogelijk in een tabel.
Noteer steeds welk resultaat overeenkomt met welk monster.
Geef ook op een correcte manier de resultaten van de controles (zowel negatieve als
positieve) weer.
Zo nodig wordt er ook een legende toegevoegd waarin vermeld staat hoe een positief of
negatief resultaat moet geïnterpreteerd worden.
3.5 Bespreking en conclusie
Bekijk je resultaten kritisch en formuleer op basis van de resultaten een besluit. Tracht een
verklaring te vinden voor onverwachte resultaten.
Als er controles worden ingezet, bespreek en interpreteer ook hiervan de resultaten en

valideer je de test.
Vermeld steeds over welk monster het gaat. Resultaten zijn waardeloos als je niet weet
waarop ze betrekking hebben of als je ze koppelt aan een verkeerd resultaat.
Eventueel kan je verwijzen naar literatuur, cursus of andere bronnen om jouw resultaten
te vergelijken (geef steeds de bronvermelding).
Formuleer een conclusie van de laboproef op basis van de door jou behaalde resultaten
4 EVALUATIE VAN HET LABO
De evaluatie gebeurt op basis van volgende elementen:
• Procesevaluatie (= “Observatie van het functioneren tijdens het

onderwijsleerproces”): werkzaamheden tijdens het labo en het inzicht wordt
getoetst via Elektronische leeromgeving
• het verslag (via Elektronische leeromgeving)
• een schriftelijke test.
In de ECTS-fiche wordt voor elk labo het gewicht van deze drie elementen vermeld en hoe
de uiteindelijke score voor het labo verkregen wordt.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 V

4.1 Procesevaluatie (= “Observatie van het functioneren tijdens het
onderwijsleerproces”)
Voor de quotering van de procesevaluatie wordt gebruik gemaakt van de

procesevaluatiefiche (zie fig. 1). Voor labo’s die over meer dan één periode lopen, geeft de
betrokken docent op basis van deze fiches minstens 1 maal tussentijdse feedback aan elke
student.
Figuur 1: Procesevaluatiefiche zoals gebruikt door de begeleidende docent
4.2 Verslag
De docent verbetert en beoordeelt je verslag.
Voor elk verslag wordt duidelijk afgesproken wat de deadline is om het verslag in te
dienen. Bij laattijdig overhandigen van het laboverslag wordt dit slechts op 50% van de
punten gequoteerd. Indien je de eerste deadline niet haalt krijg je een tweede deadline.
Indien je je verslag dan weer niet op tijd binnenbrengt krijg je als score 0/20.
Veel laboproeven worden met twee studenten uitgevoerd. Er wordt slechts één verslag
gemaakt. Op dat verslag vermeld je duidelijk wie van de twee het verslag maakte. De
score voor het verslag wordt enkel gegeven aan de maker ervan, en dus niet aan de
partner.
Indien je het practicum voor de tweede keer volgt (bist), spreek je met de docent tijdig af
wat er moet worden uitgevoerd: proeven van het vorige jaar, nieuwe proeven, enz.
4.3 Test
Indien er een test wordt afgenomen, zullen de punten doorwegen volgens de afspraken in
de ECTS-fiche.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 VI

INHOUDSOPGAVE
Cursusinformatie ................................................................................................................. I
Docent(en) ....................................................................................................................... I
Vereiste voorkennis .......................................................................................................... I
Doelstellingen................................................................................................................... I
Leerinhoud ....................................................................................................................... I
Planning ........................................................................................................................... I
Studiemateriaal ................................................................................................................ I
Evaluatie.............................................................................................................................. I
Evaluatiemomenten .......................................................................................................... I
Evaluatievorm .................................................................................................................. I
Studeertips ......................................................................................................................II
Laborichtlijnen ...................................................................................................................II
1 VOORBEREIDING VAN DE LABOPROEF .........................................................................II
2 LABOSCHRIFT ...............................................................................................................II
Wat staat er in het laboschrift? ..................................................................................... III
2.1 Voorbereiding van het labo: ................................................................................. III
2.2 Extra info die je van de docent krijgt.................................................................... III
2.3 Alle experimentele gegevens: .............................................................................. III
2.4 Eindresultaat van de proef: .................................................................................. III
3 HET VERSLAG VAN EEN LABOPROEF ........................................................................... III
De belangrijkste onderdelen van een verslag zijn: ......................................................... IV
3.1 Inleiding................................................................................................................ IV
3.2 Monster ................................................................................................................. IV
3.3 Werkwijze ............................................................................................................. IV
3.4 Resultaten ............................................................................................................. IV
3.5 Bespreking en conclusie ......................................................................................... V
4 EVALUATIE VAN HET labo ............................................................................................. V
4.1 Procesevaluatie (= “Observatie van het functioneren tijdens het
onderwijsleerproces”) .................................................................................................... VI
4.2 Verslag .................................................................................................................. VI
4.3 Test ....................................................................................................................... VI
Inhoudsopgave ...................................................................................................................II
DeEL 1 - algemene informatie .............................................................................................1
1 Algemeen ......................................................................................................................1
2 Bioveiligheid en hygiëne................................................................................................3
DEEL II – KWAliteitscontrole ...............................................................................................4
3 Kwaliteitscontrole .........................................................................................................4
3.1 Evolutie van kwaliteitscontrole naar kwaliteitssysteem en accreditatie. .................4
3.2 Kwaliteitssysteem ...................................................................................................5
Hematologie en Immunologie labo ML 2 II

3.2.1 Inleiding .......................................................................................................................... 5
3.2.2 Fasen en activiteiten in het proces ...................................................................................... 5
3.2.3 Documenten van het kwaliteitssysteem................................................................................ 6
3.2.4 Evaluatie van het kwaliteitssysteem .................................................................................... 8
3.3 Normen en accreditatie ...........................................................................................9

3.3.1 Normen of referentiesystemen ............................................................................................ 9
3.3.2 Accreditatie en accreditatiesystemen ................................................................................. 11
DEEL III – hematologie .....................................................................................................15

4 Bloedcellen ..................................................................................................................15
4.1 Hematologie-analyzers..........................................................................................15
4.1.1 Inleiding ........................................................................................................................ 15
4.1.2 Algemene principes ......................................................................................................... 17
4.1.3 Resultaten ...................................................................................................................... 26
4.2 Oplossingen voor hematologie ..............................................................................28

4.2.1 Tellen van leucocyten ...................................................................................................... 28
4.2.2 Tellen van erytrocyten ..................................................................................................... 28
4.2.3 Tellen van reticulocyten ................................................................................................... 29
4.2.4 Tellen trombocyten.......................................................................................................... 29
4.2.5 Fysiologische zoutoplossing .............................................................................................. 29
4.2.6 Bloeduitstrijkje ............................................................................................................... 30
4.3 Telkamer ...............................................................................................................31

4.4 Praktisch gedeelte: Manuele parameterbepalingen .............................................35
4.4.1 Tellen van leucocyten ...................................................................................................... 35
4.4.2 Tellen van erytrocyten ..................................................................................................... 37
4.4.3 Bepaling van hemoglobine................................................................................................ 39
4.4.4 Bepaling van hematocriet ................................................................................................. 40
4.4.5 Tellen van trombocyten ................................................................................................... 42
4.4.6 Erytrocytaire parameters en RDW ..................................................................................... 45
4.4.7 Tellen van reticulocyten ................................................................................................... 47
4.4.8 Bloeduitstrijkje ............................................................................................................... 50
4.4.9 Verwerking resultaten van het praktisch gedeelte................................................................ 55
5 Bloedgroepen, antiglobulinetest en kruisproeven .......................................................56

5.1 ABO-bloedgroepsysteem .......................................................................................56
5.1.1 Principe.......................................................................................................................... 56
5.1.2 ABO discrepanties ........................................................................................................... 57
5.2 Rhesusbloedgroepsysteem ....................................................................................58

5.2.1 Principe.......................................................................................................................... 58
5.2.2 Foutieve interpretaties ..................................................................................................... 59
5.3 Antiglobulinetest of Coombs test ..........................................................................60

5.3.1 Inleiding ........................................................................................................................ 60
5.3.2 Directe antiglobulinetest of directe Coombs test .................................................................. 60
5.3.3 Indirecte antiglobulinetest of indirecte Coombs test ............................................................. 61
5.4 Cassettesysteem voor bloedgroepen, antiglobulinetesten en kruisproeven ..........65
Hematologie en Immunologie labo ML 2 III

5.4.1 Inleiding ........................................................................................................................ 65
5.4.2 Bio Vue Systeem ............................................................................................................. 65
5.4.3 Automatisatie: AutoVue Innova......................................................................................... 67
5.5 Pretransfusioneel onderzoek .................................................................................68

5.5.1 Transfusie ...................................................................................................................... 68
5.5.2 Erytrocytentransfusie....................................................................................................... 69
5.5.3 Pretransfusionele methoden ............................................................................................. 70
5.5.4 Opmerkingen .................................................................................................................. 71
5.6 Praktisch gedeelte.................................................................................................73

5.6.1 Wassen van cellen ........................................................................................................... 73
5.6.2 Bepaling van de ABO- en rhesusbloedgroep met het cassettesysteem.................................... 74
5.6.3 Bepaling van de directe antiglobulinetest met het cassettesysteem ....................................... 77
5.6.4 Bepaling van irreguliere antistoffen in het serum/plasma met het cassettesysteem: de indirecte
antiglobulinetest ............................................................................................................................. 79
5.6.5 Kruisproef met het cassettesysteem .................................................................................. 81
DEEL IV Immunologie ........................................................................................................83

6 Fluorescentie ...............................................................................................................83
6.1 Inleiding................................................................................................................83
6.2 Excitatie en emissie...............................................................................................83
6.3 Filters ....................................................................................................................84
6.4 Factoren die de detectie van het gewenste fluorescentiesignaal beïnvloeden .......85
7 Fluorescentiemicroscopie ............................................................................................86
7.1 Lamp .....................................................................................................................86
7.2 Filterblok ...............................................................................................................86
8 Indirecte immunofluorescentie ...................................................................................88
8.1 Toxoplasma gondii ................................................................................................88
8.1.1 Inleiding ........................................................................................................................ 88
8.1.2 Symptomen.................................................................................................................... 88
8.1.3 Evolutiecyclus: zie schema ............................................................................................... 89
8.1.4 Principe.......................................................................................................................... 89
8.2 Werkwijze : Toxo-spot IF ......................................................................................90

9 Serodia TP PA ..............................................................................................................91
9.1 Treponema pallidum partikel agglutinatie .............................................................91
9.1.1 Inleiding ........................................................................................................................ 91
9.1.2 Principe van de test ......................................................................................................... 91
9.2 Werkwijze : Serodia-TP PA ....................................................................................91

10 Auto-immuun ziekten ...............................................................................................92
10.1 Anti-nucleaire antistoffen ..................................................................................92
10.1.1 Diagnostische betekenis van anti-nucleaire antistoffen ......................................................... 92
10.1.2 Antistofbepaling bij auto-immuunziekten ............................................................................ 93
10.1.3 Principe van de werkwijze ................................................................................................ 94
10.1.4 Interpretatie ................................................................................................................... 95
10.2 Identificatie van anti-nucleaire antistoffen (ANA) ........................................... 100
Hematologie en Immunologie labo ML 2 IV

10.2.1 Crithidia luciliae. ............................................................................................................ 100
10.2.2 ENA dot blots/cytodot ..................................................................................................... 101
10.3 C-anca/P-anca ................................................................................................. 101

10.4 Werkwijze: ANA – Crithidia luciliae –ENA Profile3 - C-anca/P-anca ................. 103
11 Elisa ....................................................................................................................... 104
11.1 Principe ............................................................................................................ 104
11.2 Werkwijze : Elisa .............................................................................................. 105
11.3 Bijkomende opdrachten bij het verslag ............................................................ 105
12 Bijlagen: Zie Elektronische leeromgeving: CANVAS ................................................ 106
12.1 Bijlage 1: Toxoplasma gondii: indirecte immunofluorescentietest ................... 106
12.2 Bijlage 2: Serodia-TP PA .................................................................................. 106
12.3 Bijlage 4: ANA .................................................................................................. 106
12.4 Bijlage 5: Crithidia luciliae ............................................................................... 106
12.5 Bijlage 6: ENA Profile3 ..................................................................................... 106
12.6 Bijlage 7: C-anca/P-anca ................................................................................. 106
12.7 Bijlage 8: Elisa: IgM bepaling van Epstein-Barr virus ....................................... 106
12.8 Bijlage 9: Elisa: IgG bepaling van Epstein-Barr virus ....................................... 106
Hematologie en Immunologie labo ML 2 V

LIJST MET FIGUREN
Figure 1: Principe van hydrodynamische focussering ................................................... 18

Figure 2: Impedantiemeting ..................................................................................... 19
Figure 3: Histogram van erytrocyten ......................................................................... 19
Figure 4: Hematocriet bepaling................................................................................. 20
Figure 5: 3-dimensionaal scattergram
Figure 6: 2-dimensionaal scattergram .................................................................... 21
Figure 7: Voorwaartse lichtverstrooiing
Figure 8: Schematische weergaven van FSC en SSC ................................................... 22
Figure 9: Scattergram van het WDF-kanaal ................................................................ 23
Figure 10: Scattergram van het WNR-kanaal.............................................................. 24
Figure 11: Scattergram WDF-kanaal Figure 12: scattergram in WNR kanaal ................ 25
Figure 13: protocol/resultaat van een hematologie analyzer ......................................... 27
Figure 14: Boven- en zijzicht van een telkamer met dekglas ........................................ 31
Figure 15: Telnet van de Improved Neubauer telkamer. .............................................. 32
Figure 16: Ligging van de verschillende vierkanten ..................................................... 33
Figure 17: Het tellen van cellen ................................................................................ 34
Figure 18: Afleestoestel hematocriet ......................................................................... 41
Figure 19: Het maken van een bloeduitstrijkje ........................................................... 51
Figure 20: Werkwijze voor de differentiatie van leucocyten: kanteelmethode ................. 53
Figure 21: Surgiscreencellen I, II en III ..................................................................... 61
Figure 22: Panel testerytrocyten voor identificatie van irreguliere antistoffen ................. 62
Figure 23: Cassettesysteem ..................................................................................... 66
Figure 24: AutoVue Innova ...................................................................................... 67
Figure 25: Donoreenheid in bloedzak ........................................................................ 70
Figure 26: Fluorescentiemicroscopie met gereflecteerd excitatielicht. ............................ 86
Figure 27: Structuur van een cel.............................................................................. 95
Figure 28: Celdeling ................................................................................................ 96
Figure 29: Principe van indirecte Elisa ..................................................................... 105
LIJST MET TABELLEN
Tabel 1: ABO bloedgroepen...................................................................................... 57

Tabel 2: Rhesusbloedgroepen................................................................................... 59
Tabel 3: Voorbeelden van filterblokken ...................................................................... 87
Hematologie en Immunologie labo ML 2 VI

DEEL I - Algemene informatie
DEEL 1 - ALGEMENE INFORMATIE
1 ALGEMEEN
In dit practicum leer je hematologische testen uitvoeren. Volledig bloedonderzoek (tellen

en morfologie van cellen), bloedgroepbepaling en stollingstesten komen allemaal aan bod.
Je onderzoekt hoe het menselijk immuunsysteem werkt door allerhande immunologische
testen uit te voeren. Ook testen op auto-immuunziekten horen erbij. Je leert
onderzoeksresultaten op een correcte manier interpreteren.
De volgende dingen breng je mee naar het labo hematologie/immunologie:
- Een viltstift waarmee je op glas en plastiek kan schrijven

- Veiligheidsbril
- Cursus: “Hematologie en immunologie labo ML 2”
- Een laboschrift die gebruikt wordt voor alle practica tijdens het hele academiejaar.
Tijdens het practicum krijg je een beknopte uitleg over de verschillende technieken.
Waar let je op VÓÓR je aan het practicum begint:
- Plan je labo, zodat je goed weet wat er moet gebeuren.

- Jassen en boekentassen blijven buiten het labo (lockers)!
- Enkel het strikt noodzakelijke neem je mee binnen.
- Je gebruikt enkel de labojassen die ter beschikking gesteld worden voor dit labo!
- Per tafel een recipiënt met javel (10%) of dettol (5%) om besmette pipetten in te doen.
Hematologie en Immunologie labo ML 2 1

Waar let je op TIJDENS het practicum:

- Hou rekening met BIOVEILIGHEID (zie verder en brochure)
- Zorgvuldig werken: let erop dat je met potentieel pathogene stalen aan het werken bent.
- Je mag handschoenen dragen, maar vervang deze wanneer er staal (bloed, plasma,
serum) op de handschoenen aanwezig is.
- Besmette pipetten NOOIT gewoon op tafel leggen! Pipetten in een beker
ontsmettingsmiddel.
- Als je morst, ONMIDDELLIJK ontsmetten met ethanol (70%)
Waar let je op NA het practicum:

- Al het (besmette) materiaal op een correcte manier verwerken
- Afwassen
- De tafels goed ontsmetten met ethanol (70%) en reinigen
- HANDEN WASSEN!

2 BIOVEILIGHEID EN HYGIËNE
Gebruikers van het labo ontvangen een brochure met veiligheidsrichtlijnen. Hierin staan
basisnormen voor microbiologisch/hematologisch werk. Wanneer er met meer risico
houdend materiaal gewerkt wordt (niet van toepassing in het hogeschoollabo), moeten er
extra maatregelen genomen worden (zie hoofdstukken ‘Biologische agentia’ en ‘Biologische
veiligheidscabines’), maar ook dan blijven de basisregels van kracht.
Lees en respecteer de veiligheidsvoorschriften uit de brochure. Hieronder volgen meer

specifieke aanvullingen van de veiligheidsrichtlijnen:
- Lees en respecteer de veiligheidsvoorschriften voor chemische producten en de
bioveiligheidsvoorschriften.
- Lees en respecteer de hygiënevoorschriften.
- Je mag handschoenen dragen als je in contact komt met (potentieel) besmet materiaal,
maar doe ze daarna onmiddellijk uit en gooi ze in een medische afvalbak of
autoclaveerzak voor je aan iets anders begint.
- Steek niets in je mond (schrijfgerei)
- Kom met je handen nooit aan je gezicht (ogen, mond, neus) ook niet als je handschoenen
draagt.
- Leg je persoonlijke spullen (ringen, armbanden, uurwerken,….) in de kastjes die speciaal
voorzien zijn en buiten het labo staan. Ze mogen in geen geval in contact komen met
(mogelijk) besmet materiaal.
- Werk aseptisch en denk aan de veiligheid van jezelf en de andere labogebruikers.
- Zet buizen altijd in rekjes met de gepaste openingen.
- Beschouw elk staal als (potentieel) pathogeen.
- Breng de gebruikte pasteurpipetten eerst in de ontsmette vloeistof en verwijder
daarna de pipetteerhelper.

DEEL II - Kwaliteitscontrole
DEEL II – KWALITEITSCONTROLE
3 KWALITEITSCONTROLE
3.1 Evolutie van kwaliteitscontrole naar kwaliteitssysteem en

accreditatie.
Medische labo’s hebben er steeds voor geijverd om een kwaliteitsvolle dienstverlening te

garanderen.
Vroeger lag hier de nadruk op (analytische) kwaliteitscontrole. Nu is er een verschuiving

naar “totale kwaliteit”, waarbij alle aspecten in alle fasen van het laboratoriumproces
betrokken zijn en beschreven zijn in het kwaliteitssysteem van het labo. Kwaliteitscontrole
blijft belangrijk, maar kwaliteitsbewaking en –evaluatie van v.b. de organisatie, het
personeel en de uitrusting komen ook aan bod.
Vroeger bestond de reputatie van een labo vaak als kwaliteitslabel voor de klant.
Tegenwoordig worden er meer objectieve evaluatiesystemen gebruikt, waarbij de
competentie vastgesteld wordt:
- op basis van algemeen (internationaal) erkende criteria (normen of referentiesystemen).
- door een onafhankelijke derde (v.b. accreditatiesysteem zoals BELAC) waarvan de
autoriteit algemeen (internationaal) erkend wordt door alle partijen (labo en klant).
Kwaliteitssysteem, normen en accreditatie worden in de volgende hoofdstukken

besproken.

3.2 Kwaliteitssysteem
3.2.1 Inleiding
Laboratoria voor klinische biologie moeten voldoen aan wettelijke erkenningsvoorwaarden,

die in een koninklijk besluit vastgelegd worden. Zij moeten o.a. over een kwaliteitssysteem
beschikken.
Een kwaliteitssysteem van een labo omvat alle aspecten in elke fase van het
laboratoriumproces die van belang zijn om ‘totale kwaliteit’ te garanderen. Elke activiteit
moet uitgebreid beschreven, gedocumenteerd en uitgevoerd worden zoals de betreffende
procedure voorschrijft.
Het kwaliteitssysteem is opgebouwd rond 4 belangrijke elementen:

- de organisatie
- de operationaliteit
- de kwaliteitsbeheersing
- de kwaliteitsborging
Hieronder volgen een aantal aspecten die in het kwaliteitssysteem aan bod komen:
- de organisatie: doelstellingen?, verantwoordelijkheden?, structuur,….
- constructie, ligging, inrichting van de lokalen,…..
- procedures: zie ‘SOP’ ‘s
- documentatiebeheer.
Het klinisch onderzoek bevat ook activiteiten die buiten het kwaliteitssysteem van het labo
vallen zoals de consultatie patiënt/arts.
3.2.2 Fasen en activiteiten in het proces
Het laboratoriumproces kan ingedeeld worden in drie grote fasen waarin een aantal
activiteiten onderscheiden worden.
1. De pre-analytische fase: monstername, voorlopige bewaring van het monster,

transport van het monster met aanvraagformulier, ontvangst van het monster met
aanvraagformulier, nagaan van de klinische gegevens a.d.h.v. monster en formulier,
voorbereiding van het monster voor analyse,…
2. De analytische fase: analyse van het monster.

3. De post-analytische fase: rapportering van de resultaten aangevuld met de

interpretatie, opmerkingen en/of advies, verzending van het rapport, bewaren of
verwijderen van het monster, archivering van de documenten, klachtenbehandeling,…..
3.2.3 Documenten van het kwaliteitssysteem
3.2.3.1 Inleiding
De documenten van het kwaliteitssysteem kunnen ingedeeld worden in:
- het kwaliteitshandboek
- SOP’s
- andere documenten
Deze documenten staan niet los van elkaar maar worden, waar nodig, aan elkaar gelinkt.
Het volledige documentatiepakket moet in een archief bewaard worden. Het personeel
beschikt enkel over die documenten die van belang zijn voor het uitvoeren van activiteiten
waarvoor hij/zij verantwoordelijk is. Van een document kunnen dus meerdere exemplaren
bestaan. Telkens moet geweten zijn waar welke kopie aanwezig is.
3.2.3.2 Het kwaliteitshandboek
Het kwaliteitshandboek is een schriftelijk overzicht van het algemeen beleid, de

kwaliteitsdoelstellingen en de regels en procedures om deze doelstellingen te realiseren.
Alleen de grote lijnen van het kwaliteitssysteem worden erin opgenomen met verwijzingen
naar de andere documenten voor de details.
Om de opbouw te standaardiseren en ter ondersteuning van de labo’s bij het opstellen van
het kwaliteitshandboek, heeft CCKL (Coördinatie Commissie ter bevordering van de
Kwaliteitsbeheersing op het gebied van Laboratoriumonderzoek in de Gezondheidszorg)
een praktijkrichtlijn uitgewerkt. Een laboratorium voor klinische chemie kan ook gebruik
maken van de richtlijnen die BELAC (zie hoofdstuk 4.3 Normen en accreditatie) ter
beschikking stelt. Een kwaliteitshandboek dat volgens deze richtlijnen opgesteld wordt,
voldoet ook aan de accreditatiecriteria (zie hoofdstuk 4.3 Normen en accreditatie). De
richtlijnen worden wel voortdurend aangepast, zodat er voor bestaande labodocumenten
ook voortdurend aanpassingen nodig zijn om aan de accreditatievoorwaarden te blijven
voldoen.

Ter illustratie kan het CCKL-document (niet officiële versie van november ’96),
“Praktijkrichtlijn voor het opzetten van een kwaliteitshandboek in erkende klinische
laboratoria werkzaam binnen het kader van het RIZIV “, ingekeken worden.
Deze praktijkrichtlijn is gebaseerd op de CCKL-richtlijnen voor kwaliteitsborging in
laboratoria in de gezondheidszorg, de NBN-EN 45001, de ISO 9000 versie en de wettelijke
erkenningsvereisten. Elk onderdeel van elk hoofdstuk wordt onderverdeeld in de volgende
paragrafen: Norm, Vraag, Toelichting en Vereisten.
3.2.3.3 Standard Operating Procedures of SOP’s
Van elke stap in het proces moeten procedures uitgewerkt worden. In deze procedures
wordt beschreven wat er moet gebeuren, hoe het moet gebeuren, welke problemen er
kunnen optreden enz. De verkorte versie van deze SOP’s moet aanwezig zijn op de
werkplek. De praktische uitvoering van elke activiteit dient te gebeuren zoals het in de
betreffende SOP beschreven staat.
Er zijn verschillende soorten SOP’s :

- logistieke SOP’s (v.b. procedures voor de toegangsregeling)
- analyse SOP’s (v.b. procedure voor het uitvoeren van kruisproeven)
- SOP’s voor de bediening van apparatuur (v.b. procedure voor het onderhoud en de
werking van de autoclaaf).
3.2.3.4 Andere documenten
Naast het kwaliteitshandboek en SOP’s bevat het kwaliteitssysteem nog een heleboel
andere documenten:
- c.v. van personeelsleden
- logboeken
- verslagen van vergaderingen
- veiligheidshandboek
- ...
In SOP’s wordt vastgelegd op welke manier deze documenten opgesteld, onderhouden,

gearchiveerd worden.

3.2.4 Evaluatie van het kwaliteitssysteem
3.2.4.1 Inleiding
De evaluatie kan zowel intern (interne audit) als extern (externe audit) gebeuren en omvat
alle onderdelen van het kwaliteitssysteem.
3.2.4.2 Interne audit
De interne audit gebeurt minstens één maal per jaar door personeelsleden van het labo die
hiervoor speciaal opgeleid zijn.
Tijdens deze audit wordt nagegaan of de praktijk wordt uitgevoerd zoals die beschreven
staat in de documenten van het kwaliteitssysteem. Zo nodig worden corrigerende
maatregelen genomen, die op hun beurt ook weer beschreven worden in de gepaste
documenten.
Voor deze evaluatie kan een labo gebruik maken van vragenlijsten of lijsten waarin de te
controleren punten opgenomen zijn.
3.2.4.3 Externe audit
Experten, die niet verbonden zijn aan het labo, beoordelen in dit geval het
kwaliteitssysteem.
Indien, in België, de externe audit gebeurt door een team van BELAC en indien aan alle
opgelegde criteria voldaan wordt, kan dit resulteren in een accreditatiecertificaat (zie
hoofdstuk 4.3. Normen en accreditatie)
Indien de externe audit gebeurt door een privé-organisatie zoals Vinçotte e.a. dan kan er
wel een certificaat afgeleverd worden, maar geen accreditatiecertificaat. Dit is wel geen
gebruikelijke vorm van externe audit voor laboratoria voor klinische biologie.

3.3 Normen en accreditatie
3.3.1 Normen of referentiesystemen
3.3.1.1 Inleiding
Er bestaan verschillende normen of referentiesystemen om de competentie van een labo

aan te tonen. Niettegenstaande in deze normen een aantal gemeenschappelijke criteria
voorkomen, heeft elk systeem een eigen toepassingsgebied. De keuze wordt dus bepaald
door de doelstelling en de doelgroep waarop de normen betrekking hebben. De inhoud van
normen wordt voortdurend aangepast, zodat een laboratorium ook voortdurend
aanpassingen zal moeten aanbrengen om aan de meest actuele normen te voldoen.
We beperken ons tot NBN-EN 45001, ISO/IEC Guide 25, ISO/IEC FDIS 17025,
ISO 15189 en GPL.
3.3.1.2 NBN-EN 45001, ISO/IEC Guide 25, ISO/IEC FDIS 17025, ISO15189
NBN-EN 45001 is een Belgisch/Europese norm die enerzijds criteria bevat i.v.m. het
kwaliteitssysteem dat moet instaan voor de borging van de technische deskundigheid en
de operationaliteit en anderzijds criteria i.v.m. het toepassingsgebied: er moet duidelijk
aangegeven worden welke (routine) testen in welk domein uitgevoerd worden volgens
deze norm.
Deze norm dekt alleen het technisch analytisch gedeelte van het labo-onderzoek vanaf de
monstername tot het analytisch resultaat en bevat géén criteria voor de klinische validatie.
Tot in 1999 kon een labo op vrijwillige basis kiezen om volgens deze norm te werken om
zo een accreditatiecertificaat (zie accreditatie en accreditatiesysteem) te bekomen.
ISO/IEC Guide 25 is afkomstig van de international Organisation for

Standardisation/International Electrochemical Commision en vertoont een grote
overeenkomst met de NBN-EN 45001.
In 1999 kwam er een nieuwe internationale standaard in voege, nl. ISO/IEC FDIS
17025. Deze standaard is gebaseerd op de NBN-EN 45001 en ISO/IEC Guide 25 en
vervangt ze ook.
Vanaf 2000 gebruikte Beltest (zie accreditatie en accreditatiesystemen) deze standaard
om een labo, dat op vrijwillige basis kiest om volgens deze norm te werken, een
accreditatiecertificaat te verlenen.

De hogergenoemde normen zijn niet specifiek voor medische laboratoria, maar zijn ook
van toepassing in totaal andere marktsectoren. Voor de medische laboratoria is er nood
aan een meer specifieke norm, die beter aansluit bij de activiteiten van deze laboratoria.
In 2004 komt deze nieuwe aangepaste norm als referentiesysteem in voege, n.l. de
ISO15189 norm en ISO 22870 (aanvullende norm voor labo’s die point-of-care testen
aanbieden).
Deze norm is op de voorgaande gebaseerd maar bevat ook richtlijnen i.v.m. (diagnostisch)
advies aan gezondheidswerkers (de ‘klant’ van het laboratorium is het geheel van de
medische equipe), ethiek, het beheer van kwaliteitscontrole en informatica. De technische
vereisten omvatten zowel de pre-analytische, de analytische en de post-analytische fase.
Medische laboratoria kunnen in 2004 een accreditatie aanvragen volgens deze nieuwe
norm.
Sinds 2012 kunnen medische labo’s een accreditatie aanvragen volgens een vernieuwde
norm (3de editie)
GLP of Good Laboratory Practice richtlijnen zijn opgesteld door de OESO en zijn in
Europa erkend.
In deze richtlijnen zijn de criteria opgenomen voor studies in de ontwikkelingsfase van

nieuwe producten waarvan men het gevaar voor mens, dier en milieu wenst te kennen
(v.b. geneesmiddelen, cosmetica).
Instellingen die deze studies uitvoeren zijn wettelijk verplicht om volgens deze criteria te
werken.
Een conformiteitsverklaring wordt verleend na de studie en na de inspectie door de

overheid van alle documenten.
Opmerkingen
Een labo dat zich uitsluitend met medische analyses bezig houdt, hoeft niet noodzakelijk
voor alle activiteiten aan de accreditatiecriteria te voldoen (maar krijgt voor deze
activiteiten dan ook geen accreditatiecertificaat). Voor activiteiten waarvoor nog geen
normen bestaan, kan uiteraard ook geen certificaat bekomen worden.
Een labo dat zowel medische analyses als v.b. farmaceutische studies uitvoert, kan voor
een deel van zijn activiteiten geaccrediteerd zijn en voor een deel voldoen aan de GLP
richtlijnen.

3.3.2 Accreditatie en accreditatiesystemen
3.3.2.1 Accreditatie
De accreditatie is een erkenning van competentie a.d.h.v. een formele uitspraak van een
onafhankelijke derde (accreditatie-organisatie) betreffende het kwaliteitssysteem, de
technische deskundigheid en de operationaliteit van een laboratorium voor het uitvoeren
van specifieke taken.
Alhoewel het K.B. van 3/12/1999 stelt dat de laboratoria voor klinische biologie over een
kwaliteitssysteem moet beschikken, is er nog geen wettelijke verplichting om ook
geaccrediteerd te zijn. De vereiste criteria komen echter grotendeels overeen met diegene
die voor een accreditatie gevraagd worden. Op termijn kan accreditatie één van de nieuwe
erkenningsvoorwaarden zijn en het RIZIV kan in de toekomst beslissen om enkel met
geaccrediteerde labo’s samen te werken. Sommige klanten stellen de accreditatie nu reeds
als voorwaarde.
Sommige klinische labo’s zijn al geaccrediteerd, andere zitten in de voorbereidingsfase.

Wettelijk zijn ze het nog niet verplicht, maar eigenlijk worden ze er wel toe gedwongen. De
medische laboratoriumtechnolo(o)g(e) zal er zeker mee geconfronteerd worden via het
kwaliteitssysteem van het labo o.a. door het schrijven van SOP’s, het toezicht op de
dagelijkse toepassing van kwaliteitszorg enz.
3.3.2.2 Accreditatiesysteem
Belgisch accreditatiesysteem
2004 is niet alleen het jaar waarin een nieuwe norm van kracht wordt, het is ook een jaar
waarbij verschillende Belgische accreditatie-instellingen fusioneren tot één overkoepelende
organisatie, n.l. BELAC wordt het Belgisch accreditatiesysteem waar Beltest (de
accreditatie-instelling voor beproevingslaboratoria en keuringsinstellingen) samen met BKO
(de Belgische Kalibratie Organisatie) en Belcert (accreditatie van certificatie-instellingen)
deel van uitmaken. BELAC valt onder de verantwoordelijkheid van de Federale
Overheidsdienst Economie, KMO, Middenstand en Energie. Accreditaties verleend door
BELAC worden erkend door de Belgische Staat.

Tot de beproevingslaboratoria behoren de laboratoria voor klinische biologie, maar

evengoed behoren hiertoe de laboratoria die beton onderzoeken of textiel enz…
Voor al deze laboratoria was Beltest dus tot 2004 de officieel erkende instelling die een
Belgisch accreditatiecertificaat kon verlenen. Beltest bleef hiervoor verantwoordelijk tijdens
de overgangsfase tot de nieuwe BELAC-structuur volledig operationeel was. Om het
certificaat te bekomen moet de werking van een laboratorium beantwoorden aan de
hogergenoemde norm(en).
Internationale erkenning
Er bestaan verschillende internationale accreditatie-organisaties waar BELAC voor België
deel uitmaakt: EA (European Co-operation for Accreditation), ILAC (International
Laboratory Accreditation Co-operation) en IAF (International Accreditation forum).
Door het afsluiten van multilaterale erkenningen binnen deze groeperingen, wordt de
competentie van een labo, dat door BELAC geaccrediteerd is, automatisch in een ander
(aangesloten) land aanvaard. Op zijn beurt erkent BELAC de accreditaties die uitgereikt
worden door andere aangesloten organisaties.
3.3.2.3 Accreditatieprocedure
De accreditatieprocedure verloopt in verschillende stappen die hieronder opgesomd

worden:
het labo doet bij BELAC een aanvraag voor de accreditatie (voorlopig nog op vrijwillige
basis).
- Pre-audit: dit is een oriënterend bezoek van de hoofdauditeur en de coördinator aan
het labo (±1250 €)
- audit: het audit-team komt naar het labo en evalueert en rapporteert op basis van de
BELACcriteria (± 2500 € - 10 000 €)
- Een positief advies wordt voorgelegd aan de Minister van Economische Zaken voor
bekrachtiging van het accreditatiecertificaat dat 3 jaar geldig is.
Een certificaat is dus beperkt geldig, waardoor het geregeld moet vernieuwd worden.
Tijdens de geldigheidsduur van het accreditatiecertificaat worden jaarlijkse controles
uitgevoerd (± 1000 – 2500 €). De kostprijs van een vernieuwing van het certificaat
bedraagt ±30% van de eerste audit.
Deze prijzen zijn niet meer actueel, maar zij geven toch weer dat een
accreditatieprocedure véél geld kost.

3.3.2.4 Voor -en nadelen van accreditatie voor een laboratorium
Voordelen
Een accreditatie levert een aantal voordelen op zoals:
- Een formele erkenning van competentie door een onafhankelijke, algemeen aanvaarde
organisatie.
- Een verbetering van de concurrentiepositie.
- Een verbetering van het systeem van interne kwaliteitsevaluatie.
- Het up-to-date houden van het documentatiesysteem.
- …..
Nadelen
Vanzelfsprekend zijn er aan een accreditatie ook een aantal nadelen verbonden zoals:
- extra kosten.
- arbeidsintensief.
- gezichtsverlies bij niet slagen.
- ….
3.3.2.5 Voordelen van accreditatie voor de klant.
Samenwerken met een geaccrediteerd labo heeft ook voor de klanten een aantal voordelen
zoals:
- De zekerheid dat het labo voldoet aan internationaal erkende normen.
- De klant moet zelf niet over de nodige competenties beschikken om de kwaliteit van
het labo te controleren, vermits BELAC daarvoor garant staat.
Opmerking
Zoals hoger vermeld kost het verkrijgen en behouden van een accreditatiecertificaat veel
geld. In (niet-medische)laboratoria worden deze extra kosten vaak meegerekend voor het
bepalen van de prijs die de klant betaalt.
In medische laboratoria vallen deze extra kosten vrijwel volledig ten laste van het
laboratorium, vermits het RIZIV de terugbetalingstarieven voor laboratoriumonderzoeken
vastlegt en een medisch laboratorium aan wettelijk vastgelegde eisen moet voldoen. De
klant krijgt dus wel extra garanties, maar voelt er financieel nauwelijks wat van.

In het Belgisch staatsblad van 30.12.1999 2de editie staan de nieuwe erkenningscriteria
voor de laboratoria voor klinische biologie van het K.B. van 3.12.1999.
In het tijdschrift van de BVLT (Belgische Vereniging van Laboratorium Technologen), in
Focus Diagnostica, in het Nederlands tijdschrift voor klinische chemie e.a. staan geregeld
artikels i.v.m. normen, het kwaliteitssysteem en accreditatie.

DEEL III - Hematologie
DEEL III – HEMATOLOGIE
4 BLOEDCELLEN
4.1 Hematologie-analyzers
4.1.1 Inleiding
Hematologie-analyzers zijn multiparametertoestellen: ze kunnen meerdere parameters in een

staal analyseren. De principes voor de analysen zijn toestelafhankelijk. Meestal wordt bij de pre-
analytische fase van het bloedonderzoek ingegeven in de computer welke parameters de arts
heeft aangevraagd. Elk staal krijgt op die manier een staalnummer toegewezen a.d.h.v. een
barcode. Via het computersysteem (LIS = laboratorium informatica systeem) van het labo
worden deze staalnummers (met aangevraagde parameters) doorgestuurd naar de hematologie-
analyzer. Als het staal aan het toestel wordt aangeboden leest het toestel de barcode van het
staal en op die manier weet het toestel welke parameters op elk staal moeten uitgevoerd
worden. De laborant(e) kan zelf ook aan het toestel opgeven welke parameters er geanalyseerd
moeten worden (v.b. alle parameters behalve de reticulocyten of alleen reticulocyten.)
Hieronder volgt een lijst van parameters die in de routine vaak weergegeven worden:
erytrocyten (aantal) leucocyten (aantal)
hemoglobine leucocyten (differentiatie: absoluut, in%)
hematocriet trombocyten (aantal)
MCV MPV
MCH MPW
MCHC reticulocyten (aantal, absoluut, in %)
RDW

Een deel van deze resultaten wordt gemeten en berekend (v.b. de telling van de leucocyten) een
ander deel wordt alleen berekend (v.b. RDW).
Analyzers bieden een aantal voordelen t.o.v. manuele bepalingen:

- ze kunnen op korte tijd een grote hoeveelheid stalen verwerken.
- microvolumes bloed volstaan om alle parameters te bepalen (ongeveer 30-200 µl)
- de resultaten van de tellingen en de differentiatie berusten op de analyse van een groot
aantal cellen
- meerdere toestellen kunnen aan elkaar gekoppeld worden tot een “hematologiestraat (v.b.
een combinatie van meerdere analyzers, een combinatie van een analyzer met een toestel
dat bloedstrijken maakt en kleurt).
- analyzers kunnen ook verbonden worden met computerprogramma’s die instaan voor de
rapportering aan artsen en/of verwerking van de statistische gegevens (v.b. van interne en
externe controles) en/of voor de patiëntvolgsystemen (waarbij de evolutie van de resultaten
van een test in de loop van een periode per patiënt opgevraagd kan worden).
Ondanks de voordelen blijven het screeningstoestellen.
Bij normale resultaten moeten er geen verdere stappen ondernomen worden en is directe
rapportering mogelijk.
Bij een afwijkend resultaat moet er eerst een controle uitgevoerd worden: dit kan door een
nieuwe meting te doen op hetzelfde toestel, en/of door een andere methode te gebruiken (vaak
manuele controle van de bloeduitstrijk).
Vooral bij differentiatie van de leucocyten kan zekerheid/juistheid gebracht worden door dan
gebruik te maken van een hemato-flow.
Pas als het resultaat bevestigd wordt of gecorrigeerd is, kan het gerapporteerd worden.
Hieronder worden enkel fabrikanten vermeld die hematologie-analyzers verdelen:
Sysmex:SF en SE reeks, Abbot: Cell-dyn reeks, Bayer: Technikon reeks en ADVIA, Analis:
Beckman Coulter reeks, ….

4.1.2 Algemene principes
Er zijn veel fabrikanten van hemocytometrie apparatuur. Elke fabrikant heeft zijn eigen
onderzoekstechnieken op eigen apparatuur ontwikkeld en geoptimaliseerd. Alle technieken
kunnen niet afzonderlijk besproken worden, daarom volgt een weergave van de meest
gebruikelijke technieken.
• In één toestel zitten verschillende meetprincipes:
Spectrofotometrie (hemoglobine meting)

Hydrodynamische focussering
 Impedantie
 Hematocriet bepaling
 Fluorescent flow cytometrie:
- WDF kanaal: White Differentiation Fluorescence kanaal: telling en
differntiatie van de witte bloedcellen (WBC)
- WNR-kanaal: White Nucleated Red kanaal: WBC, basofielen en NRBC
(Nucleated red blood cells) of erytroblasten
Om de verschillende technieken tegelijkertijd op het bloedmonster te kunnen uitvoeren wordt het

bloed na opzuigen verdeeld over verschillende kanalen.
• Voordat het bloed in de meetkanalen gaat, wordt het eerst in kleine buisjes in een cilinder
(Sample Rotor Valve = SRV) opgezogen.
• Nadat voldoende bloed is opgezogen draait de SRV zodanig dat de buisjes exact aansluiten op
de verschillende meetkanalen.
• Deze methode maakt het mogelijk dat het exacte benodigde volume naar het juiste
meetkanaal geleid wordt.

4.1.2.1 Spectrofotometrie: meten van hemoglobine
Spectrofotometrie wordt gebruikt om de concentratie hemoglobine in bloed te meten. Vroeger

werd hiervoor het zéér giftige cyanide-reagens gebruikt, maar tegenwoordig worden er minder
milieubelastende chemicaliën gebruikt.
Een veel gebruikte techniek berust op binding van bepaalde groepen van het hemoglobine-eiwit
aan Sodium Lauryl Sulfaat = SLS, een zeepachtig reagens (lyseert eerst de RBC))
Door deze binding verandert het eiwit van vorm en vindt er oxidatie van het ijzer(II)ion plaats.
Het ontstane ijzer(III)ion bindt aan SLS en de kleurintensiteit van deze stabiele verbinding
kan gemeten worden met een spectrofotometer.
Deze spectrofotometer is ingebouwd in de celteller en meet de ontstane kleur bij een golflengte
van 535-560 nm.
4.1.2.2 Hydrodynamische focussering:
• Hydrodynamische focussering is één van de basisprincipes van de hemocytometrie (Figuur

1)
• Dit principe wordt in bijna elke celteller toegepast en is een manier om cellen te tellen.
• In het apparaat wordt een verdund bloedmonster in een conische (kegelvormige) kamer
gespoten
• In deze kamer stroomt (sheat-)vloeistof, die met een bepaalde snelheid het apparaat in
wordt gezogen.
• De cellen uit het bloedmonster worden door deze sheath vloeistof één voor één door een
zeer smalle opening (flowcel) geleid.
• Rond de smalle opening zijn elektroden aanwezig waarmee verschillende eigenschappen van
de cel gemeten kunnen worden.
• Doordat de cellen één voor één door de flowcel stromen, kan elke cel afzonderlijk met
verschillende meetprincipes beoordeeld worden.
Figure 1: Principe van hydrodynamische focussering

 Impedantiemeting: Tellen van rode bloedcellen en trombocyten
• Voor de impedantiemeting is aan weerszijde van de flowcel een elektrode aanwezig
• Tussen de elektroden loopt een stroom
• Wanneer de cel de flowcel passeert, verandert de weerstand tussen de elektroden.
• Deze weerstand veroorzaakt een elektrische pulsverandering
• Door het aantal pulsveranderingen te meten kan het aantal cellen gemeten worden van
het bloedmonster.
• De grootte van de pulsverandering is evenredig met het volume van de cel.
Figure 2: impedantiemeting
• Dit principe wordt gebruikt voor het meten van erytrocyten en trombocyten.
• Weergave a.d.h.v. een histogram (aantal cellen tov het volume van de cellen) (Figuur 4-2)
Figure 3: Histogram van erytrocyten

 Hematocriet-bepaling in een analyzer
Hematocriet = is het volume van het bloed dat door de rode bloedcellen of erytrocyten wordt
ingenomen, weergegeven als een fractie van het totale bloedvolume.
• Referentiemethode = capillair-centrifuge methode (zie 4.4.4 Bepaling hematocriet)

• Analyzer methode = cumulative pulse height detection.
De impedantiemethode is een manier om de hematocriet te bepalen. De hoogte van één puls =

volume van één RBC. De totale som van het aantal hoogtes van de pulsen wordt herleid tot de
hematocriet-waarde.
Bij de referentiemethode (capillair-centrifuge methode) is plasma aanwezig na centrifugatie.
Plasma is niet aanwezig bij de meting in een analyzer maar wordt elke puls van de impedantie
opgeteld. Het toestel corrigeert automatisch om de hematocriet meting gelijk te stellen aan de
referentiewaarde door te vermenigvuldigen met factor K.
Figure 4: hematocriet bepaling

 Fluorescent flow cytometrie
1) WDF-kanaal: White differentiation Fluorescence kanaal: telling en differentiatie van de

WBC
BASIS:
Hoeveelheid bloed wordt opgezogen en vermengd met reagentia
- Lysercell : lyse van de RBC en perforatie van de celwand van de WBC

- Fluorocell: fluorocell dringt via de geperforeerde celwand binnen en kleurt RNA/DNA
inhoud van de cel
Het mengsel (bloed + reagens) wordt gestuurd naar de flowcel waarbij iedere cel netjes voorbij
de laser passeert en wordt gedetecteerd. A.d.h.v. bepaalde karakteristieken van de cel, zal deze
cel licht op een bepaalde manier verstrooien zodat we informatie kennen over elk type cel.
Binnen de analyzer zijn er 3 detectoren om het verstrooide licht op te vangen:
FSL= Forward Scattered Light: voorwaartse lichtverstrooiing → grootte van de cel
SSL= Side Scattered Light: zijwaartse lichtverstrooiing → interne structuur van de cel
SFL= Side Fluorescent Light: zijwaartse fluorescerend licht → indicatie RNA/DNA van de
celkern
Via bovenstaande informatie kan een 3 dimensionaal/2 dimentioneel scattergram worden

opgesteld:
3-assen: X-as: SFL, Y-as: SSL, Z-as: FSL 2-assen: X-as: SSL, Y-as: SFL
Figure 5: 3-dimensionaal scattergram Figure 6: 2-dimensionaal scattergram

Forward Scatterd Light Side Scatter Light - Side Fluorescent Light
Figure 7: Voorwaartse lichtverstrooiing Figure 8: Schematische weergaven van FSC en SSC
Immature Granulocyten:
Dit zijn reactieve, jonge cellen (blasten)

die hard werken en veel meer RNA/DNA
hebben, waardoor er meer kan
aangekleurd worden en bovenaan in het
scattergram liggen.

Figure 9: Scattergram van het WDF-kanaal
In het WDF-kanaal worden de verschillende type WBC gedifferentieerd.

Echter wordt in dit kanaal geen onderscheid gemaakt tussen neutrofielen en basofielen. Ze
worden in dit kanaal samen gemeten.
Lymfocyten hebben een weinig complex kern en liggen daarom links in het scattergram.
Monocyten zijn iets complexer door vacuolisatie en liggen iets rechtser in het scattergram dan de
lymfocyten.
Neutrofielen en basofielen hebben gesegmenteerde kernen en liggen rechts van het scattergram
Eosinofielen zijn het meest complexe omdat het reagens de rode korrels kristalliseert en hierdoor
veel side scatter zal vertonen waardoor deze helemaal rechts in het scattergram terug te vinden
zijn.

2) WNR-kanaal: White Nucleated Red channel
In dit kanaal worden de WBC, basofielen en NRBC of erytroblasten gemeten.
Hoeveelheid bloed wordt opgezogen en vermengd met reagentia
- Lysercell : lyse van de RBC en perforatie van de celwand van de WBC

- Fluorocell: fluorocell dringt via de geperforeerde celwand binnen en kleurt RNA/DNA
inhoud van de cel
In dit kanaal gebeurt een mini differentiatie van de WBC en basofielen
- Door het reagens krimpen alle WBC behalve de basofielen waardoor de basofielen groter
zijn dan alle andere WBC en deze in het scattergram bovenaan rechts bevinden.
- Scattergram:
X-as: SFL: fluorescerend aangekleurd RNA/DNA
Y-as: FSL: grootte van de cel
Figure 10: scattergram van het WNR-kanaal

In het WNR kanaal worden eveneens mogelijke aanwezigheid van NRBC of erytroblasten
gemeten
Dit type van cellen geeft afwijkende resultaten voor de leucocytentelling, waardoor deze NRBC’s
apart moeten gemeten worden.
 Het zijn gekernde cellen waarbij de celkern intact blijft na lysis van de erytrocyten
 Ze worden meegeteld als leucocyten in de flowcytometer
 Door fluorocell wordt RNA/DNA van de cel aangekleurd
 RNA van WBC > RNA van NRBC: Bij NRBC wordt minder RNA aangekleurd
→ NRBC liggen links in het scattergram
Figure 11: scattergram WDF-kanaal Figure 12: scattergram in WNR kanaal
Let op de assen van de 2 soorten scattergrammen!

4.1.3 Resultaten
Resultaten kunnen zowel numeriek als in één of meerdere histogrammen en scattergrammen

weergegeven worden, o.a. telling van RBC, WBC en trombocyten.
Resultaten kunnen alleen numeriek weergegeven worden, o.a. hemoglobine, hematocriet.
Resultaten kunnen enkel weergegeven worden na berekening door de analyzer zelf op basis van
gemeten resultaten, o.a. RDW, MCV, MCH, MCHC, differentiatie van WBC in %, …..
Naast de resultaten worden ook verschillende meldingen of boodschappen aan de analist(e)

meegedeeld. Ze kunnen in drie grote groepen ingedeeld worden:
- ‘Vlaggen’ = ‘flags’: dit zijn meldingen die aangeven dat de bovenste-of onderste
grenswaarden van een bepaalde test overschreden werden (v.b. het aantal neutrofielen ligt
lager dan 1,0 x 103/µL)
- ‘Interpretaties’ = ‘messages’: zij geven suggesties i.v.m. de afwijking waarvoor een vlag
waarschuwt (vb in geval van de bovenste vlag: neutropenie).
- ‘Foutmeldingen’ = ‘errors’: zij geven aan dat het toestel geen resultaten kan leveren omdat
er teveel afwijkende waarden worden gevonden of omdat er technische problemen zijn (vb
reagens is op, er werd te weinig bloed opgezogen).
Referentiewaarden voor leucocyten
Flowcytometers drukken de verschillende leucocytenfracties uit in absolute waarden. Deze

methode heeft het voordeel dat direct kan vastgesteld worden of er een fractie verhoogd of
verlaagd is en zo ja welke.
Relatieve resultaten (uitgedrukt in %) zoals bij een bloeduitstrijk kunnen eventueel berekend
worden. Het nadeel hierbij is dat een verhoging van de ene fractie een daling van de andere
fractie voor gevolg heeft.
Absolute referentiewaarden:
Neutrofiele granulocyten : 2,00 x 109 – 7,00 x 109/L
Eosinofiele granulocyten : 0,05 x 109 – 0,40 x 109/L
Basofiele granulocyten : < 0,10 x 109/L
Lymfocyten : 1,00 x 109 – 3,50 x 109/L
Monocyten : 0,15 x 109 – 0,75 x 109 /L
Voor de relatieve referentiewaarden van de verschillende leucocytenfracties wordt verwezen naar

het hoofdstuk 5.4.8 bloeduitstrijk.

Figure 13: protocol/resultaat van een hematologie analyzer

4.2 Oplossingen voor hematologie
Lees steeds de informatie die op het etiket van een product vermeld wordt. In de
veiligheidsdocumentatiekaft kan je de betekenis van de R/S-zinnen en gevaarsymbolen
opzoeken.
4.2.1 Tellen van leucocyten
→ Veiligheidsbril , handschoenen, hot
- Bereiding : azijnzuur 3 mL
methyleenblauw 1 mL
gedist. water aanvullen tot 100 mL
- Filtreer de oplossing
- Bewaar de oplossing op kamertemperatuur.
4.2.2 Tellen van erytrocyten
→ Veiligheidsbril, handschoenen, hot
- Bereiding : NaCl (p.a.) 9g

EDTA Na-zout 3% 0,6 mL
Formaldehyde 35% 0,72 mL
Tris 1,5 g
Gedist. water aanvullen tot 1 L
- Bewaar de oplossing op kamertemperatuur.
EDTA = ethyleendiamine-tetra-azijnzuur (Na-zout)

Tris = tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan.

4.2.3 Tellen van reticulocyten
→ Veiligheidsbril, handschoenen.
- Bereiding: New-Methyleenblauw 0,5 g

Ammoniumoxalaat (p.a.) 1,6 g
Gedist. water aanvullen tot 100 mL
- Filtreer de oplossing
- Bewaar de oplossing op 4°C
4.2.4 Tellen trombocyten
→ Veiligheidsbril, handschoenen, hot
- Bereiding: Ammoniumoxalaat (p.a.) 1g

Gedist. water aanvullen tot 100 mL
- Filtreer de oplossing voor gebruik

- Bewaar de oplossing op 4°C
4.2.5 Fysiologische zoutoplossing
- Bereiding: NaCl (p.a.) 8,5 g

Gedist. water aanvullen tot 1 L
- Bewaar de oplossing op 4°C of maak geregeld een verse oplossing.

4.2.6 Bloeduitstrijkje
Oplossingen
- Methanol (p.a.) (minder dan 0,05% water): aangekochte fles
- Sφrensen-buffer: zelf bereiden
- May-Grünwald: aangekochte fles
- Giemsa: aangekochte fles
Bewaar de oplossingen op kamertemperatuur.
Sφrensen Buffer pH 6,8
Voorbereiding
- Bereiding: gekookt gedist. water
KH2PO4 1/15 M: 9,087g oplossen in gekookt gedist. water en aanvullen
met hetzelfde water tot 1L
Na2HPO4 1/15 M: 11,876g Na2HPO4.2H2O of 9,470g Na2HPO4 oplossen in
gekookt gedist. water en aanvullen met hetzelfde
water tot 1L
Bufferoplossing
- Bereiding: KH2PO4 1/15 M 50,4 mL
Na2HPO4 1/15 M 49,6 mL
Mengen
Gekookt gedist. water: aanvullen tot 1L
- pH moet ±6,8 zijn.

- Maak de bufferoplossing juist voor gebruik.

4.3 Telkamer
De hemocytometer of telkamer wordt gebruikt voor de microscopische telling van cellen in een
suspensie.
O.a. urine, lumbaal vocht, gewrichtsvocht, pleuravocht, sperma, leucocytenarm plasma,….
De telkamer bestaat uit een dik objectglas met één of twee telnetten en een speciaal dekglaasje
dat vastgezet wordt op de verhoogde bruggen van het objectglas (zie figuur 1)
Figure 14: Boven- en zijzicht van een telkamer met dekglas

De totale oppervlakte van het telnet, de hoogte tussen het dekglas en het telnet en de verdeling
van de lijnen in het telnet zijn afhankelijk van het gebruikte type.(zie figuur 5).
In het labo wordt de Improved Neubauer telkamer gebruikt.(zie figuur 6)
Figure 15:Telnet van de Improved Neubauer telkamer.

Een telnet wordt langs opzij met een capillair, die de gewenste suspensie bevat, gevuld. Daarna
wordt de telkamer 5 minuten (grote cellen) en 15 minuten (kleine cellen) in een vochtige
omgeving gebracht (petrischaal met een vochtig doekje) om de cellen te laten bezinken zonder
dat ze daarbij uitdrogen.
De cellen worden geteld met totale vergroting 100x of 400x.
- Hoe meer cellen er in de oplossing aanwezig zijn, hoe kleiner de getelde oppervlakte (zie
telling van de erytrocyten (R)) en omgekeerd (zie telling van de leucocyten (W)) (zie figuur
3).
- Alle cellen die vrij in een te tellen vakje liggen en de cellen die op twee aan elkaar liggende
zijden van een vakje liggen worden meegerekend (zie figuur 4).
- Het is belangrijk dat de telkamer stof- en vetvrij is om het microscopisch onderzoek niet te
storen en dat de cellen homogeen verdeeld zijn.
- De celconcentratie van een staal wordt berekend a.d.h.v. het aantal getelde cellen, het
getelde volume en de verdunning van de gebruikte suspensie.
Figure 16: Ligging van de verschillende vierkanten

Figure 17: Het tellen van cellen

4.4 Praktisch gedeelte: Manuele parameterbepalingen
4.4.1 Tellen van leucocyten
In routinelaboratoria worden de leucocyten meestal geteld met automatische systemen.

De hoeveelheid cellen in een bepaald volume bloed kan ook microscopisch bepaald worden door
gebruik te maken van een telkamer.
Hiervoor moet er eerst verdund worden met een vloeistof die de erytrocyten hemolyseert.
Meestal wordt de concentratie van de leucocyten uitgedrukt per µL of – volgens het

internationaal systeem – per liter bloed.
4.4.1.1 Staal
EDTA-bloed
4.4.1.2 Materiaal
- Droog hematologiebuisje
- Proefbuisrek
- Pipettip voor 20 µL
- Eppendorf pipet
- Verdunningsvloeistof voor leucocyten (zie ‘Oplossingen voor hematologie’)
- Parafilm
- Capillair of fijne pipet om telnet te vullen
- Telkamer : Improved Neubauer
- Vochtige kamer (petriplaat met vochtig papier)
- Microscoop met objectief 10x of 40x
- Beker voor afval en gebruikt materiaal.

4.4.1.3 Werkwijze
Voorbereiding
- Breng 0,38 mL verdunningsvloeistof in een hematologiebuisje
- Neem 20 µL bloed (gemengd) en veeg de pipettip aan de buitenzijde af
- Voeg het bloed toe aan de verdunningsvloeistof en spoel de pipettip enkele malen in de
oplossing
- Sluit het buisje af met parafilm en meng de oplossing
- Laat de oplossing enkele minuten staan
- Meng de oplossing opnieuw
- Vul een telkamer
- Laat de cellen 5’ – 10’ bezinken in een vochtige kamer
- Tel de cellen met objectief 10x of 40x
Telling
- Gebruik de vier hoekvierkanten van het telnet (zie figuur 3)
- Tel de cellen in de vier vierkanten van ieder 1 mm2
Berekening
- Bereken het getelde volume: 4 mm2 x 1/10 mm = 4/10 mm3 = 4/10 µL
- Bereken het aantal cellen per µL bloed : aantal getelde cellen in vier vierkanten x 10/4
(getelde volume 4/10 mm3) x 20 (verdunning 1/20)
- Bereken het aantal cellen per liter bloed : aantal cellen/µL x 106
4.4.1.4 Referentiewaarden
Vrouwen: 3,9 x 103 – 11,1 x 103/µL of 3,9 x 109 – 11,1 x 109/L

Mannen : 3,7 x 103 – 9,5 x 103/µL of 3,7 x 109 – 9,5 x 109/L
Voor jonge kinderen liggen de referentiewaarden hoger.
4.4.1.5 Foutenbronnen
- Pipetteerfouten
- Bloed en/of verdunde oplossing zijn niet goed gemengd
- Tel- en berekeningsfouten
- Contaminatie van de verdunningsvloeistof
- Veel gekernde erytrocyten,….

4.4.2 Tellen van erytrocyten
In routinelaboratoria worden de erytrocyten geteld met automatische systemen.
De hoeveelheid cellen in een bepaald volume bloed kan ook microscopisch bepaald worden door
gebruik te maken van een telkamer. Hiervoor moet het bloed eerst verdund worden met een
isotonische vloeistof.
Meestal wordt de concentratie van de erytrocyten uitgedrukt in µL of –volgens het internationaal

systeem – per liter bloed.
4.4.2.1 Staal
EDTA-bloed
4.4.2.2 Materiaal
- Proefbuisrek
- Pipettip voor 20 µL
- Eppendorf pipet
- Verdunningsvloeistof voor erytrocyten (zie ‘Oplossingen voor hematologie’)
- Parafilm
- Capillair of fijne pipet om telnet te vullen
- Telkamer : Improved Neubauer
- Vochtige kamer (petriplaat met vochtig papier)
- Microscoop met objectief 10x of 40x
- Beker voor afval en gebruikt materiaal.
4.4.2.3 Werkwijze
Voorbereiding
- Breng 1990 µl (of 1,99 mL) verdunningsvloeistof in een hematologiebuisje
- Meng het te onderzoeken EDTA-staal
- Neem 10 µL bloed en veeg de pipettip aan de buitenzijde af

oplossing
- Laat de oplossing 10’ staan
- Meng de oplossing opnieuw
- Vul een telnet
- Tel de cellen met objectief 10x of 40x
Telling
- Gebruik het middelste grote vierkant van het telnet (zie figuur 3)
- Tel de cellen in 5 vierkanten van ieder 1/25 mm2. De vierkanten moeten verspreid liggen in
het centrale vierkant
Berekening
- Bereken het getelde volume: 5/25 mm2 x 1/10 mm = 1/50 mm3 = 1/50 µL
- Bereken het aantal cellen per µL bloed: aantal cellen x 50 (getelde volume 1/50 mm3) x 200
(verdunning 1/200)
- Bereken het aantal cellen per liter bloed: aantal cellen/µL x 106
Vrouwen: 3,88 x 106 – 4,99 x 106/µL of 3,88 x 1012 – 4,99 x 1012/L

Mannen: 4,32 x 106 – 5,66 x 106/µL of 4,32 x 1012 – 5,66 x 1012/L
- Pipetteerfouten
- Bloed en/of verdunning zijn niet goed gemengd
- Contaminatie van de verdunningsvloeistof

4.4.3 Bepaling van hemoglobine

4.4.4 Bepaling van hematocriet
De hematocriet geeft de verhouding van het volume rode bloedcellen t.o.v. het bloedvolume
waarin de cellen aanwezig zijn.
Soms wordt ook de term ‘Packed Cell Volume’ of PCV in de plaats van hematocriet gebruikt.
De hematocriet wordt uitgedrukt als percentage of in L/L, volgens het internationaal systeem.
4.4.4.1 Staal
EDTA-bloed
vers capillair bloed
4.4.4.2 Materiaal
- 2 hematocrietcapillairen: zonder anticoagulans voor EDTA-bloed

- Plasticine
- Hematocrietcentrifuge
- Hematocrietafleestoestel
4.4.4.3 Werkwijze
- Vul de capillairen voor ¾ met bloed (2 capillairen per staal)

- Sluit één uiteinde af met plasticine
- Veeg de capillairen aan de buitenzijde af
- Schik de capillairen in de centrifuge
• Het plasticine uiteinde ligt aan de buitenkant
• Zorg dat er evenwicht is
• Noteer de plaatsen in de centrifuge die overeenkomen met het staal
- Sluit het centrifugedeksel en de centrifuge
- Centrifugeer 6’
- Lees de hematocriet af met behulp van het afleestoestel

Figure 18: Afleestoestel hematocriet
Vrouwen: 36 – 44 % of 0,36 – 0,44 (L/L)

Mannen: 39 – 50 % of 0,39 – 0,50 (L/L)

4.4.5 Tellen van trombocyten
In routinelaboratoria worden de trombocyten geteld met automatische systemen.
De hoeveelheid trombocyten in een bepaald volume bloed kan ook microscopisch bepaald
worden door gebruik te maken van een telkamer.
Hiervoor moet het bloed eerst verdund worden.
Meestal wordt de concentratie van de trombocyten uitgedrukt per µL of, volgens het
internationaal systeem, per liter bloed.
Hoewel EDTA het standaard coagulans is voor de trombocyten, kan het soms aanleiding geven
tot klompvorming (aggregatie) van de bloedplaatjes. De telling geeft in dit geval een foutief laag
resultaat. Aggregatie van geactiveerd plaatjes of satellitisme kunnen eveneens resulteren in een
schijnbare trombocytopenie.
Lage resultaten van een analyser moeten gecontroleerd worden door een visuele beoordeling van
de bloeduitstrijk voor ze geïnterpreteerd mogen worden.
Bij een manuele telling valt de aggregaat vorming meteen op. Een controle van de bloeduitstrijk
kan deze vaststelling bevestigen.
Bij een pseudotrombopenie als gevolg van EDTA, moet de telling herhaald worden op een
bloedstaal dat onstolbaar gemaakt is met een ander anticoagulans (vb citraat). In andere
gevallen kan de analyse herhaald worden in een nieuw EDTA-bloestaal.
In EDTA-bloed zwellen de trombocyten, waardoor de waarde van de MPV-analyse groter is dan

de werkelijke waarde. De mate van de MPV-verandering is per staal afhankelijk van de tijd
tussen de bloedname en analyse en varieert bovendien van monster tot monster.
In EDTA-bloed ontstaan er ook vrij vlug pseudopodiën waardoor de trombocyten van vorm
veranderen.

4.4.5.1 Staal
EDTA-bloed
Vers capillair bloed
4.4.5.2 Materiaal
- Hematologiebuisje
- Proefbuisrek
- Pipettip voor 20 µL en 1000 µL
- Eppendorf pipet (10-100 µL en 100 – 1000 µL)
- Gefiltreerde verdunningsvloeistof voor trombocyten (zie oplossingen voor hematologie)
- Parafilm
- Capillair of fijne pipet om telkamer te vullen
- Zuivere telkamer : Improved Neubauer
- Vochtige kamer (petriplaat met vochtig doekje)
- Bekers voor gebruikt materiaal en afval
4.4.5.3 Werkwijze
Voorbereiding
- Breng 1mL verdunningsvloeistof in een hematologiebuisje
- Meng het te onderzoeken EDTA-bloed
- Neem 20 µL bloed en veeg de pipettip aan de buitenzijde af (met papieren doekje)
oplossing
- Laat de oplossing 10’ staan
- Meng de oplossing opnieuw en vul het telnet
- Tel de cellen met objectief 10x of 40x met de gewone microscoop of met objectief 20x en
fasecontrast met de fasecontrastmicroscoop

Telling
- Gebruik het middelste grote vierkant van het telnet (zie figuur 3)
- Tel de cellen in 12,5 vierkanten van ieder 1/25 mm2
Berekening
- Bereken het getelde volume: 12,5/25 mm2 x 1/10 mm = 1/20 mm3 = 1/20 µL
- Bereken het aantal cellen per µL bloed: aantal getelde cellen x 20 (getelde volume 1/20
mm3) x 50 (verdunning 1/50)
- Bereken het aantal cellen per liter bloed: aantal cellen/µL x 106
Vrouwen: 169 x 103 – 358 x 103/µL of 169 x 109 – 358 x 109/L

Mannen: 143 x 103 – 332 x 103/µL of 143 x 109 – 332 x 109/L
- Pipetteerfouten
- Bloed en/of verdunde oplossing zijn niet goed gemengd
- Niet gefiltreerde verdunningsvloeistof
- Stofdeeltjes in de buis, pipetpunt, telkamer

4.4.6 Erytrocytaire parameters en RDW
De erytrocytaire parameters geven bijkomende informatie over de rode bloedcellen en worden

meestal berekend in automatische hematologie-analysers Met de onderstaande formules kunnen
ze ook manueel bepaald worden.
De spreiding van de rode bloedcellen volgens volume wordt uitgedrukt in de Relatieve

Distributie Wijdte van de erytrocyten of RDW. De referentiewaarde is toestelafhankelijk en
wordt niet manueel berekend.
4.4.6.1 Formules
Het gemiddelde erytrocytenvolume = mean corpuscular volume of MCV
𝐿𝐿
ℎ𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 �𝐿𝐿� . 1000
𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 = 𝑓𝑓𝑓𝑓
𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 � 𝐿𝐿 � . 10−12
De gemiddelde corpusculaire hemoglobine = mean corpuscular hemoglobin of MCH
𝑔𝑔
𝐻𝐻𝐻𝐻 � � . 10
𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 = 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑝𝑝𝑝𝑝
𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 � 𝐿𝐿 � . 10−12
De gemiddelde hemoglobineconcentratie van de erytrocyten = mean corpuscular

hemoglobin concentration of MCHC
𝑔𝑔
𝐻𝐻𝐻𝐻 � � 𝑔𝑔
𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 = 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑛𝑛
𝐿𝐿 𝑑𝑑𝑑𝑑
ℎ𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 (𝐿𝐿)

MCV (volwassenen): 82 -98 fL

MCH (volwassenen): 27,3 – 32,6 pg
MCHC: 31,6 – 34,9 g/dL
4.4.6.3 Gebruik van de parameters en RDW
MCV normaal : normocytair

gestegen : macrocytair
gedaald : microcytair
MCH wordt vooral gebruikt voor het opsporen van een ongecompliceerde stoornis in de
aanmaak van hemoglobine.
MCHC normaal : normochromie

gestegen : hyperchromie (komt zelden voor)
gedaald : hypochromie
RDW gestegen : anisocytose (anisovolumie)
Opmerkingen
De resultaten van deze parameters kunnen vergeleken worden met het rode bloedbeeld in een
perifere bloeduitstrijk.
Zoals de MCV en de RDW geven automaten soms ook de resultaten van het gemiddelde volume
van de trombocyten = mean platelet volume = MPV en de spreiding van de trombocytengrootte
= PDW. De perifere bloeduitstrijk maakt hier ook een vergelijking mogelijk.

4.4.7 Tellen van reticulocyten
De reticulocyten zijn jonge rode bloedcellen waarin nog RNA, kleine mitochondriën en ribosomen
aanwezig zijn.
Na een vitale kleuring is een granulair netwerk in de cellen zichtbaar bij microscopisch
onderzoek.
Het resultaat wordt uitgedrukt in procent of als aantal reticulocyten per 100 erytrocyten. Bij een
manuele telling wordt geen onderscheid gemaakt tussen de verschillende rijpingsstadia van de
reticulocyt.
Deze methode wordt tijdens het practicum uitgevoerd.
Reticulocytenflowcytometers labelen eerst de cellen met een fluorescerende kleurstof (v.b.

auramine O, acridine-orange) die bindt met DNA en RNA. Vervolgens worden de cellen geteld en
ingedeeld volgens grootte en intensiteit van de fluorescentie. De cytometer telt zowel
erytrocyten, reticulocyten, erytroblasten en leucocyten.
Erytroblasten en leucocyten bezitten veel kernmateriaal zodat ze sterk fluoresceren: zij komen
niet voor op het scattergram voor reticulocyten. Om dezelfde reden vallen erytrocyten met
Howell Jolly bodies buiten de referentiewaarden van het scattergram. Trombocyten en
erytrocyten komen wel voor op het scattergram voor reticulocyten. De fluorescentie van
erytrocyten is te wijten aan aspecifieke bindingen van het fluorochroom aan de cellen.
Automatische discriminatoren zorgen voor de scheidingslijnen tussen de verschillende populaties.
Door de aanwezigheid van RNA fluoresceren de reticulocyten. Op basis van hun fluorescentie-
intensiteit kunnen ze verder opgesplitst worden in drie subgroepen:
- HFR : de groep met de meest onrijpe reticulocyten (die dus nog veel RNA bevatten) behoort
tot de “High Fluorescence Ratio” = HFR
- MFR : de groep met een middelmatige hoeveelheid RNA behoort tot de “Middle Fluorescence
Ratio” = MFR, het zijn de reticulocyten in het tussen stadium.
- LFR : de groep met de meest rijpe reticulocyten (die nog weinig RNA bevatten) behoort tot
de “ Low Fluorescence Ratio” : LFR

De resultaten van de fracties kunnen uitgedrukt worden in absolute waarden en/of in %.

De opsplitsing in ondergroepen maakt het mogelijk om zeer snel uit te maken of vb een
beenmergtransplantatie gelukt is: de HFR fractie verandert veel sneller dan andere parameters
die het herstel kunnen meten. De parameters worden ook gebruikt voor de opvolging van o.a.
anemiën.
4.4.7.1 Staal
EDTA-bloed
4.4.7.2 Materiaal
- Proefbuisrek
- Pasteurpipetten
- Parafilm
- New-Methyleenblauwoplossing (zie ‘Oplossingen voor hematologie’)
- Microscoop met immersieobjectief
- 2 of 3 objectglaasjes voor het preparaat
- 1 objectglaasje om een uitstrijk te maken
- Warmwaterbad van 37°C
- Afvalbeker voor gebruikte pipetten.
4.4.7.3 Werkwijze
Voorbereiding
- Breng 4 druppels New-Methyleenblauwoplossing in een hematologiebuisje
- Voeg 8 druppels bloed toe
- Meng de suspensie
- Sluit het buisje af met parafilm
- Incubeer het buisje 15’ op 37°C (in warmwaterbad)
- Meng de suspensie opnieuw
- Plaats een druppel van de suspensie op een objectglaasje
- Maak 2 uitstrijkpreparaten (of 3 zodat je 1 reserve hebt)
- Laat de preparaten drogen
- Merk de preparaten (initialen, datum)
- Leg een druppel immersie-olie op het preparaat

Telling
- Tel het aantal erytrocyten in een gezichtsveld.
- Bepaal hoeveel gelijkaardige velden er moeten bekeken worden om 2000 erytrocyten te
tellen.
- Tel het aantal reticulocyten per 2000 erytrocyten.
Berekening
- Deel het aantal reticulocyten door 20 om het percentage te kennen of door 2 om het aantal
reticulocyten per 1000 erytrocyten te bekomen.
Pasgeborenen: 2 -7 % of 20 – 70/1000 (reticulocyten/erytrocyten)

Volwassenen: 0,5 – 1,5 % of 5 – 15/1000 (reticulocyten/erytrocyten)
Bij automatische tellingen worden de resultaten uitgedrukt in ‘aantal reticulocyten/µL’ of in

aantal reticulocyten/L
Referentiewaarden bij automatische tellingen: 30.109 – 120.109/L
- Verwarring met stofdeeltjes, kristallen of andere insluitsels

- Telfouten

4.4.8 Bloeduitstrijkje
Door bloed uit te strijken op een objectglaasje en het dan te kleuren, is een microscopische
differentiatie van de leucocyten en een interpretatie van de erytrocyten en trombocyten
mogelijk.
Automaten geven veel informatie over het perifeer bloedbeeld zodat het in dit geval niet meer
nodig is om elk staal manueel te bestuderen. Microscopisch onderzoek blijft wel belangrijk om
sterk afwijkende resultaten te controleren.
De differentiële telling van de leucocyten, uitgedrukt als percentage, geeft het relatieve aantal
cellen van een bepaald type witte bloedcellen. De absolute waarde wordt berekend door de
relatieve waarde te vermenigvuldigen met het totale aantal leucocyten/µL bloed.
4.4.8.1 Staal
EDTA-bloed
4.4.8.2 Materiaal
- Vetvrij objectglaasje (bij het inoefenen heb je meerdere glaasjes nodig)

- Objectglaasje (met gladde rand) om bloed uit te strijken
- Capillair om bloed op het objectglaasje te brengen
- Potlood om het glaasje te merken
- 4 kleurbakjes
- Kleurrekje
- May-Grünwaldkleurstof
- Giemsakleurstof
- Methanol p.a.
- Sφrensen buffer (zie ‘Oplossingen hematologie)
- Magnetische roerder en magneet
- Leidingwater
- Microscoop met immersielens
- Immersie-olie

4.4.8.3 Principe May-Grünwald-Giemsa kleuring
Het principe van deze kleuring is gebaseerd op de binding van zure kleurstoffen (eosine) en
basische kleurstoffen (azuur methyleenblauw), met de kern of het cytoplasma van de cel.
De basische kleurstoffen gaan zure componenten van de cel kleuren, zoals DNA, RNA en granules
van basofielen. Ze krijgen een diep blauw-violette kleur.
De zure kleurstoffen gaan basische componenten kleuren zoals de rode bloedcellen en de
granules van de eosinofielen. Ze krijgen een roze-oranje kleur.
4.4.8.4 Werkwijze
Preparaat
- Maak in totaal 2 preparaten
- Breng 1 druppel bloed aan het uiteinde van het objectglaasje
- Strijk de druppel bloed open over het glaasje zodanig dat de uitstrijk niet te dik, te dun of
onregelmatig is. (zie figuur 6)
- Laat het preparaat drogen aan de lucht
- Merk het preparaat met initialen en datum
- Zet het preparaat in een kleurrekje
- Maak eventueel een derde preparaat als reserve
Figure 19: Het maken van een bloeduitstrijkje

Kleurbakjes
- Breng 200 mL methanol in kleurbakje 1
- Breng 100 mL Sφrensen-buffer en 100 mL May-Grünwaldkleurstof in kleurbakje 2
- Breng 200 mL Sφrensen-buffer in kleurbakje 3
- Breng 200 mL Sφrensen-buffer en 22 mL Giemsakleurstof in kleurbakje 4 en leg er een
magneet en 2 glazen staafjes in
Kleuring
Fixatie Kleuring 1 Spoeling 1 Kleuring 2 Spoeling 2 Droogstap
Inhoud Methanol May- Buffer Giemsa Spoelen /

Grünwald met
kraantjes
water
Tijd 3 min 5 min 1 min 20 min
Microscopisch onderzoek.
Leucocyten
- Zoek voor het tellen van de leucocyten een gedeelte van het preparaat waar de erytrocyten
elkaar nauwelijks tot max. 50% elkaar raken.
Een telling die teveel aan de randen van het preparaat gebeurt, geeft een minder
representatief beeld: grote cellen hebben de neiging om aan de zijkant te liggen terwijl
kleinere cellen zich meer in het midden van het preparaat bevinden.
- Het preparaat kan best beoordeeld worden door de kanteelmethode toe te passen d.w.z. iets
vanaf de rand verticaal naar beneden toe, vervolgens een veld naar opzij en weer terug naar
boven. (zie figuur 7)
- Differentieer 100 leucocyten en druk de resultaten van elke soort (normale en eventuele
jonge vormen, plasmacellen,…) uit in %
- Noteer speciale kenmerken:
Neurofielen: toxische korreling, Döhle lichaampjes, vacuolen in het cytoplasma,
hypersegmentatie,….?
Lymfocyten: atypisch?
…..

Figure 20: Werkwijze voor de differentiatie van leucocyten: kanteelmethode
Erytrocyten
- Zoek een plaats waar de erytrocyten los van elkaar liggen
- Bestudeer de kenmerken van de erytrocyten:
• Grootte: normaal, macrocytair, microcytair, anisocytose?
• Vorm: normaal, poikilocyten, welke vorm van poikilocytose?
• Kleur: normaal, hyperchroom, hypochroom, polychromasie?
• Insluitsels: Howell Jollylichaampjes, basofiele stippeling, lichaampjes van
Pappenheimer, ring van Cabot, malariaparasieten?
• Aantal: normaal, weinig; polycythemie
• Spreiding in het preparaat: normaal, rouleaux, aggregaten?
• Gekernde rode bloedcellen/megaloblasten?
Trombocyten
- Zoek een plaats waar de verdeling van de trombocyten duidelijk waar te nemen is
- Bestudeer de kenmerken van de trombocyten:
• Grootte: normaal, reuzentrombocyten?
• Aantal: normaal, weinig, veel?
• Spreiding in het preparaat: normaal, aggregaten.

Volwassenen: Staafkernige neutrofielen 2-6%

Segmentkernige neutrofielen 55 – 75 %
Lymfocyten 20 – 35 %
Monocyten 2–6%
Eosinofielen 1–3%
Basofielen 0-1%
Kinderen hebben over het algemeen meer lymfocyten, ten koste van de gesegmenteerde
neutrofielen.
Opmerkingen
Voor de absolute referentiewaarden van de verschillende leucocyten fracties wordt verwezen
naar hoofdstuk ‘Hematologie-analyzers’.
De resultaten van het perifeer bloed worden getoetst aan de resultaten van de celtellingen, de
hemoglobineconcentratie, de erytrocytaire parameters en eventueel aan de
trombocytenparameters.

4.4.9 Verwerking resultaten van het praktisch gedeelte
4.4.9.1 Celtelling – hemoglobine – hematocriet – erytrocytaire parameters – reticulocyten
- Zie invulbladen (te vinden op Canvas):

• Invulbladen - manuele parameterbepalingen
4.4.9.2 Inoefenen leucocytendifferentiatie – abnormale erytrocyten
- A.d.h.v. aantal preparaten normale en abnormale bloedcellen (erytrocyten en leucocyten)

herkennen en benoemen
- Zie invulbladen (te vinden op Canvas):
• Invulbladen - manuele parameterbepalingen
• Invulbladen - abnormale erytrocyten in bloedpreparaten
- Interessante app die je kan downloaden op je smartphone bij het differentiëren van
leucocyten en herkennen van abnormale erytrocyten:
CellaVision® CellAtlas

5 BLOEDGROEPEN, ANTIGLOBULINETEST EN KRUISPROEVEN
Er bestaan verschillende bloedgroepsystemen (Kell, Duffy, Lewis, ABO….). Elk systeem omvat
bloedgroep specifieke antigenen die al of niet aanwezig zijn op bloedcellen van een individu.
Het ABO- en het Rhesus systeem zullen verder besproken worden.
5.1 ABO-bloedgroepsysteem
5.1.1 Principe
Het ABO-systeem kent 4 bloedgroepen die verwijzen naar de aan-of afwezigheid van antigeen A
en/of antigeen B. Van het A-antigeen bestaan verschillende subtypen, waarvan A1 het
belangrijkste is.
In aanwezigheid van overeenkomstige antistoffen zullen de rode bloedcellen agglutineren. Bij

erytrocytaire bloedgroepbepaling (antigeenbepaling of voorproef) worden gekende antisera
gebruikt.
In het serum van een individu bevinden zich meestal antistoffen die gericht zijn tegen de
ontbrekende antigenen. Ze worden ‘natuurlijke regelmatige antistoffen’ (anti-A en anti-B)
genoemd omdat ze gevormd worden na een stimulatie van natuurlijk voorkomende
omgevingsfactoren (bv darmbacteriën) die een sterke gelijkenis vertonen met de antigenen van
het ABO-systeem. Het zijn hoofdzakelijk complete antistoffen van het IgM-type (deze zijn sterk
agglutinerend (pentameer) en kunnen ernstige hemolytische transfusiereacties veroorzaken en
zijn optimaal werkzaam op een lagere temperatuur dan 37°C). Na immunisatie kunnen er
immune regelmatige antistoffen van het IgG type gevormd worden (ze ontstaan door
immunisatie na transfusie of zwangerschap. Dit zijn antistoffen van het IgG-type
Bij de tegenproef (antistofbepaling) worden rode bloedcellen met gekende antigenen gebruikt als
controle van de erytrocytaire bloedgroepbepaling
(zie tabel 1).

Tabel 1: ABO bloedgroepen
5.1.2 ABO discrepanties
De bloedgroepbepaling en de tegenproef moeten met elkaar overeenstemmen.

Discrepanties moeten altijd verder onderzocht worden en kunnen o.a. te wijten zijn aan:
- Technische fouten
- Zwakke of ontbrekende antistoffen, v.b. bij pasgeborenen, oudere mensen,
immuundeficiënties
- Zwakke of ontbrekende antigenen, v.b. bij subgroepen van A en/of B, de ziekte van Hodgkin
- Rouleaux vorming, v.b. bij verhoogde globuline- of fibrinogeenconcentratie
- Poly-agglutinatie, v.b. bij bacteriële of virale infecties
- Auto-antistoffen, v.b. bij auto-immuunhemolytische anemie

5.2 Rhesus bloedgroepsysteem
5.2.1 Principe
Er zijn 5 belangrijke rhesus-antigenen: antigeen D, antigeen C, antigeen c, antigeen E en

antigeen e, die al dan niet aanwezig zijn op de rode bloedcellen.
Het D antigeen is hiervan het voornaamste.
Er zijn zowel kwalitatieve als kwantitatieve variaties van het D antigeen bekend onder de
benaming D type VI of D-partieel (kwalitatieve variatie) en zwakke D (kwantitatieve variatie).
Type D VI of D-partieel:
Bij het D type VI of D-partieel heeft de patiënt slechts een aantal epitopen van het rhesus D-
antigeen, waardoor allo-antistoffen kunnen gevormd worden tegen de ontbrekende epitopen na
toediening van rhesus D-positief bloed. Van alle rhesus D-varianten is de D VI-variant de
frequentste (0,02 – 0,04%). Deze partiële D is meer immunogeen en dus sneller in staat om
antistoffen te produceren.
Patiënten met het D VI-antigeen worden in geval van bloedtransfusie beschouwd als rhesus D-
negatief (zodat de vorming van anti-D vermeden wordt).
Antigeen d is tot nu toe nog niet aangetoond. Als er een d gen bestaat, wordt dit beschouwd als
een amorf gen (geen herkenbare delen aanwezig).
Personen met rhesus D type VI of D-partieel, zijn personen met een variant van de D-
bloedgroep.
Het D-antigeen is wel aanwezig, maar deze zijn onvoldoende, partieel ontwikkeld.
Als deze personen rhesus D positief bloed zouden toegediend krijgen, bestaat de kans dat zij
anti-D gaan ontwikkelen.
- Als donor worden deze personen als rhesus D positief beschouwd.
- Als acceptor worden deze personen als rhesus D negatief beschouwd.
Zwakke D:
De patiënt heeft zwakke rhesus D-antigenen, dat wil zeggen: een verminderd aantal rhesus D-
antigenen op de erytrocyten. Van de zwakke rhesus D-antigenen bestaan verschillende klassen
(afhankelijk van het aantal antigenen op de erytrocyten).

De genen D, C of c, E of e, vormen een complex dat in blok wordt overgeërfd. rhesus D

negatieve individuen hebben geen kenmerken van het D gen.
De nomenclatuur volgens Rosenfield komt steeds meer in gebruik. In tabel 2 staan de

benamingen van de belangrijkste rhesusantigenen opgegeven volgens de nomenclatuur volgens
Fisher-Race en volgens die van Rosenfield.
Rhesusantistoffen (anti-D allo antistoffen) worden meestal gevormd na contact met

rhesuspositieve cellen v.b. bij zwangerschap, tijdens de bevalling of na bloedtransfusie. Deze
incomplete antistoffen zijn van het IgG type (kunnen de placenta passeren en hemolytische
ziekte van de pasgeborene veroorzaken) en zijn optimaal werkzaam bij 37°C.
Bij rhesusbepaling kan er geen controle uitgevoerd worden a.d.h.v. een tegenproef, er worden
enkel gekende antisera gebruikt.
Tabel 2: Rhesusbloedgroepen.
5.2.2 Foutieve interpretaties
Foutieve interpretaties kunnen o.a. veroorzaakt worden door:

- Technische fouten
- Rouleaux vorming
- Auto-agglutinatie

5.3 Antiglobulinetest of Coombs test
5.3.1 Inleiding
Antiglobulinetest of Coombs test detecteert immune onregelmatige/irreguliere antistoffen en/of

complement op de oppervlakte van de rode bloedcellen.
Deze ontstaan door immunisatie met vreemde erytrocyten (mogelijk bij zwangerschap of
bloedtransfusie) en zijn van het IgG-type.
Deze rode bloedcellen kunnen geagglutineerd worden na toevoegen van antiglobuline (anti-
humaan globulineserum, Coombs serum) gericht tegen de eerste antistoffen en/of compliment.
De rode bloedcellen moeten gewassen worden voor het anti-globulineserum toegevoegd wordt
om niet gebonden serumproteïnen te verwijderen.
Polyspecifiek anti-humaan globuline is een combinatie van verschillende antistoffen (anti-IgG,

anti-complement) en wordt gebruikt bij de algemene screening. Indien gewenst kan een
specifiek antiglobuline (monospecifiek) gebruikt worden.
De test bestaat in twee varianten: de directe antiglobulinetest en de indirecte

antiglobulinetest.
5.3.2 Directe antiglobulinetest of directe Coombs test
Om na te gaan of de bloedcellen in vivo beladen zijn met IgG antistoffen

(irreguliere/onregelmatige antistoffen) en/of compliment wordt de directe Coombs test
uitgevoerd.
De directe Coombs test detecteert onregelmatige antistoffen die gebonden zijn op het
oppervlakte van de rode bloedcellen zonder agglutinatie van deze cellen onderling te
veroorzaken.
In deze test reageren de antistoffen, die op de rode bloedcellen gebonden zijn, met een tweede
antistof die gericht is tegen de antistoffen op de rode bloedcellen. De tweede antistof, het anti-
humaan globuline, veroorzaakt het “aaneenklitten” van de rode bloedcellen.
De test verloopt in één stap : anti-humaan globuline wordt direct aan de bloedcellen
toegevoegd.

Deze test wordt gebruikt om de aanwezigheid van de volgende antistoffen aan te tonen:
- Allo-antistoffen in geval van hemolytische ziekte van de pasgeborene en hemolytische

transfusiereacties
- Auto-immuun antistoffen bij auto-immuun hemolytische anemie
- Antistoffen als gevolg van medicatie
5.3.3 Indirecte antiglobulinetest of indirecte Coombs test
De indirect Coombs test verloopt in twee stappen:

In de eerste fase worden testerytrocyten in vitro beladen met antistoffen
(= irreguliere/onregelmatige antistoffen, indien deze aanwezig zijn in het serum van de patiënt).
Tijdens de tweede fase wordt het anti-humaan globuline toegevoegd.
Wanneer tijdens de eerste fase geen sensibilisatie optreedt, door afwezigheid van
irreguliere/onregelmatige antistoffen, zal het anti-humaan globulineserum ook geen agglutinatie
veroorzaken.
Irreguliere/onregelmatige antistoffen (antistoffen verkregen na immunisatie) worden in de eerste

fase in vitro gebonden aan testerytrocyten met gekende antigeensamenstelling. Voor de
screening gebruikt men een panel van drie testerytrocyten (Surgiscreen I, II, III). Voor de
identificatie van de irreguliere antistoffen wordt een hele reeks (panel) testerytrocyten gebruikt.
Figure 21: Surgiscreencellen I, II en III

Figure 22: Panel testerytrocyten voor identificatie van irreguliere antistoffen

Deze test wordt gebruikt om:

- Onbekende antigenen die aanwezig zijn op de rode bloedcellen te detecteren (v.b. D-VI of D
partieel)
- Antistoffen in het serum op te sporen (v.b. irreguliere antistoffen, anti-D tijdens de
zwangerschap, ...)
- Antistoffen (irreguliere) te identificeren
- De compatibiliteit van donorbloed met serum van de ontvanger na te gaan. Bij de
compatibiliteitstest worden de donorbloedcellen in de eerste fase in contact gebracht met het
serum van de ontvanger
Foutieve interpretaties
Foutieve interpretaties kunnen o.a. veroorzaakt worden door:
- Technische fouten
- Het gebruik van verouderd serum (inactivatie van complement) (indirecte Coombs)
- Het gebruik van plasma (inactivatie van complement bij gebruik van calciumcomplexerende
anticoagulantia) (indirecte Coombs)

Opmerkingen:
- Wanneer antistoffen van het IgM type zijn (o.a. natuurlijke/regelmatige antistoffen ( anti-
A; anti-B,…) kan er meteen agglutinatie ontstaan omdat IgM een pentameer is en groot
genoeg is om de afstand tussen de verschillende rode bloedcellen te overbruggen.
- IgG type is een monomeer (o.a. immune regelmatige of irreguliere/onregelmatige

antistoffen) en kan deze afstand tussen de rode bloedcellen niet overbruggen zonder een
hulpmiddel. Dit hulpmiddel is het anti-humaan globuline.
Het anti-humaan globulineserum bindt aan het Fc gedeelte van de IgG-molecule en
kunnen zo toch een zichtbare hemagglutinatie veroorzaken.
- Anti-humaan globuline: hierbij worden konijnen geïmmuniseerd met menselijk IgG. Dit
konijnen anti-humaan serum wordt gezuiverd en de anti-IgG (constante zware ketens)
blijft behouden. Dit anti-humaan IgG (Coombs serum) zal gesensibiliseerde rode
bloedcellen kunnen agglutineren ongeacht de specificiteit van de sensibiliserende antistof.
Het bindt met IgG moleculen op verschillende rode bloedcellen. Hier volstaan 100 tot 500
bruggen om een agglutinatie uit te lokken.
Coombs serum bevat ook anti complement. Dit wordt op dezelfde manier verkregen, n.l.
door sensibilisatie van konijnen met menselijk complement of dit kan ook van
monoclonale oorsprong zijn (anti-C3d).
Meestal wordt polyspecifiek anti-humaan globuline serum gebruikt (anti-IgG, anti-C3d,
polyspecifiek: zie praktisch gedeelte).
- Testerytrocyten (surgiscreencellen) zijn afkomstig van erytrocyten van bloedgroep O

zodat er geen interferentie kan ontstaan met anti-A en anti-B in het plasma van de
patiënt.

5.4 Cassettesysteem voor bloedgroepen, antiglobulinetesten en kruisproeven
5.4.1 Inleiding
De laatste jaren wordt er voor de bloedgroepbepaling, antiglobulinetesten en de kruisproeven

steeds meer gebruikt gemaakt van cassettesystemen.
Verschillende firma’s (Ortho, Diamed) verkopen het cassettesysteem. Al naargelang de firma
spreekt men van ‘cassetten’ (Ortho) of ‘kaartjes’ (Diamed).
Een cassette bestaat uit 6 kolommen en in elke kolom wordt een andere test uitgevoerd.
Het gebruik van de cassette heeft een aantal voordelen:
- Er is weinig reagens nodig
- De rode bloedcellen moeten minder gewassen worden in de antiglobulinetesten
- Er is minder pipetteerwerk
- Er zijn momenteel al volledig geautomatiseerde toestellen op de markt
Het nadeel is dat de gebruiker over de nodige randapparatuur (rekjes, centrifuge,…) moet
beschikken die opmaat van de cassetten gemaakt is. Zo kunnen de kaartjes van Diamed niet
gebruikt worden in de centrifuge van Ortho en omgekeerd.
In dit practicum wordt gebruik gemaakt van de cassetten van Ortho.
5.4.2 Bio Vue Systeem
Het type van de cassette en eventueel de aanwezige antistoffen (monoclonaal, polyspecifief,

anti-X) worden vermeld op de cassette. Er is ook een label voorzien waarop de
patiëntengegevens en de resultaten kunnen genoteerd worden.
Elke kolom bevat diluent en glaspartikels. Afhankelijk van de test, bevat de kolom ook
antistoffen.
Boven de kolom bevindt zich de incubatiekamer waarin serum of plasma gepipetteerd worden.
Opmerking:
- Indien de cassette per kolom een ander reagens bevat, moet de cassette juist voor gebruik
doorprikt worden met een strip met cups.
- Indien nodig wordt de cassette geïncubeerd. De cassette kan dan eventueel afgedekt worden
met parafilm.
- De cassetten worden bij het centrifugeren niet afgedekt met parafilm.

Na centrifugatie worden de verschillende reacties aan beide zijden van de cassette afgelezen (zie
figuur 10).
- Niet geagglutineerde cellen bevinden zich helemaal onderaan (reactie -)
- Sterk geagglutineerde cellen liggen boven de glasparels: deze cellen hebben een complex
gevormd en kunnen niet door de glasparels naar beneden zakken. (reactie ++++)
- Zwakkere agglutinaties situeren zich tussen de bovenkant en de onderkant van de
glaspartikels (reacties +, ++ en +++), hoe meer naar onder, hoe zwakker de reactie.
- Hemolyse is tevens een positieve reactie.
Figure 23: Cassettesysteem

5.4.3 Automatisatie: AutoVue Innova.
Deze analyzer is ontworpen om bloedgroepbepalingen, directe-en indirecte Coombs en

kruisproeven automatisch uit te voeren.
De analyzer pipetteert het staal in een 96-well plaat en verdunt het indien nodig. Het staal, al
dan niet verdund, wordt vanuit de 96-well plaat in de correcte cassette gepipetteerd.
De analyzer is gekoppeld aan het LIS, waardoor het toestel weet welke analyse op elk staal moet
uitgevoerd worden.
Het toestel is opgebouwd uit 4 units:
- Een pipetteergedeelte voor zowel reagentia als voor stalen (EDTA-staal dat eerst wordt
gecentrifugeerd: bovenaan plasma en onderaan erytrocytenconcentraat)
- Een incubatiegedeelte
- Een centrifugatie gedeelte: 2 stappen
 Centrifugatie bij lage snelheid (2 minuten bij 800 rpm) om interactie tussen
antigeen en antilichaam te versterken.
 Centrifugatie bij hoge snelheid (3 minuten bij 1500 rpm) om de
geagglutineerde deeltjes en niet-geagglutineerde deeltjes van elkaar te
scheiden. Niet-geagglutineerde deeltjeskomen onderaan de glasparels terecht,
terwijl de geagglutineerde complexen boven de glasparels blijven.
- Een afleesgedeelte waar de cassettes worden afgelezen m.b.v. digital imaging a.d.h.v.
vooropgestelde criteria.
Wanneer een cassette niet kan afgelezen worden door het toestel , wordt deze door de MLT
handmatig afgelezen en gevalideerd in het LIS.
Figure 24: AutoVue Innova

5.5 Pretransfusioneel onderzoek
5.5.1 Transfusie
Een transfusie heeft als doel de levenskwaliteit van de patiënt te verbeteren, maar houdt
niettemin een zeker risico in voor de ontvanger.
Naast de transfusiereacties (door gebruik van incompatibele cellen, door allergische reacties,
volume-overbelasting….) is er ook het risico van microbiologische contaminatie (bacteriën,
virussen, parasieten) van het donormateriaal en kunnen er administratieve fouten gemaakt
worden (met e.v. nadelige gevolgen voor de patiënt). Zelfs in landen met een zorgvuldige
donorselectie, controle van het donorbloed op een beperkt aantal, maar belangrijke, micro-
organismen en uitgewerkte administratieve procedures, kunnen transfusiereacties niet
uitgesloten worden. Het aantal ongewenste reacties wordt er natuurlijk wel door beperkt.
In deze cursus wordt niet ingegaan op de testen voorafgaand aan de transfusie van trombocyten
of plasma(bestanddelen) en ook niet op die voor weefseltransplantatie (strikt genomen is een
transfusie van bloedcellen ook een transplantatie), maar wel op die voor de
erytrocytentransfusie. Microbiologische testen worden niet besproken. In deze cursus ligt de
nadruk op het pretransfusioneel immuno-hematologisch onderzoek.
In België staat het Rode Kruis (bloedtransfusiecentrum) in voor de bloedname en identificatie

van de donoren, de verwerking van het donorbloed tot verschillende componenten en de
identificatiegegevens op de bloedzaken. Het Rode Kruis onderzoekt het donorbloed op kwaliteit,
bepaalt de bloedgroepen, test het bloed op irreguliere antistoffen en de aanwezigheid van
belangrijke overdraagbare pathogenen. Deze dienst staat ook in voor de bewaring van het bloed
tot het opgevraagd wordt voor gebruik en voor de controle op de vervaltermijnen. In andere
landen bestaan gelijkaardige organisaties, die wel een andere naam hebben.
Het onderzoek van het patiëntenmonster en het compatibiliteitsonderzoek gebeurt over het
algemeen door het labo van de transfusiekliniek. Zeer moeilijke typeringen worden doorgestuurd
naar het labo van het Rode Kruis (bloedtransfusiecentrum).

5.5.2 Erytrocytentransfusie
Van alle transfusies wordt de erytrocytentransfusie het meest uitgevoerd.

Erytrocytenconcentraten worden gebruikt als leverancier van hemoglobine. De klassieke
‘bloedzak’ voor een patiënt die ‘bloed’ krijgt, bevat erytrocyten in een suspensiemedium. De
leucocytenconcentratie in de erytrocytenzak wordt sterk gereduceerd omdat leucocyten voor
complicaties kunnen zorgen. Het plasma wordt eveneens verwijderd. Er worden altijd hoge
kwaliteitseisen gesteld aan een erytrocytenconcentraat. Daarnaast variëren de kwaliteitseisen
nog volgens de reden waarom er getransfuseerd wordt en de leeftijd en/of de immuunstatus van
de patiënt.
Er wordt intensief gezocht naar veiliger alternatieven voor de erytrocytentransfusie die

bovendien kruisproeven overbodig maken. Substituten zouden ook zo gemaakt kunnen worden
dat ze langer te bewaren zijn dan donorcellen en ze zouden goedkoper kunnen zijn.
Tot nu toe is er echter nog geen bevredigend alternatief gevonden.
Om ongewenste immunologische reacties te vermijden, moeten er voor elke transfusie een

aantal testen uitgevoerd worden op donoren ontvangerbloed. Daarnaast zijn een goed
gedocumenteerde monstername (identificatiegegevens van de patiënt, melding van
voorafgaande transfusies en/of zwangerschappen, gekende irreguliere antistoffen….) en een
zorgvuldige controle van kruisproeflabel, bloedzak en patiëntidentificatie voor de start van de
transfusie vereist. Voor elke transfusie wordt het compatibiliteitsonderzoek (kruisproef)
uitgevoerd voor elke zak donorbloedcellen die men denkt te gebruiken, ongeacht of er vroeger
reeds onderzoeken uitgevoerd werden en ongeacht het aantal voorziene bloedzakken.

5.5.3 Pretransfusionele methoden
5.5.3.1 Klassiek pretransfusioneel onderzoek
Het Rode Kruis bepaalt de ABO- en rhesus D bloedgroepen van de donor kort na de bloedgift en
voorziet de bloedzak dan van een aangepast label (Figuur 10).
Figure 25: donoreenheid in bloedzak
Bij de ontvanger worden de volgende testen uitgevoerd (meestal in het laboratorium van de
transfusiekliniek).
- Bepaling van ABO bloedgroep (voor- en tegenproef)
- In duplo bepaling van rhesus D met anti-D en bijkomend Du (DVI) bepaling
- Irreguliere antistoffen in het serum/plasma met behulp van testerytrocyten (Indirecte
Coombstest)
- Irreguliere antistoffen op de rode bloedcellen (Directe Coombstest).
Tenslotte voert het labo een kruisproef uit om na te gaan of de donorcellen compatibel zijn met
het serum/plasma van de ontvanger.
Via de kruisproef kan ook de aanwezigheid van private antistoffen (antistoffen met een zeer lage
frequentie) opgespoord worden. Deze antistoffen kunnen gemist worden als alleen
testerytrocyten (surgiscreencellen) gebruikt worden.
Donatie is enkel toegestaan als het volledige compatibiliteitsonderzoek in orde is.(d.i. ABO en
rhesus D compatibiliteit, screening van irreguliere antistoffen met testerytrocyten negatief,
kruisproef negatief) en uitgevoerd werd binnen de geldigheidsperiode.

Het voordeel van deze methode is dat in principe alle discrepanties gedetecteerd worden dus ook
de private antistoffen die niet aangetoond worden met de screeningsmethode met
testerytrocyten. Het nadeel is dat de discrepanties vaak veroorzaakt worden door klinisch
onbelangrijke antistoffen. Vermits elke discrepantie verder onderzocht moet worden, gaat er veel
tijd verloren met het zoeken naar de oorzaak enerzijds en het vinden van andere compatibele
donoreenheden anderzijds.
5.5.4 Opmerkingen
5.5.4.1 Interpretaties
Het donorbloed mag toegediend worden als:

- Bloedgroepen van ontvanger en donor compatibel zijn
- Alle reacties op onbekende antistoffen negatief zijn
- De kruisproef negatief is (klassieke methode)
Indien de bloedgroepen niet compatibel zijn of als er in één van de andere testen een positieve
reactie voorkomt, moet de oorzaak eerst onderzocht worden voor het donorbloed mag
toegediend worden. Het geteste donorbloed wordt zo nodig vervangen door ander, compatibel,
donorbloed.
5.5.4.2 Discrepanties
Discrepanties moeten altijd verder onderzocht worden.

In dringende gevallen kan de compatibiliteit van de ontvanger getest worden met verschillende
donoren. Hopelijk wordt er dan toch snel een bruikbare bloedcel eenheid gevonden.
Bij patiënten die herhaaldelijk transfusies krijgen of al meerdere zwangerschappen achter de rug
hebben, komen meer positieve screeningstesten voor dan bij patiënten die voor de eerste keer
een bloedtransfusie krijgen.
Soms is er maar één irreguliere antistof in het spel, soms komen er meerdere tegelijk voor bij
één patiënt.

5.5.4.3 Geldigheidsvoorwaarden voor bloedgroepbepaling en screening van irreguliere

antistoffen
Resultaten van een vroeger uitgevoerde bloedgroepen- en antistoffenbepaling kunnen gebruikt

worden als controle.
De ABO- en rhesus D bloedgroep is pas definitief vastgesteld als ze bepaald worden in twee
afzonderlijk afgenomen monsters en hierbij een identiek resultaat geven.
Het resultaat van een antistofscreening is beperkt geldig in tijd.
Primaire immunisatie komt langzaam op gang. Het kan soms meer dan drie maanden duren
voordat irreguliere antistoffen, gevormd door transfusie of zwangerschap, aantoonbaar zijn.
Voor patiënten die in die 3 maanden, voorafgaand aan een transfusie, al een transfusie gehad
hebben of zwanger waren, moet de antistofscreening uitgevoerd worden met een bloedmonster
dat zo kort mogelijk (max. 72 u) voor de transfusie afgenomen wordt. De antistofscreening blijft
3 maanden geldig voor wie in deze periode geen transfusie had of niet zwanger is (geweest).

5.6 Praktisch gedeelte
5.6.1 Wassen van cellen
5.6.1.1 Inleiding
Om foutieve interpretaties in de immuno-hematologie als gevolg van storende serumeiwitten te

voorkomen, kunnen de erytrocyten één of meerdere keren gewassen worden in een fysiologische
zoutoplossing.
5.6.1.2 Staal
EDTA–bloed : ongestold bloed
5.6.1.3 Materiaal
- Centrifugebuizen voor Heraeus centrifuge.

- Pasteurpipetten
- Fysiologische zoutoplossing
- Bekers voor spoelwater en gebruikt materiaal
5.6.1.4 Werkwijze
- Vul ¾ van een gemerkte centrifugebuis met fysiologisch water

- Neem met een pasteur pipet bloed uit de EDTA-tube (goed gemengd)
- Voeg een 10-tal druppels bloed toe aan de centrifugebuis
- Meng fysiologisch water en bloed door de pipet enkele malen te vullen en te ledigen in de
buis
- Maak evenwicht met een andere centrifugebuis
- Plaats de buizen in de centrifuge zodanig dat er evenwicht is
- Centrifugeer 5’ op 900 – 1000 g
- Neem de buizen uit de centrifuge
- Giet de bovenstaande vloeistof in een beker
- Klop de cellen zachtjes los
- Herhaal de procedure indien nodig
- Gebruik de cellen om een aangepaste suspensie te maken.

5.6.2 Bepaling van de ABO- en rhesusbloedgroep met het cassettesysteem
5.6.2.1 Inleiding
De aan- of afwezigheid van A -, B – en rhesusantigenen op de rode bloedcellen van de patiënt

wordt aangetoond via agglutinatiereacties met gekende antistoffen. Voor de ABO tegenproef
worden gekende A1 en B cellen gebruikt (Affirmagen cellen).
5.6.2.2 Staal
EDTA-bloed: ongestold bloed: bloedcellen en plasma
5.6.2.3 Materiaal
- 10% suspensie gewassen bloedcellen

- Affirmagen A1 en B cellen
- Cassette met anti-A, anti-B, anti-D, controle, tegenproef (cassette AB/D/Controle/reverse)
- Cassette met anti-C, anti-E, anti-c, anti-e, anti-K, controle (Rhesus/Kell)
- Cassette met anti-IgG, -C3d, polyspecific (anti-humaan globuline)
- Anti-D bioclone
- Pipettips voor 10 µL en 40 µL
- Eppendorf pipet
- Pasteurpipetten
- Bekers voor spoelwater en voor gebruikt materiaal
- Hematologiebuisjes
- BioVue centrifuge
- Waterbad/ incubator 37°C
5.6.2.4 Werkwijze
Voorbereiding
- Laat de cassetten, Affirmagen en anti-D op kamertemperatuur komen.
- Breng serum/plasma over in een apart recipiënt waarop de identificatiegegevens van het
staal staan.
- Was de cellen (zie 6.5.1. Wassen van cellen)

- Gebruik de bloedcellen om een 10% suspensie in fysiologisch water te maken in een gemerkt
hematologiebuisje
- Noteer de identificatiegegevens van het staal op de cassetten
Bloedgroepbepaling
Cassette AB/D/Control/reverse
- Zet een strip met cups op de cassette
- Vul de cassette volgens onderstaand schema
- Centrifugeer de cassette 5 min. met de BioVue centrifuge (maak evenwicht)

- Lees de reacties af
- Bepaal aanwezigheid van zwakke D als D negatief is
Cassette met anti-IgG, -C3d, polyspecific: zwakke D

- Incubeer 15 min. op 37°C


Cassette Rhesus/Kell
- Zet een strip met cups op de cassette

- Bepaal de ABO-bloedgroep
Als de tegenproef niet in overeenstemming is met de bloedgroepbepaling moet de oorzaak
opgespoord worden
- Bepaal het rhesustype
- Noteer het resultaat van de ‘K’- bepaling (Kell-antigeen)
- De controle moet negatief zijn, anders mogen de resultaten niet geïnterpreteerd worden

5.6.3 Bepaling van de directe antiglobulinetest met het cassettesysteem
5.6.3.1 Inleiding
De aanwezigheid van antistoffen en/of compliment op de rode bloedcellen wordt aangetoond in

de directe antiglobulinetest.
De test wordt uitgevoerd met het cassettesysteem.
5.6.3.2 Staal
EDTA-bloed: ongestold bloed: bloedcellen en plasma
5.6.3.3 Materiaal
- 10% suspensie van gewassen bloedcellen

- Cassette met anti-IgG, -C3d, polyspecific
- Pipet voor 10 µL
- Eppendorf pipet
- Pasteurpipetten
- Bekers voor spoelwater, fysiologische zoutoplossing en voor gebruikt materiaal
- Hematologiebuisje
- Proefbuisrek
- BioVue centrifuge
5.6.3.4 Werkwijze
Voorbereiding
- Laat de cassette op kamertemperatuur komen
- Was de cellen (zie 6.5.1. ‘Wassen van erytrocyten’)
- Maak een 10% suspensie van de rode bloedcellen in een gemerkt hematologiebuisje
- Noteer de identificatiegegevens van het staal op de cassette

Cassette anti-IgG, -C3d, polyspecific

- Vul de kolom volgens onderstaand schema

De directe Coombs test moet negatief zijn.

Als de reactie positief is, dan zijn er antistoffen en/of compliment aanwezig op de rode
bloedcellen.
Deze antistoffen moeten dan verder geïdentificeerd worden.

5.6.4 Bepaling van irreguliere antistoffen in het serum/plasma met het

cassettesysteem: de indirecte antiglobulinetest
5.6.4.1 Inleiding
Irreguliere antistoffen in het serum/plasma worden gedetecteerd met de indirecte

antiglobulinetest.
De testen worden uitgevoerd met het cassettesysteem.
5.6.4.2 Staal
Serum of plasma.
5.6.4.3 Materiaal
- Surgiscreencellen I,II,III
- OAES of BLISS
- Pipettips voor 10 µL, 40 µL en 50 µL
- Eppendorf pipetten
- Pasteurpipetten
- Fysiologische zoutoplossing (FZ)
- Bekers voor FZ, spoelwater en voor gebruikt materiaal
- Hematologiebuisje
- Proefbuisrek
- Waterbad van 37°C
- BioVue centrifuge
5.6.4.4 Werkwijze
Voorbereiding
- Laat de cassette, de surgiscreencellen en OAES of BLISS op kamertemperatuur komen
- Pipetteer het serum of plasma in een gemerkt hematologiebuisje
- Noteer de identificatiegegevens van het staal op de cassette


- Vul de kolommen volgens onderstaand schema en zorg ervoor dat de pipettip niet raakt aan
de wand van de verschillende kolommen bij het pipetteren van serum/plasma. Neem
eventueel telkens een nieuwe pipettip.
- Incubeer 15 min. op 37°C.

Bij een negatieve reactie met de drie cellen zijn er geen irreguliere antistoffen bij de patiënt
aanwezig tegen de geteste antigenen (surgiscreen I, II, III).
Een positieve reactie bij één of meerdere cellen wijst op de aanwezigheid van irreguliere
antistoffen in het serum van de patiënt.
Verder onderzoek is nodig door een identificatie van de irreguliere antistoffen uit te voeren.
Opmerking:
BLISS of OAES is een oplossing die in vergelijking met fysiologisch water de snelheid van
antistof-antigeenbinding verhoogt. Door de lage densiteit van ionen rond de erytrocyten gaan
antistoffen makkelijker aan het antigeen kunnen binden.
Low Isotonic Solution: laag isotonische oplossing.

5.6.5 Kruisproef met het cassettesysteem
5.6.5.1 Inleiding
Om ongewenste transfusiereactie te vermijden worden de bloedcellen van de donor en het serum

van de ontvanger (acceptor) met elkaar gekruist in de kruisproef (KP).
5.6.5.2 Staal
Bloedcellen van de donor

Serum/plasma van de ontvanger
5.6.5.3 Materiaal
- 10% suspensie van gewassen bloedcellen van de donor

- OAES of BLISS
- Pipettips voor 10 µL, 40 µL en 50 µL
- Eppendorf pipetten
- Pasteurpipetten
- Fysiologische zoutoplossing (FZ)
- Bekers voor FZ, spoelwater en voor gebruikt materiaal
- Hematologiebuisje
- Proefbuisrek
- Waterbad van 37°C
- BioVue centrifuge
5.6.5.4 Werkwijze
Voorbereiding
- Laat de cassette en BLISS op kamertemperatuur komen
- Was de cellen van de donor (zie 6.5.1. Wassen van erytrocyten)
- Maak een 10% suspensie van de rode bloedcellen van de donor in een gemerkt
hematologiebuisje
- Pipetteer het serum/plasma van de ontvanger in een gemerkt hematologiebuisje
- Noteer de identificatiegegevens van ontvanger en donor op de cassette


- Vul de kolom volgens onderstaand schema
- Incubeer 15 min.op 37°C.

- Lees de reactie af
Alle reacties moeten negatief zijn.

Bij een positieve reactie moet de oorzaak opgespoord worden.

DEEL IV – Immunologie
DEEL IV IMMUNOLOGIE
6 FLUORESCENTIE
6.1 Inleiding
Sommige stoffen absorberen gedeeltelijk het licht met korte golflengte waarmee ze
bestraald worden en zenden vervolgens licht uit met een andere –hogere- golflengte. Deze
stoffen fluoresceren en het verschijnsel zelf noemt men ‘fluorescentie’. In tegenstelling
tot fosforescentie stopt fluorescentie onmiddellijk wanneer het materiaal niet langer
bestraald wordt.
Een studieobject dat van zichzelf fluoresceert vertoont ‘autofluorescentie of primaire

fluorescentie’. Wanneer het onderzoeksmateriaal deze eigenschap niet vertoont (wat
meestal het geval is), dan kan het – via een specifieke techniek – gekoppeld worden aan
een fluorescerende kleurstof of ‘fluorochroom’ of ‘fluorofoor’. In dit geval gaat het om
een secundaire fluorescentie.
Enkele voorbeelden van fluorochromen zijn fluoresceïne (meestal onder de vorm van
FITC=fluoresceïne isothiocyanaat), rhodamine en auramine.
Soms maakt het fluorochroom deel uit van een groter complex (v.b. een fluorescerend
antilichaamcomplex) dat eventueel aan het preparaat zal binden.
Het gebruik van fluorochromen kent zeer veel toepassingen. De detectie van de
fluorescentie gebeurt m.b.v. een fluorescentiemicroscoop, een flowcytometer of een
spectrofluorometer.
6.2 Excitatie en emissie
Het excitatiespectrum geeft het golflengtegebied aan waarbij het excitatielicht, dat
uitgezonden wordt door de lichtbron, geabsorbeerd wordt door het beschenen product. In
dit spectrum ligt de optimale excitatiegolflengte. Deze golflengte wordt bij voorkeur
gebruikt.
Het fluorescentiespectrum of emissiespectrum geeft het golflengtegebied weer waarbij het

secundaire fluorescentielicht of emissielicht wordt uitgezonden. In dit
emissiespectrum ligt een optimale emissiegolflengte. Een preparaat wordt best bij deze
golflengte bekeken en ligt bij de fluorescentiemicroscoop in het zichtbare gebied.
De optimale excitatiegolflengte en de optimale emissiegolflengte liggen best tamelijk ver

uit elkaar om een goede scheiding te bekomen van excitatie- en emissielicht.

6.3 Filters
Filters zijn nodig om telkens het gewenste golflengtegebied uit te selecteren en

ongewenste golflengten te blokkeren.
Er bestaan meerdere typen van filters, waarvan een aantal belangrijke typen hieronder
besproken worden.
‘Short pass’ filters laten licht door tot een bepaalde golflengte, maar houden de hogere
golflengten tegen.
‘Long pass’ filters laten licht boven een bepaalde golflengte door, maar houden de kortere
golflengten tegen.
De golflengte die de filter typeert is de golflengte waarbij de transmissie 50% van het
maximum bedraagt.
V.b. een ‘SP490’ filter laat golflengten onder 490 nm passeren en houdt golflengten boven
490 nm tegen.
V.b. een ‘LP515’ filter laat alleen golflengten boven 515 nm door en niet de lagere
golflengten
Bij ‘Bandpass’ filters of interferentiefilters worden de grenswaarden niet afgebakend door

één bepaalde golflengte maar door een (smal of breed) golflengtegebied.
Deze filters worden getypeerd door hun centrale golflengte en hun bandbreedte.
V.b. BP546/30 is een filter waarbij de transmissie maximaal is bij 546 nm.
Deze filter laat op zijn beurt ligt door in het golflengtegebied van
531 nm – 561 nm. Bij deze grenswaarden bedraagt de transmissie 50%.
‘Dichroïsche’ filters reflecteren bepaalde golflengten terwijl ze andere golflengten

doorlaten. Deze filters zij ‘short pass’ of ‘long pass’ filters die onder een hoek geplaatst zijn
(meestal van 45°). Dichroïsche filters worden ook dichromatische filters, dichromatische
beamsplitters of dichroïsche spiegels genoemd.
V.b. filters die het excitatielicht, afkomstig van de lichtbron, reflecteren naar het object,
terwijl het fluorescentielicht, afkomstig van het object, doorgelaten wordt richting detector.
Bij fluorescentie-toepassingen worden er steeds combinaties van gepaste filters gebruikt.

6.4 Factoren die de detectie van het gewenste fluorescentiesignaal

beïnvloeden
Het is niet altijd mogelijk om een optimale fluorescentie-intensiteit te bekomen omdat vele
factoren interfereren. Achtergrondfluorescentie en quenching worden hierdoor besproken .
Achtergrondfluorescentie
Achtergrondfluorescentie wordt veroorzaakt door autofluorescentie van het staal of door
ongebonden of niet specifiek gebonden fluorochromen. Deze fluorescentie bemoeilijkt de
interpretatie van de gewenste fluorescentie.
Bij microscopische toepassingen wordt er vaak nagekleurd om deze fluorescentie te
maskeren.
Quenching
De daling van de fluorescentie-intensiteit van een fluorochroom door interacties met zijn
omgeving wordt quenching genoemd.
Een belangrijke oorzaak voor quenching is de fotometrische reactie van het fluorochroom
met zijn omgeving waardoor de fluorescentie-intensiteit in de tijd afneemt. Dit fenomeen
wordt photobleaching genoemd.

7 FLUORESCENTIEMICROSCOPIE
7.1 Lamp
Dit type microscoop is analoog in opbouw aan de lichtmicroscoop. De optica maakt bij de
fluorescentiemicroscoop gebruik van een complex filtersysteem en de gewone lichtbron
van de lichtmicroscoop is vervangen door een excitatiebron, meestal een kwiklamp.
Deze lamp heeft een beperkte levensduur: ongeveer 100 branduren.
Kwiklampen hebben het voordeel dat sterke emissies in het nabije ultraviolet, violet, groen
en geel beschikbaar zijn.
Xenonlampen worden ook gebruikt in de fluorescentiemicroscopie, maar deze vertonen

meer een continu spectrum.
7.2 Filterblok
Het principe van deze microscoop is licht te absorberen bij een welbepaalde golflengte en
het terug uit te zenden bij een andere, langere golflengte.
De gewenste golflengte wordt bekomen door gebruik te maken van filterblokken
Figure 26: Fluorescentiemicroscopie met gereflecteerd excitatielicht.

Gewone preparaten die men voor de lichtmicroscoop gebruikt, zijn met dit toestel niet te
bestuderen. Bij het klaarmaken van het preparaat moet je gebruik maken van fluorescente
labels of van autofluorescente preparaten.
Bij de fluorescentiemicroscoop wordt gebruik gemaakt van 2 filtersets:
 De eerste filterset filtert het licht voordat het object wordt bestraald. Deze filter is
zo gekozen dat enkel licht wordt doorgelaten van een welbepaalde golflengte, dat
een bepaald fluorochroom in een aangeslagen toestand brengt (excitatie).
 De andere filterset filtert het licht dat vrijgemaakt is uit het object. Deze filter (de
sperfilter) absorbeert het excitatielicht en laat enkel het emissiespectrum van het
aangeslagen fluorochroom door.
 Dichroïsche spiegel: deze spiegel reflecteert enkel licht van een welbepaalde
golflengte.
De toepassing bepaalt welk filterblok moet gebruikt worden. Sommige microscopen

bevatten meer filterblokken, wat het gebruikscomfort vergroot wanneer er verschillende
fluorochromen in het labo gebruikt worden.
In tabel 3 worden enkele voorbeelden van filterblokken (golflengten in nm.), met
bijhorende toepassingen en fluorochromen, opgesomd voor de Laborlux microscoop.
Filterblok Excitatiegebied Excitatiefilters Dichromatische Suppressiefilter Toepassing fluorochroom

filter
reflectiefilter
A Ultraviolet 340-380 400 425 Kerneiwitten Fluorescamine
Ag-Al
I3 Blauw 450-490 510 515 FITC
reacties
Lymfocyten
Ethidiumbro-
toxiciteits-
mide
test
Mycobacte-
Auramine
riën
Tabel 3: Voorbeelden van filterblokken
Opmerking:
De voorwerpglaasjes, de dekglaasjes mogen zelf niet fluoresceren. Veel gebruikte
montagemedia zijn glycerine en fluoprep.

8 INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE
8.1 Toxoplasma gondii
8.1.1 Inleiding
Toxoplasmose is een ziekte of besmetting die in 1908 door Nicolle in Tunesië bij een
knaagdier werd ontdekt dat de naam “gondi” draagt.
Later werd een gelijkaardige parasiet bij de meeste zoogdieren en bij de mens
teruggevonden (1938).
De naam van de parasiet is Toxoplasma gondii.
Het parasitisme is zeer verspreid en in de meeste landen bezitten meer dan de helft van de
volwassenen specifieke antistoffen.
De parasiet kan op verschillende manieren in het organisme binnendringen:
- Transplacentair: moeder op vrucht, wat kan leiden tot abortus of

vruchtdood of congenitale toxoplasmose.
- Consumptie van rauw vlees dat cysten bevat.
- Kattenfaeces: de kat is de hoofdgastheer van Toxoplasma, de andere

diersoorten en de mens fungeren als nevengastheer.
8.1.2 Symptomen
De meeste mensen merken weinig tot niets als ze geïnfecteerd worden, symptomen blijven
uit of doen denken aan een griepje, doch ernstige symptomen komen zelden voor, vaak bij
mensen met een verminderde weerstand. Dit zijn bijvoorbeelden van beschadigingen aan
o.a. de hersenen en het netvlies.
- hydrocefalie met achterlijkheid

- stuipen
- oogaantasting
- hersenverkalking
- icterus
- aseptische meningitis
Enige tientallen procenten van de bevolking hebben antistoffen tegen de parasiet en zijn er
dus ooit mee besmet geweest. De meesten hebben daar nooit iets van gemerkt. De
infectie blijft levenslang bestaan maar bij een normaal functionerend immuunsysteem
wordt hij niet meer actief.

8.1.3 Evolutiecyclus: zie schema
De vegetatieve parasiet is ovaal tot halfmaanvormig (toxon = boog in het Grieks) met een
lange diameter van 4 tot 6 nm.
8.1.4 Principe
Indirecte immunofluorescentie:
Het gelyofiliseerd toxoplasmose antigeen wordt gebruikt voor de serologische diagnose van
toxoplasmose met de immunofluorescentie techniek.
De antigeen suspensie wordt bereid uit (buikholte) ascitis vocht van muizen en wordt
vervolgens geformoleerd en daarna gelyofiliseerd.
Het antigeen wordt op de glaasjes gefixeerd. Serumverdunningen worden toegevoegd.
De specifieke antistoffen binden met het toxoplasma antigeen en worden zichtbaar
gemaakt door een anti-immunoglobuline gemerkt met een fluorochroom (FITC).

8.2 Werkwijze : Toxo-spot IF
Elektronische leeromgeving:
Bijlage 1 - Toxoplasma gondii - indirecte immunofluorescentietest

9 SERODIA TP PA
9.1 Treponema pallidum partikel agglutinatie
9.1.1 Inleiding
Treponema pallidum antilichamen worden opgespoord in serum van de patiënt.

Treponema pallidum is een gramnegatieve bacterie, die geassocieerd wordt met de
geslachtsziekte syfilis. De bacterie is spiraalvormig (spirocheten of spirillen) en groeit enkel
in anaërobe atmosfeer.
9.1.2 Principe van de test
TP PA staat voor Treponema pallidum partikel agglutinatie. Deze test maakt gebruik van
gekleurde gelatine dragerdeeltjes gesensibiliseerd met gezuiverde Treponema pallidum
antigenen.
Het principe bestaat erin dat de gesensibiliseerde partikels gaan agglutineren in

aanwezigheid van specifieke antilichamen tegen Treponema pallidum in humaan serum of
plasma (bij voorkeur serum).
9.2 Werkwijze : Serodia-TP PA
Bijlage 2 - Serodia-TP PA
Bijlage 3 - C-Reactieve Proteïne

10 AUTO-IMMUUN ZIEKTEN
10.1 Anti-nucleaire antistoffen
10.1.1 Diagnostische betekenis van anti-nucleaire antistoffen
Auto-immuunziekten worden in het algemeen gekenmerkt door een grote verscheidenheid

aan klinische verschijnselen.
Men onderscheid 2 soorten auto-antistoffen :
- Niet weefsel specifieke antistoffen v.b. : anti-nucleaire antilichamen.
- Weefsel specifieke antistoffen v.b. : anti-gestreepte spier antilichamen
In deze cursus ligt de nadruk voornamelijk op niet-weefselspecifieke antilichamen.

Ze zijn serologisch gekenmerkt door de frequente aanwezigheid van circulerende
antistoffen tegen lichaamseigen kernproteïnen. De kernproteïnen (antigenen) komen vrij
en er worden antilichamen aangemaakt. Deze antistoffen vormen een zeer heterogene
groep wat betreft hun antigene specificiteit.
Veel van deze antistoffen zijn gericht tegen aan RNA gebonden eiwitten zoals n-RNP, het
SM en SS-B/La antigeen, andere reageren met ds-DNA, centromeren of enzymen zoals
bv.popïsomerase (Scl-70) en andere zijn gericht tegen cytoplasmatische bestanddelen van
de cel.
De pathogene betekenis van deze antistoffen zijn ondanks vele inspanningen nog altijd
niet duidelijk. Wel spelen ze een grote rol in de immunodiagnostiek van auto-
immuunziekten.
Het bepalen van de “ANA” = anti-nucleaire antistoffen behoren tegenwoordig dan ook
tezamen met de reumafactorbepaling tot de eerste serologische screeningstests bij
patiënten met gewrichtsklachten, maar ook bij andere onbegrepen klachten worden de
ANA nog al eens gebruikt om te zien of er “auto-immunologisch” iets aan de hand is.
Auto-immuunziekten kennen een chronisch verloop waardoor ANA’s van het type IgG zijn.

10.1.2 Antistofbepaling bij auto-immuunziekten
Opsporen van antistoffen tegen nucleaire antigenen gebeurt tegenwoordig d.m.v.

immunofluorescentie-technieken. De meest gebruikte substraten zijn Hep2 cellen
(carcinoom van de larynx) en levercellen van de aap.
De meest voorkomende auto-immuunziekte is SLE (Systemische Lupus Erythematosus),
maar aanwezigheid van een positieve ANA test komt ook voor bij andere auto-
immuunziekten, bij een aantal leverziekten en infectieziekten.
Op hogere leeftijd kan men ook lage titers terugvinden van anti-nucleaire antistoffen.
Ook sommige geneesmiddelen veroorzaken een positieve ANA-test. Daarom gaat men
werken met verdunningen van 1/40 om vals positieve ANA’s uit te sluiten.
In onderstaande tabel wordt het voorkomen van anti-nucleaire antistoffen weergegeven
Ziektebeeld frequentie
Systemische lupus erythematosus (SLE) < 95%
Medicamenteus geïnduceerde lupus 100%
Gemengde bindweefselziekte 100%
Andere autoimmuunziekten
- reumatoide arthritis (RA) 10%-60%
- sclerodermie (SD) 60%-90%
- discoide lupus Tot 35%
- necrotiserende vasculitis 25%
- Sjörgren syndroom (SS) 80%
- dermatomyositis (DM) 49%-74%
- polyarteritsi nodosa (PAN) 15%
Leveraandoeningen
- chronische agressieve hepatitis 75%
- primaire biliaire cirrhose 38%
- andere chronische leveraandoeningen <30%
Longaandoeningen
- interstitiële longfibrose 20%
- pneumoconiose 20%
Chronische infectieuse aandoeningen
- tuberculose Tot 50%
Maligne aandoeningen 10%
Personen ouder dan 60 jaar 18%
Jonge controles 4%

Bij auto-immuunziekten worden antistoffen gevormd tegen allerhande celbestanddelen,

zowel tegen bestanddelen van de kern als van het cytoplasma.
Met deze techniek (ANA test) kunnen een groot aantal verschillende antistoffen
aangetoond worden, gericht tegen kern-of cytoplasmatische bestanddelen.
Indien deze test positief is kan men door bijkomende testen de juiste identiteit van de
antistof bepalen.
Hierdoor is de ANA test dus meer dan een test voor Systemische Lupus Erythematosus:
het is een eenvoudige en redelijk gevoelige screeningstest voor allerhande niet-orgaan-
specifieke auto-immuunziekte.
10.1.3 Principe van de werkwijze
De gebruikte methode is gebaseerd op de indirecte immunofluorescentie. De Hep2 cellen

en de levercellen worden direct gekweekt op het objectglaasje, en dus het substraat
vormen.
Het te testen verdunde serum wordt geïncubeerd in aanwezigheid van de cellen. In geval
van een positieve reactie, binden de specifieke antilichamen zich aan de nucleaire
antigenen.
Na wassen wordt een secundair humaan anti-immuunglobuline antilichaam (gebonden aan
een fluorochroom) geïncubeerd in dezelfde omstandigheden.
Na een tweede wasbeurt, wordt het complex zichtbaar gemaakt met een
fluorescentiemicroscoop.
Het substraat, Hep2-cellen en de levercellen leveren een maximum aan informatie
naargelang het waargenomen beeld.
Antistoffen die kunnen aangetoond worden met de ANA-test op Hep-2-en levercellen

Antistoffen tegen celkernbestanddelen Antistoffen tegen cytoplasma bestanddelen
Anti-histonen
Anti-DNA
Anti-nDNA (native DNA) Anti-centromeer (ACA)
Anti-ssDNA (single string DNA) Anti-Mi 1&2
Anti-dsDNA (double string DNA) Anti-NUMA (=MSA)
Anti- RNP Anti-centriolen
Anti-ENA Anti-Jo-1
Anti-nRNP (Mo)(nuclear RNP) Anti-vimentine
Anti-Sm (Smith) Anti-actine (=SMA)
Anti-SS-A (Anti-Ro) Anti-lysosomen
Anti-SS-B (Anti-La) Anti-mitochondriën (=MA)
Scl-70 Anti-ribosomen
Anti-Ku
Anti-to
Anti-PM1 (=PM-Scl)
Anti-PCNA

10.1.4 Interpretatie
10.1.4.1 Celstructuur
Het immunofluorescentiepatroon geeft inlichtingen over de categorie van de betrokken

nucleaire antigenen
- kernzuren
- histonen
- non-histone zure proteïnen (ENA)
ANA is:
- negatief : geen patroon en geen echte fluorescentie
- positief : er is een specifieke fluorescentie met een duidelijk te onderscheiden patroon.
Vooraleer we een fluorescentiepatroon kunnen herkennen, is het dus zeer belangrijk dat
we de verschillende structuren in een cel kunnen onderscheiden.
Figure 27: Structuur van een cel

10.1.4.2 Celindeling
Bij het bepalen van celkernpatronen bij een ANA test geeft het celdelingsproces veel
informatie voor verdere definiëring van de aanwezige antistof(fen).
Bij een cel in rust zijn de meeste kernantigenen vrij uniform verspreid over de nucleus.
Bij condensatie van de chromosomen en fragmentatie van het kernmembraan gebeurt er
een herschikking van de kernantigenen.
Enkel antigenen gelokaliseerd op, of geassocieerd met de chromosomen blijven
fluoresceren in het chromosoomgedeelte van metafasecellen, zoals DNA, histone,
centromeer.
Alle andere nucleaire antigenen blijven buiten het chromosoomgedeelte tijdens het
delingsproces, zoals Sm, RNP, SS-A, SS-B, en andere nucleolaire antigenen.
Mitosecellen zijn meer rond en hebben geen kernmembraan meer. In metafase is het
chromosoomgedeelte langwerpig van vorm met een sterke concentratie aan
chromosomen.
Sera positief voor DNA, DNP en/of histonen, zullen een heldere kleuring van het
chromosoomgedeelte van de kern geven; in het omgekeerde geval zal het
chromosoomgedeelte niet te zien zijn (zgn. “sleutelgat).
Figure 28: Celdeling

10.1.4.3 Patroonbeschrijving
Bij een positief resultaat zijn de patronen onderverdeeld in volgende groepen:
1. Anti-nucleaire factor
2. Auto-antilichamen tegen antigenen in mitosestructuren
3. Auto-antilichamen tegen cytoplasmatische componenten.
Bij een positief resultaat met KERNFLUORESCENTIE (anti-nucleaire factor)
homogeen patroon
Hep-2 cellen: mitosecellen : de kern is egaal gekleurd. Het chromosoomgedeelte is
negatief of positief (homogeen) met donkere achtergrond rond de
chromosomen. interfasische cellen : vrij homogene fluorescentie, maar er
kan ook een duidelijke granulaire fluorescentie voorkomen.
Levercellen: homogene, dense of fijnkorrelige fluorescentie van de hepatocytkernen met

dezelfde intensiteit als op de Hep-2-cellen
Nucleaire antigenen: dsDNA, ssDNA, histonen, nucleosomen (vnl. bij SLE)
Granulair patroon
Hep-2-cellen: mitosecellen : het chromosoomgedeelte is negatief (sleutelgatfiguur) of
positief met een perifere zone die nagenoeg egaal fluorescerend is.
interfasische cellen: fijn granulaire fluoresentie van de celkernen met
negatief of positief chromosoomgedeelte. Nucleoli meestal negatief
Levercellen: granulaire fluorescentie van de hepatocytkernen met identieke intensiteit als

op de Hep-2-cellen
Nucleaire antigenen : Sm, RNP, SS-A, SS-B, PM-1,PCNA

Kernmembraan
Hep-2-cellen: mitosecellen: negatief
interfasische cellen: fijne ring rond de kern + diffuus homogene fluorescentie
in de kern.
Levercellen: kernmembraan van de hepatocytenkernen duidelijk positief

ringvormig
(zeer typisch)
Nucleair antigeen : lamine.
Nuclear Dots
Hep-2-cellen: mitosecellen : negatief met eventueel een aantal fluorescerende dots;
interfasische cellen : 6 tot meer dan 20 dots, verschillend in grootte en
verdeeld over de volledige kern
Levercellen : alle nucleoli van de hepatocytenkernen vertonen duidelijke dots met dezelfde
intensiteit als op de Hep-2-cellen.
Few Nucleair Dots

Hep-2-cellen: mitosecellen : negatief met eventueel een aantal fluorescerende granula.
interfasische cellen : slechts enkele dots (2-6) in de celkern;
Levercellen : hepatocytkernen vertonen 1 of 2 fijne dots met lagere intensiteit dan op de

Hep-2-cellen.

Nucleolair patroon
Hep-2-cellen :mitosecellen : chromosoomgedeelte negatief met een omringende fijn
granulaire fluorescentie.
interfasische cellen : sterk homogene fluorescentie van de nucleoli
(kernlichaampjes) met een zwakke tot negatieve fijn granulaire fluorescentie
in het nucleoplasma.
Levercellen : homogene fluorescentie van de hepatocytennucleoli.
Nog andere kernfluorescenties :

Centromeer, cycline I (PCNA), cycline II (Mitosine),……
Actie: Na het vinden van één van deze patronen :

• titreren van het staal 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280.
• uitvoeren van dsDNA (Crithidia lucilliae-bepaling) en bij positief resultaat: inzetten van
ENA dot blots om de identiteit van de antistoffen te bepalen.
Algemene regel : Positieve stalen steeds verder verdunnen tem 1/1280
Bij een positief resultaat van de MITOSE-CEL, zonder kernfluorescentie.
Spindle, Midbody; Centriolen, ….
Actie : titreren van het staal 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280.
Bij een positief CYTOPLASMATISCHE fluorescentie.
Vimentine, Actine, Ribosomaal P- Proteïne, Jo-1, Mitochondriën (=AMA), Lysosomen,

Golgi-apparaat,…
Actie:
• titreren van het staal 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280.
• inzetten van ENA dot blots

10.2 Identificatie van anti-nucleaire antistoffen (ANA)
10.2.1 Crithidia luciliae.
Crithidia luciliae is een eukaryote eencellige protozoa (pantoffeldiertje). De familie

Trypanosomatidae behoort tot de orde van kinetoplastida en wordt gekenmerkt door de
aanwezigheid van de kinetoplast, deze kinetoplast bevat een netwerk van heel veel
zuiver dubbelstrengig DNA (dsDNA).
Crithidia luciliae wordt door de firma op een draagglaasje gespot en is commercieel

verkrijgbaar.
A.d.h.v. indirecte immunofluorescentietechniek kan anti-dsDNA aangetoond worden.
 Het te testen verdunde serum (1/40) wordt geïncubeerd in aanwezigheid van

Crithidia luciliae.
 In geval van aanwezige anti-dsDNA (in serumstaal) bindt deze aan het zuiver
dubbelstrengig DNA (aanwezig in de kinetoplast van het pantoffeldiertje)
 Na wassen wordt een secundair humaan anti-immuunglobuline antilichaam
(gebonden aan een fluorochroom) geïncubeerd in dezelfde omstandigheden.
Na een tweede wasbeurt, wordt het complex zichtbaar gemaakt met een
fluorescentiemicroscoop.
 Kinetoplast fluoresceert = positieve test = aanwezigheid van anti-dsDNA.
Deze test is heel belangrijk bij de diagnose van SLE (= Systemische Lupus
Erythematosus ).
De bepaling van het ANA is een zeer sensitieve test, maar berust echter op weinig
specificiteit.
Vandaar het belang van de identificatie van de ANA. De bepaling/identificatie van anti-
dsDNA antistoffen is zeer specifiek voor de vaststelling van de diagnose SLE.

10.2.2 ENA dot blots/cytodot
Deze test is gebaseerd op enzymimmuno-assay en wordt uitgevoerd bij een positief ANA
resultaat met kernfluorescentie en bij een positief ANA resultaat met cytoplasmatische
fluorescentie.
10.3 C-anca/P-anca
ANCA = antineutrofiele cytoplasmatische antistoffen
ANCA's zijn auto-antistoffen gericht tegen enzymen aanwezig in de korrels van neutrofiele
granulocyten en monocyten, zoals proteïnase-3 (PR-3), myeloperoxidase (MPO),
elastase, lactoferrine, cathepsine G en andere. Antistoffen gericht tegen de twee
eerstgenoemde eiwitten hebben een grote diagnostische waarde:
 antistoffen tegen PR-3 zijn sterk geassocieerd met de ziekte van Wegener
 antistoffen tegen MPO worden meer gevonden in sera van patiënten met het
Churg Strauss syndroom.
Van de antistoffen die gericht zijn tegen de andere korreleiwitten is de klinische betekenis
nog niet duidelijk.

De ontstaanswijze van ANCA's is niet opgehelderd. Men vermoedt dat bepaalde microbiële
superantigenen (streptococcen, S.aureus, E.coli), defecten in het beloop van apoptose of
het opruimen van apoptotische leukocyten, geneesmiddelen (minocycline, sulfasalazine,
propylthiouracil), malaria, antistoffen tegen Saccharomyces cerevisiae (ASCA) oorzaak
kunnen zijn van de vorming van deze ANCA’s.
ANCA’s kunnen aangetoond worden a.d.h.v. indirecte immunofluorescentietest.

Als substraat wordt gebruikt gemaakt van donorleucocyten gefixeerd in ethanol.
 c-anca: korrelige cytoplasmatische fluorescentie van de granulocyten → meestal

anti-PR-3 (soms anti-MPO)
 p-anca: fluorescentie rond de kern (=perinucleair) → meestal anti-MPO (soms

anti-PR-3)
De ANCA immunofluorescentietest is een goede screeningstest. Maar het is steeds

aanbevolen om de specifieke antistoffen tegen PR-3, MPO en andere antigenen te
detecteren.
Dit kan door een specifieke immunofluorescentietest uit te voeren met verschillende
substraten.
c-anca p-anca

10.4 Werkwijze: ANA – Crithidia luciliae –ENA Profile3 - C-anca/P-anca
Bijlage 4 - ANA (anti-nucleaire antistoffen)
Bijlage 5 - Crithidia luciliae
Bijlage 6 - ENA Profile 3 (wordt niet uitgevoerd in het labo)
Bijlage 7 - C-anca en P-anca

11 ELISA
11.1 Principe
De ELISA staat voor Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay.

Het principe is eigenlijk eenvoudig. Als verwacht wordt dat een patiënt een infectie heeft of
doorgemaakt heeft, dan wordt verondersteld zal hij/zij ook antilichamen heeft gevormd.
Door het serum samen te brengen met de antigenen van de te onderzoeken infectie zullen
er immuuncomplexen ontstaan die men zichtbaar kan maken.
Dit doet men vereenvoudigd als volgt :

- Op een microtiterplaat fixeert men een suspensie van kapotgemaakte antigenen. Men
brengt dit in contact met het serum van de patiënt. Als er antilichamen aanwezig zijn
tegen deze antigenen zullen deze zich hechten aan de antigenen
- Antigeen-antilichaam complexen worden gevormd. Door een wasbeurt worden niet
gebonden delen weggewassen
- Aan het Ag-Al complex wordt een label (enzym) bevestigd d.m.v. een secundair
antilichaam (enzym gelabeld anti-humaan IgM of IgG) te koppelen aan het primair
antilichaam.
- Als laatste stap wordt een kleurstof (substraat*) toegevoegd die het label (het enzym)
doet verkleuren en dit wordt zichtbaar
* Substraat = substantie die van kleur verandert als het enzym actief is
Als er veel Ag-Al complexen gevormd zijn, dan is de intensiteit van de verkleuring groter.
Men kan deze met een kleurmeter (microplate-reader van Techno Fisher) meten.
De gemeten kleurwaarde in een bepaalde verdunning, is een maat voor de hoeveelheid
antilichamen in het monster.

Figure 29: Principe van indirecte Elisa
11.2 Werkwijze : Elisa
Bijlage 8 - Elisa IgM bepaling van Epstein-Barr virus
Bijlage 9 - Elisa IgG bepaling van Epstein-Barr virus
11.3 Bijkomende opdrachten bij het verslag
1. Geef in je verslag alle resultaten op een correcte manier weer a.d.h.v. de beschreven
formules in de bijsluiter en QC-certificaat.
• Bereken en bespreek de resultaten van de controles en kalibratoren a.d.h.v.
QC-certificaat
• Bereken en bespreek de resultaten van de patiënten stalen a.d.h.v.de bijsluiters
2. Leg het verschil uit tussen een indirecte ELISA en een sandwich ELISA.
Geef van elke methode een voorbeeld waarbij deze techniek zou gebruikt kunnen
worden.

12 BIJLAGEN: ZIE ELEKTRONISCHE LEEROMGEVING: CANVAS
12.1 Bijlage 1: Toxoplasma gondii: indirecte immunofluorescentietest
12.2 Bijlage 2: Serodia-TP PA
12.3 Bijlage 4: ANA
12.4 Bijlage 5: Crithidia luciliae
12.5 Bijlage 6: ENA Profile3
12.6 Bijlage 7: C-anca/P-anca
12.7 Bijlage 8: Elisa: IgM bepaling van Epstein-Barr virus
12.8 Bijlage 9: Elisa: IgG bepaling van Epstein-Barr virus

Cursus Hematologie en Immunologie Labo ML 2 2022-2023 PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cursus Hematologie en Immunologie Labo ML 2 2022-2023 PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Hematologie en Immunologie labo ML 2

Auteur en titularis: Katrien Wachters

Onderwijsgroep Wetenschappen en Technologie

Katrien Wachters; katrien.wachters@kdg.be; A.01.17; 03.502.22.24

In de ECTS-fiche vind je voor welke opleidingsonderdelen je geslaagd moet zijn om dit

In de ECTS-fiche vind je de doelstellingen van dit opleidingsonderdeel: http://ects.kdg.be/.

In de inhoudstafel en ook in de ECTS-fiche vind je de beschrijving van de leerinhoud van

Er worden zes labodagen ingericht tijdens periode 3 en 4.

De gebruikte studiematerialen vind je in de ECTS-fiche: http://ects.kdg.be/.

PowerPointpresentaties die in het labo gebruikt worden staan op de Elektronische

In de ECTS-fiche vind je de evaluatiemomenten http://ects.kdg.be/.

In de ECTS-fiche vind je de evaluatievorm(en) http://ects.kdg.be/.

Hematologie en Immunologie labo ML 2 I

1 VOORBEREIDING VAN DE LABOPROEF

Een grondige voorbereiding is noodzakelijk om de labo's zelfstandig, veilig en met

Voorafgaand aan elk labo worden :

Op die manier kunnen de labo’s door de student goed voorbereid worden.

De voorbereiding gebeurt voorafgaand aan het practicum en steeds in het

Je moet een laboschrift met vaste en genummerde pagina’s hebben. Per

Hematologie en Immunologie labo ML 2 II

2.1 Voorbereiding van het labo:

 titel van de proef + datum van uitvoering

2.2 Extra info die je van de docent krijgt

2.3 Alle experimentele gegevens:

 noteer alle waarnemingen onmiddellijk: noteer slechts wat je werkelijk waarneemt en

2.4 Eindresultaat van de proef:

3 HET VERSLAG VAN EEN LABOPROEF

Hematologie en Immunologie labo ML 2 III

De belangrijkste onderdelen van een verslag zijn:

Noteer welke reactiedeelnemer (antigeen of antistof) in het monster aanwezig is en welke

Welk monster (volbloed, serum, plasma,…) ga je onderzoeken? Werd er een anticoagulans

 bereidingen van alle nodige oplossingen, reagentia, andere benodigdheden;

Hematologie en Immunologie labo ML 2 IV

3.5 Bespreking en conclusie

Als er controles worden ingezet, bespreek en interpreteer ook hiervan de resultaten en

4 EVALUATIE VAN HET LABO

De evaluatie gebeurt op basis van volgende elementen:

• Procesevaluatie (= “Observatie van het functioneren tijdens het

Hematologie en Immunologie labo ML 2 V

Voor de quotering van de procesevaluatie wordt gebruik gemaakt van de

Figuur 1: Procesevaluatiefiche zoals gebruikt door de begeleidende docent

De docent verbetert en beoordeelt je verslag.

Hematologie en Immunologie labo ML 2 VI

Hematologie en Immunologie labo ML 2 II

3.3 Normen en accreditatie ...........................................................................................9

DEEL III – hematologie .....................................................................................................15

4.2 Oplossingen voor hematologie ..............................................................................28

4.3 Telkamer ...............................................................................................................31

5 Bloedgroepen, antiglobulinetest en kruisproeven .......................................................56

5.2 Rhesusbloedgroepsysteem ....................................................................................58

5.3 Antiglobulinetest of Coombs test ..........................................................................60

5.4 Cassettesysteem voor bloedgroepen, antiglobulinetesten en kruisproeven ..........65

Hematologie en Immunologie labo ML 2 III

5.5 Pretransfusioneel onderzoek .................................................................................68

5.6 Praktisch gedeelte.................................................................................................73

DEEL IV Immunologie ........................................................................................................83

8.2 Werkwijze : Toxo-spot IF ......................................................................................90

9.2 Werkwijze : Serodia-TP PA ....................................................................................91

10.2 Identificatie van anti-nucleaire antistoffen (ANA) ........................................... 100

Hematologie en Immunologie labo ML 2 IV

10.3 C-anca/P-anca ................................................................................................. 101

Hematologie en Immunologie labo ML 2 V

Figure 1: Principe van hydrodynamische focussering ................................................... 18