GRUANJE ili SIRENJE MLIJEKA djelovanjem kiseline ili enzima

GRUANJE ili SIRENJE MLIJEKA

Opa zbivanja tijekom koagulacije proteina:
destabilizacija proteina (denaturacija) - poremeaj prirodne strukture- rezultat razgradnje zbliavanje razdvojenih proteina (asocijacija) povezivanje promijenjenih proteina (agregacija) - uvjetuje daljnju izmjenu strukture- rezultat interakcije oblikovanje trodimenzionalne mree gel proteina - koja obuhvaa preostalu tekuu fazu- poluvrsti sustav

koagulum ili gru sira

2

GRUANJE MLIJEKA

DJELOVANJEM KISELINE
izravnim zakiseljavanjem mlijeka:

dodatkom neke kiseline

mlijene, octene, limunske, fosfatne, klorovodine

- samo u proizvodnji- kuhanog sira ili kiselog kazeina

dodatkom glukono-delta-laktona (GDL) u prahu

(dobiva se kristalizacijom glukonske kiseline)

- samo u proizvodnji- nekih mekih sireva (netradicionalnih) dehidrogenacija glukoza 2H glukono delta lakton GDL + H2O glukonska kiselina H2O
3

mlijeno-kiselim vrenjem: postepeno zakiseljavanje mlijeka

(pH 4,6) djelovanjem kulture BMK (bakterije mlijene kiseline)
do pH izoelektrine toke kazeina

kod tradicionalnog svjeeg mekog sira

(mezofilna kultura) kod probiotikog svjeeg mekog (termofilna kultura)

sira

KOAGULACIJA KAZEINA

DJELOVANJEM KISELINE
Mlijeno-kiselo vrenje (BMK): postupno zakiseljavanje mlijeka
(ovisno o vrsti kulture / procesnim uvjetima)

fizikalno/kemijske- promjene- strukture micela kazeina

(a) Tenja destabilizaciji micela kazeina (dezagregacija) (b) Tenja povezivanja micela kazeina (agregacija)

(a)

Tenja destabilizaciji micela kazeina (dezagregacija) (do pH = 5,2 5,4):

- rezultat promjena djelovanjem kiseline do odre enog stupnja

postepeno otapanje kazeina unutar micela - otapanje i disocijacija koloidnog Ca-fosfata

(pri 20-30C i pH = 5,2- 5,3 potpuno je topljiv)

odvajanje pojedinih frakcija kazeina od micela - osobito -kazeina

(poveanje udjela slobodnih kazeina u serumu mlijeka)

poveanje hidrofilnosti i poroznosti micela - zbog prethodnih zbivanja

6

(b) Tenja povezivanja micela kazeina (agregacija)

- rezultat daljnjeg zakiseljavanja i stalnih promjena:

smanjenje neto-negativnog naboja kazeina - poveanje hidrofobnosti micela od pH= 5,4- 4,6
(zbiva se stalno sve do pH 4,6)

smanjenje topljivosti micela kazeina - premjetanje -kazeina agregiranim -kazeinom

(nakon pada pH od 5,4 na 5,2 sve do pH 4,6)

poveanje ionske jakosti u serumu mlijeka - uinak otapanja koloidnog Ca-fosfata i Ca2+ micela
(zbiva se stalno sve do pH 4,6)

(stezanje matrice kazeinskih micela)

Slijed zbivanja tijekom oblikovanja kiselog grua

= KOAGULACIJA KAZEINA

pH 4,6

Kada rasprene estice agregiranih micela budu toliko povezane da oblikuju kontinuiranu trodimenzionalnu mreu gel proteina kroz tekuu fazu mlijeka nastaje stabilan sustav koagulum ili gru mlijeka

Kakvoa kiselog grua: ovisi o vrsti mlijeka, kakvoi i prethodnoj obradbi koliini i vrsti dodataka te uvjetima procesa brzini zakiseljavanja (izravno ili pomou kulture)
9

10

Kiseli gru obranog mlijeka

gruba otvorena mrea

(od nezagrijanog mlijeka)

njena povezana mrea

(od zagrijanog mlijeka na 90 C/5)

Gru kazeina (mikrostruktura)

Gru kazeina + proteini sirutke 11

Kiseli gru punomasnog mlijeka

nehomogenizirano homogenizirano

(od nezagrijanog mlijeka)

(od zagrijanog mlijeka na 90 C/5)

12

GRUANJE MLIJEKA

DJELOVANJEM ENZIMA
provodi se pomou sirinih pripravaka
(enzimi ivotinjskog ili mikrobnog podrijetla)

pri T oko 30 oC i pH oko 6 - 6,5 (zrenje mlijeka) uz dodatak CaCl2 (oko 0,02%)- opt. Ca2+iona Aktivnost enzima (kisele proteinaze): - ovisi o vrsti i jakosti pripravka, - pH- vrijednosti i T mlijeka, - koncentraciji enzima i Ca2+ iona

13

Komercijalni pripravci u praksi: pripravak kimozina (renin ili sirilo) izoliran iz etvrtog dijela eluca mladih sisavaca
(80-90% kimozin + pepsin)

najee od teladi i janjadi starih 10-30 dana

(kada se hrane mlijekom), udjel pepsina raste s dobi optimalna aktivnost (T oko 40 C / pH= 5,0-5,5)

pripravak mikrobnih proteinaza (plijesni ili bakterija) - jae izraena proteolitika svojstva od kimozina - manje specifino djelovanje na (Phe105 - Met106) vezu - kazeina
- manja osjetljivost na uvjete aktivnosti (pH, T, Ca2+) - vie se koriste od 1976. god. (zbog nedostatka kimozina)
14

Neke vrste mikrobnih proteinaza

IZVOR ENZIMA* NAZIV PRIPRAVKA Rennilase plijesni Hannilase Fromase Noury plijesni Meito Emporase Suparen plijesni Sure curd Mikrozyme bakterije Milkozym

Mucor miehei Mucor miehei Mucor miehei Mucor pusillus Mucor pusillus Mucor pusillus Endothia parasitica Endothia parasitica Bacillus subtilis Bacillus polymyxa

* U novije vrijeme za plijesni roda Mucor koristi se naziv Rhizomucor *Mucor novi naziv- Rhizomucor Endothia novi naziv- Cryphonectria
15

noviji pripravci (rekombinantni kimozin)

- DNA genska rekombinacija pomou proizvodnih mikroorganizama: - MAXIREN - (Kluyveromyces marxianus var. lactis)

- Chymogen - (Escherichia coli, soj K-12) - Chy-Max - (Aspergillus niger ) Prednosti MAXIREN sirila (100% kimozin): - mogua je neograniena opskrba
- manja osjetljivost na promjene pH- vrijednosti - vrlo specifiano djelovanje na (Phe105- Met106) vezu - kazeina - potrebna manja koliina (oko 10-15%, ponekad i 25%) - bolja vrstoa grua (manji gubitci- u sirutku) - optimalna aroma sireva nakon zrenja ( proteoliza)
16

Utjecaj T na vrijeme gruanja mlijeka djelovanjem enzima sirila

17

Utjecaj dodatka kalcija ili smanjenja kalcija u mlijeku na

vrijeme gruanja, djelovanjem razliitih enzima

18

KOAGULACIJA KAZEINA

DJELOVANJEM ENZIMA
Primarna enzimska faza: - destabilizacija micela - hidroliza - kazeina (djelovanje proteinaza na peptidnu vezu Phe105 Met106)
enzim -kazein (169 ak) para--kazein + makropeptid (GMP / MP) (105 ak) (64 ak)

19

Sekundarna neenzimska faza: - agregacija hidroliziranih micela - pomou Ca2+ (ovisi o promjeru micela kazeina, pH i T mlijeka)
Ca 2+ para --kazein pH= 6,0- 6,4 dikalcijev para --kazein

Tercijarna faza (daljne promjene):

- vrijeme gruanja, ovravanje gela, otputanje sirutke (sinereza)

- daljnja hidroliza kazeinskog grua (nespecifina proteoliza)

20

10

Grafiki prikaz zbivanja tijekom oblikovanja slatkog grua

enzim

stabilne micele s vanjskim slojem kose (-kazeina)

enzim je uklonio polovicu izdanaka kose, preteito kod manjih micela

Ca Ca
2+

2+

oblikovana mrea gela sa vornim tokama od veih micela

neznatno razgranati polimeri, preteito od manjih micela 21

Model prikaza primarne i sekundarne faze gruanja kazeina

SIRUTKA

(GMP) ili MP
(proteoliza -kazeina)

(povezivanje para-kazeina)

oblikovanje trodimenzionalne mree gel proteina

22

11

Kakvoa grua ovisi o vie faktora:

vrsti mlijeka i kakvoi proteina
(T i vrijeme uvanja- prethodne promjene)

prethodnoj obradbi mlijeka

(T pasterizacije, BF, MF, UF)

koliini dodataka u mlijeko

(sirilo, CaCl2 , kiseline - za podeavanje pH)

udjelu i veliini m.m. i proteina

(uvjetuju strukturu grua, sinerezu, gubitke)

23

Vei udjel m.masti : - ograniava agregaciju kazeina - blokira stezanje grua i otjecanje sirutke - uvjetuje tvorbu mekeg grua, gla e teksture Vei udjel proteina: - utjee na bre agregiranje kazeina
(zapoinje pri manjem stupnju hidrolize kazeina)

- uvjetuje tvorbu vreg ili punijeg grua

(koliina sirutke- obrnuto proporcionalna udjelu proteina)

24

12

MIKROBNE KULTURE
U PROIZVODNJI SIREVA

- koncentrirane
(REDI SET)

- vrlo koncentrirane
(DVS/DVI)

- zamrznute/u prahu
- monokulture - mjeovite kulture

- mezofilne/termofilne
25

Tip koncentriranih kultura (Chr. Hansen A/S, Danska)

Tip kulture
Zamrznute-osuene (DVS) Duboko-zamrznute (DVS) Zamrznute-osuene (REDI-SET) Duboko-zamrznute (REDI-SET)

uvanje
zamrzavanje ispod 18 C zamrzavanje ispod 45 C zamrzavanje ispod 18 C zamrzavanje ispod 45 C

Trajnost
min. 12 mjeseci min. 12 mjeseci min. 12 mjeseci min. 12 mjeseci

DVS (direct vat set) ili DVI (direct vat inoculation) - izravno staviti u spremnik (mlijeka za proizvod) REDI SET - staviti i pripraviti (radnu kulturu)
26

13

27

ULOGA MIKROBNE KULTURE

U PROIZVODNJI SIREVA bakterije mlijene kiseline (BMK): - odgovorne za tvorbu kiseline i arome (kod svih sireva) - neke proizvode i malo CO2 (sirne rupice- gaude / trapista)

bakterije propionske kiseline (BPK):

- odgovorne za tvorbu specifine arome sira (slatkasti okus) - proizvode vei udjel CO2 (vee sirne rupe- ementalera)

sojevi proteolitike bakterije Brevibacterium linens

- odgovorne za proteolizu i tvorbu naran astog maza na povrini - utjeu na rumenu boju i specifinu aromu (sireva tipa Limburger)

odabrane vrste plemenitih

plijesni :

- rast bijele plijesni- na povrini sira (bri / kamamber) - rast plavo-zelene plijesni- unutar sira (rokfor / gorgonzola i dr.)

utjeu na intenzivni okus i miris (jaki proteoliti i lipoliti) 28

14

Kulture BMK (mezofilne ili termofilne):

primarno djelovanje (kod svih sireva) - tijekom proizvodnje (rast i tvorba kiseline)
(od 107 cfu/mL u mlijeku do 108 - 109 cfu/g u sirnom gruu)

- tijekom zrenja (aktivnost egzogenih enzima)

(postepena tvorba arome i ostalih karakteristika sira)

Kulture drugih bakterija ili plemenitih plijesni: sekundarno djelovanje (kod nekih sireva) - samo tijekom zrenja (rast i aktivnost)
Propionibacterium spp. (ementaler / grojer)- rupice sira Brevibacterium linens i dr. (limburger i slini)- maz sira Penicillium spp. (sirevi s plemenitm plijesnima) - aroma
29

30

15

ULOGA KULTURA BAKTERIJA MLIJENE KISELINE MEZOFILNE BMK

Tip vrenja Glavni uinak EPS

Lactococcus lactis ssp. lactis ssp. cremoris ssp. diacetylactis Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Leuconostoc lactis
TERMOFILNE BMK

homof. (Cit+/-) homof. homof. (Cit+) heterof. (Cit+) heterof. (Cit+)

Tip vrenja

kiselina +/kiselina +/kiselina, aroma, CO2 aroma, CO2 aroma, CO2

Glavni uinak
+/+/-

EPS

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ssp. lactis Lactobacillus helveticus Lactobacillus casei ssp casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus acidophilus Streptococcus thermophilus Enterococcus faecium
(Cit+)- metaboliziraju citrate

homof. homof. homof. homof./f. heterof. homof./f. heterof. homof. homof. homof. (Cit+/-)

kiselina, aroma + kiselina kiselina kiselina, aroma, CO2 kiselina, aroma, CO2 kiselina kiselina, aroma + kiselina
31

EPS (egzopolisaharidi)

Glavne karakteristike bakterija mlijene kiseline (BMK)

Bakterije mlijene kiseline (stari naziv) Optimalni rast (C) Vrenje Lac Glu Gal Tvorba laktata tip/% Vrenje citrata (+/-) Podnose soli (%)

Mlijeni koki (okrugli oblik bakterija) *S. lactis *S. cremoris *S. diacetylactis S. thermophilus
Leuconostoc ssp.

oko 30 25-30 oko 30 40-45 20-25

+ + + + +

+ + + + +

+ + + +

L/0,8-1 L/0,8-1 L/0,8-1 L/0,8-1 D/malo

+/+ +

4-6,5 2-4,0 4-6,5 <2 2-4

Laktobacili (tapiasti oblik bakterija) L. helveticus L. lactis L. bulgaricus L. acidophilus 40-45 40-45 40-45 35-40 + + + + + + + + + (+/-) + DL/2,5-3 D/1,5-2 D/1,5-2 D/1,5-2 <2 2-4 <2 -

32 *S= mlijeni streptokoki (sada Lactococcus osim Streptococcus thermophilus)

16

Tvorba kiseline (primarna uloga BMK): utjee na svjei okus sirnog grua (sveih sireva) potpomae djelovanje sirila (vea aktivnost) utjee na stezanje grua (sinereza) utjee na promjene unutar estica grua
(demineralizacija) kazein + ml.kis. kiseli gru (pH 4,6) + Ca-fosfat + Ca-laktat Ca-parakazeinat + ml.kis. monokalcijev-parakazeinat + Ca-laktat

utjee na

udjel

Ca u gruu ili siru (i teksturu tijesta)

osigurava uvjete za tvorbu arome sira (u zrionici) inhibira rast patogenih i plinotvornih bakterija
33

Meki sirevi ( pH) sadravaju manje Ca tijesto sira: - kratko, drobljivo, blijedo - esto i raspuknuto Tvr i sirevi ( pH) sadravaju puno vie Ca tijesto sira: - dugo, povezano, izraenije boje - mogunost oblikovanja sirnih rupica Svjei meki sirevi ( pH) sadravaju najmanje Ca
34

17

Mezofilne kulture BMK (20-30 oC): Lactococcus spp. / Leuconostoc spp.

- oko 90% mikroflore - za tvorbu kiseline (homofermentativne) - oko 10% mikroflore - za tvorbu arome i plina (heterof. i Cit+) - (Cit+): vrste koje metaboliziraju i citrate mlijeka

Lactococcus lactis ssp. diacetylactis (homof./ Cit+) Leuconostoc spp. (heterof./ Cit+)

proizvode tvari arome ( diacetil) proizvode malo CO2 (male rupice goude/trapista) ssp. lactis i ssp. cremoris)

- proteolitika aktivnost (Lactococcus lactis Termofilne kulture BMK (37-45 oC):

Streptococcus thermophilus / Lactobacillus spp. - za tvorbu kiseline (Lb. > Str.) i arome ( acetaldehid) - proteolitika aktivnost (Lb. > Str.); Lb. helveticus (Prt+) - tvorba plina (Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. plantarum)
35

Probiotike kulture (terapijska svojstva svjeeg sira)

Nakon preanja i soljenja sira:

mnoge BMK- primarne kulture ugibaju

(Lactococcus spp. - podnose vei udjel soli)

nastavak aktivnosti njihovih egzogenih enzima Biokemijski procesi tijekom zrenja sireva:
djelovanjem egzogenih enzima

(od primarne kulture BMK)

uz pomo sekundarne kulture

(drugih bakterija ili pl. plijesni)

uz pomo sekundarne mikroflore

nastaju specifine karakteristike zrelih sireva

(ili njihovih egzogenih enzima)

36

18

ULOGA KULTURE BAKTERIJA

PROPIONSKE KISELINE
Najee se koriste:
Red. nitrata: Tvorba kiseline:

Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii ssp. globosum ssp. shermanii

(ementaler / grojer)

+ +

+ +

Propionsko-kiselo vrenje (nakon termofilnih BMK) :

bakterije propionske kiseline
3CH3-CHOH-COO(laktat) 2 CH3-CH2-COO- + CH3-COO- + (propionat) (acetat)

CO2 + H2O

37

Razgradnja laktata tijekom zrenja ementalera

- slaba aktivnost proteinaza - vea aktivnost peptidaza - vei udjel prolina - slatkasti okus sira ementaler

38

19

Stupanj tvorbe CO2 i oblikovanje sirnih rupica (ementalera):

Proizvodnja CO2 i difuzija CO2

(poinje s mlijeno-kiselim vrenjem)

Akumulacija CO2 u tijesto sira (propionsko-kiselo vrenje)

Prodiranje u sredite buduih sirnih rupica (propionsko-kiselo vrenje)

Zadravanje u sreditu oblikovanih rupica (nakon 10-30 dana zrenja)

Poveanje broja i veliine sirnih rupica (max. broj nakon 50 dana)

(propionsko-kiselo vrenje i dekarboksilacija aminokiselina/ CO2)

39

Na oblikovanje sirnih rupica utjeu: vrijeme, te intenzitet proizvodnje CO2 tekstura tijesta (koncentracija soli i kiseline, opt. pH=5-6) T zrionice (opt. 22-24 C; propionsko vrenje) pritisak CO2 i stupanj difuzije (unutar ili izvan sira)

ementaler - elastino tijesto - vee rupice,

ali manji broj

grojer ( T vrenja, krae zrenje, manji sir) - plastino tijesto (manje rupice/ vei broj)
40

20

ULOGA KULTURE BAKTERIJA

Brevibacterium linens
aerobna proteolitika bakterija odgovorna za intenzivnu proteolizu
na povrini polumekih sireva maa

(limburger, romadur, belpaeze, tilzit) optimalno raste pri 21-30 C (raste i pri 8 i 37 C) podnosi veu koncentraciju soli (neki sojevi i 15%) raste pri pH= 6,0- 9,0 / ne raste pri pH= 5,0 proizvode naran asti pigment (utjecajem svjetla) aktivne proteinaze, peptidaze i lipaze (aroma sira)

41

Mikrobioloki sastav maza sireva: glavni sadraj Brevibacterium linens mogu biti prisutni - kvasci i plijesni (Geotrichum candidum) - mikrokoki ili neke druge aerobne bakterije utjeu na karakteristinu aromu - ovisno o trajanju zrenja
(stupanj proteolize i lipolize)
limburger

- razgradnja aminokiselina
(tvorba amina, hlapljivih kiselina, NH3, CO2)

- tvorba metantiola od metionina (miris sumpora/inhibitor plijesni) utjeu na boju povrine sira i tijesta (neki sojevi brevibakterija)

42

21

ULOGA KULTURE

PLEMENITIH PLIJESNI
Kulture plijesni koriste se: najee u kombinaciji s mezofilnom kulturom BMK
- svi plemeniti sirevi (Lactococcus i Leuconostoc spp.)

ponekad i s termofilnom kulturom BMK

- gorgonzola (Lb. bulgaricus i Str. thermophilus) - kamamber/bri (Streptococcus thermophilus)

43

Kulture u proizvodnji plemenitih sireva:

VRSTE PLIJESNI

Rast (uinak)
plave, unutar sira
(proizvodnja tvari arome)

Penicillium roqueforti Penicillium camemberti (ili mutant P. caseicolum) Penicillium candidum Penicillium album Geotrichum candidum

bijele, na povrini sira (jaa proteoliza) bijelo-plave (tvari arome) bijele, na povrini kamambera (ubrzava zrenje- aroma)

44

22

Plijesni su aerobne optimalno rastu: uz povienu vlanost uz povienu kiselost (pH oko 4-5) pri T oko 20 C (dobro rastu i pri nioj T) dobro podnose oko 6-7% soli (NaCl)

Plijesni posjeduju: vrlo moan proteolitiki sustav (proteinaze i peptidaze) vrlo moan lipolitiki sustav (kisele i alkalne lipaze)

45

Proteoliza plemenitih sireva:

stupanj razgradnje proteina (ovisi o trajanju zrenja):

- max. 50% (uz plave plijesni) - max. 90% (uz bijele plijesni, osobito sira bri)

stupanj razgradnje AK (tijekom kasne faze zrenja):

- dekarboksilacija (amini) - deaminacija (NH3, karbonilni spojevi)

- desulfurizacija i demetilacija (H2S, metantiol i dr.) - transaminacija (druge aminokiseline)

Rezultat proteolitike aktivnosti: - porast pH sira (najvie od NH3) - omekavanje sira (pri pH=5,3 - 7,0)
laka probavljivost proteina (porast topljivih N-tvari) intenzivnija aroma sira (karbonilni, alkoholni i sumporni spojevi)
46

23

Lipoliza plemenitih sireva: stupanj razgradnje masti (ovisi o trajanju zrenja) - pad pH sira (slobodne masne kiseline)

-oksidacija masnih kiselina (zrak)

- nastaju tvari intenzivnog okusa i mirisa (metil ketoni)

Rezultat lipolitike aktivnosti (sekundarni procesi zrenja): laka probavljivost masti intenzivnija aroma sira
(aldehidi, ketoni, esteri)

puno jai okus i miris sireva od ovjeg i kozjeg mlijeka)

47

Utjecaj aktivnosti specifinih mikroorganizama

na tvorbu sastojaka arome tijekom zrenja sireva Sastojci arome
Aminokiseline Amini

Penicillium Kvasci B. linens BPK* camemberti roqueforti (korine bakt.)

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +

NH3
Sumporni spojevi Masne kis. (kratki lanci) Metilketoni Sekundarni alkoholi Esteri masnih kis.

+ +

BPK* (bakterije propionske kiseline)

+(znai da ti mo. tvore puno vie tvari od nekih drugih, ukljuujui i floru startera)
48

24