Đột biến điểm định hướng

Chuyển gene thực vật

Giải trình tự

An Phạm
 Chuyển gene để làm gì?
• Forward genetics: Từ tính trạng -> xác định được gene quy định.

• Reverse genetics: Từ gene mục tiêu -> xác định tính trạng do gene quy
định

• => Kiểm tra, đánh giá và chứng minh chức năng gene
• => Ứng dụng đưa gene mục tiêu vào sản xuất.
 Các phương pháp chuyển gene ở thực vật
• Dùng phương pháp vật lý: Vi tiêm, bắn gene, dùng điện

• Dùng vi sinh vật: vi khuẩn (Agrobacterium) - Virus

• Dùng chất hóa học (trên tế bào trần): Polyethylene glycol (PEG), dung
nạp liposome.
Phương pháp vật lý
Vi tiêm: Rất khó thực hiện, đòi hỏi kỹ thuật cao. Hiệu suất chuyển gene
cao. Ít được sử dụng trên tế bào thực vật.

Bắn gene: Dễ thực hiện, hiệu suất chuyển gene thấp, lượng biến dị cao,
khó kiểm soát kết quả. Được sử dụng rất nhiều trên thực vật.

Shock điện: Quy trình dễ thực hiện, cần máy móc hiện đại, hiệu suất
chuyển gene rất thấp. Ít đượ sử dụng trên tế bào thực vật.
Phương pháp hóa học
Phương pháp PEG: Tương đối khó thực hiện, đòi hỏi kỹ thuật người
thực hiện. Hiệu suất chuyển gene thấp. Được sử dụng nhiều trong
nghiên cứu tế bào thực vật.

Phương pháp dung nạp liposome: Đòi hỏi kỹ thuật và thiết bị hiện đại
để tạo thể liposome. Hiệu suất chuyển gen thấp. Ít được sử dụng trong
chuyển gene thực vật.
Phương pháp sử dụng vi sinh vật
• Agrobacterium: Hiệu suất chuyển gene không cao lắm. Rất dễ thực
hiện. Được sử dụng nhiều trong nghiên cứu thực vật và chuyển gene
thực vật.

• Virus: Cần các dòng virus chuyên biệt cho loài thực vật sử dụng. Hiểu
suất chuyển gene cao. Khó kiểm soát kết quả. Sử dụng nhiều trong
nghiên cứu thực vật.
 Chú ý về các phương pháp chuyển gene trên
thực vật
• Đa số được sử dụng để biểu hiện tạm thời trên thực vật.

• Phương pháp sử dụng Agrobacterium và súng bắn gene được sử

dụng phổ biến để tạo cây chuyển gene trong chọn giống.

• Các phương pháp chuyển gene đa số đều cần nuôi cấy mô để hình
thành cây con chuyển gene (trừ trường hợp đặc biệt của
agrobacterium và một số loài cây như Arabidopsis).
 Phương pháp sử dụng Agrobacterium
• Các thành phần chính (về vật liệu di
truyền):

• Gene mục tiêu

• Vector mang
• Gene sàng lọc
• Gene Vir

https://www.nature.com/articles/433583a/figures/2
Vectors
 Đột biến điểm định hướng
• Gây đột biến có chủ đích, tại vị trí chính xác đã thiết kế.

• Có hai dạng phổ biến:

• 1) Gây đột biến trên vector tạo dòng (site-direct mutagenesis)

• 2) Gây đột biến sử dụng hệ thống CRISPR/Cas của vi khuẩn.

Site-directed mutagenesis
Site-directed mutagenesis
Đặc điểm chuyển gene sử dụng phương pháp
site-direct mutagenesis
• Dễ thực hiện: không cần quá phức tạp trong quá trình thiết kế.

• Thay đổi chính xác gene mục tiêu theo mong muốn.

• Quá trình chèn gene mục tiêu (đã biến đổi) vào bộ gene thực vật là
ngẫu nhiên.

• Thường được tính là cây chuyển gene (GMO)

 Phương pháp sử dụng CRISPR/Cas

• Là phương pháp sử dụng hệ thống CRISPR/Cas của khuẩn để chỉnh

sửa bộ gene của sinh vật mục tiêu.

• Bên cạnh CRISPR/Cas còn có các hệ thống như: zinc finger nucleases
(ZFNs), Tal effector nucleases (TALENs). Tuy nhiên CRISPR/Cas có
nhiều ưu điểm hơn cả về hiệu suất lẫn khả năng ứng dụng.

• Có nhiều CRISPR/Cas khác nhau (được đánh số 9, 12a, 12b và 13).

Hiện nay phổ biến nhất là CRISPR/Cas9
Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9

Alexandra C.
Chadwick
and Kiran
Musunuru
(2017)
 Đặc điểm của phương pháp chỉnh sửa bộ
gene
• Chỉnh sửa được chính xác trên locus mục tiêu (trên bộ gene)

• Có phương án để không bị tính là cây chuyển gene

• Vị trí chỉnh sửa là xác định, tuy nhiên vẫn chưa kiểm soát được kết
quả -> Khó sử dụng trên người -> sử dụng nhiều trên thực vật.

• Vẫn có trường hợp chỉnh sửa nhầm chỗ

• Cần kiểm tra lại rất nhiều bằng phương pháp giải trình tự.
Phương pháp giải trình tự Sanger
 Các vấn đề của phương pháp giả trình tự
Sanger
• Ứng với mỗi primer, chỉ đọc được đoạn trình tự mục tiêu. Kích thước
đoạn trình tự mục tiêu dài nhất có thể đọc là khoảng 1kb.

• Ứng dụng để kiểm tra chính xác trình tự ngắn.

• Vẫn là phương pháp được ứng dụng để phát triển các giải pháp giải
trình tự sau này.
 Các phương pháp giải trình tự thế hệ mới
(Next generation sequencing - NGS)
• Sử dụng để giải nhiều trình tự cùng một lúc.

• Có 2 trường phái phát triển:

• Ứng dụng phương pháp Sanger: Illumina (short read)

• Phát triển công nghệ mới: Ion torrent (short read); Pacbio (long read)
Illumina (short read)

https://www.intechopen.co
m/books/next-generation-
sequencing-advances-
applications-and-
challenges/next-generation-
sequencing-in-aquatic-
models
 Ion torrent (short read)

https://www.researchgate.net/publication/317594687_Generations_of_Sequencing_Technologies_From_First_to_Next_Generation
Pacbio (long read)
 Các vấn đề của các phương pháp NGS
• So với lượng thông tin có được, NGS là phương pháp cho kết quả
nhanh.
• So với lượng thông tin thu được, NGS là phương pháp rất rẻ (chi phí
cho một lần chạy vẫn khá cao).
• Lượng thông tin thu được bao quát cả những gì dự đoán được lẫn
không dự đoán được. => để sàng lọc là rất tốt.

• Yêu cầu cao về: chất lượng DNA/RNA, trang thiết bị hiện đại, kỹ năng
kỹ thuật viên và trình độ phân tích dữ liệu.
• Có sai sót cao
• Chưa được coi là phương pháp chuẩn (luôn phải kiểm định lại bằng
Sanger).
 Ứng dụng của giải trình tự trong chọn giống
thực vật
• Đánh giá lại vật liệu di truyền của giống thực vật.

• Khảo sát sự sai khác về vật liệu di truyền quy định tính trạng.
• Khảo sát sự biểu hiện gene ở các điều kiện khác nhau của giống.
• Khảo sát tính đa hình của các marker phân tử -> lập bản đồ vật lý cho
các marker.
• Xác định loài (giống) mới -> lưu trữ loài – giống.
• Hiểu được cơ chế của sự sai khác tính trạng về mặt di truyền của các
loài – giống thực vật khác nhau -> tiến tới tạo ra những loài – giống
theo mong muốn của con người