XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro
Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : HUỲNH PHƯỚC
Niên khóa : 2009 – 2013
Tháng 06/2013
i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
ThS. TÔN TRANG ÁNH HUỲNH PHƯỚC
KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM
Tháng 06/2013
ii

LỜI CÁM ƠN
Xin chân thành cám ơn

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công nghệ sinh học, thầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý
thầy cô truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học và làm đề tài.
Cô Tôn Trang Ánh và cô Tô Thị Nhã Trầm đã giúp đỡ cũng như đã chỉ dẫn em
trong khi thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Các bạn của lớp DH09SH, bạn Nguyễn Thị Nhật Lệ, Lê Thị Ngân Hà, Nguyễn
Hoàn Nguyên, cùng các bạn làm đề tài ở bộ môn đã giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn
tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Huỳnh Phước
iii

TÓM TẮT
Cây nắp ấm (Nepenthes mirabilis Druce) là một trong các loài cây ăn thịt phổ
biến ở Việt Nam. Cây có gân lá kéo dài thành tua cuốn, phần cuối tua hình thành ấm
nhiều màu sắc, có chức năng chính là bắt côn trùng. Cây có giá trị về kinh tế và y học.
Việc vi nhân giống cây nắp ấm nếu thành công sẽ mang lại lợi nhuận cao.
Nghiên cứu thực hiện dựa trên việc xác định môi trường phù hợp cho hạt nảy
mầm, nồng độ khoáng đa lượng của môi trường MS phù hợp với cây nắp ấm, ảnh
hưởng của BA và NAA đến sự tạo chồi ở cây, nồng độ than hoạt tính phù hợp cho
cây phát triển và ảnh hưởng của 2,4-D, BA lên sự tạo sẹo.
Kết quả cho thấy hạt nảy mầm thuận lợi trên môi trường 1/2MS bổ sung 60g
đường với tỉ lệ nảy mầm đạt 72,3 %. Môi trường 1/2MS là thích hợp nhất cho sự
phát triển của cây nắp ấm, chiều dài thân đạt 0,76 cm. Cụm chồi được phát sinh
trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,1 – 0,5 mg/l NAA sau 60 ngày nuôi cấy
với số chồi là 3,73 và 4. Than hoạt tính với nồng độ 1mg/l + 1/2MS cho ấm to, đẹp
với 4,3 ấm, trong khi đó môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA + 0,3 - 0,5 g/l than hoạt
tính thích hợp với sự phát sinh chồi đạt 4,3 – 3,5 chồi. Sẹo hình thành từ lá ở môi
trường 1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1,5 – 2,0 mg/l BA với tỉ lệ là 67% và 80%.
iv

SUMMARY
The thesis: In vitro mutiplication of Nepenthes mirabilis Druce

The Pitcher Plant (Nepenthes mirabilis) is the very popular carnivoruos plants
in Vietnam. The tip of tendril, which is created from its midribs, will develop into
many colourful pitcher. The primer aim of pitcher is catching insect. Picher plant has a
high economic value and be used for medication. If the micropropagation of
nepenthes is success, it will make a more benefit in economy.
The study is about selection of medium, that’s accord for seeds germination.
Influence of different strengths of MS to nepenthes’s generation, effect of NAA, BA
and 2,4-D in multiplication shoot and callus induction.
The in vitro seed germination show that a haft-stregth Murashige and Skoog
(1962) media formulation with high sucrose level enhanced seed germination
compared to other media (72.3 %). The 1/2MS medium dive the highest results for the
nepenthes’s development, which average height is 0.76 cm. Following 60 days of
culture, the 1/2MS medium supplemented with BA 1.5 mg/l + NAA 0.1 – 0.5 mg/l
give the highest multiple shoots (3.73; 4 shoot). The development of shoots from
nodes in medium 1/2MS + BA 1.5 mg/l + activated carbon 0.3 – 0.5 g/l is highest (4.3
– 3.5 shoot). The high average number of pitchter (4.3 pitcher) form the plant which
cultured in 1/2MS medium contained with activated carbon 1 g/l. Callus was
efficiently induced when leaf segments were cultured on 1/2MS medium
supplemented with 2.4-D 0.3 mg/l and BA1.5 – 2.0 mg/l after 2 months.
Key words: MS, nepenthes mirabilis, multiplication shoot, callus, pitcher plant.
v

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Tổng quan về loài nắp ấm ........................................................................................ 3
2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm ................................................................................. 3
2.1.2. Cấu tạo cây nắp ấm................................................................................................ 3
2.1.2.1 Thân cây nắp ấm .................................................................................................. 3
2.1.2.2 Lá cây nắp ấm ...................................................................................................... 3
2.1.2.3. Hoa cây nắp ấm .................................................................................................. 5
2.1.3 Phân loại cây nắp ấm .............................................................................................. 6
2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm ....................................................................... 6
2.1.5 Mô tả cây nắp ấm ................................................................................................... 8
2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm ............................................................................................ 8
2.1.7 Nhân giống truyền thống cây nắp ấm ..................................................................... 8
2.2. Nhân giống in vitro ................................................................................................. 10
2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro .............................................................................. 10
2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng ................................................... 10
2.3 Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm ............................................... 11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 13
3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................. 13
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 13
vi

3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 13
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng ............................................................. 13
3.3.2 Khảo sát môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ..................................... 15
3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS ................................. 16
3.3.4 Khảo sát sự phát sinh cụm chồi ............................................................................ 16
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường 1/2MS ........................................................ 17
3.3.6 Khảo sát sự tạo sẹo của lá nắp ấm ........................................................................ 18
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 19
4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1%............................................................................. 19
4.2 Môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng..................................... 23
4.3 Hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS................................................... 26
4.4Sự phát sinh chồi từ mẫu thân trên môi trường 1/2MS ............................................ 29
4.5 Ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính ................................ 31
4.6 Sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA ........ 36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 39
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 39
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 40
vii

DANH SÁCH CÁC CHữ VIếT TắT
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA 6-Benzyl-adenin
CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild
Fauna and Flora
GA3 Gibberellin
IAA Indole-3-acetic acid
IBA Indole-3-butiric acid
KC KnudsonC
1/2KC Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2
3/4KC Môi trường KC có thành phần khoáng đa lượng giảm 3/4
MS Murashige và Skoog, 1962
1/2MS Môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm 1/2
NAA α-Naphthalene acetic acid
WPM Wood Plant Medium
8

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm ................. 14
Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu thân nắp ấm ............. 14
Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá nắp ấm ...... 14
Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường và đường đến việc nảy mầm hạt .............................. 15
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng MS lên cây nắp ấm in vitro ... 16
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA đến sự sinh cụm chồi .......................................... 17
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BA và than đến phát triển của mẫu thân .............................. 17
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro ..... 18
Bảng 4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu lá nắp ấm ................. 19
Bảng 4.2 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu thân .......................... 21
Bảng 4.3 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu cuống lá ..................................... 22
Bảng 4.4 Môi trường và đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt ........................... 24
Bảng 4.5 Nồng độ khoáng đa lượng MS ảnh hưởng đến cây nắp ấm .......................... 27
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi ...................................... 29
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi ...................................... 29
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu nắp ấm................................ 31
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu khi bổ sung 1,5 mg/l BA.... 34
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 2,4–D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm ............... 36
Bảng4.11 Màu sắc và hình dạng mô sẹo....................................................................... 36
9

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997) ....................................................................... 4
Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007) ............................................. 7
Hình 2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986) .......................... 9
Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm ...................................................................... 13
Hình 3.2 Quả và hạt nắp ấm ......................................................................................... 15
Hình 4.1 Tình trạng mẫu lá sau khi khử trùng .............................................................. 20
Hình 4.2 Tình trạng mẫu thân sau khi khử trùng .......................................................... 21
Hình 4.3 Tình trạng mẫu cuống lá sau khi khử trùng ................................................... 22
Hình 4.4 Quá trình phát triển hạt nắp ấm trên môi trường nghiệm thức ...................... 24
Hình 4.5 Cây nắp ấm phát triển trên các môi trường nghiệm thức .............................. 27
Hình 4.6 Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi ở cây nắp ấm ........................... 33
Hình 4.7 Ảnh hưởng của than hoạt tính theo các nồng độ ........................................... 34
Hình 4.8 Sự ảnh hưởng của than hoạt tính kết hợp với BA.......................................... 37
Hình 4.9 Ảnh hưởng của BA, 2,4 – D đến sự phát sinh sẹo ở lá cây nắp ấm. ............. 38
10

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây nắp ấm (Nepenthes sp.) là một trong các loại cây ăn thịt được biết nhiều ở
Việt Nam. Nổi bật với gân lá kéo dài tạo thành cấu trúc dạng bình nhiều màu sắc, có
chức năng chính để bắt các loại sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Nắp ấm
có khoảng 90 tới 130 loài chính và các loài lai tự nhiên cũng như nhân tạo. Cây
thường yêu cầu độ ẩm cao, thích nghi với môi trường nghèo dinh dưỡng. Cây mọc
leo, cao1 – 2 m, thân rất dai, lá hình bầu dục, dài khoảng 10 cm, có cuống dài, ôm
vào thân, phía trên lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong, dài. Ở Việt Nam, cây
phân bố chủ yếu ở các vùng miền Trung và Nam bộ (Pietropaolo và ctv, 1986; Phạm
Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009; McPherson, 2009).
Cây nắp ấm có nhiều ứng dụng trong y học, kinh tế. Về phương diện làm thuốc,
nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát. Nắp ấm chữa vàng da do viêm gan, đau do loét dạ
dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà. Về mặt kinh tế, cây
nắp ấm với các dạng bình nhiều màu sắc đẹp rất được ưa chuộng để làm cảnh và tiểu
cảnh như hoa lan. Những năm gần đây, thị trường cây nắp ấm đã phát triển mạnh và đi
vào ổn định. Bên cạnh đó, giá thành của một cây nắp ấm lại cao so với các loại cây
kiểng khác và khả năng sống của cây tăng dần theo kinh nghiệm của người mua. Từ
đó, ta có thể thấy rằng đây một nhánh thị trường tiềm năng to lớn cần được khai thác,
nếu thành công sẽ đem lại lợi nhuận cao cho người trồng lẫn người kinh doanh.
Phương thức sinh sản hữu tính thông thường của cây nắp ấm gặp nhiều khó
khăn. Việc thụ phấn cần cả cây đực, cây cái và phải đảm bảo ra hoa cùng lúc. Một số
hạt giống có thể nảy mầm trong vòng vài ngày, trong khi những loại khác có thể phải
mất nhiều tháng có khi là vài năm. Khả năng nảy mầm bị mất hoặc hạn chế sau vài
tuần hoặc vài tháng lưu trữ phụ thuộc loài. Hạt giống nắp ấm khá nhỏ thường bị xâm
nhiễm bởi các bào tử nấm trong tự nhiên, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn.
Thực tế, người ta thường sử dụng phương pháp giâm cành để tạo cá thể mới.
Đây cũng là phương pháp sinh sản cơ bản của các loài nắp ấm trong tự nhiên để duy trì
số lượng. Tuy nhiên, phương pháp giâm cành lại cho ra số lượng cá thể con ít, tốn
11

nhiều công sức, diện tích, thời gian, phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi trường, và
quan trọng nhất là cần kinh nghiệm của cá nhân phải cao.Vì vậy khi đưa vào sản xuất
sẽ không đạt được hiệu quả. Trong những năm trở lại đây phương pháp nhân giống in
vitro được sử dụng rộng rãi do các ưu điểm như hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời
gian, diện tích, tạo được các cây con có chất lượng tốt. Một số loài nắp ấm đã được
nhân giống bằng phương pháp này và đạt được khá nhiều kết quả. Tuy nhiên, các công
trình nghiên cứu còn chưa được bao quát và tối ưu, hệ số nhân chồi còn thấp.
Với thực trạng trên, cây nắp ấm là một loài cây có giá trị kinh tế cao, có thể nói
là rất cao, mà các phương pháp truyền thống không phù hợp vào sản xuất và mang lại
lợi nhuận. Vì vậy đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống cây nắp ấm (Nepenthes
mirabilis Druce) in vitro” cần được thực hiện, để khảo sát môi trường thích hợp cho
việc nhân giống cây nắp ấm cho hệ số nhân giống cao nhất, phù hợp việc sản xuất nhất
mang lại hiệu quả kinh tế cao và đáp ứng kịp thời số lượng cây con giống.
1.2 Yêu cầu

Xác định được môi trường và nồng độ đường thích hợp cho sự nảy mầm của hạt
cây nắp ấm in vitro.
Xác định được hàm lượng khoáng đa lượng của MS, tỉ lệ than hoạt tính phù hợp
cho sự sinh trưởng của câynắp ấm in vitro.
Xác định được nồng độ thích hợp của các chất kích thích sinh trưởng trên môi
trường 1/2MS cho sự phát sinh cụm chồi, mô sẹo cây nắp ấm in vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện đầu tiên bằng việc xác định thời gian xử lý HgCl20,1% phù
hợp để khử trùng các loại mẫu loài cây nắp ấm(mẫu lá, cuống lá và đốt thân non). Bên cạnh
đó là khử trùng hạt cây nắp ấm và nuôi trên các môi trường khác nhau với các nồng độ
đường khác nhau để xác định môi trường phù hợp nhất cho sự nảy mầm. Sau khi nuôi
khoảng 2 tháng, mẫu lá, thân không có cảm ứng, lấy các mẫu cây sinh trưởng từ hạt cấy
chuyền sang môi trường MS có hàm lượng khoáng thay đổi để khảo sát hình thái sinh trưởng
của cây. Cây được 30 ngày, chuyển qua môi trường 1/2MS bổ sung nồng độ BA và NAA
thay đổi để khảo sát sự phát sinh cụm chồi. Do có sự tiết phenol từ mẫu, sau 2 tháng tiếp tục
cấy chuyền mẫu sang môi trường có nồng độ than hoạt tính thay đổi, để khảo sát sự tác động
12

của than lên cây cũng như ngăn chặn việc tiết phenol từ mẫu. Bên cạnh đó, cấy chuyền lá
của cây sang môi trường bổ sung 2,4-D và BA thay đổi để theo dõi sự hình thành sẹo.
13

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về loài nắp ấm
Nắp ấm(Nepenthes mirabilis) là loài cây ăn thịt được biết đến rất phổ biến.
Cũng như các loài cây ăn thịt khác, nắp ấm có chiếc bẫy để bắt côn trùng được gọi là
ấm (Temple, 1993). Hiện nay có khoảng 120 loài nắp ấm, phân bố chủ yếu ở miền
Nam Trung Quốc, Indonesia, Malaysia và Philippines,kéo dài về phía Tây tới
Madagascar và Seychelles, Ấn Độ và Sri Lanka về phía Nam tới Australia và New
Caledonia (McPherson, 2009). Nhiều loài nắp ấm được coi là loài bị đe dọa hay nguy
cấp và được liệt kê trong phụ lục 1 và 2 của CITES (1992).
2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm
Năm 1658, Etienne de Flacourt tại Madagascar đã công bố miêu tả một loài nắp
ấm trong công trình chuyên đề của ông Histoire de la Grande Isle de Madagascar. Cái
tên “Nepenthes” được sử dụng vào năm 1689 bởi J.P.Breney. Năm 1790, Joao de
Loureiro miêu tả cây nắp ấm ở Việt Nam. Vào năm 1874, J.D.Hooker đã công bố về
sự tiêu hoá của nắp ấm.
2.1.2. Cấu tạo cây nắp ấm

2.1.2.1 Thân cây nắp ấm
Nắp ấm là loại cây sống lâu năm với thân cây rất dai, có đường kính khoảng 5 cm
(Pietropaolo và ctv, 1986). Độ dày của thân rất khác biệt ở mỗi loài, từ vài mm ở loài
N.gracilis tới khoảng 3 cm ở loài N.bicalcarata. Thân cây có thể cao tới hơn 20 m,
nhưng thường thì cây trưởng thành cao từ 2 – 5 m (Clarke, 1997). Thân cây thường bám
vào các bụi cây, thân cây khác hoặc bò trên mặt đất (Pietropaolo và ctv, 1986).
2.1.2.2 Lá cây nắp ấm

Lá của nắp ấm rất đa dạng về hình dạng, màu sắc, kết cấu và kích cỡ. Kích
thước có thể từ 5 cm cho tới 1m (Clarke, 1997). Lá cây thường dài và dai, một số loài
lá có thể dài tới 6m. Các phiến lá thường có màu xanh đến màu vàng xanh với các gân
lá kéo dài ra khỏi giới hạn của lá trở thành các dây nho. Các dây nho này sẽ phát triển
trở thành ấm ở môi trường thích hợp (Pietropaolo và ctv, 1986). Ấm của cây được giữ
14

bởi cấu trúc dây nho cho tới phiến lá. Đó là chiếc bình tự nhiên được cây sử dụng để
bắt các loài sinh vật như côn trùng. Ví dụ như loài sinh vật chủ yếu hoặc được hiểu là
con mồi được tìm thấy trong ấm của loài N. gracilis là kiến (Beaver, 1979). Màu sắc
của ấm rất đa dạng từ xanh đến xanh đốm tím hoặc đốm đỏ (Pietropaolo và ctv, 1986).
Hình2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997).

Nắp ấm thường chia thành hai dạng ấm, tuy hình dạng của các loại ấm rất đa
dạng về loài, nhưng thường các ấm nằm gần mặt đất có hình trụ với hai cánh chạy
song song nhau từ đầu tới chân ấm (Pietropaolo và ctv, 1986). Thường các cây còn
nhỏ sản xuất ra loại ấm ngắn, mập lùn được gọi là ấm thấp và cánh hai bên được
cho là để dụ các loài côn trùng bò vào trong ấm. Khi thân cây leo cao, nó sản xuất
ra một loại ấm dài hơn và có hình trụ được gọi là ấm cao (Clarke, 1997). Các ấm ở
trên cao thường có dạng hình ống, nhỏ dần về phía tua cuốn. Thường các tua cuốn
này uốn cong lại trở thành một dạng cấu trúc nâng đỡ ấm, đưa ấm lên cao hơn. Các
tua cuốn ở ấm thấp thường không uốn cong (Pietropaolo và ctv, 1986). Mặc dù ấm
của các loài nắp ấm thường giống nhau về cấu trúc, nhưng chúng rất khác nhau về
kích cỡ, hình dạng, màu sắc. Chính sự khác nhau đó là nhân tố cơ bản để phân biệt
các loại nắp ấm khác nhau (Clarke, 1997). Không phải toàn bộ các loại ấm đều
dùng để bắt côn trùng (Joel, 1988). Gần đây đã phát hiện ra rằng một số loài
Nepenthes với các loại ấm đặc biệt lớn bắt được chuột chù Tupaia montana (Chin
và ctv, 2010), phân giải thành các chất dinh dưỡng dùng để cung cấp cho
15

cây(Adlassnig và ctv, 2011). Loài N.meririlliana ở Philippines sản xuất ra loại ấm
lớn nhất cao tới 50 cm và có đường kính 25 cm. Chim nhỏ, chuột và một số loài thú
nhỏ cũng bị bắt vào ấm (Pietropaolo và ctv, 1986).
Ấm thường được chia làm bốn phần chính: nắp, môi, phần trên ấm, phần dưới
ấm. Trên cùng của ấm là nắp, nắp rất đa dạng từ hình dáng đến màu sắc, phụ thuộc vào
loài (Clarke, 1997). Nắp gắn với ấm vào phía sau lưng của ấm, nó gắn vào phía trên
của ấm, được coi như nón của ấm có tác dụng để hạn chế lượng nước mưa rơi vào
ấm,phần nối giữa ấm và nắp gọi móc.Phần miệng của ấm được bao phủ bởi một cấu
trúc dày được gọi là môi (Pietropaolo và ctv, 1986). Chức năng chính của môi là ngăn
cản con mồi thoát khỏi ấm. Ngoài ra, nó còn có công dụng là tác nhân thu hút con mồi
vào ấm do có màu sắc sặc sỡ (Clarke, 1997). Thân ấm thường được chia làm hai phần:
vùng sáp và vùng tiêu hoá. Vùng sáp hay còn gọi là vùng trên được phủ một lớp sáp
mỏng trên bề mặt, hạn chế sự trốn thoát của côn trùng, tăng khả năng côn trùng rớt
xuống dịch phía dưới. Phần tiêu hoá ở phía dưới được bao phủ gồm các tuyến tiết ra
các loại acid và enzyme để phân huỷ con mồi. Mẫu của enzyme gồm ribonuclease,
lipase, esterase, acid phosphatase và protease (Slack, 1979). Pavlovic và ctv (2007) đã
công bố về sinh lý của phiến lá và ấm. Chất lỏng trong ấm thường có tính acid và có
chứa các enzyme thực vật (Peroutka và ctv, 2008; Adlassnig và ctv, 2011). Mật là sản
phẩm phụ của ấmđể thu hút côn trùng,nó được sản xuất từ các tuyến trên môi và nắp.
Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng môi của bình rất ướt và côn trùng có thể trượt khi
đậu trên nó để ăn mật, rơi vào các bình bên dưới, nơi chúng chết và được tiêu hóa, chỉ
khi môi bị khô là côn trùng có thể đi trên đó dễ dàng, nhưng họ vẫn có thể bị mắc kẹt
khi chúng bò trên mặt trong của ấm được phủ sáp (Bohn và Federle, 2004). Điều thú vị
là kiến Camponotus schmitzi sống cộng sinh với Nepenthes bicalcarata, và có thể bò
trên cả môi ướt (Kitching, 2000).
2.1.2.3 Hoa cây nắp ấm
Nắp ấm gồm có cây đực và cái, để tạo hạt cần có hoa đực và hoa cái cùng lúc.
Cả hoa đực và hoa cái đều rất sặc sỡ. Chúng khá nhỏ, không có cành hoa, có bốn đài
hoa, nhị và nhuỵ nằm ngay giữa và nhìn rất giống nhau. Có thể phân biệt hoa cái
16

bằng cách xem xét noãn phồng to lên ngay trên các lá đài. Hoa được sinh ra theo
chùm hoặc bụi (Pietropaolo và ctv, 1986).
2.1.3 Phân loại cây nắp ấm
Trong khi đa số cái loài nắp ấm mọc ở vùng nhiệt đới, một số loài khác thì phát
triển ở vùng đất cao hơn, nơi mà nhiệt độ thấp hơn. Dựa vào mục đích phát triển, nắp
ấm được chia làm hai loại: loài mọc ở vùng cao, mọc ở vùng đất cao hơn 1000 m, nơi
nhiệt độ trung bình từ 10 - 21 oC; loài mọc ở vùng thấp, dưới 1000m, nhiệt độ trung
bình khoảng từ 21 - 35 oC (Temple, 1993).
Loài ấm vùng thấp: N. ampullaria, N. gracilis, N. mirabilis…
Loài ấm vùng cao: N. alta, N.lamii, N.maxima…
2.1.4Đặc điểm phân loại học cây nắp ấm(Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce)
Tên gọi: Trư lủng thảo, trư tử lung (Trung Quốc), nắp ấm (miền Trung và Nam
Việt Nam), cây bắt ruồi (Đỗ Tất Lợi, 2003).
Phân loại thực vật học (Hoàng Thị Sản, 2006)
Giới Plantae Thực vật
Ngành Angiospermae Hạt kín
Lớp Eudicotyledoneae Hai lá mầm
Bộ Caryophyllales Cẩm chướng
Họ Nepenthaceae Nắp ấm
Chi Nepenthes Nắp ấm
Loài Nepenthes mirabilis
Các loài phụ:
Nepenthes mirabilis var. anamensis (Weiner, 1985)
Nepenthes mirabilis var. biflora (J.H.Adam và Wilcock, 1992)
Nepenthes mirabilis var. echinostoma(Burbidge, 1988)
Nepenthes mirabilis var. globosa (Catal, 2010)
Nepenthes mirabilis var. simensis (Westphal, 1991)
Nepenthes mirabilis var. smilesii(Weiner, 1985)
17

Hình 2.2 Tiêu bản loài N.mirabilis (François Mey, 2007).
18

2.1.5 Mô tả cây nắp ấm
Nắp ấm là một cây chủ yếu mọc hoang dại ở các tỉnh miền Trung và Nam Bộ,
còn thấy ở chân núi đá vôi các tỉnh nói trên. Tại miền Bắc chỉ mới gặp ở Vĩnh Linh,
cây mọc leo, cao 1 – 2 m, thân rất dai, lá có cuống dài, một nửa ôm vào thân, phần lá
hình bầu dục, dài khoảng 10 cm; phía đầu lá tạo thành một cuống hình dây, uốn cong,
dài chừng 15 cm, với đầu biến thành cái bình, trông như cái hoa nhưng không phải hoa
nên có tên bình nước. Bình hình trụ, hơi phồng ở gốc, mặt bình có nắp đậy, mặt trên
nắp trơn, mặt dưới có nhiều phiến phân phối đều, trong bình tiết ra một chất nhầy, khi
nào có côn trùng vào trong bình, thì lập tức nắp đậy chặt lại, chất nhầy trong bình tiêu
huỷ sâu bọ. Cụm hoa là một chùm thưa gồm hoa đực hoặc hoa cái. Lá dài hình bầu
dục, mặt trong có nhiều phiến nhỏ, cột nhị dài bằng các lá đài, 16 – 20 bao phấn cong,
xếp thành hai dãy. Bầu hình trứng, phủ lông trắng, vòi ngắn, đầu nhị chia làm 4 thuỳ,
quả nặng, hạt mảnh và dài. Mùa hoa thường gặp vào tháng giêng. Người ta thu hái
toàn cây, quanh năm, rửa sạch, chặt thành từng đoạn 2 – 3 cm, phơi nắng cho khô
dùng dần (Phạm Hoàng Hộ, 1999; Đỗ Tất Lợi, 2003; Huỳnh Ngọc Tựng, 2009).
Loại cây này có rễ dạng chùm và mỏng. Lá mỏng có lông, phiến lá thuôn dài
hình ngọn giáo. Ấm thấp phình to ở phần thân, nhất là ở phần hông của ấm, nắp có
hình tròn hoặc ovan. Ấm cao hình trụ, có một số nơi bị phình lên. Hoa đực và hoa cái
sinh sản đơn độc trên các cành mỏng. Các phần non thì thường có lông nhỏ bao phủ,
cây trưởng thành thì nhẵn với mép lá có rìa lông bao quanh (Mey, 2010).
2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm
Trồng làm cảnh:Ở nước ta thị hiếu về hoa cảnh của các loài cây bắt mồi nói
chung và nắp ấm nói riêng còn rất mới mẽ, tiềm năng rất lớn nhưng chưa được khai
thác đúng mức, nhất là các loài có sẵn trong nước (Nguyễn Thị Thư, 2005). Thị
trường nấp ấm hiện nay đã khá ổn định, với số lượng người sưu tầm cây tăng mạnh
trong những năm gần đây. Giá thành của cây cũng khá cao do việc chăm sóc khó
khăn đồng thời do số lượng người bán khá ít.
Sử dụng làm dược liệu: Nắp ấm có vị ngọt, nhạt, tính mát, có tác dụng thanh
nhiệt, lợi thấp, hoá đờm, giảm đau. Nắp ấm còn có tác dụng trị vàng da do viêm gan,
đau do loét dạ dày, tá tràng, sỏi niệu quản, huyết áp cao, ho do cảm mạo, ho gà, còn
19

dùng trong điều trị các chứng phù thủng toàn thân (Lê Quí Ngưu và Trần Thị Như
Đức,1993). Rễ của cây nắp ấm trị huyết áp, trị bệnh vàng da (Phạm Hoàng Hộ,
1999). Dịch của ấm chưa mở được sử dụng như thuốc nhuận trường, viêm họng, trị
bỏng, viêm mắt và các bệnh về da (Pietropaolo và ctv, 1986).
2.1.7Nhân giống truyền thống cây nắp ấm
Gồm có nhân giống hữu tính (gieo hạt) và nhân giống vô tính (giâm cành).
Sau khi thụ phấn, hạt phát triển thành dạng dài và mảnh. Hạt được gieo bằng
cách rải trên mặt đất, phải bảo đảm độ ẩm và nhiệt độ phù hợp (Pietropaolo và ctv,
1986). Hạt có thể được gieo trên xơ dừa và đá nhỏ sạch giữ ở 26oC. Tưới phun sương
và không được để môi trường khô, sự nảy mầm diễn ra từ hai đến sáu tuần. Hạt dễ bị
hư và cần phải bảo vệ tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp (Temple, 1993). Tuy nhiên
phương pháp nhân giống bằng hạt gặp nhiều khó khăn do đòi hỏi cây đực và cây cái
phải ra hoa cùng lúc, hạt khá nhỏ, sinh trưởng chậm, dễ bị côn trùng lấy làm thức ăn
(Lavarack, 1981; Lee, 2008).
Hình2.3 Các bước giâm cành cây nắp ấm (Pietropaolo và ctv, 1986).
Phương pháp thông dụng nhất để nhân giống nắp ấm là giâm cành. Phương
pháp này không những tạo ra nhiều cây con mà còn giải quyết vấn đề về cây có
thân quá già và leo quá cao trên giàn, lúc này cây cho ít bình và nhỏ dần (Nguyễn
20

Thị Thư, 2005). Yêu cầu cành giâm là cây nắp ấm đang khỏe mạnh, thân phải chắc.
Điều kiện môi trường là nhiệt độ không quá 34oC, độ ẩm càng cao càng tốt trên
90%, ánh sáng 2500 – 3000 lux. Chọn cành giâm khỏe mạnh, cắt bớt 1/2 tất cả các
lá, cắt từng đoạn từ 3 - 5 lá, sau đó giâm xuống giá thể, cắt các đốt nghiêng 45 độ,
sau đó trùm bọc nilon trong suốt để cây ở môi trường thích hợp, sau 1,5 - 2 tháng
cây ra rễ tốt, 4 - 6 tháng cây to khỏe mới, tỉ lệ thành công phụ thuộc rất nhiều vào
môi trường (Châu Kiến Đạt, 2010).
Tuy nhiên phương pháp này còn có nhiều hạn chế: không ổn định về mặt duy
truyền, hệ số nhân giống thấp, tốn nhiều thơi gian và công sức, chiếm diện tích, khả
năng sống sót kém do phụ thuộc vào môi trường. Vì thế phương pháp vi nhân giống
có lẽ là một lựa chọn lý tưởng nhằm giải quyết các vấn đề khó khăn liên quan đến
nhân giống truyền thống.
2.2. Nhân giống in vitro

2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công kiên, 2002).
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá,
thân, hoa hoặc rễ. Phương pháp này có nhiều ưu điểm. Nhân giống in vitro tiết kiệm
thời gian, nhân giống các loài mà phương pháp nhân giống tự nhiên không cho phép
hay không thuận lợi. Sự tăng trưởng của cây in vitro thường mạnh hơn cây bình
thường, tạo được cây sạch bệnh, dễ dàng chọn lọc cá thể, giảm chi phí và diện tích, sản
xuất quanh năm, tạo ra các dòng đột biến, tạo ngân hàng gene (Pierik, 1975;
Anonymous, 1980; Assche, 1983; Gebhard và ctv, 1983; Kunneman, 1984).
2.2.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần
dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền
21

phù tế bào và điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp
với các cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Cytokinin là một trong nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật. Cytokinin ít
có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích sự
sinh tổng hợp protein. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân
chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Khi được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn và
kích thích sự hoạt động của các chồi bên. Về phương diện này thì cytokinin có tác
động ngược lại với auxin nội sinh (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.3Tình hình nghiên cứu về vi nhân giống cây nắp ấm trong và ngoài nước
Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước về việc ứng dụng kĩ thuật
nuôi cấy tế bào thực vật trong việc nhân giống cây nắp ấm và đạt được một số
thành công nhất định.
Vào năm 2005, Nguyễn Thị Thư đã thực việc nuôi cấy trên đối tượng là
đốt thân loàiN.mirabilis. Kết quả đạt được là tìm ra môi trường phù hợp để tăng
trưởng chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 3 mg/l + NAA 2mg/l và môi trường tối
ưu cho việc phát sinh cụm chồi từ đốt thân là 1/2MS + BA 5mg/l.
Ngoài ra, theo Nguyễn Bảo Toàn và Lê Hồng Giang (2011) thực hiện trên
đối tượng là đốt thân loài N.mirabilis. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi
trường WPM phù hợp hơn môi trường MS trong sự cảm ứng mầm bên phát triển
và môi trường WPM bổ sung 0,05 mg/l NAA + 8 mg/l BA cho tỷ lệ tạo cụm chồi
cao nhất 81,3%.
Năm 2000, Sani và ctv đã thực hiện nghiên cứu trên hạt của loài
N.ampullaria. Từ đó đã chỉ ra rằng môi trường thích hợp nhất cho hạt nảy mầm là
1/2MS với nồng độ đường lên tới 60%, môi trường 1/2MS + 1 mg/l IBA phù hợp
nhất cho việc phát triển của thân rễ, bên đó môi trường 1/2MS + 2 mg/l 2, 4 – D
thích hợp cho sự phát sinh sẹo từ thân, và cuối cùng môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l
BAP cho tỉ lệ phát sinh cụm chồi cao.
Năm 2005, Rasco Jr và Maquilan đã thực hiện nghiên cứu trong việc cảm
ứng hạt loài N.truncata nảy mầm. Một số kết luận được rút ra, môi trường
22

1/4KC và 3/4KC phù hợp nhất cho việc nảy mầm và phát triển của cây, tỉ lệ
sống và nảy mầm của hạt tỉ lệ nghịch với nồng độ khoáng đa lượng của môi
trường MS.
Vào năm 2007, Khompat và ctv đã công bố nghiên cứu trên loài
N.mirabilis. Môi trường rắn MS + 3 mg/l BA cho tỉ lệ nảy mầm tốt, môi trường
lỏng cho tỉ lệ nảy mầm nhanh hơn môi trường rắn chỉ sau 6 tuần nuôi cấy. Môi
trường MS bổ sung 5 mg/l BA thích hợp cho sự phát sinh cụm chồi. Môi trường
1/2MS phù hợp cho sự phát triển của cây.
Theo Fong (2008), môi trường WPM + 0,5 mg/l IBA phù hợp nhất cho sự
phát sinh rễ ở loài N.gracilis.
Năm 2009, Kumaria và Tandon đã thực hiện nghiên cứu và thấy rằng môi
trường 1/2MS là phù hợp nhất cho sự nảy mầm và môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l
NAA là phù hợp nhất cho sự phát sinh ấm ở loài N.khasiana tại Ấn độ.
Dinarti và ctv (2010) đã tiếp tục thực hiện việc nghiên cứu sự nảy mầm
của loài N.mirabilis. Và đạt được các kết quảmôi trường 1/4KC và 1/2MS có bổ
sung TDZ, IAA, GA3 phù hợp cho sự nảy mầm của hạt, giúp tăng phần trăm số
hạt nảy mầm cũng như giảm số ngày nảy mầm. Môi trường 1/2MS và 1/4 KC
chứa 0 – 1 mg/l BAP phù hợp cho sự phát triển của chồi và lá.
Đến năm 2011, Sukamto và ctv thực hiện các nghiên cứu trên loài
N.albomarginata đã kết luận rằng, môi trường 1/2MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l
NAA là phù hợp nhất cho sự phát triển của cây, 1/2MS + 1,5 mg/l NAA thích
hợp cho việc phát sinh chồi nách, và cuối cùng 1/2MS + 1 mg/l BA + 2mg/l
NAA cho sự cảm ứng sẹo tốt.
Trong cùng năm 2011-2012, Jala đã kết luận nuôi cấy loài N.mirabilis
dưới ánh sáng đỏ phù hợp với việc thúc đẩy sự nảy mầm của hạt, trong khi ánh
sáng vàng tốt nhất cho sự tăng trưởng của cây. Môi trường 1/2MS + 2 mg/l BA
phù hợp cho sự phát triển của cây và có sự hình thành cấu trúc sẹo sau 20 tuần
nuôi cấy.
23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm

Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 06/2013 tại phòng
nuôi cấy mô, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu
Vật liệu thí nghiệm là cành cắt cây nắp ấm dài 30 – 50 cm, hạt từ 2 đến 3 tuần
tuổi mua ở vườn ươm, mẫu cấy ban đầu gồm lá, đoạn thân, hạt.
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS, WPM, KC.
Điều kiện nuôi cấy là thời gian chiếu sáng: 16 h/ngày; nhiệt độ: 25 ± 20C; độ
ẩm: 50 - 60%; cường độ chiếu sáng: 2000 - 3000 lux.
3.3.Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả năng sống
của mẫu cây nắp ấm
Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm

Các bước tiến hành: Lá cây cắt thành nhiều mảnh nhỏ dài 6 cm, cuống lá từng
đoạn dài 6 cm, thân cây cắt từng đoạn ngay chồi ngủ khoảng 5cm, sau đó dùng cồn 700
rửa sạch theo 1 chiều từ trên xuống để tránh tổn thương mẫu. Chuyển mẫu sang bình
tam giác vô trùng và đưa vào tủ cấy. Thực hiện thao tác khử trùng mẫu cấy trong điều
24

kiện vô trùng. Mẫu cấy được lắc qua cồn 700 trong 30 giây - 1 phút, sau đó được khử
trùng với vitamin C trong 15 phút; kháng sinh (nồng độ 1 g/l) trong 30 phút;
HgCl20,1% bổ sung vào 3 giọt Tween 20 lắc trong các khoảng thời gian khác nhau và
được bố trí trên từng nghiệm thức. Sau khi khử trùng xong loại bỏ những phần hư hại,
mẫu được cắt thành từng đoạn dài từ 1 - 1,5 cm đối với mẫu thân chồi, đối với mẫu lá
cắt mẫu thành từng mảnh 1x1 cm, cuống lá cắt từng lát mỏng dày 0,5 – 1 cm sau đó
được cấy vào môi trường MS.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với mẫu lá, thân, cuống lá cây
nắp ấm.Mẫu lá, cuống lá được đặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, thân cây
cấy trên môi trường MS. Gồm có 4 nghiệm thức, mẫu lá mỗi nghiệm thức 5 chai, mẫu
thân mỗi nghiệm thức 4 chai, mẫu cuống lá mỗi nghiệm thức 4 chai, thực hiện lặp lại 3
lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.
Bảng 3.1Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến mẫu lá nắp ấm
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng (phút) Mẫu/chai Tổng mẫu
A1 MS 2 5 75
A2 MS 3 5 75
A3 MS 4 5 75
A4 MS 5 5 75
Bảng 3.2Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu thân
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng(phút) Mẫu/chai Tổng mẫu
B1 MS 4 1 12
B2 MS 5 1 12
B3 MS 6 1 12
B4 MS 7 1 12
Bảng 3.3Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến của mẫu cuống lá
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng(phút) Mẫu/chai Tổng mẫu
C1 MS 2 5 60
C2 MS 3 5 60
C3 MS 4 5 60
C4 MS 5 5 60
25

Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống và sạch nấm khuẩn/tổng số mẫu thí
nghiệm) x 100.
Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch nấm khuẩn/tổng số mẫu thí nghiệm) x 100.
3.3.2 Khảo sát môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng đến sự
nảy mầm của hạt nắp ấm
Hình 3.2 Quả và hạt nắp ấm

Cách tiến hành: Hạt nắp ấm được rửa dưới vòi nước chảy, tiếp theo rửa sạch
mẫu với xà phòng loãng. Chuyển mẫu sang bình nước cất vô trùng và đưa vào tủ
cấy.Mẫu cấy được lắc qua cồn 70o trong 30 giây. Tiếp theo, lắc mẫu với hỗn hợp javel
và nước có tỉ lệ 1:3, rửa lại với nước cất vô trùng. Đặt mẫu hạt lên trên bề mặt môi
trường theo như nghiệm thức, theo dõi trong 30 ngày nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu
nhiên, gồm 8 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai,
lặp lại 3 lần.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường và đường đến sự nảy mầm hạt cây nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường Nồng độ đường (g/l) Mẫu/chai Tổng mẫu
D1 (ĐC) MS 30 30 450
D2 MS 60 30 450
D3 1/2MS 30 30 450
D4 1/2MS 60 30 450
D5 KC 30 30 450
D6 KC 60 30 450
D7 WPM 30 30 450
26

D8 WPM 60 30 450

Thời gian nảy mầm của hạt (ngày) = ngày hạt đầu tiên nảy mầm ở nghiệm
thức – ngày cấy mẫu
Tỉ lệ hạt nảy mầm (%) = (tổng số hạt nảy mầm/tổng số hạt đã cấy) x 100
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS đến
sự phát triển của cây nắp ấm in vitro
Cách tiến hành: chọn chồi có chiều cao 0,5 cm và 2 – 3 lá, cấy chuyền các cây
con khoẻ mạnh lên các môi trường MS với nồng độ khoáng đa lượng khác nhau, các
môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Quan sát hình thái cây
trong 30 ngày nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu
nhiên, gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 chai, mỗi chai 1 mẫu, lặp lại 3 lần.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng MS lên cây nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường Mẫu/chai Tổng mẫu
E1 MS 1 15
E2 1/2MS 1 15
E3 1/4MS 1 15
E4 1/8MS 1 15
Kích thước của cây (cm)
Số ấm, chiều dài lá (cm), số lá trên một cây (lá)
3.3.4 Khảo sát sự phát sinh cụm chồi cây nắp ấm trên môi trường 1/2MS có bổ sung
BA và NAA
Các bước tiến hành: Mẫu được cấy chuyền trên môi trường nuôi cấy 1/2MS có
bổ sung chất kích thích sinh trưởng thực vật với các nồng độ khác nhau BA (1,5; 1,0;
0,5 mg/l) và NAA (0,1; 0,5 mg/l). Sự hình thành và phát triển cụm chồi được theo dõi
sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm
7 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần.
27

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA đến sự sinh cụm chồi của mẫu nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường NAA BA Mẫu/ chai Tổng mẫu

F1 (ĐC) 1/2MS 0 0 1 15
F2 1/2MS 0,1 0,5 1 15
F3 1/2MS 0,1 1,0 1 15
F4 1/2MS 0,1 1,5 1 15
F5 1/2MS 0,5 0,5 1 15
F6 1/2MS 0,5 1,0 1 15
F7 1/2MS 0,5 1,5 1 15

Kích thước của mẫu (cm)
Số lá (lá)trên một mẫu
Số chồi hình mới hình thành trên bề mặt môi trường ở mỗi nghiệm thức (chồi)
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính và
chất kích thích sinh trưởng BA đến sự phát triển của cây nắp ấm
Các bước tiến hành: Mẫu chồi được cắt với kích thước 0,5 cm, 2 - 3 lá, được
cấy chuyền trên môi trường nuôi cấy 1/2MS có bổ sung than hoạt tính với các nồng độ
khác nhau (0; 0,3; 0,5; 0,7; 1 g/l) và BA (0; 1,5 mg/l). Sự phát triển và tạo thành cụm
chồi được theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm
10 nghiệm thức có một nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần.
Bảng 3.7Ảnh hưởng của BA và than đến phát triển của mẫu thân nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường BA(mg/l) Than hoạt tính Mẫu/chai Tổng mẫu
(g/l)
G1 (ĐC) 1/2MS 0 0 1 15
G2 1/2MS 0 0,3 1 15
G3 1/2MS 0 0,5 1 15
G4 1/2MS 0 0,7 1 15
G5 1/2MS 0 1,0 1 15
G6 1/2MS 1,5 0 1 15
G7 1/2MS 1,5 0,3 1 15
28

G8 1/2MS 1,5 0,5 1 15
G9 1/2MS 1,5 0,7 1 15
G10 1/2MS 1,5 1,0 1 15
Kích thước của mẫu
Số lá (lá), chiều dài lá (cm) trên một mẫu
Số chồi (chồi), chiều cao chồi (cm) hình thành trên một mẫu
Số ấm (ấm), chiều dài ấm (cm) trên một mẫu
3.3.6 Khảo sát sự tạo sẹo của lá nắp ấm trên môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA
Các bước tiến hành: Cắt mẫu lá 1 - 3 cm. Mẫu được đặt trên môi trường
nuôi cấy 1/2MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thực vật 2,4-D (0,3 mg/l)
và BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l). Sự nuôi
cấy mô sẹo được thực hiện trong điều kiện tối hoàn toàn trong 2 tuần sau cấy.
Tiếp đó chuyển những mẫu mô sẹo này sang điều kiện ánh sáng nhẹ để kích thích
mẫu tạo thêm diệp lục tố. Mẫu theo dõi liên tục sau 2 tháng nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,
gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 chai, lặp lại 3 lần.
Bảng 3.8Ảnh hưởng của 2,4D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường 2,4-D(mg/l) BA (mg/l) Mẫu/chai Tổng mẫu

H1 1/2MS 0,3 0 3 45
H2 1/2MS 0,3 0,5 3 45
H3 1/2MS 0,3 1,0 3 45
H4 1/2MS 0,3 1,5 3 45
H5 1/2MS 0,3 2,0 3 45
H6 1/2MS 0,3 2,5 3 45
H7 1/2MS 0,3 3,0 3 45
Chỉ tiêu theo dõi

Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%) = (số mẫu có tạo sẹo/tổng số mẫu cấy) x 100%
Màu sắc, đặc điểm, trọng lượng mô sẹo (g), thời gian cảm ứng sẹo (ngày).
Tỉ lệ khối lượng sẹo (%) = (khối lượng tươi/khối lượng khô) x 100%
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
29

Số liệu thu thập được sẽ được xử lý trên máy tính bằng phần mềm xử lý thống kê
MSTATC. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh sự
khác biệt giữa các nghiệm thức (bằng phương pháp LSD).
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu cây nắp ấm
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô, giai đoạn ban đầu nhằm tạo nguồn mẫu in vitro
là giai đoạn mang tính quyết định và tỉ lệ thành công thấp. Đặc biệt là mẫu nắp ấm do
có tiết phenol và sống trong môi trường có độ ẩm cao, thường mọc sát đất, mẫu lá có
lông nhỏ bao phủ làm tăng khả năng nhiễm nấm, khuẩn.
Mẫu trước khi khử trùng được rửa thật sạch, khử trùng bằng dung dịch khử
trùng mạnh là HgCl2 0,1%. Kết quả xử lý mẫu sau 2 tuần được ghi nhận như sau:
Bảng 4.1 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu lá nắp ấm
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng Tỉ lệ sống Tỉ lệ mẫu sạch
(phút) (%) (%)
A1 MS 2 83,7a 61,3a
A2 MS 3 77,3a 78,7a
A3 MS 4 53,0ab 81,3a
A4 MS 5 38,7b 86,7a
CV (%) 37,58 26,95
Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê
(P<0,05).
Đối với mẫu lá nắp ấm, thời gian khử trùng ở nghiệm thức A2 (2 phút) là
tốt nhất, với tỉ lệ mẫu sống đạt 77,3%, tỉ lệ mẫu sạch đạt 78,7%. Thời gian khử
trùng càng tăng thì tỉ lệ mẫu lá sạch càng cao, do HgCl2 là một chất khử trùng
mạnh. Tuy nhiên, tỉ lệ sạch của mẫu lá giữa các nghiệm thức không có sự sai biệt
về mặt thống kê. Tỉ lệ sạch của mẫu lá đạt trên 50% ở tất cả các nghiệm thức.
Ngược lại, thời gian khử trùng càng cao thì tỉ lệ mẫu lá sống càng thấp.
Mẫu hoá nâu được ghi nhận do sự ngộ độc thuỷ ngân sau 2 tuần nuôi cấy. Nếu
mẫu nuôi cấy chuyển màu nâu và trắng, chứng tỏ mẫu nuôi cấy đã khử trùng
quá giới hạn cho phép. Cần giảm thời gian khử trùng hoặc giảm nồng độ chất
khử trùng (Trần Văn Minh, 1997). Tỉ lệ sống của mẫu lá không có sự sai biệt
30

về mặt thống kê giữa các nghiệm thức nhưng độ biến thiên của tỉ lệ mẫu lá
sống giữa các nghiệm thức lại cao. Điều đó cho thấy, mẫu lá nắp ấm nhạy cảm
đối với chất khử trùng HgCl 2 .
Từ tỉ lệ sạch và sống của mẫu lá, nhận thấy nghiệm thức có tỉ lệ mẫu sống
càng cao thì tỉ lệ mẫu sạch càng thấp và ngược lại. Vậy thời gian ở nghiệm thức
A2 (2 phút) là phù hợp nhất để khử trùng mẫu lá nắp ấm. Không chọn nghiệm
thức A1 do tỉ lệ mẫu lá sạch thấp nhất (61,7%) dù tỉ lệ mẫu sống là cao nhất
(83,7%). Nghiệm thức A3 và A4 cũng không thích hợp do tỉ lệ mẫu sạch cao
(81,3%; 86,7%) nhưng tỉ lệ mẫu sống lại thấp hơn (53%; 38,7%). Việc giảm nồng
độ HgCl2 có thể tăng tỉ lệ mẫu lá sống và sạch cao hơn.
a
b
c
31 lá sau khi khử trùng.

Hình 4.1 Tình trạng mẫu

(a) Mẫu lá sống và sạch, (b) Mẫu lá hoá nâu, (c) Mẫu lá
nhiễm nấm.
Bảng 4.2 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng của mẫu thân nắp ấm
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử Tỉ lệ mẫu sống Tỉ lệ mẫu sạch
trùng (phút) (%) (%)
B1 MS 4 83,3a 41,7b
B2 MS 5 80,7a 83,3a
B3 MS 6 72,3a 75ab
B4 MS 7 50,0a 83,3a
CV (%) 30,57 34,23
(P<0,05).
32

a
b c
Hình 4.2 Tình trạng mẫu thân sau khi khử trùng.
(a) Mẫu thân sống và sạch, (b) Mẫu thân hoá nâu, (c) Mẫu thân bị nhiễm.
Thời gian khử trùng 5 phút là phù hợp nhất cho việc khử trùng mẫu thân. Vì
thời gian khử trùng ở nghiệm thức B2 (5 phút) cho tỉ lệ mẫu thân sống cao (80,7%) và
tỉ lệ mẫu thân sạch cao (83,3%). Tỉ lệ mẫu thân sống của các nghiệm thức tỉ lệ nghịch
với thời gian khử trùng do HgCl2 là chất khử trùng mạnh. Tỉ lệ mẫu thân sống cao hơn
50% và độ biến thiên của các nghiệm thức thấp. Từ đó, nhậnthấy mẫu thân nắp ấm
thích hợp cho việc khử trùng bằng HgCl2, do mẫu thân dai và chắc. Theo Nguyễn Thị
Thư (2005), khữ trùng mẫu thân với dung dịch NaClO 7,5% cho tỉ lệ sống và sạch chỉ
đạt 27,74% và 28,4%, tương ứng với thời gian khử trùng là 20 và 30 phút. Không có
sự sai biệt giữa các nghiệm thức về mặt thống kê ở tỉ lệ mẫu sống. Nhưng nếu xét về
độ lớn thì ở các nghiệm thức B1 (4 phút), B2 (5phút), B3 (6 phút) có tỉ lệ mẫu sống
33

cao, lần lượt là 83,3%; 80,7%; 72,3%, nghiệm thức B4 thì có tỉ lệ mẫu thân sống thấp
hơn (50%). Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu sạch ở mỗi nghiệm thức cũng không có sự sai biệt
về mặt thống kê. Nghiệm thức B1 có tỉ lệ mẫu thân sạch thấp nhất (41,7%), trong khi ở
nghiệm thức B2 (83,3%), B3 (75%) và B4 (83,3%) cao hơn. Qua đó nhận thấy thời
gian 5 phút phù hợp nhất cho việc khử trùng mẫu thândo có tỉ lệ mẫu sạch cao và tỉ lệ
mẫu sống cao nhất.
Bảng 4.3 Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến mẫu cuống lá nắp ấm
Nghiệm thức Môi trường Thời gian khử trùng Tỉ lệ mẫu sống Tỉ lệ mẫu sạch
(phút) (%) (%)
C1 MS 2 49,3a 91,7a
C2 MS 3 40,0a 95,0a
C3 MS 4 35,3a 95,0a
C4 MS 5 24,0a 96,7a
CV (%) 7,32 39,54
(P<0,05)
a b
Mẫu cuốngHình 4.3trùng

lá khử Tìnhbằng
trạngHgCl
mẫu 2cuống
0,1%látrong
sau khi khử ởtrùng.
2 phút nghiệm thức C1 là
(a) Mẫu cuống lá sống và sạch, (b) Mẫu cuống lá hoá nâu
tốt nhất, do tỉ lệ mẫu sống (49,3%) và tỉ lệ mẫu sạch (91,7%) là cao nhất so với các
nghiệm thức khác. Xét về tỉ lệ mẫu cuống lá sống, thời gian khử trùng mẫu càng
tăng thì tỉ lệ mẫu cuống lá sống càng thấp. Số mẫu cuống lá sống giữa các nghiệm
thức không có sự sai biệt về mặt thống kê. Bên cạnh đó, tỉ lệ mẫu sống của cuống lá
nhìn chung là khá thấp, tất cả nghiệm thức đều thấp hơn 50% (49,3%; 40%; 35,3%;
24%) trong đó nghiệm thức C1 có tỉ lệ mẫu sống cao nhất (49,3%). Nguyên nhân
do mẫu cuống lá không thích hợp với chất khử trùng mạnh như HgCl2 hoặc thời
gian khử trùng không thích hợp đối với mẫu cuống lá. Vô trùng trực tiếp mẫu
thường gây hại mẫu nuôi cấy ở các mức độ khác nhau do chất khử trùng gây ra
34

(Trần Văn Minh, 1997). Ngược lại với tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ mẫu sạch rất cao, luôn
hơn 90% ở cả 4 nghiệm thức (91,7%; 95%; 95%; 96,7%). Sự sai biệt về mặt thống
kê của tỉ lệ mẫu sạch ở các nghiệm thức là không có. Dựa vào tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ
mẫu sống của mẫu cuống lá kết luận nghiệm thức C1 (2 phút) là thời gian phù hợp
nhất cho việc xử lý mẫu cuống lá. Để đạt được kết quả tốt hơn cho việc khử trùng
mẫu cuống lá, nên giảm thời gian hoặc nồng độ của HgCl2 dùng để khử mẫu.
Mẫu lá thích hợp với thời gian khử trùng 3 phút, trong khi mẫu cuống lá là 2
phút và mẫu thân là 5 phút. Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu sạch và sống ở từng loại mẫu vẫn
chưa đạt được sự tối ưu. Do ngoài tác động của HgCl2, mẫu còn bị ảnh hưởng bởi
cồn 70% và chất kháng sinh dùng trong khử trùng. Ngoài ra, tuổi của mô cấy, vị trí
lấy mẫu và mùa trong năm cũng ảnh hưởng đến sự nhiễm nấm và khả năng đáp ứng
của mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002).
4.2Môi trường MS, WPM, KC và nồng độ đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của
hạt nắp ấm
Do khả năng nảy mầm của hạt nắp ấm trong tự nhiên là khá thấp và thời
gian nảy mầm lên tới 30 ngày, nên thực hiệnthí nghiệm này có thể giúp tăng
khả năng nảy mầm của hạt. Hạt là nguồn nguyên liệu nhân giống tiềm năng với
số lượng lớn. Hạt nắp ấm sau khi khử trùng, đặt trên môi trường nuôi cấy và
theo dõi liên tục trong 30 ngày với các chỉ tiêu về số lượng hạt nảy mầm, tỉ lệ
sống và thời gian nảy mầm.
Bảng 4.4 Môi trường và đường ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt nắp ấm in vitro
Nghiệm thức Môi trường Nồng độ đường Số ngày nảy Tỉ lệ hạt nảy
(g/l) mầm (ngày) mầm (%)
D1 (ĐC) MS 30 24 28,7d
D2 MS 60 19 39,7bc
D3 1/2MS 30 22 29,0d
D4 1/2MS 60 20 72,3a
D5 KC 30 22 13,0e
D6 KC 60 22 16,7e
35

D7 WPM 30 30 37,0cd
D8 WPM 60 28 49,0b
CV (%) 12,78
Cùng một cột, các giá trị có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê
(P<0,05)
a b
c d
Hình 4.4Quá trình phát triển hạt nắp ấm trên môi trường nghiệm thức
(a) Hạt trên môi trường, (b) Hạt hoá nâu, (c) Hạt mọc chồi, (d) Cây sau 2 tuần nuôi cấy.
Nghiệm thức D4 (1/2MS + 60 g/l) phù hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt nắp
ấm. Thời gian nảy mầm ở nghiệm thức D4 khá sớm, chỉ sau 22 ngày kể từ ngày
nuôi cấy với tỉ lệ nảy mầm đạt tới 72,3%. Tỉ lệ nảy mầm của hạt nắp ấm phụ thuộc
nhiều vào nồng độ đường ở từng loại môi trường. Trong nuôi cấy in vitro, nguồn
cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia,
tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là do
nguồn cacbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường (Nguyễn Đức Lượng,
2002). Đường cung cấp năng lượng giúp hạt thoát ra khỏi miên trạng, rút ngắn thời
gian nảy mầm và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm.
Trong môi trường MS, 1/2 MS, WPM tỉ lệ nảy mầm của hạt nắp ấm cao ở
nồng độ đường 60 g/l. Trong môi trường MS, tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ đường 30 g/l
là 28,7% trong khi ở nồng độ 60 g/l là 39,7%, có sự sai biệt về thống kê so với các
36

nghiệm thức khác. Trong môi trường WPM, tỉ lệ nảy mầm là 37% ở nồng độ đường
30 g/l, tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ 60 g/l đường là 49%, có sự sai biệt thống kê so với
các nghiệm thức khác. Đặc biệt trong môi trường 1/2 MS, tỉ lệ sống đạt 72,3% ở
nồng độ 60 g/l đường, trong khi nồng độ 30 g/l đường tỉ lệ nảy mầm giảm mạnh chỉ
còn 29% và có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 2 nồng độ. Tuy nhiên ở môi trường
KC không có sự sai biệt về mặt thống kê khi thay đổi nồng độ đường. Nồng độ
đường 60g/l cho tỉ lệ nảy mầm cao hơn nồng độ 30 g/l trong từng loại môi trường.
Vậy nồng độ đường phù hợp cho sự nảy mầm của hạt nắp ấm là 60 g/l.
Sự khác biệt tỉ lệ nảy mầm giữa hai nồng độ đường còn do lượng nước trong
môi trường. Hạt hấp thụ nước cung cấp điều kiện cần thiết để thuỷ phân các chất dự
trữ bởi enzym như amilaza phân giải tinh bột (Vũ Đức Lưu, 2002) từ đó bắt đầu
quá trình nảy mầm của hạt. Ở nồng độ đường 30g/l, lượng nước trong môi trường
cao có thể gây ức chế sự nảy mầm của hạt nắp ấm. Nồng độ đường 60g/l tạo áp suất
thẩm thấu (Gate and Greenwood, 1991) tốt hơn cho sự nảy mầm của hạt do giảm đi
lượng nước mà hạt hấp thụ.
Ngoài ra, ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt còn có thể do hàm lượng GA3.
Trong mô thực vật, GA tồn tại ở dạng tự do (dạng hoạt tính) và dạng liên kết
(dạng bất hoạt). GA có thể liên kết với đường, tạo GA glucozit nhờ các liên kết
đồng hoá trị. Dạng liên kết không hoạt tính là dạng dự trữ và vận chuyển (Nguyễn
Như Khanh, 2010). Khi nồng độ đường ngoài môi trường tăng, dẫn đến sự chênh
lệch nồng độ thì GA dạng dự trữ sẽ bị chuyển hoá thành dạng tự do để hoạt động
do cơ chế điều hoà ở thực vật. Hàm lượng GA tăng lên sẽ kích thích quá trình nảy
mầm ở hạt, tăng số lượng hạt nảy mầm.
Nếu so sánh giữa các loại môi trường khác nhau, tỉ lệ nảy mầm cũng thay đổi
và số ngày cần để nảy mầm cũng giảm đi hoặc tăng lên. Môi trường KC hoàn toàn
không phù hợp cho hạt nắp ấm nảy mầm. Tỉ lệ nảy mầm thấp, không có sự sai biệt
về mặt thống kê ở 2 nồng độ đường (30 g/l:16%; 60 g/l: 16,7%) và hạt cần tới 30
ngày để nảy mầm. Ở môi trường WPM, thời gian cần để nảy mầm là như nhau ở 2
nồng độ đường (20 ngày), tỉ lệ nảy mầm là khá cao (30 g/l: 37%; 60 g/l: 49%).
Nguyên nhân của tốc độ nảy mầm cao là do trong môi trường WPM có nồng độ Ca
cao nhất so với các môi trường khác. Không có Ca, sự bài tiết α – amylase không
37

xảy ra (Nguyễn Như Khanh, 2010). Bước đầu tiên của việc sinh sản năng lượng để
hoạt động của hạt là hoạt động của các enzym thuỷ phân năng lượng dự trữ. Vật
chất dự trữ được phân cách và chuyển đến những vùng tăng trưởng (Phan Kim
Ngọc, 2003). Tuy vậy, thành phần khoáng của WPM không thích hợp để hạt phát
triển, nên tỉ lệ nảy mầm không quá 50%.
Thời gian cần để hạt nảy mầm trong môi trường MS cao (30 g/l: 25 ngày; 60
g/l: 24 ngày). Tỉ lệ nảy mầm ở nồng độ đường 30 g/l không có sự sai biệt về mặt
thống kê so với môi trường WPM ở cùng nồng độ đường, điều này cũng xảy ra
tương tự ở nồng độ đường 60 g/l. Tỉ lệ nảy mầm ở môi trường MS thấp do cây nắp
ấm cần hàm lượng dinh dưỡng thấp, môi trường MS giàu dinh dưỡng sẽ ức chế sự
nảy mầm, đồng thời nồng độ NH4+ cao trong môi trường gây độc cho cây. Điều đó
được chứng minh khi so sánh môi trường MS với môi trường 1/2MS, tỉ lệ nảy mầm
cao hơn đạt 72,3% ở nồng độ 60 g/l đường. Môi trường MS có hàm lượng khoáng
đa lượng giảm đi 1/2 lần là tối ưu cho việc nảy mầm cũng được công nhận ở các
công bố trước đó (Jala, 2012; Sani và ctv, 2000; Dinaroti và ctv, 2010).
4.3Hàm lượng khoáng đa lượng của môi trường MS ảnh hưởng đến sự phát triển
của cây nắp ấm in vitro
Hạt sau khi nảy mầm được 30 ngày, được cấy chuyền qua môi trường MS
với các nồng độ khoáng đa lượng khác nhau để quan sát sự phát triển do cây nấp
ấm không thích nghi với môi trường nhiều chất dinh dưỡng.
Bảng 4.5 Nồng độ khoáng đa lượng MS ảnh hưởng đến cây nắp ấm in vitro
Nghiệm Chiều cao Số lá Chiều dài lá Số ấm Chiều dài ấm
thức cây (cm) (cm) (cm)
E1(MS) 0,42b ± 0,03 4,0a ± 0,28 0,59b ± 0,09 0,8bc ± 0,49 0,14b ± 0,02
E2(1/2MS) 0,76a ± 0,07 3,7a ±0,19 0,90a ± 0,07 1,1b ± 0,34 0,19b ± 0,03
E3(1/4MS) 0,39b ± 0,02 2,6b ± 0,57 0,96a ± 0,03 2,4a ± 0,16 0,39a ± 0,06
E4(1/8MS) 0,23c ± 0,04 2,2b ± 0,00 0,61b ± 0,02 0,0c ± 0,00 0,00c ± 0,00
CV (%) 12,19 12,97 10,22 35,49 22,51
38

(P<0,05).
b
a
a
c d
Hình 4.5 Cây nắp ấm phát triển trên các môi trường nghiệm thức.
(a) Môi trường MS, (b) Môi trường 1/2MS, (c) Môi trường 1/4MS, (d) Môi trường 1/8MS.
Môi trường MS với hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi 1/2 thích hợp nhất hợp
việc tăng trưởng và phát triển của cây nắp ấm in vitro. Các tác giả khác cũng đã công
bố môi trường 1/2MS là phù hợp nhất cho việc nảy mầm của hạt nấp ấm (Nguyễn Thị
Thư, 2005, Kompat và ctv, 2007, Dinarti và ctv, 2010). Môi trường 1/2MS có chiều
cao cây cao nhất là 0,76 cm và đạt trung bình 3,7 lá/cây.
Ở môi trường MS, chiều cao cây chỉ đạt giá trị trung bình là 0,42 cm và có sự sai
biệt về mặt thống kê so với môi trường 1/2MS. Số lá trung bình của môi trường MS cao đạt
4 lá/cây nhưng không có sự sai biệt về thống kê so với môi trường 1/2MS. Xét về chiều dài
lá, cây ở môi trường MS đạt 0,59 cm, sai biệt về thống kê so với môi trường 1/2MS. Trong
khi đó ở môi trường 1/2MS cây đạt giá trị cao nhất về chiều cao (0,76 cm), sai biệt so với
các nghiệm thức khác, số lá đạt trung bình 3,7 lá/cây, chiều dài lá trung bình là 0,9 cm.
39

Nhận thấy môi trường 1/2MS phù hợp cho sự phát triển của cây nhất, vượt trội
hơn môi trường MS. Điều này do môi trường MS rất giàu muối khoáng gây hiệu quả ức
chế lên sự tăng trưởng của các mô, gây độc cho mô (Dương Công Kiên, 2002). Môi
trường MS còn chứa hàm lượng ion NH4+ cao có tác động tới việc ức chế cây (Nguyễn
Đức Lượng, 2002). Trong môi trường 1/2MS hàm lượng NH4+ thấp hơn, do hàm lượng
khoáng đa lượng đã giảm đi 1/2.
Ở môi trường 1/4 MS, ấm phát triển đạt 2,4 ấm/cây và chiều dài ấm đạt 0,39 cm,
có sự sai biệt về thống kê so với các nghiệm thức khác. Sự hình thành ấm ở cây nắp ấm
phục vụ cho viêc bắt sâu bọ. Ở cây bắt mồi, bắt sâu bọ là phương thức căn bản để lấy
thức ăn đạm (Vũ Đức Lưu, 2002). Ở một số cây lúc ra hoa, quá trình phát triển diễn ra
mạnh thì quá trình sinh trưởng lại tiến hành chậm và có khi dừng hẳn (Nguyễn Như
Khanh, 2010). Nhận thấy do ấm được hình thành và phát triển mạnh để đáp ứng nhu cầu
thiếu chất dinh dưỡng trong môi trường, đây là phản ứng của cây.
Ấm hình thành dẫn tới việc phát triển mạnh của lá (0,96 cm) ở môi trường
1/4MS, không có sự sai biệt về thống kê so với nghiệm thức E2 (1/2MS). Do ở môi
trường 1/4MS cần phát triển lá to, vững chắc để hình thành ấm, trong khi ở môi trường
1/2MS lá phát triển là do cây đầy đủ dinh dưỡng. Cây tập trung chất dinh dưỡng để
phát triển kích thước lá và ấm, dẫn đến việc giảm số lượng lá chỉ đạt 2,6 lá/cây và
kiềm hãm sự tăng trưởng cây (0,39 cm) trên môi trường 1/4MS. Vậy để cây có ấm to,
đẹp thì môi trường 1/4MS là phù hợp nhất.
Trong khi đó, ở nghiệm thức E4 (1/8MS) các chỉ số đều không cao. Cây cao
0,23 cm, số lá đạt trung bình 2,2 lá/cây và chiều dài lá đạt 0,61 cm, có sự sai biệt so
với các nghiệm thức khác. Nhận thấy môi trường 1/8MS không thích hợp cho cây nắp
ấm phát triển, do lượng chất dinh dưỡng thấp không đủ cung cấp cho cây.
4.4Sự phát sinh chồi từ mẫu thân trên môi trường 1/2MS có bổ sung BA và NAA
Trên môi trường có bổ sung các hợp chất kích thích sinh trưởng phù hợp, cây sẽ
phát sinh cụm chồi, do ưu thế ngọn bị ức chế. Khi ứng dụng lên cây nấp ấm và theo
dõi các chỉ tiêu phát triển cũng như các chỉ tiêu về chồi đạt được những kết quả rất khả
quan. Các chỉ tiêu được ghi nhận sau 30 ngày và 60 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên phản
40

ứng của cây với các chất kích thích sinh trưởng chậm. Ngoài ra còn nhận thấy có sự
tiết phenol từ cây làm môi trường nâu hoá.
Bảng 4.6Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi của mẫu nắp ấm sau 30 ngày
Nghiệm thức NAA (mg/l) BA (mg/l) Chiều cao cây (cm) Số lá Số chồi
F1 (ĐC) 0,0 0,0 0,20cd ± 0,01 2,33a ± 0,47 -
F2 0,1 0,5 0,17d ± 0,01 1,40b ± 0,16 -
F3 0,1 1,0 0,27abc ± 0,07 1,67b ± 0,09 -
bcd ab
F4 0,1 1,5 0,24 ± 0,04 1,73 ± 0,09 +
F5 0,5 0,5 0,23bcd ± 0,06 1,60b ± 0 -
ab b
F6 0,5 1,0 0,28 ± 0,03 1,27 ± 0,09 +
a b
F7 0,5 1,5 0,32 ± 0,04 1,67 ± 0,25 +
CV (%) 19,15 16,14
(P<0,05), (-) có sự xuất hiện chồi, (+) không có sự xuất hiện chồi
Sự tăng trưởng của cây không có sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức, tuy
nhiên có thể thấy môi trường ở các nghiệm thức F3, F6, F7 với sự tăng trưởng cây khá
tốt. Số lá tăng ở môi trường ở nghiệm thức F4 là cao nhất. Trong khi sự phát sinh chồi
nách đã bắt đầu xuất hiện ở các nghiệm thức F4, F5, F6.
Bảng 4.7Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh chồi của mẫu nắp ấm sau 60 ngày
41

Nghiệm thức NAA BA Chiều cao cây Số lá Số chồi
(mg/l) (mg/l) (cm)
F1 (ĐC) 0 0 0,42bc ± 0,03 3,33ab ± 0,47 0,00c ± 0,0
F2 0,1 0,5 0,33c ± 0,03 1,60e ± 0,28 0,77c ± 0,17
F3 0,1 1,0 0,52bc ± 0,09 2,00de ± 0,28 1,87b ± 0,25
F4 0,1 1,5 0,41bc ± 0,06 3,07abc ± 0,19 3,73a ± 0,09
F5 0,5 0,5 0,88ab ± 0,10 2,33cde ± 0,19 0,47c ± 0,19
F6 0,5 1,0 1,16a ± 0,37 2,53bcd ± 0,41 1,87b ± 0,09
F7 0,5 1,5 1,18a ± 0,11 3,73a ± 0,09 4,00a ± 0,59
CV (%) 27,85 13,84 17,88
42

a b
c d
e f
g
Hình 3.6 Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi ở cây nắp ấm.
(a) 1/2MS, (b) 1/2MS + 0,1 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA, (c) 1/2MS + 0,1 mg/l NAA + 1,0 mg/l
BA, (d) 1/2MS + 0,1 mg/l NAA + 1,5 mg/l BA, (e) 1/2MS + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA,
Sự phát
(f) 1/2MS sinhmg/l
+ 0,5 chồiNAA
cho+kết
1,0 quả
mg/ltốt
BA,nhất ở 21/2MS
(g), (h) nghiệm thức
+ 0,5 F4NAA
mg/l (1/2MS
+ 1,5+mg/l
0,1 BA.
mg/l
NAA + 1,5 mg/l BA) và F3 (1/2 MS + 0,5 mg/l NAA + 1,5 mg/l BA). Chiều cao của
cây có sự khác biệt giữa hai nồng độ NAA. Chiều cao cây trong môi trường trường
43

bổ sung 0,5 mg/l NAA (0,88 cm; 1,16 cm; 1,18 cm) lớn hơn chiều cao cây trong môi
trường bổ sung 0,1 mg/l NAA (0,33 cm; 0,52 cm; 0,41 cm). Nguyên nhân do auxin
có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Auxin còn ảnh hưởng đến ưu thế ngọn. Từ đó, khi tăng nồng độ auxin sẽ làm tăng
mức độ sinh trưởng của lá và thân cây. Số lá tăng dần về số lượng khi tăng nồng độ
BA. Do cytokinin thúc đẩy sự phát triển trong sinh trưởng lá (Trần Văn Minh, 1997).
Số chồi tăng dần theo nồng độ BA, chồi hình thành cao nhất ở nghiệm thức
F7, F4 (4 chồi, 3,73 chồi) với nồng độ BA là 1,5 mg/l trong khi nồng độ BA thấp hơn
thì số chồi hình thành cũng giảm đi.Chất kích thích sinh trưởng BA là loại cytokinin
hiệu quả trong sự cảm ức tạo chồi ở nhiều loại thực vật. Với hàm lượng cytokinin
cao sẽ hoạt hóa sự hình thành chồi bất định (Vũ Văn Dụ, 1999). Nguyên nhân là do
khi nuôi cấy có sự hiện diện của BA thì BA sẽ kết hợp với auxin nội sinh kích thích
cho sự phát triển chồi. Sự phát sinh chồi còn tùy thuộc vào tỉ lệ auxin và cytokinin
(Bùi Trang Việt, 2002). Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng
auxin với nồng độ thấp phối hợp với cytokinin ở nồng độ cao. Tỉ lệ cytokinin và
auxin thông thường là 10/1 (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Thật vậy, tỉ lệ giữa auxin và
cytokinin nghiệm thức F7 (1/2MS + 0,5 mg/l NAA + 1,5 mg/l BA) và nghiệm thức
F4 (1/2MS + 0,1 mg/l NAA + 1,5 mg/l BA) cao nhất nên cho tỉ lệ tạo chồi cao nhất.
Theo Sukamto và ctv (2011), nhận thấy môi trường 1/2MS + 1 mg/l BA + 0,5
mg/l NAA là môi trường phù hợp nhất cho sự phát sinh chồi ở loài nắp ấm. Trong
khi Jala (2012) đã công bố sự phát triển của cây tốt nhất trên môi trường 1/2MS + 2
mg/l BA, Nguyễn Thị Thư (2005) thì cho rằng môi trường phát triển cụm chồi từ đốt
thân là 1/2MS + 5 mg/l BA và Sani và ctv (2000) lại cho kết quả là môi trường
1/2MS + 2,5 mg/l BA cho tỉ lệ phát sinh cụm chồi cao nhất. Tuy nhiên, khi sử dụng
BA nồng độ cao, sẽ gây nguy cơ đột biến cho chồi mới hình thành hoặc gây phù sẹo
ở gốc thân, phần tiếp giáp với môi trường.
4.5 Ảnh hưởng của môi trường 1/2MS có bổ sung than hoạt tính và chất kích
thích sinh trưởng đến sự phát triển của cây nắp ấm
44

Ở các mức nồng độ khác nhau thì than hoạt tính ảnh hưởng tới cây khác nhau.
Đồng thời than hấp thụ lượng phenol cây tiết ra, giúp cây sinh trưởng tốt hơn.
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của than đến phát triển của mẫu nắp ấm khi không bổ sung BA
Nghiệm Than hoạt Chiều cao Số lượng Kích thước Số lượng Chiều dài
thức tính (g/l) cây (cm) ấm ấm (cm) lá lá (cm)
G1 (ĐC) 0 0,88c ± 0,06 d
0,0 ± 0,0 0,0d ±0,0 c
3,5 ± 0,09 0,7d ± 0,01
G2 0,3 1,63a ±0,15 1,5c ± 0,34 0,3c ± 0,08 4,9b ± 0,38 1,6c ± 0,16
G3 0,5 1,27b ± 0,08 3,1b ± 0,25 0,6b ± 0,10 6,0a ± 0,43 2,2bc ± 0,19
G4 0,7 1,05bc ± 0,07 3,2b ± 0,43 0,8b ± 0,03 4,4bc ± 0,16 2,6b ± 0,20
G5 1,0 0,91c ± 0,06 4,3a ± 0,09 1,4a ± 0,10 4,9b ± 0,34 3,9a ± 0,20
CV (%) 9,91 13,79 13,84 8,02 9,57
(P<0,05).
Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy, cây sinh trưởng đặc
biệt tốt hơn. Than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất cản như phenol ngăn
chặn quá trình hóa nâu và đen của mẫu (Trần Văn Minh, 1997). Trong môi trường
1/2MS không bổ sung than, chiều cao cây kém (0,88 cm). Khi bổ sung 0,3g/l than
vào môi trường, chiều cao của cây tăng lên đến 1,63 cm, có sai biệt về mặt thống
kê so với các nghiệm thức khác. Do than kết hợp với phenol độc, kích thích mô
thực vật phát triển (Nguyễn Đức Lượng, 2005). Khi nồng độ than tăng lên, chiều
cao của cây giảm dần. Tại nồng độ than 0,5g/l chiều cao cây đạt 1,27 cm, nồng độ
than 0,7 g/l chiều cao cây đạt 1,05 cm và môi trường có nồng độ than 1 g/l chiều
cao cây chỉ còn 0,91 cm, không có sự sai biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm
thức. Sự kiềm hãm tăng trưởng này xảy ra là do ở nồng độ cao than cản trở sự
phát triển của mô cấy, hấp thụ các chất kích thích sinh trưởng. Chất kích thích
sinh trưởng IAA nội sinh gây ra ưu thế ngọn, thúc đẩy cây phát triển. Từ đó,
lượng IAA bị hấp thụ làm giảm chiều cao cây. Đặc biệt là IAA kết hợp với than
hoạt tính rất nhanh (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Ngoài ra, số lá có sự tăng dần về số lượng từ môi trường bổ sung 0,3 g/l than
(4,9 lá/cây)đến môi trường bổ sung 0,7 g/l (6 lá/cây), do IAA nội sinh còn có tác dụng
ngăn chặn sự già đi của lá, tăng số lượng lá non. Nhưng khi nồng độ than tăng lên thì
số lá giảm dần ở 2 nghiệm thức G4 và G5 (4,4 lá/cây và 4,9 lá/cây), không có sự sai
45

biệt về mặt thống kê giữa hai nghiệm thức. Sự thay đổi này là do hàm lượng than cao,
kiềm hãm sự phát triển của cây.
Tuy nhiên, chiều dài lá, số lượng ấm và chiều dài ấm có sự tăng dần từ môi
trường không bổ sung than hoạt tính đến môi trường có nồng độ than hoạt tính cao nhất.
Trong khi nghiệm thức đối chứng (0 g/l) không có sự xuất hiện của ấm thì ở nghiệm
thức G2 (chứa 0,3 g/l than) số lượng ấm trung bình đạt 1,5 ấm/cây, kích thước ấm đạt
0,3 cm và kích thước lá đạt 1,6 cm. Nghiệm thức G2 có ấm ít và có sự sai biệt về mặt
thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở nghiệm thức G3 (0,5 g/l than) và G4 (0,7 g/l
than) đạt các chỉ số ở mức trung bình, số ấm (3,1 ấm/cây; 3,2 ấm/cây), kích thước ấm
(0,6 cm; 0,8 cm) và kích thước lá (2,2 cm; 2,6 cm). Các chỉ số này không có sự sai biệt
về mặt thống kê. Trong khi ở môi trường bổ sung 1g/l than, các chỉ số đều rất cao như
số ấm trung bình (4,3 ấm/cây), kích thức ấm (1,4 cm) và kích thước lá (3,9 cm), có sai
biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại.
Nồng độ than bổ sung vào môi trường tỉ lệ thuận với sự tăng trưởng của ấm,
dẫn theo sự tăng trưởng của lá. Than hoạt tính hấp thụ các chất kích thích sinh trưởng
và các chất khác, cần cho sự phát triển bình thường (Trần Văn Minh, 1997). Ấm được
hình thành từ các tua cuốn kéo dài từ gân lá ở môi trường nghèo dinh dưỡng
(Pietropaolo và ctv, 1986). Nên có sự hình thành ấm khi bổ sung than hoạt tính vào
môi trường và ấm phát triển mạnh khi nồng độ than tăng lên do nhu cầu về dinh dưỡng
của cây. Từ đó kết luận, môi trường bổ sung 1 g/l than hoạt tính là phù hợp nhất cho
sự hình thành và phát triển ấm. Ngoài ra ở nồng độ 1g/l than hoạt tính, cây bắt đầu có
sự hình thành rễ trong môi trường. Do than tạo môi trường tối đồng thời hấp thụ nhiều
chất dinh dưỡng, kích thích sự hình thành rễ của cây để tìm nguồn dinh dưỡng.
46

a b
c d
e
f
h
i j
Hình 4.7 Ảnh hưởng của than hoạt tính theo các nồng độ trên nghiệm thức
lên sựphát triển và hình thành ấm của cây nắp ấm.
(a) G2 (1/2MS + 0,3 g/l than hoạt tính), (b) ấm G2, (c) G3 (1/2MS + 0,5 g/l than
hoạt tính), (d) ấm G3, (e) G4 (1/2MS + 0,7 g/l than hoạt tính), (f) ấm G4, (g) G5
(1/2MS + 1,0 g/l than hoạt tính), (h) ấm G5, (i) rể G5, (j) G1(1/2 MS).
47

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của than đến sự phát triển của mẫu khi bổ sung 1,5 mg/l BA
Nghiệm Than Chiều cao Số lượng Chiều cao Số lượng Chiều dài
thức hoạt tính cây (cm) chồi chồi (cm) lá lá (cm)
(g/l)
G6 (ĐC) 0 1,07b ± 0,19 2,5bc ± 0,09 0,8b ± 0,04 5,5a ± 0,20 0,7d ± 0,03
G7 0,3 1,86a ± 0,11 3,5ab ± 0,34 1,6a ± 0,02 4,5ab ± 0,62 2,7a ± 0,25
G8 0,5 1,72a ± 0,04 4,3a ± 0,81 1,6a ± 0,20 5,4a ± 0,33 1,7b ± 0,03
G9 0,7 1,17b ± 0,07 2,5bc ± 0,09 1,0b ± 0,08 3,9b ± 0,79 1,4bc ± 0,14
G10 1,0 0,87b ± 0,02 1,5c ± 0,09 0,7b ± 0,06 3,7b ± 0,31 1,1c ± 0,09
CV (%) 9,76 17,07 12,03 9,79 11,04

(P<0,05).
a b
c
e f
Hình 4.8 Sự ảnh hưởng của than hoạt tính kết hợp với BA trong sự hình
thành cụm chồi ở cây nắp ấm.
(a) 1/2MS + 1,5 mg/l BA, (b) 1/2MS + 1,5mg/l BA + 0,3 g/l than, (c), (d) 1/2MS +
1,5mg/l BA + 0,5 g/l than, (e) 1/2MS + 1,5mg/l BA + 0,7 g/l than, (f) 1/2MS + 1,5mg/l
BA + 1,0 g/l than.
48

Môi trường 1/2MS bổ sung 0,3 – 0,5 g/l than + 1,5 mg/l BA là phù hợp nhất
cho sự phát sinh và tăng trưởng của chồi cây nắp ấm. Chiều cao của cây tăng trong
môi trường có bổ sung 0,3 (1,86 cm) và môi trường có bổ sung 0,5 g/l than (1,72cm),
có sự sai biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở 2 môi trường này số
lá (4,5 lá/cây; 5,4 lá/cây) và kích thước lá (2,7 cm; 1,7cm) đều cao, có sự sai biệt về ,ặt
thống kê so với các nghiệm thức khác. Nguyên nhân là môi trường có bổ sung than
hoạt tính giúp thân vươn dài (Monteuuis, 1987). Đồng thời khả năng kích thích sự tăng
trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các chất độc phenol có
tiết ra trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Do vậy nên có sự vượt
trội về sự tăng trưởng của cây ở môi trường bổ sung 0,3 – 0,5 g/l than so với môi
trường không bổ sung than. Tuy vậy khi tăng nồng độ than lên 0,7 – 1 g/l, chiều cao
cây, số lá, chiều dài lá có sự thay đổi so với các nghiệm thức còn lại. Các chỉ tiêu này
đều thấp so với môi trường bổ sung 0,3 – 0,7 g/l than. Do than hoạt tính ở nồng độ cao
sẽ hấp thụ hết các chất dinh dưỡng trong môi trường làm cản trở sự tăng trưởng của
mô cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Khi bổ sung BA vào môi trường, sự tạo chồi xuất hiện. Khi cây được cấy
trên môi trường có bổ sung cytokinin và than hoạt tính thì cây sẽ được trẻ hoá
(Fouret và ctv, 1986; Monteuuis và Bon, 1989). Do đó, thấy được ở 2 nghiệm thức
G7 (0,3 g/l than) và G8 (0,5g/l than) có sự tăng trưởng về kích thước chồi là như
nhau (1,6 cm) và số lượng chồi ít khác biệt (3,5 chồi/cây; 4,3 chồi/cây), không có
sự sai biệt về mặt thống kê giữa hai nghiệm thức và có sự sai biệt về mặt thống kê
so với các nghiệm thức khác. Đặc biệt là có sự sai biệt rõ ràng so với nghiệm thức
đối chứng có số chồi trung bình là 2,5 chồi/cây và chiều cao chồi là 0,8 cm. Theo
Wang (1976), Nakagura và Itagki (1973), Bajanj (1976) than hoạt tính có tác động
hấp thụ các chất sinh trưởng nội tiết làm tăng hiệu suất tạo chồi.
Ngoài ra, trong cơ thể thực vật bậc cao đã phát hiện được một số loại auxin.
Trong các auxin tự nhiên đó, IAA là auxin chủ yếu, nhiều nhất và có tác động sinh
lý nổi bật nhất. Nồng độ auxin trong cây ức chế sự sinh trưởng của chồi bên
(Nguyễn Như Khanh, 2010). Than hoạt tính có khả năng hấp thụ trực tiếp auxin có
trong mô (Buchchein và ctv, 1989). Nên than hoạt tính làm giảm sự ức chế tạo
chồi, giúp cho sự phát triển chồi bên nắp ấm mạnh hơn. Tuy nhiên, khi tăng nồng
49

độ than lên, số chồi và chiều cao chồi giảm đi rõ rệt. Nhất là ở môi trường bổ sung
than hoạt tính 1g/l, số lượng chồi chỉ đạt trung bình 1,5 chồi/cây và chiều cao chồi
đạt 0,7 cm, sai biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Do than còn
hấp thu BA có trong môi trường (Nguyễn Đức Lượng, 1997) làm giảm khả năng
tạo chồi và tăng trưởng của chồi.
4.6 Sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA đến sự tạo sẹo của mẫu lá nắp ấm in vitro
Nghiệm Tỉ lệ mẫu Kích thước Khối lượng Khối lượng Tỉ lệ khối

thức tạo sẹo (%) mô sẹo (cm) sẹo tươi (g) sẹo khô (g) lượng sẹo (%)
H2 31,3d 0,387d ± 0,08 0,06bcd ±0,0 0,01ab ±0,0 23,64de
H3 39,7cd 0,609cd ±0,04 0,04cd ±0,01 0,02ab ± 0,0 39,74c
H4 64,7ab 1,087b ± 0,13 0,13b ± 0,02 0,01a ± 0,01 65,90b
H5 80,0a 1,460a ±0,08 0,06bcd ± 0,01 0,05ab ± 0,01 85,87a
H6 37,7cd 0,784c ±0,19 0,10bc ± 0,02 0,03ab ± 0,01 32,92cd

H7 48,7bc 1,372ab ± 0,06 0,40a ± 0,03 0,06ab ± 0,01 14,01ef
CV (%) 15,86 15,41 22,23 22,53 15,74
(P<0,05).
Bảng4.11 Màu sắc và hình dạng mô sẹo

Nghiệm Ngày cảm ứng
Màu sắc Hình dạng
thức sẹo (ngày)
H2 Xanh, đỏ Dạng khối, nhỏ, mọc dọc gân lá 60
H3 Vàng, vàng chóp đỏ Dạng khối, mọc ở gần gân lá 56
H4 Xanh, vàng, vàng nhạt Nhỏ, mọc quanh rìa lá 50
H5 Xanh, vàng Khối to, mọc quanh rìa lá 50

H6 Vàng, xanh Khối to, mọc xù lên 41
H7 Xanh, có rìa đỏ Dạng khối to tròn, trương phồng 40
50

a b
c d
e f
Hình 4.9 Ảnh hưởng của BA, 2,4 – D đến sự phát sinh sẹo ở lá cây nắp ấm.
(a) MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l BA, (b) MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA, (c) MS
+ 0,3 mg/l 2,4-D + 1,5 mg/l BA, (d) MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 2,0 mg/l BA, (e) MS + 0,3
mg/l 2,4-D + 2,5 mg/l BA, (f) MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 3,0 mg/l BA.
Môi trường H5 (1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 2mg/l BA) là môi trường thích hợp
nhất cho việc hình thành sẹo với tỉ lệ tạo sẹo cao (80%), kích thước sẹo to (1,46 cm)
và tỉ lệ khối lượng sẹo cao đạt 85,87%. Không có sự hình thành sẹo ở nghiệm thức H1
(1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D) do để cảm ứng tạo mô sẹo từ cây hai lá mầm, người ta
thường kết hợp auxin với cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Thời gian tạo sẹo giảm dần theo nồng độ của BA. Sự cảm ứng sẹo lá ở H7
(1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 3 mg/l BA) là nhanh nhất chỉ sau 40 ngày nuôi cấy với
51

khối lượng tươi nặng nhất (0,4 g). Tuy nhiên, tỉ lệ khối lượng sẹo ở nghiệm thức này
lại thấp (14%), sai biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức khác. Chứng tỏ môi
trường 1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 3mg/l BA có sự cảm ứng sẹo nhanh, mô sẹo phát
triển mạnh về kích thước nhưng xốp và chứa nhiều nước, là do nồng độ BA trong môi
trường cao so với mức cần thiết để tạo sẹo của cây nắp ấm. Nồng độ cytokinin tăng
cao kích thích sự tạo sẹo bở (Ceriani và ctv, 1992). Theo Vũ Văn Vụ (1999), khả năng
biệt hóa chồi sẽ sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng duy trì lâu hơn ở mô sẹo cứng.
Vậy có thể nhận thấy nồng độ BA có ảnh hưởng đến chất lượng của sẹo. Nồng
độ BA tăng dần từ 0,5 mg/l cho đến 2 mg/l thì tỉ lệ tạo sẹo, kích thước sẹo và tỉ lệ khối
lượng sẹo cũng tăng dần. Có sự tăng dần các chỉ tiêu này là do nếu giữ nguyên nồng
độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ
cytokinnin thì hình thái mô sẹo sẽ thay đổi (Merhra và Jaidka, 1985; Pal và ctv, 1985;
Shikhande và ctv, 1993).
Tuy nhiên, các chỉ tiêu này giảm ở nồng độ BA cao hơn 2,5 – 3 mg/l, do ở nồng
độ cao BA ức chế hoặc gây ảnh hưởng đến sự tạo sẹo. Nghiệm thức H2 (1/2MS + 0,3
mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l BA) có tỉ lệ tạo sẹo (31,3%), kích thước sẹo (0,387 cm) và tỉ lệ
khối lượng sẹo (39,74%) thấp, không có sai biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức
H3 (1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA) Trong khi đó ở nghiệm thức H5 (1/2MS +
0,3 mg/l 2,4-D + 2 mg/l BA) có tỉ lệ tạo sẹo (80%), kích thước sẹo (1,46 cm) và tỉ lệ
khối lượng sẹo (85,87%) cao nhất, sai biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức
khác. Sự tạo sẹo có khả năng tái sinh trên môi trường ở nghiệm thức H5 chứng minh tỉ
lệ auxin/cytokinin của nghiệm thức phù hợp cho việc tạo sẹo cây nắp ấm. Năm 2012,
Jala cũng đã công bố nồng độ BA 2 mg/l là thích hợp cho việc hình thành mô sẹo có
khả năng tái sinh chồi.
52

Chương 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Mẫu lá cây nắp ấm sau khi được khử trùng với HgCl2 0,1% đạt kết quả tốt nhất
trong thời gian 3 phút, đối với mẫu thân tỉ lệ tốt nhất là trong thời gian 5 phút, đối với
cuống lá là 2 phút.
Hạt nắp ấm nảy mầm tối ưu trên môi trường là 1/2MS + 60g/l đường.
Thích hợp cho sự tạo phát triển của cây nắp ấm là môi trường MS có hàm lượng
khoáng đa lượng giảm đi 1/2.
Cụm chồi nắp ấm phát sinh tốt trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l BA kết hợp
với 0,1 hoặc 0,5 mg/l NAA với số chồi trung bình đạt 3,74 chồi/cây và 4 chồi/cây.
Nồng độ 1 g/l than hoạt tính thích hợp cho sự tạo ấmcủa cây cho số ấm cao nhất (4,3
ấm/cây). Môi trường thích hợp nhất cho tăng trưởng chồi cây nắp ấm là 1/2 MS + 1,5 mg/l
BA + 0,3 – 0,5 g/l than hoạt tính.
Môi trường cho ra tỉ lệ sẹo tốt nhất là 1/2MS + 0,3 mg/l 2,4-D + 2,0 mg/l BA, với tỉ
lệ tạo sẹo đạt 80%.
5.2 Đề nghị
Nghiên cứu thêm về nồng độ và thời gian của các chất khử trùng để có kết quả vô
mẫu nắp ấm sống và sạch nấm khuẩn với tỉ lệ cao nhất (100%).
Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác
nhau đến sự tái sinh chồi từ mô sẹo.
53

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Vũ Văn Dụ. 1999. Sinh lí thực vật ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục, Tp. Hồ
Chí Minh.
2. Phạm Hoàng Hộ. 1999. Cây cỏ Việt Nam, quyển 1. Nhà xuất bản trẻ, Tp Hồ Chí
Minh.
3. Nguyễn Như Khanh. 2010. Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
Nhà xuất bản đại học quốc gia Tp, Tp. Hồ Chí Minh.
4. Dương Công Kiên. 2002. Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhà xuất bản đại học
quốc gia Tp, Tp. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Đức Lượng. 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản đại học quốc gia
Tp, Tp.HồChí Minh.
6. Vũ Đức Lưu. 2002. Sinh học thực vật. Câu hỏi và bài tập tổng hợp, tập 2. Nhà
xuất bản giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh.
7. Đỗ Tất Lợi. 2003. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học
cổ truyền, Tp. Hồ Chí Minh.
8. Trần Văn Minh. 1997. Công nghệ tế bào thực vật. Nhà xuất bản đại học quốc
gia Tp, Tp. Hồ Chí Minh.
9. Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thuỳ Dương. 2003. Sinh học của sự sinh sản.
Nhà xuất bản giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh.
10. Hoàng Thị Sản. 1999. Phân loại học thực vật. Nhà xuất bản đại học sư phạm,
Tp. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Thị Thư. 2005. Tìm hiểu môi trường nhân giống cây huệ loa kèn đỏ
(Hippeastrum equetre herb.) và cây nắp bình (Nepenthes sp.) trong điều kiện
nuôi cấy in vitro. Luận văn Kĩ sư Khoa học Nông học, Đại học Nông Lâm Tp.
Hồ Chí Minh.
12. Mai Trần Ngọc Tiếng. 2001. Thực vật cấp cao. Nhà xuất bản đại học quốc gia
Tp, Tp. Hồ Chí Minh.
13. Nguyễn Bảo Toàn và Lê Hồng Giang. 2011. Sự cảm ứng mầm bên và tạo cụm
chồi cây nắp bình (nepenthes mirabilis). Tạp chí Khoa học 2011: 20a 84-91.
14. Huỳnh Ngọc Tựng. 2009 Cây nắp ấm. Thuốc Và Sức Khoẻ số 377: 14.
Tài liệu nước ngoài
15. Allan A.S. 1977. Cultivating Carnivorous Plants. Doubleday and Copany, New
York.
16. Clarke C.M. 2001. Literature Review: Nepenthaceae - Flora Malesiana Series 1
(Seed Plants). Bulletin of the Australian Carnivorous Plant Society 20: 7–12.
17. Cheek M.R., and M. H. P. Jebb. 2001. Nepenthaceae. Malaysia.
54

18. D. Dinarti, U. Saykekti, and Y. Alitalia. 2010. Tissue culture of pitcher plant
(Nepenthes mirabilis). J.Hort.Indonesia 1: 59-65.
19. Jala A. 2011. Effects of differen type of light treatments on the germination of
Nepenthes mirabilis. International Transaction Journal of Engineering,
Management, and Applied Science and Technology 2: 83-91.
20. Jala A. 2012. Type of media for seeds germination and effect of BA on mass
propagation of Nepenthes mirabilis Druce. American Transactions on
engineering and Applied Sciences 1: 163-171.
21. L.A. Sukamto, Mujiono, Djukri and V. Henuhili. 2011. Shoot tip culture of
nepenthes albomarginata Loobb ex Lindl. in vitro. Jurnal Biologi Indonesia 7:
251-261.
22. Khompat K., Tokhao W., and Jantaslip A. 2007. Factors affecting in vitro seed
germination and shoot multiplication of a pitcher plant (Nepenthes mirabilis
(Lour.) Druce). Songklanakarin J. Sci. Technol 29: 253-260.
23. Pietropaolo P. and Pietropaolo J. 1986. Carnivorous plants of the word. Timber
Press, Hong Kong.
24. Rasco Jr., Eufemio T., and M.A.D. Maquilan. 2005. Initial studies on in vitro
germiation and erly seedling growth of Nepenthes truncata Macf. Techical
Refereed Contribution 34: 51-55.
25. Sani B.H., Meekiong K., Lee W.W., and Dayang A.A.L. 2000. Vegetative
propagation of selected nepenthes species. Borneo Science 7: 1-9.
26. S. Kumaria, P. Tandon and I. Nongrum. 2009. Multiplication through in vitro
germination and pitcher development in Nepenthes khasiana Hook.f.,a unique
insectivorous plant of India. Journal of Horticultural Science and
Biotechnology 84: 329-332.
27. S.W. Fong. 2008. In vitro induction of polyploidy in nepenthes gracilis.The
thesis of master of science, Sience University of Malaysia Kuala Lumpur.
55

PHỤ LỤC
Phụ lục 1
Bảng 1.1 Số liệu dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm 1
Lần lặp lại
Nghiệm thức Trung bình
1 2 3
A1 0,72 0,32 0,80 0,61
A2 1,00 0,36 1,00 0,79
A3 1,00 0,44 1,00 0,81
A4 0,92 0,68 1,00 0,87
Bảng 1.2 Bảng ANOVA thí nghiệm 1 trên số liệu Bảng 1.1
ANALYSIS OF VARIANCE TABLE

Degrees of Sum of Mean
Freedom Squares Square F-value Prob.
---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.108 0.036 0.430
Within 8 0.670 0.084
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.778
Coefficient of Variation = 37.58%
Bảng 1.3 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm 1 trên kết quả Bảng 1.1
Original Order Ranked Order
Mean 1 = 0.6100 A Mean 4 = 0.8700 A
Mean 2 = 0.7900 A Mean 3 = 0.8100 A
Mean 3 = 0.8100 A Mean 2 = 0.7900 A
Mean 4 = 0.8700 A Mean 1 = 0.6100 A

Lần lặp lại
1 2 3
A1 0,56 1,00 0,95 0,84
A2 0,60 1,00 0,72 0,77
A3 0,40 0,55 0,64 0,53
A4 0,35 0,41 0,40 0,39
56

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.397 0.132 4.571 0.0380
Within 8 0.232 0.029
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.629
Mean 1 = 0.8400 A Mean 1 = 0.8400 A
Mean 2 = 0.7700 A Mean 2 = 0.7700 A
Mean 3 = 0.5300 AB Mean 3 = 0.5300 AB
Mean 4 = 0.3900 B Mean 4 = 0.3900 B

Lần lặp lại
1 2 3
B1 0,50 0,25 0,50 0,42
B2 0,75 0,75 1,00 0,83
B3 0,75 0,50 1,00 0,75
B4 1,00 0,50 1,00 0,83
---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.354 0.118 2.519 0.1318
Within 8 0.375 0.047
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.729
57

Mean 1 = 0.4200 B Mean 2 = 0.8300 A
Mean 2 = 0.8300 A Mean 4 = 0.8300 A
Mean 3 = 0.7500 AB Mean 3 = 0.7500 AB
Mean 4 = 0.8300 A Mean 1 = 0.4200 B

Lần lặp lại
1 2 3
B1 1,00 1,00 0,50 0,83
B2 0,67 1,00 0,75 0,81
B3 0,67 1,00 0,50 0,72
B4 0,75 0,50 0,25 0,50
---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.206 0.069 1.144 0.3883
Within 8 0.480 0.060
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.686
Mean 1 = 0.8300 A Mean 1 = 0.8300 A
Mean 2 = 0.8100 A Mean 2 = 0.8100 A
Mean 3 = 0.7200 A Mean 3 = 0.7200 A
Mean 4 = 0.5000 A Mean 4 = 0.5000 A

Lần lặp lại
1 2 3
C1 0,90 1,00 0,85 0,92
C2 1,00 1,00 0,85 0,95
C3 0,95 1,00 0,90 0,95
58

C4 1,00 1,00 0,90 0,97

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.004 0.001 0.275
Within 8 0.038 0.005
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.042
Mean 1 = 0.9200 A Mean 4 = 0.9700 A
Mean 2 = 0.9500 A Mean 3 = 0.9500 A
Mean 3 = 0.9500 A Mean 2 = 0.9500 A
Mean 4 = 0.9700 A Mean 1 = 0.9200 A

Lần lặp lại
1 2 3
C1 0,39 0,50 0,59 0,49
C2 0,20 0,35 0,65 0,40
C3 0,21 0,35 0,50 0,35
C4 0,30 0,20 0,22 0,24

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.100 0.033 1.541 0.2773
Within 8 0.173 0.022
---------------------------------------------------------------------------
59

Total 11 0.273
Mean 1 = 0.4900 A Mean 1 = 0.4900 A
Mean 2 = 0.4000 A Mean 2 = 0.4000 A
Mean 3 = 0.3500 A Mean 3 = 0.3500 A
Mean 4 = 0.2400 A Mean 4 = 0.2400 A

Phụ lục 2

Lần lặp lại
1 2 3
D1 0,33 0,33 0,20 0,29
D2 0,41 0,43 0,35 0,40
D3 0,34 0,25 0,28 0,29
D4 0,72 0,77 0,68 0,72
D5 0,13 0,13 0,13 0,13
D6 0,17 0,18 0,15 0,17
D7 0,41 0,40 0,30 0,37
D8 0,45 0,51 0,51 0,49

---------------------------------------------------------------------------
Between 7 0.752 0.107 51.701 0.0000
Within 16 0.033 0.002
---------------------------------------------------------------------------
Total 23 0.786
60

Mean 1 = 0.2900 D Mean 4 = 0.7200 A
Mean 2 = 0.4000 BC Mean 8 = 0.4900 B
Mean 3 = 0.2900 D Mean 2 = 0.4000 BC
Mean 4 = 0.7200 A Mean 7 = 0.3700 CD
Mean 5 = 0.1300 E Mean 1 = 0.2900 D
Mean 6 = 0.1700 E Mean 3 = 0.2900 D
Mean 7 = 0.3700 CD Mean 6 = 0.1700 E
Mean 8 = 0.4900 B Mean 5 = 0.1300 E

Phụ lục 3
Lần lặp lại

1 2 3
E1 0,46 0,38 0,41 0,42
E2 0,80 0,67 0,82 0,76
E3 0,37 0,42 0,38 0,39
E4 0,17 0,23 0,28 0,23

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.458 0.153 50.921 0.0000
Within 8 0.024 0.003
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.482
61

Mean 1 = 0.4200 B Mean 2 = 0. 7600 A
Mean 2 = 0.7600 A Mean 1 = 0.4200 B
Mean 3 = 0.3900 B Mean 3 = 0.3900 B
Mean 4 = 0.2300 C Mean 4 = 0.2300 C

Lần lặp lại
1 2 3
E1 3,8 4,4 3,8 4,00
E2 3,4 3,8 3,8 3,67
E3 2,2 2,2 3,4 2,60
E4 2,2 2,2 2,2 2,20

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 6.570 2.190 13.408 0.0017
Within 8 1.307 0.163
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 7.877
Mean 1 = 4.000 A Mean 1 = 4.000 A
Mean 2 = 3.670 A Mean 2 = 3.670 A
Mean 3 = 2.600 B Mean 3 = 2.600 B
Mean 4 = 2.200 B Mean 4 = 2.200 B

Lần lặp lại
1 2 3
62

E1 0,46 0,63 0,68 0,59
E2 0,82 1,00 0,89 0,90
E3 0,99 0,91 0,99 0,96
E4 0,61 0,64 0,58 0,61

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.339 0.113 18.417 0.0006
Within 8 0.049 0.006
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.388
Mean 1 = 0.5900 B Mean 3 = 0.9600 A
Mean 2 = 0.9000 A Mean 2 = 0.9000 A
Mean 3 = 0.9600 A Mean 4 = 0.6100 B
Mean 4 = 0.6100 B Mean 1 = 0.5900 B

Lần lặp lại
1 2 3
E1 0,8 1,4 0,2 0,80
E2 0,6 1,4 1,2 1,07
E3 2,4 2,6 2,2 2,40
E4 0 0 0 0

---------------------------------------------------------------------------
Between 3 8.960 2.987 20.837 0.0004
Within 8 1.147 0.143
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 10.107
63

Mean 1 = 0.8000 BC Mean 3 = 2.400 A
Mean 2 = 1.070 B Mean 2 = 1.070 B
Mean 3 = 2.400 A Mean 1 = 0.8000 BC
Mean 4 = 0.0000 C Mean 4 = 0.0000 C
Lần lặp lại

1 2 3
E1 0,12 0,14 0,16 0,14
E2 0,18 0,22 0,14 0,19
E3 0,43 0,31 0,44 0,39
E4 0 0 0 0
---------------------------------------------------------------------------
Between 3 0.239 0.080 48.460 0.0000
Within 8 0.013 0.002
---------------------------------------------------------------------------
Total 11 0.252
Mean 1 = 0.1400 B Mean 3 = 0.3900 A
Mean 2 = 0.1900 B Mean 2 = 0.1900 B
Mean 3 = 0.3900 A Mean 1 = 0.1400 B

64

Mean 4 = 0.0000 C Mean 4 = 0.0000 C
Phụ lục 4

Lần lặp lại
1 2 3
F1 0,21 0,18 0,20 0,20
F2 0,18 0,17 0,15 0,17
F3 0,21 0,34 0,27 0,27
F4 0,19 0,28 0,26 0,24
F5 0,16 0,30 0,23 0,23
F6 0,25 0,32 0,28 0,28
F7 0,27 0,34 0,35 0,32

---------------------------------------------------------------------------
Between 6 0.050 0.008 3.829 0.0180
Within 14 0.031 0.002
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 0.081
Mean 1 = 0.2000 CD Mean 7 = 0.3200 A
Mean 2 = 0.1700 D Mean 6 = 0.2800 AB
Mean 3 = 0.2700 ABC Mean 3 = 0.2700 ABC
Mean 4 = 0.2400 BCD Mean 4 = 0.2400 BCD

65

Mean 5 = 0.2300 BCD Mean 5 = 0.2300 BCD
Mean 6 = 0.2800 AB Mean 1 = 0.2000 CD
Mean 7 = 0.3200 A Mean 2 = 0.1700 D

Lần lặp lại

1 2 3
F1 2,0 3,0 2,0 2,33
F2 1,6 1,2 1,4 1,40
F3 1,6 1,6 1,8 1,67
F4 1,6 1,8 1,8 1,73
F5 1,6 1,6 1,6 1,60
F6 1,2 1,4 1,2 1,27
F7 2,0 1,4 1,6 1,67

---------------------------------------------------------------------------
Between 6 2.053 0.342 4.728 0.0078
Within 14 1.013 0.072
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 3.067
Mean 1 = 2.330 A Mean 1 = 2.330 A
Mean 2 = 1.400 B Mean 4 = 1.730 AB
Mean 3 = 1.670 B Mean 3 = 1.670 B
Mean 4 = 1.730 AB Mean 7 = 1.670 B
Mean 5 = 1.600 B Mean 5 = 1.600 B
Mean 6 = 1.270 B Mean 2 = 1.400 B

66

Mean 7 = 1.670 B Mean 6 = 1.270 B

Lần lặp lại
1 2 3
F1 0,46 0,38 0,41 0,42
F2 0,39 0,29 0,37 0,33
F3 0,41 0,64 0,51 0,52
F4 0,42 0,49 0,35 0,41
F5 0,77 1,01 0,86 0,88
F6 0,87 1,69 0,92 1,16
F7 1,31 1,04 1,18 1,18

---------------------------------------------------------------------------
Between 6 2.397 0.400 10.532 0.0002
Within 14 0.531 0.038
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 2.928
Mean 1 = 0.4200 BC Mean 7 = 1.180 A
Mean 2 = 0.3300 C Mean 6 = 1.160 A
Mean 3 = 0.5200 BC Mean 5 = 0.8800 AB
Mean 4 = 0.4100 BC Mean 3 = 0.5200 BC
Mean 5 = 0.8800 AB Mean 1 = 0.4200 BC
Mean 6 = 1.160 A Mean 4 = 0.4100 BC
Mean 7 = 1.180 A Mean 2 = 0.3300 C
67

Lần lặp lại

1 2 3
F1 0 0 0 0
F2 0,7 0,6 1,0 0,77
F3 1,8 1,6 2,2 1,87
F4 3,6 3,8 3,8 3,73
F5 0,2 0,6 0,6 0,47
F6 2,0 1,8 1,8 1,87
F7 4,6 3,2 4,2 4,00

---------------------------------------------------------------------------
Between 6 44.012 7.335 69.703 0.0000
Within 14 1.473 0.105
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 45.486
Mean 1 = 0.0000 C Mean 7 = 4.000 A
Mean 2 = 0.7700 C Mean 4 = 3.730 A
Mean 3 = 1.870 B Mean 3 = 1.870 B
Mean 4 = 3.730 A Mean 6 = 1.870 B
Mean 5 = 0.4700 C Mean 2 = 0.7700 C
Mean 6 = 1.870 B Mean 5 = 0.4700 C
Mean 7 = 4.000 A Mean 1 = 0.0000 C

68

Lần lặp lại
1 2 3
F1 3,0 4,0 3,0 0,33
F2 1,8 1,2 1,8 1,60
F3 2,2 1,6 2,2 2,00
F4 3,2 2,8 3,2 3,07
F5 2,6 2,2 2,2 2,33
F6 3,0 2,0 2,6 2,53
F7 3,8 3,6 3,8 3,73
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 10.358 1.726 12.765 0.0001
Within 14 1.893 0.135
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 12.251
Mean 1 = 3.330 AB Mean 7 = 3.730 A
Mean 2 = 1.600 E Mean 1 = 3.330 AB
Mean 3 = 2.000 DE Mean 4 = 3.070 ABC
Mean 4 = 3.070 ABC Mean 6 = 2.530 BCD
Mean 5 = 2.330 CDE Mean 5 = 2.330 CDE
Mean 6 = 2.530 BCD Mean 3 = 2.000 DE
Mean 7 = 3.730 A Mean 2 = 1.600 E
Phụ lục 5

Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình
69

1 2 3
G1 0,80 0,90 0,94 0,88
G2 1,70 1,42 1,78 1,63
G3 1,18 1,24 1,38 1,27
G4 1,04 0,96 1,14 1,05
G5 0,98 0,84 0,90 0,91
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 1.170 0.292 22.660 0.0001
Within 10 0.129 0.013
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 1.299
Mean 1 = 0.8800 C Mean 2 = 1.630 A
Mean 2 = 1.630 A Mean 3 = 1.270 B
Mean 3 = 1.270 B Mean 4 = 1.050 BC
Mean 4 = 1.050 BC Mean 5 = 0.9100 C
Mean 5 = 0.9100 C Mean 1 = 0.8800 C

Lần lặp lại
1 2 3
G1 0 0 0 0
G2 2,0 1,2 1,4 1,53
G3 3,4 3,2 2,8 3,13
G4 3,4 3,6 2,6 3,20
G5 4,2 4,4 4,2 4,27
70

---------------------------------------------------------------------------
Between 4 33.509 8.377 74.798 0.0000
Within 10 1.120 0.112
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 34.629
Mean 1 = 0.0000 D Mean 5 = 4.270 A
Mean 2 = 1.530 C Mean 4 = 3.200 B
Mean 3 = 3.130 B Mean 3 = 3.130 B
Mean 4 = 3.200 B Mean 2 = 1.530 C
Mean 5 = 4.270 A Mean 1 = 0.0000 D

Lần lặp lại
1 2 3
G1 0 0 0 0
G2 0,41 0,23 0,36 0,33
G3 0,70 0,72 0,50 0,64
G4 0,82 0,77 0,85 0,81
G5 1,38 1,32 1,55 1,42
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 3.411 0.853 108.483 0.0000
Within 10 0.079 0.008
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 3.489
Mean 1 = 0.0000 D Mean 5 = 1.420 A
71

Mean 2 = 0.3300 C Mean 4 = 0.8100 B
Mean 3 = 0.6400 B Mean 3 = 0.6400 B
Mean 4 = 0.8100 B Mean 2 = 0.3300 C
Mean 5 = 1.420 A Mean 1 = 0.0000 D

Lần lặp lại
1 2 3
G1 3,4 3,4 3,6 3,47
G2 5,2 4,4 5,2 4,93
G3 5,4 6,4 6,2 6,00
G4 4,4 4,6 4,2 4,40
G5 4,4 5,2 5,0 4,87
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 10.133 2.533 17.593 0.0002
Within 10 1.440 0.144
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 11.573
Mean 1 = 3.470 C Mean 3 = 6.000 A
Mean 2 = 4.930 B Mean 2 = 4.930 B
Mean 3 = 6.000 A Mean 5 = 4.870 B
Mean 4 = 4.400 BC Mean 4 = 4.400 BC
Mean 5 = 4.870 B Mean 1 = 3.470 C

Lần lặp lại
1 2 3
G1 0,72 0,70 0,72 0,71
72

G2 1,78 1,40 1,70 1,63
G3 2,24 2,32 1,88 2,15
G4 2,90 2,62 2,40 2,64
G5 3,60 4,10 3,84 3,85
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 16.340 4.085 92.617 0.0000
Within 10 0.441 0.044
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 16.781
Mean 1 = 0.7100 D Mean 5 = 3.850 A
Mean 2 = 1.630 C Mean 4 = 2.640 B
Mean 3 = 2.150 BC Mean 3 = 2.150 BC
Mean 4 = 2.640 B Mean 2 = 1.630 C
Mean 5 = 3.850 A Mean 1 = 0.7100 D

Lần lặp lại
1 2 3
G6 1,34 0,98 0,90 1,07
G7 2,02 1,76 1,80 1,86
G8 1,66 1,76 1,74 1,72
G9 1,26 1,10 1,14 1,17
G10 0,90 0,84 0,86 0,87
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 2.220 0.555 32.569 0.0000
Within 10 0.170 0.017
73

---------------------------------------------------------------------------
Total 14 2.390
Mean 1 = 1.070 B Mean 2 = 1.860 A
Mean 2 = 1.860 A Mean 3 = 1.720 A
Mean 3 = 1.720 A Mean 4 = 1.170 B
Mean 4 = 1.170 B Mean 1 = 1.070 B
Mean 5 = 0.8700 B Mean 5 = 0.8700 B

Lần lặp lại
1 2 3
G6 2,6 2,6 2,4 2,53
G7 3,8 3,0 3,6 3,47
G8 3,6 3,8 5,4 4,27
G9 2,6 2,6 2,4 2,53
G10 1,4 1,4 1,6 1,47
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 13.504 3.376 14.225 0.0004
Within 10 2.373 0.237
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 15.877
Mean 1 = 2.530 BC Mean 3 = 4.270 A
Mean 2 = 3.470 AB Mean 2 = 3.470 AB
Mean 3 = 4.270 A Mean 1 = 2.530 BC
Mean 4 = 2.530 BC Mean 4 = 2.530 BC
74

Mean 5 = 1.470 C Mean 5 = 1.470 C

Lần lặp lại
1 2 3
G6 0,94 0,72 0,74 0,80
G7 1,60 1,58 1,54 1,57
G8 1,37 1,57 1,86 1,60
G9 1,08 0,93 0,90 0,97
G10 0,73 0,60 0,74 0,69
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 2.236 0.559 30.442 0.0000
Within 10 0.184 0.018
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 2.420
Mean 1 = 0.8000 B Mean 3 = 1.600 A
Mean 2 = 1.570 A Mean 2 = 1.570 A
Mean 3 = 1.600 A Mean 4 = 0.9700 B
Mean 4 = 0.9700 B Mean 1 = 0.8000 B
Mean 5 = 0.6900 B Mean 5 = 0.6900 B

Lần lặp lại
1 2 3
G6 5,22 5,47 5,72 5,47
G7 5,1 3,66 4,78 4,51
G8 5,67 5,59 4,94 5,40
G9 4,20 3,89 3,66 3,92
G10 3,70 4,00 3,25 3,65
75

---------------------------------------------------------------------------
Between 4 8.320 2.080 10.292 0.0014
Within 10 2.021 0.202
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 10.341
Mean 1 = 5.470 A Mean 1 = 5.470 A
Mean 2 = 4.510 AB Mean 3 = 5.400 A
Mean 3 = 5.400 A Mean 2 = 4.510 AB
Mean 4 = 3.920 B Mean 4 = 3.920 B
Mean 5 = 3.650 B Mean 5 = 3.650 B

Lần lặp lại
1 2 3
G6 0,69 0,65 0,61 0,65
G7 2,72 2,95 2,35 2,67
G8 1,,63 1,62 1,69 1,65
G9 1,58 1,25 1,34 1,39
G10 1,26 1,03 1,13 1,14
---------------------------------------------------------------------------
Between 4 6.787 1.697 61.897 0.0000
Within 10 0.274 0.027
---------------------------------------------------------------------------
Total 14 7.061
Mean 1 = 0.6500 D Mean 2 = 2.670 A
76

Mean 2= 2.670 A Mean 3 = 1.650 B
Mean 3= 1.650 B Mean 4 = 1.390 BC
Mean 4= 1.390 BC Mean 5 = 1.140 C
Mean 5= 1.140 C Mean 1 = 0.6500 D
Phụ lục 6

Lần lặp lại
1 2 3
H1 0 0 0 0
H2 0,70 0,40 0,27 0,31
H3 0,53 0,33 0,33 0,40
H4 0,67 0,60 0,67 0,65
H5 0,73 0,87 0,80 0,80
H6 0,33 0,40 0,40 0,38
H7 0,40 0,53 0,53 0,49
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 1.169 0.195 41.606 0.0000
Within 14 0.066 0.005
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 1.234

Mean 1 = 0.0000 E Mean 5 = 0.8000 A
Mean 2 = 0.3100 D Mean 4 = 0.6500 AB
Mean 3 = 0.4000 CD Mean 7 = 0.4900 BC
Mean 4 = 0.6500 AB Mean 3 = 0.4000 CD
Mean 5 = 0.8000 A Mean 6 = 0.3800 CD
Mean 6 = 0.3800 CD Mean 2 = 0.3100 D
Mean 7 = 0.4900 BC Mean 1 = 0.0000 E

Lần lặp lại
1 2 3
H1 0 0 0 0
H2 0,38 0,49 0,30 0,39
77

H3 0,59 0,67 0,57 0,61
H4 0,93 1,07 1,26 1,09
H5 1,44 1,38 1,57 1,46
H6 0,52 0,98 0,85 0,78
H7 1,37 1,30 1,44 1,37
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 5.057 0.843 53.556 0.0000
Within 14 0.220 0.016
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 5.278
Mean 1 = 0.0000 E Mean 5 = 1.460 A
Mean 2 = 0.3900 D Mean 7 = 1.370 AB
Mean 3 = 0.6100 CD Mean 4 = 1.090 B
Mean 4 = 1.090 B Mean 6 = 0.7800 C
Mean 5 = 1.460 A Mean 3 = 0.6100 CD
Mean 6 = 0.7800 C Mean 2 = 0.3900 D
Mean 7 = 1.370 AB Mean 1 = 0.0000 E

Lần lặp lại
1 2 3
H1 0 0 0 0
H2 0,060 0,058 0,049 0,06
H3 0,050 0,036 0,040 0,04
78

H4 0,138 0,107 0,148 0,13
H5 0,041 0,062 0,069 0,06
H6 0,067 0,116 0,116 0,10
H7 0,389 0,374 0,440 0,38
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 0.295 0.049 82.148 0.0000
Within 14 0.008 0.001
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 0.303
Mean 1 = 0.0000 D Mean 7 = 0.3800 A
Mean 2 = 0.06000 BCD Mean 4 = 0.1300 B
Mean 3 = 0.04000 CD Mean 6 = 0.1000 BC
Mean 4 = 0.1300 B Mean 2 = 0.06000 BCD
Mean 5 = 0.06000 BCD Mean 5 = 0.06000 BCD
Mean 6 = 0.1000 BC Mean 3 = 0.04000 CD
Mean 7 = 0.3800 A Mean 1 = 0.0000 D

Lần lặp lại
1 2 3
H1 0 0 0 0
H2 0,013 0,012 0,014 0,01
H3 0,016 0,017 0,016 0,02
H4 0,091 0,080 0,080 0,08
79

H5 0,036 0,055 0,056 0,05
H6 0,024 0,035 0,038 0,03
H7 0,053 0,051 0,065 0,06
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 0.015 0.003 39.453 0.0000
Within 14 0.001 0.000
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 0.016
Mean 1 = 0.0000 B Mean 4 = 0.08000 A
Mean 2 = 0.01000 AB Mean 7 = 0.06000 AB
Mean 3 = 0.02000 AB Mean 5 = 0.05000 AB
Mean 4 = 0.08000 A Mean 6 = 0.03000 AB
Mean 5 = 0.05000 AB Mean 3 = 0.02000 AB
Mean 6 = 0.03000 AB Mean 2 = 0.01000 AB
Mean 7 = 0.06000 AB Mean 1 = 0.0000 B

Lần lặp lại
1 2 3
H1 0 0 0 0
H2 21,67 20,69 28,57 23,64
H3 32,00 47,22 40,00 39,74
H4 65,94 77,76 54,00 65,90
80

H5 87,80 88,70 81,12 85,87
H6 35,82 30,17 32,76 32,92
H7 13,62 13,63 14,77 14,01
---------------------------------------------------------------------------
Between 6 15968.198 2661.366 76.625 0.0000
Within 14 486.253 34.732
---------------------------------------------------------------------------
Total 20 16454.452
Mean 1 = 0.0000 F Mean 5 = 85.87 A
Mean 2 = 23.64 DE Mean 4 = 65.90 B
Mean 3 = 39.74 C Mean 3 = 39.74 C
Mean 4 = 65.90 B Mean 6 = 32.92 CD
Mean 5 = 85.87 A Mean 2 = 23.64 DE
Mean 6 = 32.92 CD Mean 7 = 14.01 EF
Mean 7 = 14.01 EF Mean 1 = 0.0000 F
81

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY NẮP ẤM (Nepenthes mirabilis Druce) in vitro

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN TRANG ÁNH HUỲNH PHƯỚC

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Xin chân thành cám ơn

The thesis: In vitro mutiplication of Nepenthes mirabilis Druce

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Yêu cầu

1.3 Nội dung nghiên cứu

2.1. Tổng quan về loài nắp ấm

2.1.1 Lịch sử phát hiện cây nắp ấm

2.1.2. Cấu tạo cây nắp ấm

2.1.2.2 Lá cây nắp ấm

Hình2.1 Cấu trúc của ấm (Clarke, 1997).

2.1.2.3 Hoa cây nắp ấm

2.1.3 Phân loại cây nắp ấm

Loài ấm vùng thấp: N. ampullaria, N. gracilis, N. mirabilis…

Loài ấm vùng cao: N. alta, N.lamii, N.maxima…

2.1.6 Giá trị của cây nắp ấm

2.1.7Nhân giống truyền thống cây nắp ấm

2.2. Nhân giống in vitro

3.1 Thời gian và địa điểm

Hình 3.1 Cành nắp ấm lấy từ vườn ươm

Hình 3.2 Quả và hạt nắp ấm

Chỉ tiêu theo dõi:

Nghiệm thức Môi trường NAA BA Mẫu/ chai Tổng mẫu

Chỉ tiêu theo dõi:

Nghiệm thức Môi trường 2,4-D(mg/l) BA (mg/l) Mẫu/chai Tổng mẫu

Chỉ tiêu theo dõi

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

31 lá sau khi khử trùng.

Mẫu cuốngHình 4.3trùng

CV (%) 9,76 17,07 12,03 9,79 11,04

Nghiệm Tỉ lệ mẫu Kích thước Khối lượng Khối lượng Tỉ lệ khối

H5 80,0a 1,460a ±0,08 0,06bcd ± 0,01 0,05ab ± 0,01 85,87a

H6 37,7cd 0,784c ±0,19 0,10bc ± 0,02 0,03ab ± 0,01 32,92cd

Bảng4.11 Màu sắc và hình dạng mô sẹo

H3 Vàng, vàng chóp đỏ Dạng khối, mọc ở gần gân lá 56

H4 Xanh, vàng, vàng nhạt Nhỏ, mọc quanh rìa lá 50

H5 Xanh, vàng Khối to, mọc quanh rìa lá 50

ANALYSIS OF VARIANCE TABLE

Original Order Ranked Order

Mean 1 = 0.6100 A Mean 4 = 0.8700 A

Mean 2 = 0.7900 A Mean 3 = 0.8100 A

Mean 3 = 0.8100 A Mean 2 = 0.7900 A

Mean 4 = 0.8700 A Mean 1 = 0.6100 A

Bảng 1.4 Số liệu dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm 1

Original Order Ranked Order

Mean 1 = 0.8400 A Mean 1 = 0.8400 A

Mean 2 = 0.7700 A Mean 2 = 0.7700 A

Mean 3 = 0.5300 AB Mean 3 = 0.5300 AB

Mean 4 = 0.3900 B Mean 4 = 0.3900 B

Bảng 1.7 Số liệu dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm 1

Original Order Ranked Order

Mean 2 = 0.8300 A Mean 4 = 0.8300 A

Mean 3 = 0.7500 AB Mean 3 = 0.7500 AB

Mean 4 = 0.8300 A Mean 1 = 0.4200 B