MỘT SỐ THỬ

NGHIỆM VỀ
CHẤT KHÁNG
KHUẨN
Yêu cầu đối với sinh viên:
• Trình bày được các khái niệm MIC
(Minimum Inhibitory Concentration), MBC
(Minimum Bactericidal Concentration).
• So sánh được các kỹ thuật xác định tính
nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh
và các chất kháng khuẩn.
• Thực hiện được các thử nghiệm định tính
và định lượng kháng khuẩn.
 TỔNG QUÁT

Các PP thử tính nhạy cảm của kháng sinh:

Xác định MIC, MBC

Kháng sinh đồ

Thử nghiệm phối hợp kháng sinh

 TỔNG QUÁT

 Các chất kháng khuẩn: chế phẩm kháng sinh,

các chất được ly trích từ tự nhiên hoặc tổng hợp…
tác động trên tế bào vi khuẩn theo cơ chế kìm
khuẩn hoặc diệt khuẩn.
 Phổ kháng khuẩn: là khả năng kìm khuẩn hoặc
diệt khuẩn của kháng sinh trên những vi khuẩn
khác nhau.
 Vi khuẩn có thể phát triển tính đề kháng với
kháng sinh, khi đó cần xác định tính nhạy cảm
thực tế của vi khuẩn gây bệnh đối với KS nhằm
đưa ra chỉ định thích hợp.
 TỔNG QUÁT

• Thử nghiệm khả năng diệt khuẩn:

Từ kết quả MIC cách một nồng độ sẽ tiến hành thử MBC
để tìm nông độ diệt khuẩn.

Tiến hành đếm vi khuẩn cách 2h trong vòng 24 giờ.

Thử nghiệm tìm MIC và MBC của chất kháng khuẩn

 TỔNG QUÁT

Các PP thử nghiệm về tính kháng khuẩn:

• Thử nghiệm tính nhạy cảm: PP khuếch tán và
PP pha loãng (xác định MIC - Minimal Inhibitory
Concentration: là nồng độ tối thiểu ức chế sự
tăng trưởng của vi khuẩn khảo sát bằng mắt
thường
• Thử nghiệm khả năng diệt khuẩn: xác định
MBC (Minimal Bactericidal Concentration)
• Thử nghiệm phối hợp kháng sinh.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN
1. PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN
1.1. MỤC ĐÍCH
 Trong lâm sàng, dùng PP khuếch tán của Kirby-Bauer
xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh
(kháng sinh đồ) chỉ định điều trị thích hợp.

Một số KS phải xác định MIC để xác định đề kháng

hoặc liều dùng

 Trong nghiên cứu, sơ bộ cho biết chất thử nghiệm có

tính kháng khuẩn hay không qua giá trị vòng kháng
khuẩn. Sau đó thử MIC
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN
1.2. NGUYÊN TẮC
 Trên bản thạch trải vi khuẩn với số lượng tiêu chuẩn,
các chất kháng khuẩn khuếch tán từ vị trí đặt đĩa hoặc lỗ
đục vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi
khuẩn tạo thành vòng kháng khuẩn. Đường kính của
vòng này tỷ lệ nghịch với MIC.

 Tiêu chuẩn thực hiện và biện giải kết quả phải dựa
vào các tiêu chuẩn của CLSI hoặc EUCAST

 Thử nghiệm song song với kháng sinh chuẩn để so sánh

kết quả.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN
1.3. VẬT LIỆU
Môi trường
- Mueller - Hinton agar (MHA): MT thử nghiệm kháng sinh
đồ thường quy
- Ngoài ra: Trypticase soy Agar (TSA) hay môi trường
thạch máu, ...
- Lượng MT được tính khi đổ hộp sẽ tạo thành lớp thạch
dày 4 mm.
Vi khuẩn
- Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa vào MT lỏng MHB hay
TSB.
- Pha loãng với MT lỏng đạt độ đục bằng 0,5 của thang
McFarland (tương đương 1-3.108 vi khuẩn / ml).
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

Chất kháng khuẩn

- Kháng sinh: kháng sinh được tẩm vào giấy lọc hoặc
nhỏ vào lỗ đã được đục trong bản thạch.

- Kích thước khoanh giấy, lượng kháng sinh trong mỗi

đĩa phải đúng tiêu chuẩn.

- Chất kháng khuẩn: hòa tan hoặc phân tán với dung
môi thích hợp. Các dung môi sử dụng ở nồng độ không
có tính kháng khuẩn và pH trung tính.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

1.5 . THỰC HIỆN

1. Nấu chảy MT, đổ hộp. Để đông.
2. Trải vi khuẩn: đều trên thành hộp thạch.
3. Ấp khô mặt thạch ở 37oC không quá 15 phút.
4. Đặt kháng sinh: dùng kẹp tiệt khuẩn cặp khoanh
giấy rồi đặt lên mặt thạch sao, các đĩa cách nhau tối
thiểu 2,5 cm và cách thành hộp 2 cm.
Không xê dịch đĩa sau khi đã đặt. Chỉ được phép
đặt đĩa khi mặt thạch đã khô.
5. Ủ 37oC trong 24 giờ.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

1.6. ĐỌC KẾT QUẢ

Dùng thước có độ chia đến milimet đo đường kính vùng
ức chế.
Tra bảng biện giải theo KS, vi khuẩn và hoạt lực đĩa
tương ứng để suy ra độ nhạy cảm.
Các lưu ý:
 Các đĩa KS cần bảo đảm họat lực với các VK chuẩn:
S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922...
 Với các VK khó mọc như Haemophilus sp,
N.gonorrhoeae... cần có MT và bảng tiêu chuẩn biện
giải riêng biệt.
 Các KS lựa chọn làm kháng sinh đồ sẽ tùy thuộc vào
tác nhân gây bệnh.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

Ñöôø ng kính
Đường kính
vòng
vuø ức
ng öù chế
c cheá

Kết qủa kháng sinh đồ

 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

Phương pháp Etests (Epsilometer test)

 Nguyên tắc tương tự như PP khuếch tán nhưng sử dụng
các dải dài thay cho các khoang giấy tẩm kháng sinh.
 Các dải được tẩm một gradient giảm dần nồng độ kháng
sinh dọc theo chiều dài.
 Khi đưa vào đĩa thạch đã trải một loại vi khuẩn, vi khuẩn
sẽ phát triển nơi nồng độ kháng sinh thấp nhưng không
phát triển ở đầu nồng độ kháng sinh cao.
 Vết có mảng vi khuẩn đầu tiên chạm vào dải dài được sử
dụng để tính MIC, có thang đánh số nồng độ ngay trên
dải để hỗ trợ xác định MIC.
 PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

Cách đọc kết quả trên E-test

 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG
PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG
2.1. MỤC ĐÍCH
Xác định giá trị MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là
nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan
sát được bằng mắt thường.
2.2. NGUYÊN TẮC
 Xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi
trường rắn hoặc lỏng.
 Kháng sinh được pha loãng ½ liên tục trong môi trường,
sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định.
 Sau thời gian ủ, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự
tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường.
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG

2.3. VẬT LIỆU

Môi trườnG: MHA hoặc MHB
Vi khuẩn
 Mật độ VK đạt sau khi hoạt hoá 108 vi khuẩn / ml. Pha
loãng 10 lần trước khi dùng.
 Lượng vi khuẩn cấy vào: 104 (1µl) với PP pha loãng
trong MT rắn hoặc 3 - 7.105/ml với PP pha loãng trong
MT lỏng.
Kháng sinh
 Cân chính xác và pha dung dịch KS mẹ có nồng độ
gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy.
 Pha KS trong dung dịch đệm thích hợp
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG
2.4. THỰC HIỆN
2.4.1. Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng
1. DD KS mẹ có nồng độ 160 µg/ml
2. Hút 1ml DD KS mẹ pha vào ống 9ml môi trường lỏng.
3. Pha loãng 1/2 liên tục thành dãy các ống MT chứa KS
có nồng độ giảm dần.
4. Cấy vi khuẩn: cấy 0,3 ml huyền trọc VK có mật độ 107
CFU/ml vào các ống để đạt khoảng 3 - 7.105 CFU/ml.
5. Ủ các ống ở 37oC / 24 giờ
5ml 5ml 5ml 5ml
1 2 3 4 5 6

9ml 5ml

CÁCHCaù
ch pha daõ
PHA DÃYyNỒNG
noàng ñoäkhaù
ng sinh
ĐỘ KHÁNG SINH
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG

VÍ DỤ: THực hiện pha dãy nồng độ kháng sinh theo bảng sau

Ống số 1 2 3 4 5 6
Lượng kháng sinh (dung dịch 1 Chứng
mẹ) cho vào (ml)
Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5
Nồng độ kháng sinh (µg/m 16 8 4 2 1 0
môi trườngl)
Lượng vi khuẩn (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Sự tăng trưởng của vi khuẩn - - - + + +
sau 24 giờ
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG
Đọc kết quả
- Lắc các ống trước khi đọc.
- Quan sát, tìm ống có nồng độ KS thấp nhất ức chế tăng trưởng
của vi khuẩn, nghĩa là ống vẫn trong. Đây là ống có MIC.

Các
Caùcống ứcsöï
oáng coù chế VK tăng
öùc cheá trưởng
taêng tröôû
ng

1 2 3 4 5 6 Đọc
Ñoïckết
keátquả MIC
quûa MIC

Ông
ngdhdgfuhsudbjvbjs
OÁ coùnoàng ñoäMIC Ống
Chöùnchứng
g
Ống có MIC là ống số (3) và MIC tương ứng là 4 µg/ml môi trường.
Ống (1) và (2) cũng có sự ức chế tăng trưởng nhưng không phải ở nồng độ thấp nhất.
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG

2.4.2. Pha loãng trong môi trường rắn

1. KS hoặc chất KK pha loãng trong MT thạch ở 45-50oC.

2. Pha loãng các ống thạch với độ pha loãng ½.

3. Đổ ngay các ống pha loãng vào hộp petri, để đông.

4. Cấy 1µl VK trên bề mặt thạch. Cấy 4 VK trong 1 hộp.

5. Ủ các hộp thạch ở 37oC/24 giờ

 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG

Veá
Vếtt cấy
caáyvivikhuẩn
khuaån1 1 VK có
Coùsöïtăng
taêngtrưởng
tröôûng

Vi khuaån22
Vi khuẩn

Vi khuẩn
khuaån33
ViVikhuẩn
khuaån Vi
44
VK n
Khoâkhông tăng
g coùsöï taêntrưởng
g tröôûng
Xác định MIC
Xaùc ñò bằngbaè
nh MIC phương pháp
ng PP pha pha
loaõ loãng
ng trong trong
moâ nmôi
i tröôø trường
g raé
n rắn

Đọc kết quả

Quan sát sự tăng trưởng của vi khuẩn ở các vùng đã chấm vi
khuẩn. Xác định vùng có nồng độ thấp nhất vi khuẩn không mọc
 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG
Lưu ý
 Xác định MIC là thử nghiệm có tính chất định lượng nên
việc cân đong cần chính xác.
 VK sử dụng phải tinh khiết trước khi hoạt hóa.
 Môi trường, hay dung môi pha chất KK không có chất ảnh
hưởng đến tác động của KS.
 Thao tác nhanh và tránh nhiễm trùng từ bên ngoài.
 Kết quả chỉ có giá trị khi trên mẫu chứng có sự tăng trưởng
bình thường của VK.
 Tiến hành song song xác định MIC của KS chuẩn trên VK
chuẩn để chuẩn hóa kỹ thuật
 PHỐI HỢP KHÁNG SINH

3. THỬ NGHIỆM PHỐI HỢP KHÁNG SINH

3.1. MỤC ĐÍCH
Phối hợp kháng sinh nhằm
 Tăng hiệu quả diệt khuẩn.
 Mở rộng hoạt phổ: phối hợp KS để mở rộng hoạt phổ
nhằm đảm bảo kháng sinh diệt hầu hết vi khuẩn.
 Ngăn ngừa vi khuẩn phát triển sự đề kháng.
 PHỐI HỢP KHÁNG SINH

3.2. Kết quả của sự phối hợp

 Hiệp lực: phối hợp có tác động kháng khuẩn mạnh hơn
khi dùng riêng rẽ trên 1 loại vi khuẩn. Đây là phối hợp
có lợi.

 Riêng rẽ: phối hợp có tác động như các KS dùng riêng
rẽ, để mở rộng hoạt phổ.

 Đối kháng: tác động của phối hợp thấp hơn khi dùng
riêng. Tránh trường hợp này.
 PHỐI HỢP KHÁNG SINH

3.3. Phương pháp khuếch tán trong môi trường rắn

 Thực hiện như kháng sinh đồ nhưng các KS được đặt

sao cho các vùng ức chế chồng lên nhau.

 Hiệp lực: VK sẽ bị ức chế mạnh nhất ở vùng tiếp giáp.

 Đối kháng: VK phát triển mạnh hơn ở vùng tiếp giáp.

 Tác động riêng rẽ: tại vùng tiếp giáp VK phát triển như
các vùng khác
 PHỐI HỢP KHÁNG SINH

KẾT QUẢ PHỐI HỢP KHÁNG SINH

 XÁC ĐỊNH ESBL
4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG TIẾT enzym -lactamase
PHỔ RỘNG (ESBL) Ở VI KHUẨN
Enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL)
 ESBL có nguồn gốc từ sự đột biến của các gen mã hóa
-lactamase nguyên thủy như: TEM., SHV, CTX-M… Vi
khuẩn sinh ESBL sẽ kháng rất nhiều kháng sinh đặc biệt
là nhóm cephalosporin.
 Gen mã hóa ESBL nằm trên plasmid.
 Plasmid mang gen ESBL thường có một số các gen
kháng kháng sinh khác, tạo nên hiện tượng đồng kháng
rất nguy hiểm.
4.1. MỤC ĐÍCH
Phát hiện các chủng VK gây bệnh có khả năng sinh ESBL
nhằm đưa ra phác đồ điều trị hợp lý.
 XÁC ĐỊNH ESBL
4.2. PHƯƠNG PHÁP

4.2.1. Phương pháp đĩa đôi:

 Clavulanic acid ức chế ESBL làm giảm mức độ đề kháng
của cephalosporins và mở rộng vòng ức chế của đĩa
kháng sinh cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh
chứa clavulanic acid.
 Trải VK trên đĩa MHA, đặt đĩa cephalosporin (30µg) với
đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm.
Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa
cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate.
 Ưu điểm là dễ thực hiện, khuyết điểm có thể bỏ sót một số
chủng sinh ESBL.
 XÁC ĐỊNH ESBL
4.2.2. Phương pháp đĩa kết hợp

 Sử dụng hai loại đĩa KS là cephalosporins thế hệ 3 và

cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với
clavulanic acid. Hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của
đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa
cephalosporins ≥5mm thì VK sinh ESBL.

 Sử dụng các loại đĩa: cefotaxime (30µg)/ cefotaxime –

clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime
– clavulanic acid (30/10µg); cefpodoxime (10 µg)/
cefpodoxime (10/10 µg).4.2.2.
 XÁC ĐỊNH ESBL

Phương pháp đĩa kết hợp

 Thực hiện đồng thời cả hai hệ thống là: cefotaxime

(30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg);
ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid
(30/10µg).

 Các kĩ thuật xác định ESBLs bằng sinh học phân tử

đang được ứng dụng rộng rãi.
 XÁC ĐỊNH ESBL

Đọc kết quả:

- Đo đường kính vòng vô khuẩn và dựa theo tiêu chuẩn
CLSI để xác định vi khuẩn sinh ESBL.
- Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn
của đĩa cephalosporins có phối hợp với clavuclanic acid
so đĩa cephalosporins ≥ 5 mm.

Kết quả thử nghiệm chủng vi khuẩn sinh ESBL