HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ VÀ LIỆU PHÁP GEN

CHƢƠNG 5
LIỆU PHÁP GEN

1
 NỘI DUNG

5.1. Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen

5.2. Chiến lƣợc liệu pháp gen

5.3. Vector có bản chất virus dùng trong liệu pháp gen

5.4. Vector không phải virus dùng trong liệu pháp gen

2
5.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP GEN

Những năm 1960, dự án đầu tiên

đề xuất sử dụng gen trong sản
xuất các chế phẩm điều trị bệnh ở
người được thành lập.

3
 Được thực hiện bằng việc sử dụng một vector virus:

Adenovirus Virus adeno-associated

Retrovirus Lentivirus 4
 Năm 1963, Joshua
Lederberg giới thiệu
về liệu pháp gen.

Năm 1972, việc tạo ra

DNA tái tổ hợp (rDNA) Năm 1980, tiến sĩ Martin
dẫn đến sự tiến bộ trong Cline đã trở thành người đầu
nghiên cứu liệu pháp gen. tiên tiến hành thí nghiệm liệu
pháp gen trên con người. 5
 Ông nghiên cứu về 𝛽 –
thalassemia gây nên đột biến
của một gen lặn trên NST 11,
làm suy giảm sản xuất chuỗi
𝛽 – globin dẫn đến bệnh
thiếu máu huyết tán.

Tiến sĩ Martin Cline

6
 Năm 1980, một nhóm nhà khoa
học thuộc Đại học Y Bayler ở
Mỹ đã thử nghiệm liệu pháp gen
để chữa trị bệnh Lesch – Nyhan.

Năm 1990, French Anderson và

Michael Blaese sử dụng liệu pháp
gen ex vivo chữa bệnh thiếu hụt
miễn dịch tổ hợp trầm trọng ADA
– SCID.

7
Năm 1992 – 1993, liệu pháp gen ung thư sử dụng antisense
IGI RNA đã được giới thiệu.
8
 Năm 1999, thất bại sử dụng liệu
pháp gen chữa bệnh di truyền do
thiếu hụt enzyme Ornithine
Transcarbamylase (OTC).

Năm 2000, bác sĩ French thành công

chữa trị bệnh suy giảm miễn dịch trầm
trọng kết hợp NST X (X – SCID) hay
hội chứng Bubble Boy.

Năm 2002, thành công tạo ra vector

liposome siêu nhỏ giúp dễ dàng đưa
gen trị liệu qua lỗ màng nhân.

9
 Phát hiện cách ngăn
chặn hệ thống miễn
dịch đáp ứng với gen
liệu pháp bằng các
miRNA che mắt các
Thành công sử thụ thể của tế bào Sử dụng VRX46
dụng liệu pháp miễn dịch. – một liệu pháp
gen điều trị bệnh miễn dịch dựa
u hạt mãn tính trên gen để điều
liên kết với NST trị HIV có sử
X. dụng một
lentivirus vector.

Năm 2006

10
Thông qua các phương pháp tiếp cận
nonviral (Edelstein et al. 2007).

Năm 2007, thử nghiệm liệu pháp gen

đầu tiên cho bệnh thái hóa võng mạc di
truyền.

Năm 2008, Cotrim và Braum phát triển

liệu pháp gen liên quan đến vị trí và
chức năng của một gene vào tế bào đảo
ngược rối loạn chức năng của tế bào
hoặc tạo ra các chức năng tế bào mới.
11
 Bệnh được điều trị bằng liệu pháp gen

Ung thư Bệnh Huntington Bệnh xơ nang

Bệnh thiếu máu Bệnh lão hóa sớm Bệnh máu khó đông
hồng cầu liềm 12
5.2. CHIẾN LƢỢC LIỆU PHÁP GEN

Liệu pháp gen

Liệu pháp in vivo Liệu pháp ex vivo

13
 5.2.1. Liệu pháp in vivo

 Liệu pháp gen in vivo là phương pháp đưa trực tiếp gen
liệu pháp vào trong tế bào của mô riêng biệt trên cá thể bị
bệnh.

 Gen liệu pháp được dòng hóa vào trong một vector và
vector này được được vào tế bào hay mô của cơ thể.

Liệu pháp gen in vivo 14

 Không cần
lấy tế bào bị
bệnh ra ngoài
cơ thể sống.

Phương pháp
in vivo

Hiệu quả Ít thao tác

thường liệu pháp
không rõ rệt. hơn.
15
 Phương pháp in vivo gồm

Căn cứ vào đặc điểm

Tách dòng gen liệu
của bệnh, loại tế bào
pháp thích hợp, tạo
hoặc mô bị bệnh để
các vector tái tổ hợp
chọn vector liệu pháp
mang gen liệu pháp.
phù hợp.

Kiểm tra, theo dõi chặt Bằng kỹ thuật vi tiêm,

chẽ hoạt động của đưa vector tái tổ hợp
vector, cũng như mọi mang gen liệu pháp
thay đổi biểu hiện của vào tế bào hay mô bị
bệnh. bệnh.
16
 Các loại vector liệu pháp

Adenoviral vector Retroviral vector AAV vector

HSV – 1 vector DNA trần Liposome

 Phương pháp in vivo dùng cho điều trị ung thư cho kết quả
tốt nhất. 17
 5.2.2. Liệu pháp ex vivo

 Liệu pháp ex vivo là phương pháp thao tác chuyển gen vào
tế bào bên ngoài cơ thể. Sau đó, nhân tế bào lành rồi đưa
vào cơ thể.

 Liệu pháp ex vivo có thể làm hạn chế biểu hiện bệnh hoặc
chữa bệnh hoàn toàn.

18
  Liệu pháp ex vivo

Tách dòng gen liệu

pháp và chọn lọc
Bằng kỹ thuật sinh các vector liệu Đưa vector tái tổ
thiết, lấy tế bào từ pháp thích hợp với hợp mang gen lành
các mô bị bệnh ra tế bào đích. Tạo vào tế bào đích và
khỏi cơ thể, sau đó các vector tái tổ nuối cấy nhân dòng
nuôi cấy. hợp mang gen liệu tế bào.
pháp bằng DNA tái
tổ hợp.

Nuôi cấy riêng các

Nuôi cấy tế bào
tế bào bình thường Kiểm tra, theo dõi
khỏe mạnh, đạt số
đã chọn lọc, tiếp tục chặt chẽ các tế bào
lượng, sau đó đưa
theo dõi biểu hiện đích mới.
tế bào trở lại cơ thể.
của gen lành.

19
Liệu pháp gen ex vivo
20
 Liệu pháp ex vivo thường được áp dụng điều trị trong các
liệu pháp gen tế bào dòng soma.

Tế bào tủy xương Tế bào gan

Tế bào gốc Tế bào biểu bì da 21

 Vector liệu pháp

Adenoviral vector Lentiviral vector Retroviral vector

AAV vector DNA trần Polycation Liposome

22
Video 1. Xây dựng một vector liệu pháp gen
23
Video 2. Lentivirus vector
24
Video 3. Các bước nhân lên của Herpes Simplex Virus
25
Video 4. Giới thiệu về Adeno-Associated Virus (AAV)
26
Video 5. Sản xuất và sửa đổi AAV 27
5.3. VECTOR CÓ BẢN CHẤT VIRUS TRONG
LIỆU PHÁP GEN

Retrovirus vector Adenovirus vector

28
 Liệu pháp gen được tiến hành bằng cách chuyển một gen mã
hóa cho protein chức năng hay một thực thể sinh học nào đó
vào tế bào, nhằm thay đổi sự biểu hiện của một gen nội sinh.

 Chuyển thành công các gen vào tế bào là yêu cầu tiên quyết
để có thể đạt được hiệu quả mong muốn trong liệu pháp gen.

29
 Các vector là phương tiện vận chuyển thông tin di truyền vào
tế bào.

Vector có bản chất virus

Hai
hệ thống

Vector không có bản chất virus

30
 AAV

 Hệ thống chuyển gen có bản chất virus thường được

biến đổi từ các retrovirus, adenovirus và virus kết hợp -
adeno (Adeno Associated Virus – AAV).
 Một số virus có bản chất virus khác, nhưng ít được sử
dụng hơn: Herpes simplex virus 1 (HSV_1), virus đậu
mùa hay Baculovirus… 31
 HSV_1

Virus đậu mùa

 Những vector không có bản chất virus bao gồm các plasmid
của vi khuẩn và các hợp chất được tổng hợp hóa học hay
tương tự.
32
 Tế bào mục tiêu và
những đặc tính của nó.

Việc lựa chọn các

vector và phương Thời gian biểu hiện
pháp chuyển gen cần thiết.
tùy thuộc vào?

Kích thước của vật liệu

di truyền cần chuyển.

33
 5.3.1. Vector có bản chất virus

Tuy
Chúng
Sử dụng nhiên,
không
vector có virus mới
làm thay Tạo ra
bản chất mạnh
đổi điều virus mới
virus rất hơn và
hòa hoạt
có lợi nguy
động gen
hiểm

34
 Trong chu kỳ sống của virus

Dạng viron Chuyển thông tin di truyền

 Các virus được chọn

Khả năng tái tổ hợp và sản xuất virus mới.

Khả năng sao chép theo kiểu đa vòng tròn.

35
 Hầu hết các nghiên cứu liệu pháp gen đều sử
dụng các vector virus chứa các nhân tố của
một virus thiếu khả năng sao chép độc lập.
 Các gen sớm của một virus bị cắt bỏ, thay
thế bằng trình tự promoter và trình tự gen
mong muốn.

 Để có khả năng sao chép, các virus này cần

có sự hỗ trợ của các tế bào đóng gói gọi là
các virus giúp đỡ.
 Tế bào đóng gói cung cấp gen của virus đã
bị cắt bỏ.

36
  Các receptor bề mặt hiện diện ở virus hoang dại
cũng biểu hiện ở các tiểu phần vector virus.
 Nếu các virus hoang dại có khả năng nhiễm được
vào những kiểu tế bào nào đó, thì các tiểu phần
vector virus cũng dễ nhiễm vào các tế bào ấy.

 Ở một số trường hợp, có thể biến đổi gen mã hóa

cho các protein bề mặt bằng các gen mã hóa bề mặt
của các virus khác, nhằm có thể gắn và nhiễm vào
các kiểu tế bào được chọn.
 Việc sử dụng protein của virus khác để làm thay
đổi kiểu tế bào mục tiêu gọi là “kiểu virus giả”.

37
 5.3.2. Vector retrovirus (Rv)

Nội 5.3.2.1. Murine Leukemia Virus (MLV)

dung
5.3.2.2. Lentivirus

5.3.2.3. Một số vector retrovirus khác

5.3.2.4. Rủi ro khi sử dụng các vector retrovirus

5.3.2.5. Ứng dụng của các vector retrovirus

5.3.2.6. Triển vọng

38
 5.3.2. Vector
Retrovirus (Rv)

Quy
Cấu
trình sử
trúc
dụng

Ƣu Nhƣợc
điểm điểm

39
 Cấu trúc Retrovirus

 Đường kính trung bình khoảng 100nm và có một vỏ. 40

 Vỏ bọc chứa những phân tử glycoprotein, các phân tử này
sẽ quyết định tính chuyên biệt cho các tế bào mục tiêu qua
sự gắn kết tương đồng lên receptor của tế bào đích.

Có 2 loại:
o Glycoprotein vỏ bên ngoài
(SU): Kháng nguyên chủ yếu
của virus, có chức năng bám
vào các nội quan.
o Glycoprotein màng (TM):
Bám vào protein SU ở vỏ,
chịu trách nhiệm đối với sự
dung hợp.
41
Bên trong chứa:
o Hai bản sao của mạch RNA đơn dương dài khoảng 5 - 10kb.
Thường nhận gắn gen chuyển (transgene) dài khoảng 8kb.
Gen này chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu in vivo.
42
o Protein cơ bản (MA), không định hình. Protein này bao lấy
capsid (CA). CA là protein phong phú nhất trong hạt virus
(chiếm 33% trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt.
o Capsid là lõi, thường có hình nón, bao gồm: RNA genome,
protein nucleocapsid (NC), enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase) và enzyme hợp nhất (intergrase).

43
 Chia làm 7 giống Retrovirus dựa vào các đặc điểm khác nhau:

Cấu trúc nucleotide vỏ

Cấu hình nucleocapsid

Kiểu prion

Trình tự nucleotide

44
 Quy trình sử dụng Retrovirus

1. Nhiễm virus vào tế bào đích.

2. Sao chép ngược bộ gen RNA tạo thành

DNA nhờ enzym reverse transcriptase.

3. Chuyển DNA của virus vào trong nhân.

4. DNA của virus sát nhập vào bộ gen của

tế bào chủ.
45
5. DNA virus phiên mã thành mRNA bởi
promoter mạnh trong trình tự 5‟ – LTR.

6. Dịch mã trong cytoplasm tạo thành các

protein Gag, Pol, Env.

7. Sự hình thành và đóng các gói capsid với

hai mạch RNA virus và các phân tử reverse
transcriptase.

8. Các virion làm “nổ” các tế bào và giải

thoát ra ngoài.

46
Ƣu điểm Nhƣợc điểm
Gắn chèn gen mục Gắn chèn gen mục tiêu một cách
tiêu vào NST của tế ngẫu nhiễn.
bào quan tâm. Không có khả năng chuyển
=> Sự biểu hiện của nhiễm lên các dòng tế bào không
gen mục tiêu ổn định. phân chia.
Ít nhạy cảm với hệ Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau
thống miễn dịch. một thời gian biểu hiện ổn định.
Sử dụng đối với các Sự biểu hiện có thể bị gián đoạn
dòng tế bào có khả trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần
năng phân chia mạnh. bởi NST đang bị cuộn nên gen
cần chuyển không đến được ngay
khu vực phiên mã.
47
Dòng tế bào đóng gói các vector retrovirus
(Saimin và cs : 1991)
48
(a) Retrovirus hoang dại: trình tự LTR hai bên đầu cần thiết
cho sự sao chép ngược thành DNA và sát nhập vào bộ gen
tế bào chủ, nhân tố ψ+ cần thiết cho RNA đóng gói trong
các tiểu phần virus.

• Vị trí gắn mồi (PBS) và chuỗi polypurin (PP) cần thiết

cho sự tổng hợp của mạch đầu và mạch thứ hai của
DNA.
• Các gen Gag, Pol, Pro và Env mã hóa cho các protein
cần thiết cho sự đóng gói.
49
(b) Vector retrovirus: retrovirus bị làm mất các trình tự mã
hóa, thay vào đó là một promoter (Prom) và gen liệu pháp.
Vector còn lại giữ trình tự LTR, dấu hiệu đóng gói ψ+ (chứa
một phần của gen Gag), PBS và PP cần thiết để đưa vật liệu
di truyền của nó vào tế bào mục tiêu.

(c) Các tế bào đóng gói mang gen Gag, Pol, Pro và Env mã
hóa các protein cần thiết cho sự đóng gói. Những tế bào
đóng gói không có dấu hiệu đóng gói ψ+ nên không thể tự
nó tạo ra các tiểu phần virus. 50
 5.3.2.1. Murine Leukemia Virus (MLV)

 Là retrovirus đơn giản với bốn gen.

Gag Pro Pol Env

 Gen Gag mã hóa một nhóm các protein đặc biệt cấu
thành lõi của virus.
 Cơ chất Gag được cắt thành 4 chuỗi polypeptide (10,
12, 15 và 30 kD) bằng protease virus (PR).
51
Hệ thống vector
retrovirus đầu tiên
từ virus gây bệnh
bạch cầu ở chuột
(murine leukemia
virus – MLV) đã
và đang sử dụng
trong các tiến
trình lâm sàng.

52
Lý do lựa chọn MLV làm hệ thống vận chuyển gen

Đặc tính sinh học của MLV được hiểu rõ.

Bộ gen của MLV là bộ gen retrovirus được

tạo dòng sớm nhất.

Những virus này có khả năng xâm nhập

vào tế bào chủ rất hiệu quả.
53
 Hệ thống vector retrovirus gồm hai thành phần

Cấu trúc vector mang gen.

• Chứa trình tự promoter, trình tự cần cho sự sát nhập

vào bộ gen chủ và trình tự cần thiết cho sự đóng gói
vỏ, kí hiệu.

Dòng tế bào cung cấp vỏ protein vỏ virus.

-.

• Cần thiết cho sự sản xuất virus tái tổ hợp gọi là dòng tế
bào đóng gói (packing cell line).
• Các tế bào đóng gói chứa các gen mã hóa cho protein
vỏ cần cho sự đóng gói (Gag và Env) nhưng không
chứa trình tự cần thiết cho sự đóng gói φ-.
54
 5.3.2.1. Lentivirus

Đây là một họ phụ của retrovirus,

trong đó có HIV.

Được sử dụng làm vector chuyển gen.

Được bao bọc bởi một lớp đôi lipid

chứa những protein xuyên màng.

55
Một trong những loại protein này là gp120.
Tế bào chủ nhận diện gp120 và cho virus
xâm nhập, gp120 tác động đến protein
receptor CD4 trên tế bào T.

56
 Vật chất di truyền của retrovirus gồm có hai mạch RNA.
Sau khi bộ gen virus sát nhập vào DNA bộ gen của tế bào
chủ, chúng được chuyển đổi thành DNA.
 Hai enzyme cần thiết cho sự sao chép virus là:

Enzyme sao chép

ngược (reverse
transciptase) Enzyme sát nhập
(integrase)

57
 Loại vector này được tạo ra khi sử dụng một phần cấu trúc
tiền virus HIV (provirus HIV).
o Plasmid 3 (vector
o Plasmid 1 là một chuyển): trong
thành phần chính Plasmid 3 vector này, cấu
của virus, kí hiệu là trúc vẫn còn giữ
pCMVAR9 (chứa lại những cặp
virus sự bào người base của gen Gag
– hCMV). Vector và RRE (tìm thấy
HIV trong gen Env.

Plasmid 1 Plasmid 2

o Plasmid 2 (plasmid mã hóa cho protein Env) mã hóa hai loại

protein vỏ khác nhau, có tác dụng làm vector ổn định hơn. 58
o Lợi ích của việc lấy đi một số cặp base là làm giảm khả
năng đóng gói của virus. Vector vận chuyển chứa vị trí
để có thể chèn vào các đoạn gen mong muốn.

Quá trình đóng gói vector retrovirus 59

5.3.2.3. Một số vector retrovirus khác

Ngoài hai loại kể trên, một số retrovirus

khác cũng được dùng tùy vào mức độ khác
nhau và phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm
sinh học của chúng.

60
LNL 6: Chứa hai đầu 3‟ và 5‟ LRT, trình tự đóng gói dài
với trình tự 418 nucleotide gen Gag và đột biến trong
codon bắt đầu dịch mã AUG thành codon bất hoạt UAG
và phần đầu 3‟ của gen Env.

61
 Nhóm LN: Có cấu trúc LNL 6
nhưng không chứa phần đầu 3‟ của
gen Env.

LNSX

Vector LNCX

LXSN

L là LRT, N là gen kháng neomycin, S là protomer SV40, C là

protomer CMV và X là trình tự đa liên kết (polilinker) để giúp
chèn các gen liệu pháp vào.
62
• Chứa vùng 3‟LRT và 5‟LRT, một trình tự đóng gói dài nối
với đầu 5‟, một trình tự dài 380 nucleotide với đầu kết thúc
của gen Pol và vị trí nối 3‟ và 100 nucleotide của vùng 3‟ của
gen Env.
• Gen liệu pháp được dịch mã từ RNA ghép nối và sử dụng
vị trí bắt đầu dịch mã của gen Env.
63
5.3.2.4. Rủi ro khi sử dụng các vector retrovirus

64
 Hai rủi ro lớn nhất của việc
sử dụng liệu pháp gen người

Đột biến chèn Tạo ra virus hoang dại

• Xảy ra khi vector virus • Sự tái tổ hợp trong quá

chèn vào bên trong hay
kề gen nội bào.
• Có thể gây ra sự phát
triển các khối u khi bất
hợp các gen ức chế khối
u hay hoạt hóa các proto-
oncogene.
• Khả năng cảm ứng khối
u không xuất hiện khi sử
dụng các retrovirus
không có khả năng sao
chép.
trình đóng gói giữa dòng
tế bào đóng gói và vector
sẽ tạo thành các virus
hoang dại.
• Sự tái tổ hợp có thể xảy
ra ở các virus có khả
năng sao chép.
• Sự tái tổ hợp giữa các
vector virus không có
khả năng sao chép với
các virus nội sinh in
vitro. 65
Sự sản sinh các virus hoang dã sao chép
theo phương pháp tái tổ hợp 66
5.3.2.5. Ứng dụng của
các vector retrovirus

• Vector retrovirus là cần thiết

cho liệu pháp gen, đã được
sử dụng có hiệu quả trong
nhiều liệu pháp gen chữa
bệnh cho người.

67
• Các vector retrovirus
khác nhau đã được thiết
kế để tạo động vật
chuyển gen và gà
chuyển gen đặc biệt
(Ronfort, Legras và
Verdier, 1997).
• Các vector này mang
các trình tự Env có khả
năng nhận biết các tế
bào phôi gà.
• Chúng được tiêm vào
trứng gà mới đẻ.

68
• Ở giai đoạn này, các tế bào vẫn còn đa năng và có thể
tham gia vào việc tạo thành giao tử, truyền gen ngoại lai
cho thế hệ sau.
• Phương pháp này cho hiệu quả không cao.
• Phôi ở giai đoạn này chứa khoảng 60.000 tế bào.
• Chỉ một tỉ lệ nhỏ các tế bào này có cơ hội mang gen
chuyển nhờ vector retrovirus.
• Gà chuyển gen tạo thành ở dạng thể khảm và có rất ít cơ
hội truyền gen chuyển của chúng cho thế hệ sau.

69
Lentivirus là một phân
lớp của retrovirus.
Chúng có khả năng hợp
nhất vào genome của
các tế bào ở pha nghỉ, cả
các tế bào tăng sinh và
tế bào không tăng sinh.
Khả năng này có được
là do sự có mặt của một
tín hiệu ở một trong số
các protein virus.
Protein virus này nhằm
tới genome của virus ở
vùng nhân.
70
Lentivirus phức tạp hơn các retrovirus đơn giản, chứa
thêm 6 gen tat, rev, vpr, vpu, nef và vif. HIV là một loại
lentivirus. Vector lentivirus được nghiên cứu nhiều do
tiềm năng sử dụng của chúng trong liệu pháp gen.

71
72
Một nghiên cứu cho thấy Genome của chúng có
vector lentivirus tiêm vào nguồn gốc từ lentivirus
phôi một tế bào hoặc ủ đã tạo ra các hạt virus tái
với phôi đã được loại bỏ tổ hợp có khả năng
màng trong là có hiệu quả nhiễm vào tế bào phân
đặc biệt đối với việc chia hoặc tế bào không
chuyển gen vào chuột. phân chia.
Sự vắng mặt các gen tăng
cường làm cho nó có thể
Vector này chứa LTR đã thay thế cho một promoter
được sửa đổi dẫn đến sự nội sinh điều khiển gen
tự bất hoạt genome virus mong muốn hoạt động mà
đã hợp nhất. không lệ thuộc vào ảnh
hưởng của các gen tăng
cường LTR.
73
 • Hiệu quả biến nạp cao, thao tác đơn giản, sự xâm
Ưu nhiễm thực hiện bằng ủ phôi.
điểm • Được mở rộng đối với các động vật có vú.
• Thuận lợi cho việc chuyển gen vào chuột.

• Các hạt virus phải được kiểm soát an toàn

sinh học.
• Các đoạn DNA có kích thước không vượt
quá 7-9kb.
Nhược
• Sự biểu hiện của gen reporter tương đối
điểm thấp.
• Sự hợp nhất độc lập của vector xảy ra
trong cùng một phôi dẫn đến động vật
chuyển gen thể khảm.
74
5.3.2.6. Triển vọng

75
Các vector retrovirus là những vật chuyển gen thông dụng
nhất trong gen trị liệu lâm sàng, tính đến tháng 6 – 1996
đã có 969 bệnh nhân được trị liệu với vector này.

Vài năm gần đây, các

vector retrovirus vẫn
chưa xây dựng được Nhưng với các thành tựu
nền móng vững chắc. đương thời thì người ta
lại quan tâm nhiều hơn
tới các vector retrovirus.

76
 Cải tiến nâng cấp mô hình thiết kế chung.

Đã thiết lập được các vector cơ sở lentivirus.

Đã thấu hiểu về tính ổn định và sự sản sinh

retrovirus.
Các hệ thống vector an toàn hơn đảm bảo
chắc chắn rằng không sản sinh ra các virus
sao chép cao.
77
• Tuy nhiên vẫn chưa thể đòi
hỏi về một vector retrovirus
hoàn thiện và có lẽ phải phấn
đấu nhiều nữa mới có được
thành quả đó.
• Hệ thống vector tổng hợp
nhân tạo sẽ giải quyết được
nhiều vấn đề có liên quan
đến hệ thống vận chuyển như
hiện nay.
• Nhưng chắc chắn trong
tương lai trong thành phần
của retrovirus sẽ có cả hệ
thống vector nhân tạo.

78
79
 Adenovirus là một loại virus
có capsid đa diện 20 mặt,
phần lõi chứa DNA mạch
kép. Vỏ capsid của virus
chứa 3 loại protein: hexon,
fiber và base penton.
 Hexon là thành phần cấu trúc
quan trọng, tạo thành bề mặt
20 mặt, trong khi các penton
tạo thành phức hệ với fiber
cho kết quả là 12 chóp ngoài
vỏ virus đóng vai trò quan
trọng trong việc gắn với các Cấu trúc của Adenovirus
phối tử.
80
81
Cấu trúc và tổ chức bộ gen của Adenovirus

82
83
84
85
86
Sơ đồ cấu trúc hệ gen của adenovirus serotype 5 và các
thế hệ adenovirus vector.
87
88
89
90
91
92
 Trong liệu pháp gen có 2 loại vector adenovirus là FG
(first generation) và HD (helper dependent) được sử dụng
nhiều nhất.
• Vector FG (vector thế hệ thứ nhất) kích thước khoảng
8,3kb. Trong đó, các vùng gen quan trọng của E1 và E3
được thay thế bằng gen liệu pháp và các gen cần thiết khác.
• Vector HD (vector phụ thuộc và helper) bị cắt bỏ phần lớn
gen của adenovirus, do vậy có thể cho phép cài gắn các
gen liệu pháp có kích thước lớn hơn.
• Đặc điểm quan trọng của vector HD là ít gây đáp ứng miễn
dịch và chỉ có thể tái bản trong các tế bào bị virus helper
xâm nhiễm.

93
 Adenovirus là một loại virus xâm nhiễm cả tế bào không
phân chia và các tế bào đang phân chia.
 Vector adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích
thước lớn từ 8 kb đến 30 kb, không gây đột biến gen của
các tế bào đích.
 Vector adenovirus có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen
in vivo vào phổi, gan, cơ, mạch máu, màng hoạt dịch, mắt,
màng bụng, não, khối u ở động vật.

94
Cơ chế hoạt động của vector adenovirus
95
 Hiện nay có thể sử dụng một loại
vector adenovirus có khả năng tái
bản DNA, vector này được sử dụng
trong liệu pháp gen chữa bệnh ung
thư.
 Khi thiết kế các vector adenovirus
này, chỉ cần thêm vài gen liệu pháp
mã hóa các protein đặc hiệu có thể
tiêu diệt các tế bào u một cách chọn
lọc, đồng thời gây bất hoạt các gen
độc và gen có hại của adenovirus.
 Protein liệu pháp tạo ra trong tế bào
đích làm ngừng quá trình phát triển Sử dụng vector
của khối u, hoặc tiêu diệt khối u. adenovirus trong
liệu pháp gen
96
Có 3 rủi ro tiềm ẩn khi sử dụng các vector adenovirus:

Sốt và gây rối loạn chức năng cơ quan do sự đáp

ứng miễn dịch với các tế bào bị biến nạp gen.

Sự phát triển của cơ chế dung nạp các vector

adenovirus có thể gây nên các bệnh bạo phát, khi
nhiễm virus hoang dại có cùng serotipe.

Sự phát triển của những kiểu virus hoang dại in vivo,

có khả năng sao chép, gây bệnh.

97
 Liệu pháp gen chữa ung thư:
 Ad vector được sử dụng rộng
rãi trong thay thế đột biến và
các phương pháp hóa trị liệu
phân tử, mục đích là diệt trừ tế
bào bị chuyển đổi (transduced).
 Ad vector chuyển các gen khác
nhau để chữa ung thư như gen
ức chế khối u p53, p16,
antisense DNA, ribozyme và
các kháng thể đơn chuỗi, gen tự
chết herpes simplex virus Gen p53 được đưa vào
thymidine kinase và để kiềm chế sự phát
cytosinedeaminase. triển của ung thư
98
 Liệu pháp gen cho các bệnh
di truyền:
 Đã sử dụng adenovirus được
thiết kế đặc biệt (sử dụng
cationic lipids và calcium
phosphate co-precipitates,
chimeric adenovirus vector,
giữ gen E4 trong vector) để
chữa các bệnh như xơ nang
(cystic fibrosis), các bệnh về
phổi.
 Ngoài ra, adenovirus cũng
Xơ nang tuyến vú
được sử dụng trong loạn
dưỡng cơ.
99
 Liệu pháp hỗ trợ:
 Adenovirus vector rất hiệu quả trong việc làm sáng tỏ
vai trò của cytokines và các bước của chúng trong quá
trình tiến triển của bệnh khớp.
 Trên mô hình chuột, đã sử dụng adenovirus vector
mang thụ thể TNFa và cytokine IL-1, cho thấy tác dụng
hỗ trợ trực tiếp và gián tiếp để chữa bệnh khớp.

Một số
bệnh về
xương
khớp

100
Video 6. Hệ thống biểu hiện Adenovirus tái tổ hợp 101
5.3.4. Hệ thống vector virus kết hợp với Adeno
 5.3.4.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền
• Adeno - Associated Virus (AAV) là loại virus có kích
thước nhỏ thuộc nhóm parvovirus không gây bệnh cho
người.

• Cấu tạo và hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử của AAV
102
• Khi không có mặt của một loại virus trợ giúp
khác, AAV có thể xâm nhiễm các tế bào không
phân chia, gắn bộ gen của AAV vào tế bào
người ở vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19
tạo nên tiền virus (provirus).

• Provirus tồn tại cùng bộ gen người một thời

gian dài trong tế bào.

• Khi gặp một điều kiện nào đó AAV tách khỏi bộ

gen người, thực hiện các quá trình phiên mã tái
bản tạo nên vô số hạt virion AAV trong tế bào,
chuẩn bị chu trình xâm nhiễm tế bào khác.

103
 How AAV gene transfer works?

Video 7. chuyển gen AAV hoạt động như thế nào? 104
 Cấu tạo của AAV

• Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lớp
vỏ capsid.
• Bộ gen AAV có kích thước khoảng 4,5 - 4,7Kb, hai đầu là
các trình tự tận cùng đảo ngược ITR gồm 145bp.

A – Sơ đồ cấu trúc bộ gen của Adeno - Associated Virus.

B – Sơ đồ cấu trúc vector AAV. 105
Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là gen rep và gen cap,
phần cuối bộ gen là trình tự poly Adenin – poly A.

Gen cap mã hóa cho 3 chuỗi polypeptide có khối lượng

phân tử 85 kDa (VP1), 72kDa (VP2) và 61 kDa (VP3)
trong cấu trúc vỏ capsid của AAV.

Gen rep mã hóa cho 4 chuỗi polypeptide có khối lượng

phân tử 78, 68, 52, và 40 kDa.

Những protein này có vai trò điều hòa sự sao chép và sát
nhập vào bộ gen tế bào chủ.
106
 5.3.4.2. Nguyên lý thiết kế

Khi thiết kế các vector • làm giảm đáp ứng miễn dịch
AAV phải loại bỏ các của cơ thể với vector, đồng
gen rep, gen cap của thời thay thế vào vị trí đó là
AAV gen liệu pháp và promoter
thích hợp.
Thiết kế vector AAV
chỉ sử dụng các gen • Kích thước gen liệu pháp quá lớn
liệu pháp có kích → mất khả năng hoạt động của
thước nhỏ vector.

Bộ gen của AAV có

kích thước nhỏ, chỉ • Khi gen liệu pháp kích thước
thích hợp với các gen lớn hơn 5 kb gây mất tác dụng
liệu pháp kích thước của vector.
dưới 4 kb 107
 • Thường sử dụng là các
Quá trình thiết kế adenovial helper giúp quá
vector AAV cần sự có trình tái tổ hợp đồng thời
mặt của virus trợ giúp với gen liệu pháp, gọi là sự
(helper virus) đồng chuyển nhiễm
(contransfection).

• Vector plasmid mang gen

Khi tổng hợp AAV liệu pháp.
người ta sử dụng • Các đoạn IRT.
đồng thời ba thành
phần chủ yếu gồm: • Virus Adeno-associated
virus (AAV) và virus trợ
giúp là adenoviral helper.
108
Sơ đồ quá trình thiết kế vector AAV

Sơ đồ quá trình thiết kế vector AAV

109
Quá trình chuyển nhiễm đồng thời làm cho quá trình tái tổ
hợp giữa plasmid mang gen liệu pháp, AAV và adenoviral
helper, tạo nên vector mang AAV mang gen liệu pháp và
các dạng adenovirus lai.

Bằng kỹ thuật xử lý nhiệt để gây bất hoạt các adenovirus lai

(do vector AAV bền nhiệt hơn), sau đó sử dụng kỹ thuật siêu
ly tâm phân đoạn, có thể tách được các vector AAV mang
gen liệu pháp cần thiết.

110
111
 Ưu điểm

• Điểm quan trọng nhất là vector AAV có hiệu quả rất cao,
không gây bệnh cho người, mặt khác protein virus không
được biểu hiện do đó không gây đáp ứng miễn dịch
trong tế bào hoặc gây hiệu ứng viêm trên cơ thể.
• Virus AAV kiểu dại và vector AAV chỉ có thể tái bản khi
có mặt các virus trợ giúp (helper virus) nên không gây
lan rộng.
• Vector AAV chỉ có khả năng gắn, chèn các gen ở một số
vị trí rất hạn chế, nên giảm khả năng gắn sai vị trí của
vector, hoặc giảm hiệu quả đột biến gây ung thư như các
loại vector khác.

. • Các vector nhóm này cũng có thể chuyển gen hiệu quả
lúc tế bào đang nghỉ hoặc đang phân chia.
112
 Nhược điểm

Do kích thước nhỏ nên chỉ có thể cho cài gắn và

chuyển những gen liệu pháp có kích thước nhỏ, sau
khi cài gen liệu pháp thường gây ức chế tái bản DNA
của vector AAV, làm hạn chế hiệu quả sử dụng của
vector AAV.
Trong quá trình tạo vector AAV, sự tái tổ hợp tạo ra
những vector mang một vài gen của virus trợ giúp, có
thể gây các đáp ứng miễn dịch không mong muốn → kỹ
thuật tạo vector AAV cần hết sức nghiêm ngặt.

Việc sản xuất số lượng lớn các vector AAV để ứng dụng
lâm sàng vẫn còn nhiều khó khăn.

113
 5.3.4.3. Cơ chế hoạt động

Khi vector AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trưng
(receptor), toàn bộ các gen qua lỗ màng nhân vào trong
nhân tế bào.

Trong nhân tế bào chủ, một số gen mã hóa các protein

enzym (protein sớm) được phiên mã và dịch mã, giúp cho
quá trình tái bản DNA và gắn DNA vào vị trí đặc hiệu trên
bộ gen của tế bào chủ, gen liệu pháp trong vector cũng
được nhân lên, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein
liệu pháp, giống như các viral vector khác.

114
 5.3.4.4. Ứng dụng

• Điều trị bệnh

2
ung thư. • Điều trị bệnh
• Điều trị bệnh xơ nang và
nghẽn mạch nhiều loại
vành tim bệnh khác.

1 3
5.3.5. Hệ thống vector Virus simplex herpes
5.3.5.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền của virus simplex herpes

Virus simplex herpes (Herpes Simplex Virus – HSV) là một

nhóm virus lớn, có bộ gen là DNA mạch kép, gây nhiều
loại bệnh ở người và động vật. Đặc biệt trong đó, virus
simplex herpes-1 (HSV1) có thể nhiễm và tồn tại rất lâu
trong tế bào thần kinh không phân chia, đồng thời chúng có
khả năng sinh sản trong nhân.

Virus simplex herpes-1 116

 Vỏ bọc

Nhân HSV Teguenzymt

Capsid
117
Đường kính virus khoảng 150nm, trung tâm là nhân đậm đặc
chứa DNA mạch đôi, một capsid bao bọc bên ngoài có cấu
trúc 20 mặt, bao gồm 162 tiểu phần. Bên ngoài capsid là một
lớp vỏ định hình có tên là teguenzymt, cấu trúc sợi đặc trưng
cho HSV. Bên ngoài teguenzymt có một lớp vỏ với bề mặt có
nhiều tua nhỏ.

Cấu trúc virus simplex herpes 118

Bộ gen của HSV chứa nhiều vùng dài và vùng ngắn duy nhất
gọi là các vùng UL (long unique region) và US (short unique
region), mỗi bên được bao bởi các trình tự lật ngược. Sự
phiên mã các vùng gen sớm nhờ nhân tố phiên mã VP16
hiện diện trong virus.

Virus Simplex Herpes 1

119
HSV chứa 3 điểm khởi sự sao chép (Ori). Một ori nằm giữa
vùng UL gọi là OriL, Ori thứ hai nằm trong vùng lật ngược
US gọi là OriS. Ori thứ ba nằm trong mạch kép cuộn tròn
cần cho sự sao chép. DNA virus được đóng góp thông qua
trình tự đóng gói nằm trong vùng gen cuối của bộ gen.

120
5.3.5.2. Nguyên lý thiết kế vector HSV

• Phần lớn hệ thống chuyển gen nhờ HSV đều dựa vào các
virus để giúp đỡ cung cấp các protein cần cho sự sao mã và
gắn kết các bộ phận của virus.
• Bộ gen của virus giúp đỡ được biến đổi để không đóng gói
được. Vì vậy các hạt virus hoang dại không được tạo thành.
• Để sản xuất các vector, một amplicon plasmid được biến
nạp vào trong tế bào chủ đã nhiễm helper HSV. 121
Amplicon lasmid là vector
có cấu trúc bao gồm các
thành phần nguyên thủy
của HSV như:
 Trình tự khởi sự sao
chép.
 Dấu hiệu đóng gói được
kết hợp chặt chẽ vào
trong plasmid của E.coli.

122
 HSV có bộ mã sao chép tương tự như ở phage lamda và
trong suốt quá trình sao chép DNA, mạch vòng ở trong làm
khuôn, sự sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ đầu 3‟OH.
 Quá trình sao chép tạo ra DNA mạch đôi thẳng, phân tử
này gồm nhiều bản sao của amplicon.
 Bởi mỗi amplicon có chiều dài khoảng 15 kb, một bộ gồm
nhiều bản sao nối tiếp nhau sẽ bằng kích thước bộ gen
HSV, sau đó được đóng gói trong vỏ capsid của HSV.

Virus del herpes simplex 123

 Một trình tự khởi đầu sao chép của HSV (HSV Ori), một tín
hiệu đóng gói cho HSV, một gen trị liệu (TG) được đưa vào
một plasmid E.coli (HSV amplicon plasmid).
 HSV amplicon plasmid này được nhiễm vào một tế bào chủ
(tế bào chủ đã được nhiễm với helper HSV trước đó).
 DNA của HSV amplicon plasmid sao chép kiểu cuộn vòng.

Herpes Simplex Virus 2

124
Một bộ gen của HSV (tương đương với khoảng 10 amplicon)
được đóng gói như là một đơn vị vào trong vỏ capsid.

Bộ gen của HSV helper không được đóng gói.

Những tiểu phần HSV mang nhiều bản sao gen trị liệu được
giải phóng sau chu trình tan của tế bào và được dùng để nhiễm
nạp vào tế bào thần kinh).

125
Hệ thống vector HSV 126
Đồng nhiễm vào tế bào chủ virus hoang dại HSV và plasmid
mang gen liệu pháp để tạo HSV tái tổ hợp

Sau quá trình sao chép của DNA plasmid và DNA HSV
hoang dại diễn ra trong nhân tế bào chủ, sự tái tổ hợp
giữa bộ gen của của HSV và trình tự tương đồng của
HSV trong plasmid tạo nên bộ gen của HSV có cấu trúc
đầy đủ và chúng mang gen trị bệnh.
Sự đóng gói diễn ra với cả hai hạt virus hoang dại và
virus tái tổ hợp. Sau khi làm tan tế bào chủ, cả hai virus
đều được giải phóng vào môi trường.

127
 Sự đóng gói diễn ra với cả hai hạt virus hoang dại và virus
tái tổ hợp. Sau khi làm tan tế bào chủ, cả hai virus đều được
giải phóng vào môi trường.
 Các virus tái tổ hợp mang gen liệu pháp được chọn lọc qua
phân tích bằng PRC hoặc lai DNA.
 Vector HSV được sử dụng để chuyển gen vào não, tủy sống
và cơ, nhưng đến nay vẫn chưa sử dụng liệu pháp này trên
người.

Biểu hiện bệnh liên quan đến Virus Herpes

128
 Một plasmid chứa gen trị liệu nằm giữa những trình tự
DNA không cần thiết của bộ gen HSV và một bộ gen
DNA hoàn chỉnh của HSV được đồng nhiễm vào cùng
một tế bào chủ.
 Sau quá trình sao chép cuộn vòng của bộ gen HSV trong
nhân tế bào chủ, sự tái tổ hợp (biểu thị bằng những gạch
nối) có thể xảy ra trình tự HSV của plasmid và HSV
DNA.

129
Cả phân tử DNA đầy đủ của chủng hoang
dại và phân tử DNA của HSV tái tổ hợp đều
được đóng gói vào trong tiểu phần virus và
được giải phóng. Những phần tử virus này
sau đó tiến hành sinh sôi nảy nở và người ta
kiểm nghiệm những vệt tan để nhận diện ra
vector HSV tái tổ hợp. Nguồn vector HSV
tái tổ hợp này được lưu trữ cách xa HSV
hoang dại.

130
Sự tạo thành của vector HSV tái tổ hợp
131
5.3.5.3. Cơ chế hoạt động của vector HSV-1

Vector HSV-1 là loại vector liêu pháp gen có

nhiều ưu thế, có khả năng gắn và chuyển
những gen liệu pháp kích thước tương đối lớn
từ 30-50 Kb.

Vector HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh,

thời gian tiềm ẩn dài, đồng thời không gây
hoặc ít gây đáp ứng miễn dịch không mong
muốn ở tế bào chủ.

Với kích thước 152kb, DNA của virus mã hóa

cho hơn 75 loại protein khác nhau.

132
Quá trình nhiễm diễn ra khi virus bám vào bộ phận đặc biệt của
tế bào chủ giúp cho capsid sau đó lọt vào bên trong để chuyển
tới nhân của tế bào.

Các thành phần của virus sẽ tương tác ức chế các quá trình
sinh tổng hợp của tế bào chủ.

133
Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HSV
134
 • Độc tố của những virus nhược độc.

Có 2 rủi ro • Sự phát triển của các virus hoang

chính khi sử dại. Sử dụng liều cao các vector
HSV-1 hủy bỏ một gen sẽ có nguy
dụng các cơ gây bệnh tế bào.
vector HSV-1 • Các vector HSV-1 hủy bỏ bốn gen
cho thấy sẽ ít độc hơn. Sự phát
triển virus hoang dại sẽ gây nhiều
bệnh nguy hiểm chẳng hạn như
viêm não, tủy sống...
135
 5.3.6. Những vector virus khác

Một số virus khác cũng được sử dụng như các phương tiện cho
việc chuyển gen.

Baculoviruse là virus có nhân DNA vòng mạch

kép từ 80kb- 230kb, sao chép trong tế bào côn
trùng in vitro và in vivo, hiện đang được sử dụng
nhiều làm vector trong chuyển gen liệu pháp.
Virus đậu mùa có DNA mạch kép dài 191kb,
chúng có hơn 198 ORF và có thể được chèn vào
bộ gen tế bào qua sự tái tổ hợp tương đồng. Tuy
nhiên, đây là các virus độc, trong thao tác cần hết
sức thận trọng.
136
 5.4. VECTOR KHÔNG PHẢI VIRUS DÙNG
TRONG LIỆU PHÁP GEN

• Những vector không có bản chất

virus bao gồm tất cả phương tiện
mang những phân tử nucleic acid
không liên quan đến việc tạo ra
những tiểu phần virus.
• Chúng được chia thành 2 dạng cơ bản
dựa vào thành phần phân tử:
 Các phân tử DNA và RNA tại chỗ
được khuếch đại trong tế bào vi
khuẩn hay các tế bào eukaryote khác.
 Những oligodeoxyribonucleic hay
những phân tử tương tự khác được
tổng hợp in vitro bằng phương pháp
nhân tạo.
137
5.4.1. DNA và RNA đƣợc khuếch đại trong vi khuẩn và
tế bào Eukaryote

 Các phân tử DNA hay RNA mục tiêu

được dòng hóa trong các plasmid, hay
các NST nhân tạo, tại đây chúng được
khuếch đại trong các tế bào vi khuẩn
hay tế bào eukaryote.
 Sau đó, một lượng lớn plasmid hay
NST nhân tạo được thu nhận, gọi
chung là các DNA trần (naked DNA)
mang gen liệu pháp.
 Các DNA trần này sẽ được biến nạp
vào trong tế vào mục tiêu (in vitro hay
in vivo) bằng nhiều các thức khác nhau.
138
 5.4.1.1. Các vector

Một số điểm cần phải lưu ý đối với

các vector không virus, được khuếch
đại trong các tế bào prokaryote hay
eukaryote:
Kích thước đoạn gen chèn.
Cách chuyển các vật liệu di truyền
vào trong tế bào đích hiệu quả.
 Duy trì vật liệu di truyền trong tế Plasmid map
bào để có thể biểu hiện trong thời
gian dài.
139
5.4.1.1. Các vector

• Để có thể khuếch đại được đoạn gen mong muốn, kích

thước đoạn gen mục tiêu thường phụ thuộc các tế bào
chủ khác nhau.
• Vi khuẩn thường khuếch đại các plasmid, bacteriophage,
cosmid và NST nhân tạo của vi khuẩn (BAC).

140
5.4.1.1. Các vector

• Plasmid là phân tử DNA dạng vòng tròn có nguồn gốc

từ vi khuẩn. Các plasmid có thể nhận một trình tự dài
chừng 15kb của các gen ngoại sinh.
• Bacteriophage là phân tử DNA của virus dạng mạnh kép
thẳng, có thể nhận được đoạn gen ngoại sinh dài 20kb.
• Cosmid là phân tử plasmid được biến đổi mang trình tự
cần thiết cho sự đóng gói DNA vào trong tiểu phần
bacteriophage, chúng có thể nhận đoạn gen ngoại sinh
dài đến 45kb.
• BAC chứa các nhân tố của một NST bình thường và có
khả năng sao chép độc lập, chúng mang được những
đoạn gen chèn ngoại lai đến 100kb.
141
BAC vector
142
5.4.1.1. Các vector

• NST nhân tạo của nấm men (YAC)

chứa telomere. YAC có thể mang
một trình tự gen ngoại lai dài đến
1000kb (1Mb). Tuy nhiên, YAC
không khuếch đại trong tế bào động
vật có vú.
• Trên cơ sở lý thuyết, NST nhân tạo
người có thể là một vector mang gen
chữa bệnh rất tốt. Chúng có khả năng
mang một được một đoạn DNA kích
thước lớn, cho phép đưa một loạt các
nhân tố điều hòa ổn định, nhằm biểu YAC vector
hiện của một hoặc nhiều gen chữa
bệnh vào trong tế bào của người.
143
5.4.1.2. Biến nạp các vector vào tế bào

Việc biến nạp các phân tử DNA

plasmid vào trong tế bào rất khó
đạt hiệu quả cao. Tuy nhiên, các
vector không virus này vẫn có thể
được chuyển vào tế bào theo các
cách in vivo và ex vivo.
Đối với phương thức ex vivo, các
gen được chuyển vào tế bào bằng
cách sử dụng calciphosphat, điện
biến nạp, các lipid tích điện
dương hay các liposome.

144
Việc chuyển gen in vivo
thường kém hiệu quả hơn
việc chuyển gen ex invo.
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng
liposome, các lipid tích điện
âm hay dương để tăng cường
vận chuyển DNA vào trong
tế bào.

145
 5.4.1.2. Biến nạp các vector vào tế bào

• Một số cách biến nạp:

Để thu nhận chọn lọc các DNA
nhằm đưa chúng vào tế bào, mô
hay cơ quan chuyên biệt, phân tử
DNA phải được gắn với một phân
tử X chuyên biệt có khả năng kết
hợp với các receptor nào đó, chẳng
hạn receptor asialoglycoprotein.
Bắn DNA vào trong tế bào mục
tiêu là phương pháp được phát
triển đầu tiên để chuyển gen vào tế
bào thực vật và hiện nay được mở Hệ thống chuyển gen
rộng ở tế bào động vật có vú và DNA và phân tử liên
các mô sống khác. hợp
146
5.4.1.3. Những rủi ro

• Hai rủi ro chính khi sử dụng các vector nói trên trong
liệu pháp gen:
Đột biến chèn có thể gây hoạt hóa các oncogene, hay ức
chế chính các gen ức chế khối u, nếu plasmid sát nhập
vào bộ gen.
Các chất kích thích cho cơ chế vận chuyển DNA có thể
sẽ phát sinh tác dụng độc lên tế bào đích.

147
 5.4.2. Oligonucleotide

Oligonucleotide là nhóm vetor thứ hai không dựa vào virus.

Oligodeoxynucleotide là một phân tử DNA dài chừng 20 –

25 nucleotide, chúng điều hòa sự biến đổi gen trong tế bào
bằng nhiều cách khác nhau.

148
 5.4.2. Oligonucleotide

• Antisense
Kỹ thuật oligonucleotide
antisense • Ribozyme
• RNAi

SMaRT • SMaRT

Liệu pháp
triplex • triplex

149
 5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

 Antisense là những đoạn

oligonucleotide dài chừng 15 - 20
nucleotide, được sử dụng để ức
chế sự biểu hiện của gen mục
tiêu, bằng cách gắn chuyên biệt
trình tự mRNA (mRNA gọi là
mạch sense) thông qua sự bắt cặp
Watson-Crick.

 Kỹ thuật antisense dựa vào sự

tổng hợp các trình tự nucleic acid
ngắn, mạch đơn hay dài (RNA
hay dựa vào DNA) của các trình
tự nucleotide đặc biệt. 150
 5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

Năm 1978, Zamecnik và Stephenson đã

phát hiện ra khả năng của oligonucleotide
hoạt động như một tác nhân antisense ức
chế sự nhân lên của virus trong nuôi cấy tế
bào.
Paul C. Zamecnik

Năm 1998, thuốc antisense đầu tiên với

thương hiệu Vitravene (Fomivirsen) ra
đời, thông qua sự chấp nhận bởi Cơ quan
Thực phẩm và Thuốc của Mĩ - FDA. Thuốc antisense
151
  5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

Sử dụng các antisense-oligonucleotide

(AS-ON) để bắt cặp bổ trợ với các mRNA.

Kỹ thuật
sử dụng Sử dụng ribozyme và DNA enzyme để
anti- phân hủy các RNA mục tiêu.
mRNA.
Sử dụng các đoạn oligonucleotide kích
thước nhỏ để can thiệp (interference), ức
chế sự biểu hiện gen trong tế bào động vật
có vú gọi là các iRNA hay siRNA (small
interference RNA).
152
 5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

Cơ chế hoạt động chính của antisense

AS-ON được thiết kế để hoạt hóa RHase H, cắt

một mạch RNA của mạch kép DNA-RNA.

Ức chế dịch mã do khóa cấu trúc không gian,

ngăn cản sự di chuyển của ribosome.

153
 5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

Những phân tử RNA

dài hình thành nên cấu
trúc bậc hai và cấu Xác định
trúc bậc bốn. được
những vị trí
mục tiêu dễ
bị ảnh
hưởng trên
Trung bình, chỉ 1/8 phân tử
các AS-ON là gắn mRNA.
hiệu quả và đặc hiệu
vào các mRNA mục
tiêu.
154
 5.4.2.1. Khái quát kỹ thuật antisense

Việc mô hình hóa Cấu trúc Sử dụng máy

các cấu trúc RNA RNA tính thiết kế
dài theo các phần không các AS-ON sẽ
mền máy tính giống như bị hạn chế
còn nhiều tính trong tế không chính
hạn chế. bào. xác.

155
 Khi sử dụng thư viện ON và
RNase H đã cho thấy một bức
tranh toàn cảnh các vị trí mục tiêu
dễ bị ảnh hưởng trên mRNA.
 Qua đó, dạng biến thể của chiến
lược này sẽ được phát triển, các
AS-ON chuyên biệt mục tiêu
được tạo ra bằng cách mạch DNA
khuôn.
 Một phương pháp khác đơn giản
hơn, là sàng lọc lượng lớn các ON
đặc hiệu với sự phiên mã khi hiện
diện RNase H, qua đó ước lượng
phạm vi cắt được cảm ứng với
từng ON riêng.
156
Khi thiết kế ON cho
các thử nghiệm
antisense cần tránh.

Nếu AS-ON chứa bốn Giảm nồng độ ON và

đầu guanosine liên tiếp những ảnh hưởng không
thì không nên sử dụng. mong muốn.

Các ON chứa các motif Motif này sẽ kích thích sự

CpG được loại bỏ đáp ứng miễn dịch trong hệ
trong các thí nghiệm in thống tế bào động vật có
vivo. vú.

157
 5.4.2.2. Thiết kế các antisense oligonucleotide

Việc lựa chọn và thiết kế tốt những

antisense oligonucleotide thích hợp là
một bước quan trọng trong việc ứng
dụng thành công kỹ thuật antisense.

Biết được cấu Thiết kế và

Thành
trúc thứ cấp chọn lựa
phần
RNA, ái lực
hóa học. antisense.
của antisense.

158
 5.4.2.2. Thiết kế các antisense oligonucleotide

Thông thường một đoạn vào khoảng 10-30 nucleotide trên

mạch mRNA được chọn làm mục tiêu cho các antisense. Các
mảnh mRNA đã lựa chọn trước đó cũng hình thành các cầu
nối nội phân tử giữa các cặp base, giúp tạo nên các cấu trúc
bậc hai và bậc bốn.

Phần lớn mRNA không thể tương tác với các antisense
oligonucleotide.

159
 5.4.2.2. Thiết kế các antisense oligonucleotide

Kỹ thuật đi bộ trên Sàng lọc được trợ giúp

mRNA. bởi máy tính.

Bốn cách tiếp cận

trong thiết kế
antisense.

Nguyên lý cắt thông

Các dãy
RNase H ra khỏi phân tử
oligonucleotide.
mRNA mục tiêu.

160
 5.4.2.2. Thiết kế các antisense oligonucleotide

Kỹ thuật đi bộ trên mRNA

Kỹ thuật đi bộ trên mRNA hay còn gọi là kỹ thuật

giải trình bằng phương pháp đi bộ, dựa trên việc tổng
hợp nhiều trình tự khác nhau để có thể bắt cặp với
những vùng khác nhau trên trình tự đã có sẵn.

Có khoảng một trăm trình tự được kiểm tra nhưng chỉ

có vài trình tự cho kết quả tốt.

161
Kỹ thuật đi bộ trên mRNA

Ưu điểm Nhược điểm

Thu nhận được

một lượng lớn các Tốn kém.
trình tự antisense.

Sàng lọc các

thuốc antisense Mất thời gian
với quy mô và công sức.
lớn. 162
Sàng lọc được trợ giúp bởi máy tính.

Dựa vào dự đoán sự gấp cuộn mRNA, có thể xác

định được những vị trí dễ bị ảnh hưởng của mRNA.

Khi áp dụng phương pháp trên thường thấy có sự

thay đổi một hoặc một vài base, đó là sự thay đổi
không có ý nghĩa về cấu tạo oligonucleotide lại có
sự khác biệt về hoạt tính antisense.

163
Sàng lọc được trợ giúp bởi máy tính.

Ưu điểm Nhược điểm

dự đoán cấu trúc chưa thật

Rẻ, nhanh và dễ tiến hành.
chính xác.

Tìm được những trình tự

Hiệu quả không cao.
cần tìm.

164
Các dãy oligonucleotide.
Những ích lợi trong công nghệ dãy
DNA (DNA array technology) đã dẫn
đến việc phát triển các dãy quét
oligonucleotid như là một phương
pháp mới để xác định các antisense
oligonucleotid hoạt tính.

Phương pháp này cho phép tổng hợp

tổ hợp một lượng lớn oligonucleotid
song song với việc đo lực liên kết của
tất cả các oligonucleotid với mRNA
đích.
165
Nguyên lý cắt thông RNase H ra khỏi phân tử
mRNA mục tiêu.

Tiến hành gắn ngẫu nhiên

với thư viện oligonucleotide.

Sau đó phân tích các vị trí

gắn oligonucleotide bằng
điện di trên gel.

Phương pháp này cũng chưa xác định được một cách
chính xác các vị trí có thể dùng được của mRNA đích
bởi vì sự phân giải của RNase H có thể xảy ra ở nhiều
hơn một vị trí. 166
 5.4.2.3. Những biến đổi của antisense oligonucleotide

Oligonucleotide rất không ổn định trong dịch thể sinh học,

chúng bị phân hủy bởi các enzyme nuclease.

Một lượng lớn nucleotide đã biến đổi hóa học được sử dụng
trong kỹ thuật antisense.

167
 5.4.2.3. Những biến đổi của antisense oligonucleotide

Các cấu trúc

base không tự
nhiên.

Ba phương
pháp biến
đổi.
Phân tử đường
Thay đổi biến đổi (đặc
sườn biệt vị trí 2‟
phosphate. của ribose).
168
 AS-ON thế hệ thứ nhất

Phosphorothioate (PS) oligonucleotide

là thế hệ đầu tiên được sử dụng trong
AS-ON.

Ở thế hệ này, nguyên tử oxy không có

trong cầu nối liên kết trong liên kết
photphodiester sẽ được thay thế bằng
nguyên tử lưu huỳnh.

169
 AS-ON thế hệ thứ nhất
Năm 1960,Eckstein lần đầu tiên tổng hợp PS DNA ON. Sau đó
năm 1987, được Matsukura sử dụng chúng như các AS-ON,
nhằm ức chế sự nhân lên của virus HIV.

170
AS-ON thế hệ thứ nhất

Ưu điểm Nhược điểm

Thời gian tồn Có thể gây độc

tại lâu. tế bào.

giảm nhẹ ái lực

Dễ dàng vận
đối với các
chuyển vào
phân tử RNA
trong tế bào.
bổ trợ.
171
AS-ON thế hệ thứ hai.

Các AS-ON thế hệ thứ hai là những nucleotide có biến đổi

ở vị trí 2‟ ribose.

2‟-O-methyl RNA và 2‟-O-methoxy-ethyl RNA là thành

viên quan trọng của lớp này.

172
 AS-ON thế hệ thứ hai.

Ưu điểm Nhược điểm

Ít độc hơn thế hệ thứ nhất. 2‟-O-alkyl RNA đã không

Ái lục mạnh hơn với RNA thể cảm ứng RNase H cắt
bổ trợ. RNA mục tiêu.

173
AS-ON thế hệ thứ ba.

Peptide nucleic acid (PNA) là những phân tử DNA tương tự

dùng thay thế, được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất
(ngoại trừ PS DNA và 2‟-O-alkyl RNA).

Trong PNA, sườn deoxyribose phosphate được thay thế bởi

các liên kết polyamide.

174
AS-ON thế hệ thứ ba.

Ưu điểm: PNA có đặc tính lai hữu dụng, ổn định

sinh học cao, không độc, ái lực thấp với protein,
gắn được với nucleic acid.

Nhược điểm: Không phát động cơ chế cắt RNA

bởi RNase H, chúng là những phân tử trung hòa
điện, nên sự tan và chuyển vào tế bào luôn nảy
sinh nhiều vấn đề quan trọng,

175
AS-ON thế hệ thứ ba.
 Các nucleic acid bị khóa (locked nucleic acid-LNA): đây
là một trong những nucleotide biến đổi mang lại nhiều
hứa hẹn nhất được tổng hợp đầu tiên ở phòng thí nghiệm
Wengel và Imanishi.
 Các LNA đã được chứng minh có nhiều ứng dụng, đặc
biệt là ức chế sự biểu hiện gen.

176
AS-ON thế hệ thứ ba.

 Morpholino oligonucleotide (MF): Morpholino ON

là những phân tử tương tự DNA, trong đó một nửa
phân tử đường ribose bị thay thế bởi morpholino và
những liên kết phosphoroamidete giữa các tiểu phần
được sử dụng, thay vì các liên kết phosphodieste.
 MF không hoạt hóa RNase H, do đó để ức chế biểu
hiện của gen nào đó, chúng phải gắn vào vùng 5‟
không được dịch mã, hay gắn vào 25 base đầu tiên
xuôi dòng của codon mở đầu đẻ khóa sự dịch mã
(nhằm ngăn chặn ribosome gắn vào).

177
AS-ON thế hệ thứ ba.
• Cyclohexene nucleic acid (CeNA): thay thế vòng 5‟-
furanose bởi vòng 6- là cấu trúc cơ bản của cyclohexene
nucleic acid, làm cấu hình của các oligomer có độ cứng
cao.

• CeNA hình thành nên xoắn kép ổn định với DNA hay RNA
bổ trợ và bảo vệ các ON khỏi sự phân hủy bởi các
nuclease...

178
AS-ON thế hệ thứ ba.
Tricycle-DNA (tcDNA): là nucleotide khác, với khả năng
gắn kết mạnh vào trình tự bổ trợ, được tổng hợp bởi
Leumann và cộng sự. tcDNA không hoạt hóa Rnase H cắt
mRNA.

179
 5.4.2.4. Chuyển các AS-ON vào trong tế bào
 Phương pháp in vivo và in vitro được phát triển để chuyển
ON vào trong tế bào.
 Sử dụng các liposome và lipid tích điện.

 Chiến lược khác để tăng hiệu quả vận chuyển của các
AS-ON là nhập bào thông qua các receptor.
 Vận chuyển xuyên màng tế bào

 Kỹ thuật vi tiêm (microinjection), khoang lỗ màng

(electroporation) hay tăng tính thấm của màng với các
tác nhân hóa học.

180
 Các bước chuyển AS-ON vào tế bào.

Giải phóng các AS-ON ra khỏi các

endosome.

Chuyển các AS-ON qua màng nhân.

Sự phân phối của phức hợp AS-ON

trong nhân và các mối liên quan tới
hoạt động antisense.

Gặp gỡ các mục tiêu trong nhân và

xác định số phận của các mục tiêu.
181
Giải phóng các AS-ON ra khỏi các endosome.

Các AS-ON Để chuyển vị các AS-ON vào cần

trần không thể làm xáo trộn tính ổn định của màng
thấm qua màng bằng các liposome mang điện tích
endosome. dương làm mất ổn định màng.

182
Chuyển các AS-ON qua màng nhân.

Sau khi vi tiêm vào cytosol

hay sau khi thoát ra khỏi
những endosome.

Các AS-ON tích lũy trong

nhân bằng sự khuếch tán thụ
động xuyên qua màng nhân.

183
Sự phân phối của phức hợp AS-ON trong nhân và các mối
liên quan tới hoạt động antisense.

Một khi các ON xuyên qua màng

nhân, chúng sẽ phân phối xuyên
qua các lumen của nhân.

Các ON có thể hình thành nên các

thể có dạng hình cầu (150 - 300nm)
với chức năng chưa rõ.

184
Gặp gỡ các mục tiêu trong nhân và xác định số phận của các
mục tiêu.
Mục tiêu ban đầu của các phân tử antisense là các phân tử
mRNA bổ trợ với chúng.
Các AS-ON có thể lai với các mRNA phiên mã in vitro hay
tổng hợp bổ trợ với các RNA hay DNA.
Phân tử nucleic acid có thể gắn với protein, cho nên có thể
dùng một oligonucleotide gắn với protein nhưng lại không
gắn với nucleic acid, kết quả là ngăn cản chức năng của
protein. Loại oligonucleotide này gọi là „aptamer‟.

185
 Hoạt động của ribozyme:
• Lúc đầu, các ribozyme được tin tưởng là các metalloenzyme.
• Trung tâm xúc tác của ribozyme kết hợp với phân tử RNA
antisense và thể hiện sự cắt chuyên biệt với cơ chất mục tiêu
RNA.
• Hoạt tính enzyme của trung tâm xúc tác ở ribozyme với thời
gian đủ dài, sẽ gây nên sự cắt và phá hủy, hay bất hoạt chức năng
RNA mục tiêu.
• Khi phân tử mục tiêu bị cắt và tái thiết lập trở lại chu trình
gắn-cắt-tách.
• Khả năng ribozyme cắt phân tử mục tiêu và sau đó phục hồi, có
nhiều thuận lợi bởi các RNA antisense chỉ bất hoạt với các RNA
mục tiêu, mà không phân hủy nó (khác với ribozyme).
186
Hoạt động kết hợp các RNA antisense và ribozyme 187
187
Dựa vào kích thước, ribozyme được xếp thành hai nhóm.

Ribozyme Ribozyme
kích thước kích thước
lớn nhỏ

188
 Nhìn chung, đó là các ribozyme thuộc intron
I, II và tiểu phần RNA của enzyme RNase P.
Chúng được tìm thấy trong vi khuẩn và
các bào quan của tế bào thực vật bậc cao,
nấm và tảo (Khan và cs, 2000).
Ribozyme
kích thƣớc Các intron này sẽ được cắt ra khỏi
lớn hnRNA của chúng bằng cơ chế hai bước.
Bước thứ nhất, vị trí được cắt 5‟ bị tấn
công bởi phức hợp 3‟-OH của nhóm
guanosine bên ngoài (nhóm I).
Ở bước hai, nhóm 3‟-OH đầu tận cùng 3‟ của
exon ngược dòng gắn vào vị trí cắt 3‟ để tạo ra
189
sản phẩm cắt.
 RNase P là một endonuclease phân giải từ đầu 5‟ của các
tRNA trưởng thành.
 Trong RNase P vi khuẩn, tiểu phần RNA (RNase P
ribozyme) có hoạt tính xúc tác và là thành phần protein quan
trọng được biết, chỉ hoạt động làm dễ dàng quá trình gắn
của RNase P ribozyme mang điện tích âm vào cơ chất của
nó.
 Phần này đều quan trọng cho hoạt tính xúc tác của
enzyme này. Trong suốt quá trình cắt RNase P ribozyme,
phosphate đều ở vị trí có thể tách ra được (scissile-site
phosphate), và chúng có thể được gắn bởi ion hydroxide để
cắt 3‟-oxygen và tạo đầu mút 5‟-phosphate.
190
Cấu trúc bậc hai của RNase P ribozyme
191
 Cấu trúc riboyzme đầu búa
(hammerhead)

Ribozyme
Ribozyme kẹp tóc HDV
kích thước
nhỏ (hepatitis delta viroid)

3 VS ribozyme

192
Phân tử nhỏ nhất là ribozymehammerhead có trong một và
iRNA vệ tinh (RNAsatellite) của virus thực vật, viroid,
những mRNA phiên mã của các DNA vệ tinh (DNAsatellite)
và nhân tế bào của loài sa giông (một tiểu phần riboprotein
của khoảng 12S trong tế bào trứng)…
Hoạt động của ribozymehammerhead cần các ion kim loại
hóa trị hai (Mg2+). Cơ chế hoạt động của ion kim loại hóa trị
hai như một acid Lewis.
Chúng kết hợp trực tiếp với nhóm 2‟-OH và nguyên tử
oxy còn lại ờ đầu 5‟ để hoạt hóa nucleophile, tạo sự ổn định
của phân tử.
Về bản chất, các hammerhead ribozyme
có thể không phải là metalloenzyme.
193
 Mô hình cấu trúc bậc hai
hammerhead và 10-23 DNA enzyme 194
HDV ribozyme được thu nhận từ các RNA kháng bộ
gen (antigenomic RNA) và RNA bộ gen (genomic
RNA) của HDV.
Trong phản ứng xúc tác bởi HDV ribozyme, nhiều nghiên
cứu cho rằng, phản ứng nội năng phân tử,
N3 tại C76 trong ribozyme HDV kháng bộ gen, và N3 tại
C75trong ribozyme HDV
có thể hoạt động như là một chất xúc tác thực sư.
Tùy vào vai trò khác nhau của N3, hai cơ chế trên được
đặt tên là xúc tác base và xúc tác acid.
Ribozyme VS được thu nhận từ ti thể Neurospora.
Phản ứng xúc tác của ribozyme VS cần ion kim loại hóa trị
hai như Mg2+, nhưng vẫn có hoạt tính tốt với cation hóa trị 1.195
 Sự phát triển của những thư viện dữ liệu đã mở ra con đường
để tạo ra các ribozyme mới với nhiều thuận lợi hơn.
Dễ dàng tiếp cận được những mục tiêu mới, hoạt tính cao ở
điều kiện nồng độ Mg2+ và được tăng cường ổn định sinh học…
Một trong số những công ty đứng đầu trong lĩnh vực này là
Ribozyme Pharmaceuticals đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng
với những ribozyme hammerhead khác nhau đã được ổn định.

Một số ribozyme tổng hợp hóa học được sử dụng thử nghiệm
lâm sàng 196
 5.4.3.4. RNAi

 Cơ chế hoạt động của RNAi

o Cơ chế có thể làm “im lặng” gen sau phiên mã, đáp ứng
lại khi tiêm các RNA mạch đôi dài, được phát hiện đầu
tiên ở giun tròn Caenorhabditis elegans (Fire A và cs,
1998), gọi là sự can thiệp của RNA (interference RNA-
RNAi).

Caenorhabditis elegans 197

o RNAi đang nổi bật như là một chiến lược mới để “tắt có
chọn lọc” sự biểu hiện sau phiên mã của các mRNA.
o Cơ chế này được duy trì một các tiến hóa từ nấm men
đến tế bào động vật.

Nấm men 198

o Khả năng làm “im lặng” một cách chọn lọc, nhanh chóng của
các sản phẩm gen trong hệ thống sinh học phức tạp, rõ ràng.

 Mở ra con đường mới trong các lĩnh vực virus

học và nghiên cứu ung thư.
 Tạo thuận lợi để tìm hiểu sâu hơn các khiếm
khuyết di truyền, thiết kế thuốc…

199
• RNA mạch đôi (dsRNA)
được tổng hợp bên trong
tế bào động vật có vú sẽ
đi vào quá trình “chế
biến” bởi một hệ enzyme
giống Rnase kiểu III gọi
là Dicer.
• Kết quả của quá trình
này là hình thành các
đoạn dsRNA dài khoảng
21 nucleotide, đó là
những RNAi nhỏ siRNA
(small interfering RNA).

200
o Khi bắt cặp với các protein trong tế bào, các siRNA hình
thành phức hợp RISC (RNA – interfering silencing
complex) và phần đầu được sử dụng để nhận diện các
mRNA nội bào.
o RISC sẽ gắn với các trình tự bổ sung trên mRNA và dẫn
đến sự cắt các phân tử mRNA.
o Gần đây, RISC được tinh sạch từ dịch chiết của tế bào
Drosophila bao gồm: một protein đơn, Argonaute 2 với
hoạt tính cắt mRNA.

201
Nguyên tắc hoạt động của RNAi
202
 Cơ chế hoạt động của RNAi có thể tóm lược qua các bước:

Sát nhập các

Các RISC
Các dsRNA phân tử trên
với siRNA
dài được cắt vào phức hợp
mạch đơn bổ
thành các làm “im
trợ các trình
phân tử lặng” cảm
tự mRNA
siRNA bởi ứng RNA-
mục tiêu và
enzyme RISC đã
cắt RNA mục
Dicer được hoạt
tiêu này
hóa

o Kết quả cuối cùng của việc cắt nói trên dẫn đến “knock
down” sự biểu hiện của gen và chức năng của nó.
203
 Có năm phương pháp cảm ứng sự im lặng của những gen
chuyên biệt:
Chuyển nhiễm
các siRNA được
phiên mã in vitro

Chuyển nhiễm các

Chuyển nhiễm các Phương siRNA “cocktail”
siRNA được tổng pháp (sự phân hủy
hợp hóa học
dsRNA dài)

Biểu hiện các Biểu hiện các

siRNA sử dụng siRNA sử dụng
mảnh hoạt tính vector plasmid hay
phiên mã PCR virus 204
Tạo các dsRNA và cắt thành siRNA bằng enzyme Dicer 205
o Để tổng hợp hoặc biểu hiện siRNA, bước đầu tiên phải chọn
trình tự mRNA tối ưu gắn vào mục tiêu.

Scan trình tự mRNA mục tiêu (xuôi dòng từ codon mở đầu
AUG) để chọn lấy một trình tự 21 nucleotide với AA.

Xác định và loại bỏ những trình tự 21 nucleotide không

chuyên biệt (ví như những trình tự tương đồng với những
mRNA khác) bằng cách tìm kiếm các trình tự từ cơ sở dữ
liệu của bộ gen (ví dụ BLAST).

Tiếp theo, chọn khoảng 3 – 4 trình tự mục tiêu dài chừng 21
nucleotide, từ những vùng khác nhau của mRNA.

206
 Tổng hợp hóa học các siRNA: Khi trình tự siRNA
được chọn, chúng có thể được tiến hành tổng hợp từ
những nucleotide riêng rẽ ban đầu. Cần phải tạo ra
khoảng 3 – 5 siRNA để dễ dàng kiểm tra, lựa chọn
chúng sao cho có thể tối ưu hóa sự im lặng của gen.

 Phiên mã in vitro các siRNA: Vì sự tổng hợp hóa

học các siRNA chi phí cao, phương pháp in vitro
đơn giản dựa trên nghiên cứu của Milligan và cs
(1987) cho phép tạo ra các siRNA trong 24 giờ với
chi phí thấp nhất.
207
o Phiên mã các siRNA này bao gồm:
(1)Tạo mạch khuôn dsRNA của các trình tự mRNA
mục tiêu dài 21bp bên sườn của promoter T7.

(1)Phiên mã những mạch khuôn DNA dùng T7

RNA polymerase để tạo ra các RNA mạch đơn nhỏ
(ssRNA).

(1)Gắn các ssRNA với các trình tự antisense để tạo
ra các dsRNA nhỏ.

(1)Tạo các siRNA trưởng thành bằng các xử lý với

phản ứng DNase để tách mạch khuôn DNA và
Rnase.
208
 Tạo ra các siRNA “cocktail”:
Trong các động vật bậc thấp (côn trùng, giun tròn…)
và thực vật, RNAi có thể được tạo ra bằng cách
chuyển nhiễm tế bào với các dsRNA dài.
Ở các động vật có vú, sự chuyển nhiễm các siRNA là
cần thiết bởi dsRNA dài hơn 30 nucleotide biểu hiện
hoạt hóa đáp ứng sự kháng virus, dẫn đến ức chế và
phân hủy các mRNA (Brigde và cs, 2003).

209
 Tạo siRNA sử dụng các vector biểu hiện:
Một chiến lược phát triển gần đây để hoạt hóa sự ức chế
gen cảm ứng RNAi, đưa đến việc sử dụng các vector
biểu hiện siRNA dưới dạng phân tử RNA loop kẹp tóc
cuộn lại phía sau như một RNA kẹp tóc ngắn (short
hairpin RNA – shRNA) (Sui và cs, 2002).

210
Vector plasmid hay virus mã hóa các shRNA điển hình
được đưa vào tế bào thông qua các kỹ thuật tải nạp hay
chuyển nhiễm. Cấu trúc shRNA mang mã được biểu
hiện từ promotor polymerase III như U6 hay H1
promotor (Paddison và cs, 2002).

Sau khi biểu hiện, shRNA được chế biến trong

cytoplasm thành các siRNA hoạt động, sau đó chúng thu
hút phức hợp RISC, dẫn đến phá hủy mRNA mục tiêu.

211
Tạo shRNA từ một cassette biểu hiện shRNA
(Ketting và cs, 2001)
212
 Các mảnh được tạo ra
bởi quá trình PCR:
Những tập hợp biểu hiện
shRNA đầy đủ chứa một
promotor, và một
terminator cũng có thể
được tạo ra bằng phản ứng
PCR. Việc này giản tiện vì
không cần phải tạo dòng,
biến nạp vào vi khuẩn và
chuẩn bị plasmid.

213
o Đầu tiên phải tổng hợp các oligonucleotide
DNA hai mạch bổ trợ khoảng 50 nucleotide mã
hóa các trình tự sense và antisense shRNA và
cũng chứa các vị trí giới hạn nhô ra.
o Tiếp theo, các oligonucleotide được tách mạch
và gắn lại. Tiếp đến là phản ứng nối được tiến
hành bằng quy trình PCR, sử dụng các primer
chứa trình tự promoter và terminator. Bằng cách
đó sẽ tạo ra các mảnh shRNA hoạt động
o Sau cùng, các mảnh được tinh sạch và chuyển
vào tế bào.

214
 Chiến lƣợc
Triplex DNA :
Làm thay đổi
sự biểu hiện của
gen dựa trên sự
gắn trực tiếp
các
oligonucleotit
lên DNA
Sơ đồ biểu diễn sự hình thành
bộ ba DNA giữa các phân tử.
215
 Phương pháp

(C) Các
(A) Sử dụng các
(B) Sử dụng PNA oligonucleotide
polyamide gắn
để thay thế một gắn vào rãnh
vào các rãnh
đoạn mạch lớn của xoắn
nhỏ của phân tử
xoắn DNA. DNA hình thành
DNA mạch kép.
các triplex.

Ba cách thay đổi sự biểu hiện của DNA 216

 Nguyên lí hoạt động: PNA sẽ thay thế một đoạn mạch của
chuỗi xoắn kép DNA. Dưới nhiều điều kiện, xoắn kép
PNA-DNA ổn định hơn xoắn kép DNA-DNA (Egholm và
cs, 1993).
 Riêng cấu trúc PNA rất ổn định bên trong tế bào, tuy nhiên
mức độ thành công còn phụ thuộc các tế bào phôi hay các
tế bào đang biệt hóa.

Sự bắt cặp kiểu Wtson-Crick, Hoogsteen và Hoogsteen ngược217


Polyamide liên quan đến các
polymer pyrrole – imadazole
được gắn như các dimmer
đối song song vào rãnh nhỏ
của xoắn kép DNA.
Mục tiêu chủ yếu là các cặp 5
-7 của DNA, bởi vì ái lực của
polyamide sẽ giảm khi phải
lựa chọn các mục tiêu lớn
hơn.
Sự tương tác chuyên biệt các
trình tự sẽ được tăng cường,
thông qua sự bắt cặp cạnh -
cạnh của pyrrole và amino
acid imadizole vào các cặp
base nucleotide ở rãnh nhỏ
(White và cs, 1998).
218
 Có hai motif gắn được biết
Các oligonucleotide hình đều liên quan đến sự tương
thành triplex (TFO) sẽ gắn tác giữa các cấu trúc base
vào các rãnh lớn của xoắn của TFO với các base purine
kép DNA. của chuỗi polypurine/
polypyrimidine thuộc chuỗi
xoắn kép DNA.

Trong điều kiện

nhất định

Trong motif pyrimidine, một

OND gắn song song vào mạch
purine của chuỗi DNA (T gắn
với A của chuỗi A-T và C gắn
với G của chuỗi G-C).
219
Các nghiên cứu in vitro về quá trình tổng hợp DNA (sử
dụng các DNA polymerase khác nhau) cho rằng triplex có
thể ức chế sự tổng hợp DNA (Hacia và cs, 1994).

TFO có khả năng ức chế sự phiên mã ở cả in vitro và in

vivo (Bailey và Weeks, 2000).

Tuy nhiên, sự sao chép in vivo của DNA có bị ức chế bởi sự

hình thành triplex DNA không thì chưa rõ (Maine, 1994).

220
SMaRT được viết tắt từ thuật
ngữ “cắt nối
chéo RNA thông qua
spliceosome”
Cấu trúc SMaRT sẽ trực
tiếp sửa chữa những đột
biến gen nhờ thay thế
các đoạn gen bị đột
biến bằng các exon bình
thường, thông qua sự
cắt nối bởi spliceosome.

Chiến lược SMaRT 221

 Sự trƣởng thành của phân tử mRNA
Quá trình cắt và ghép các
đoạn exon và loại bỏ các đoạn
intron sau khi gen phiên mã.
Sự cắt nối cis là quá trình trưởng
thành chủ yếu của mRNA diễn
ra trong các tế bào eukaryote.
Các intron bị cắt và các exon của
cùng một pre-mRNA được ghép
để tạo thành mRNA trưởng
thành.
Sự trưởng thành của phân tử
mRNA, chúng được tiến hành
bằng hai cách.
Sự cắt nối trans (cắt nối chéo)
hiếm có trong tế bào động vật.
Quá trình này xảy ra trên 2 pre-
mRNA khác nhau, exon của
mRNA này có thể ghép nối vào
exon của mRNA khác.
222
223