Sắc Ký Lớp Mỏng

(Thin Layer Chromatography)

PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)

Mục tiêu: Trình bày

 Cơ chế chính trong SKLM
 Pha tĩnh và pha động trong SKLM
 Trang thiết bị dùng trong SKLM
 Các bước tiến hành trong SKLM
 Ứng dụng của SKLM trong ngành Dược

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)

Dàn bài
 Giới thiệu - Định nghĩa
 Các cơ chế tách trong SKLM
 Pha tĩnh
 Pha động
 Trang thiết bị
 Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM
 Phát hiện các vết trên bản mỏng
 Vài thông số đặc trưng của SKLM
 Ứng dụng của SKLM
 Đánh giá SKLM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Giới thiệu – Định nghĩa

 1938: Izmailov & Schraiber dùng bột oxyd nhôm để phân tích
dịch chiết alcaloid thực vật
 Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn
 Pha tĩnh: trương nở theo cả chiều dọc và chiều ngang
 Định nghĩa: SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp
phụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay
kim loại. Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là
dung môi di chuyển qua pha tĩnh. Do đó SKLM thuộc sắc ký
lỏng - rắn
 SKLM có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách
bằng sắc ký lỏng trên cột

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh

 Silicagel (Kieselgel – gel của acid silicic)

 Sử dụng rộng rải nhất

 Kích thước hạt 10 – 60 m, diện tích bề mặt 200 – 400 m2/g

 Hoạt tính hấp phụ do –OH trên bề mặt quyết định

 Hàm ẩm tăng sẽ làm giảm hoạt độ

 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng

HO OH HO OH HO OH
Si Si Si

O O

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh

 Nhôm oxyd
 Oxyd nhôm trung tính, acid, base
 Hoạt tính tùy thuộc lượng nước
 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng
 Theo Brockman: 5 bậc oxyd nhôm

Bậc hoạt tính I II III IV V

% nước 0 3 6 10 15

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh

 Xác định bậc hoạt tính của nhôm oxyd: dựa vào Rf của màu chuẩn

Bậc hoạt tính của oxyd nhôm theo Brockman

Chất màu II III IV V
Giá trị Rf
Aminoazobenzen 0,59 0,74 0,85 0,95
Sudan đỏ 0,00 0,10 0,33 0,56
Sudan vàng 0,01 0,25 0,57 0,78

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh

 Kieselguhr
 Bột nhẹ, vàng xám chứa 70 – 95% SiO2
 Chất hấp phụ yếu
 Tách các chất phân cực: cetoacid, lacton,…
 Chất mang pha tĩnh trong sắc ký phân bố
 Kieselguhr – silicagel hay kieselguhr – thạch cao (1:1)
 Thạch cao
 Cellulose: không cần chất kết dính, tách các chất thân nước
 Polyamid: tách các phenol
 Nhựa trao đổi ion: silicagel sulfon hóa

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh

 Chất hấp phụ đã được tiêu chuẩn hóa

 Chất hấp phụ có chất kết dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr G,
oxyd nhôm G trộn sẳn 5% thạch cao
 Chất hấp phụ không kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H
 Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thị huỳnh quang: silicagel GF254,
silicagel HF254,…
 Bản sắc ký tráng sẳn với giá đở: thủy tinh, giấy nhôm, polymer
 Ưu điểm bản mỏng tráng sẳn
 Độ ổn định cơ học cao, thao tác đơn giản và dễ dàng hơn
 Tính đồng nhất cao: thích hợp để bán định lượng, định lượng
 Hiệu lực tách cao hơn bản mỏng tráng thủ công

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha tĩnh
Tính chất Ứng dụng phân tích
Pha tĩnh Độ acid Hoạt tính Tác dụng phân chia
Silicagel Acid Có hoạt tính Hấp phụ Hầu hết tất cả
Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực
Oxyd nhôm Base Có hoạt tính Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực
phẩm, lipid
Kieselguhr Trung tính Không có hoạt tính Phân bố Đường, các triglycerid, các acid béo bậc
cao
Magnesi diphosphate Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol
Magnesi trisilicat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol
Calci hydroxyd Base Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol
Calci phosphate Base yếu Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol
Calci sulfat Hoạt tính yếu Hấp phụ Carotinoic, tocopherol, các acid béo
glycerid kỵ nước
Silicagel + oxyd nhôm (1:1) Acid + base Có hoạt tính Hấp phụ Các chất màu, các acid barbituric
Sắt hydroxyd Có hoạt tính Hấp phụ Các chất phân cực
Than Có hoạt tính Hấp phụ Các chất không phân cực
Cellulose Thực tế trung Không có hoạt tính Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid
tính
Polyamid Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi ?) Các flavon
Polyacrylonitril Trung tính Không có hoạt tính (Trao đổi, phân bố ?) Các antoxyan
Nhựa trao đổi ion Acid + base Không có hoạt tính Trao đổi Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenic
Gel sephadex Rây phân tử Polymer, protein, phức kim loại

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha động

 Thay đổi tùy theo cơ chế tách

 Tăng cường sức rửa giải: thường kết hợp 2 dung môi
 Không có qui tắc cụ thể để lựa chọn dung môi
 Sắc ký sơ bộ để thăm dò hệ dung môi
 Nên chọn hệ dung môi đơn giản và dùng loại tinh khiết
 Hướng dẫn lựa chọn pha tĩnh và pha động:
 Tính chất của mẫu phân tích: độ hòa tan, độ phân cực, số lượng và đặc tính các
nhóm chức
 Cơ chế sắc ký của pha tĩnh
 Dung môi: độ bay hơi, độ nhớt, độ tinh khiết, sự phân lớp
 Chất phân tích ion hay phân cực: dung môi phân cực như butanol – nước, thêm
acid acetic hoặc amoniac
 Pha tĩnh silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác: độ phân cực pha động
quyết định tốc độ di chuyển và Rf
 Điều chỉnh sức rửa giải của pha động để Rf: 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Pha động

 Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ tăng dần

CH=CH < OCH3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH2 < OH < COOH
 Dung môi với sức rửa giải (sức dung môi) tăng dần
Dung môi 0 Dung môi 0 Dung môi 0
Ether dầu hỏa 0,01 Ether etylic 0,38 Acetonitril 0,65
Hexan 0,01 Cloroform 0,40 Pyridin 0,71
Heptan 0,01 Methylen clorid 0,42 Dimethyl sulfoxid 0,76
Cyclohexan 0,04 Dicloroetan 0,49 Isopropanol 0,82
Carbon tetraclorid 0,18 Aceton 0,56 Ethanol 0,88
Ether isopropylic 0,28 Dioxan 0,56 Methanol 0,95
Toluen 0,29 Butanol 0,56 Nước 1,00
Benzen 0,32 Ethyl acetat 0,58

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Trang thiết bị - Bản mỏng

 Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ được trộn thêm
5 – 15% chất kết dính (thạch cao, tinh bột, dextrin)
 Bản mỏng không dính chắc

5 x 20 10 x 20 20 x 20 (cm)

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Trang thiết bị – Bình sắc ký
 Bình đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Các loại bình sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Các bước tiến hành SKLM

 Chuẩn bị bản mỏng, bình sắc ký thích hợp, pha động

F
 Chấm dung dịch lên bản mỏng: 1-10 g
X
 Khai triển sắc ký
A
 Phát hiện các vết trên bản mỏng
 Màu sắc tự nhiên của vết
 Soi dưới đèn UV 254 hoặc 365 nm: thêm chất phát O x x x

huỳnh quang không tan vào pha tĩnh

 Phun thuốc thử hiện màu
 Dùng máy đo mật độ quang (densitometer): đo
Mẫu
cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi
dưới đèn UV. Chất phân tích hấp thụ bức xạ được ghi
lại thành pic sắc ký

Triển khai sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
 Các bước tiến hành SKLM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thuốc thử hiện màu

Thuốc thử Màu của vết Ứng dụng phân tích

Thuốc thử chung
Acid phosphomolypdic Xanh tối Nhiều chất hữu cơ
Acid sulfuric đặc Nâu – đen Tất cả các chất hữu cơ
Hơi iod Nâu Nhiều chất hữu cơ
Thuốc thử chọn lọc
Ninhydrin Hồng – tím Acid amin, các nhóm chức amin
2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ Các hợp chất carbonyl
Xanh hoặc lục bromocresol Vàng Các acid hữu cơ
2,7 fluorescein Vàng – lục Nhiều chất hữu cơ
Vanilin/acid sulfuric Xanh – lục – hồng Alcol, ceton
Rhodamin B Huỳnh quang đỏ Các lipid
Anisaldehyd/SbCl3 Nhiều màu Các steroid
Diphenylamin/Zn2+ Nhiều màu Các chất bảo vệ thực vật

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

dR v Đường
Rf   ===> 0  Rf  1
d M V0 dung
môi
 Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm
tại điểm xuất phát
dM
 Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của
dung môi
 dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách dR
 dM: khoảng di chuyển được của dung môi
 v: vận tốc di chuyển của chất cần tách x x
1 2
 V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

Các yếu tố ảnh hường đến Rf

 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường sắc ký,
lượng chất chấm
 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng
 Thành phần và độ tinh khiết của pha động
 Phương pháp khai triển sắc ký
 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký (hiện
tượng “bờ”)
Hiện tượng “bờ”
 Anh hưởng của các cấu tử khác có trong thành
phần hỗn hợp cần tách
 Độ ẩm, nhiệt độ và pH...

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

Sử dụng chất đối chiếu

F
OX
R f ( X ) OF OX X
Rs ( X )   
R f ( A) OA OA A

OF
 Hai chất giống nhau lần lượt phải có Rf và O x x x
Rs bằng nhau
 Hai chất phải có cùng lượng chấm như Sắc ký đồ sắc
nhau và được triển khai trong cùng điều ký đối chứng
kiện sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Thông số đặc trưng của SKLM

dM  dR 1 R f
Hệ số dung lượng k '   Đường
dR Rf
dung
2 môi
 dR 
Số đĩa lý thuyết biểu kiến N  16 
W  WB
dB
dM
2[d B  d A ] dA
Độ phân giải Rs 
WA  WB dR W
WA

x x
1 2

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Các kỹ thuật khai triển SKLM
 Sắc ký một chiều
 Sắc ký hai chiều
 Mẫu phân tích nhiều chất
 Sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy

Kỹ thuật sắc ký hai chiều

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

 Các kỹ thuật khai triển SKLM
Dung môi B
Dung môi A
Sắc ký đồ SKLM hai chiều của một vài acid amin
Dung môi A: toluen/2-cloroethanol/pyridin.
Dung môi B: Cloroform/benzyl alcol/acid acetic.
1. acid aspartic, 2. acid glutamic, 3. serin, 4. -
alanin, 5. glycin, 6. alanin, 7. methionin, 8. valin, 9.
isoleucin, 10. cystein.
Nguyễn Đức Tuấn
Đường dung môi Đường chấm mẫu
Sắc ký đồ các dẫn chất xanthin trên bản
mỏng pha đảo C-18
Pha động: methanol - K2HPO4 0,1 M (55:45
tt/tt). Phát hiện: hơi iod. Thời gian khai triển:
1 giờ. Các giá trị Rf: theobromin 0,68;
theophylin 0,56; cafein: 0,44; 3-isobutyl-
methyl xanthin 0,21.
Đại học Y Dược TPHCM
 Ứng dụng của SKLM
Định tính và thử tinh khiết
 Dựa vào Rf
 Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ
 Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau
 Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ
Bán định lượng – định lượng
 Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm sạch
dịch chiết, định lượng bằng kỹ thuật thích hợp: ít dùng, tốn thời gian
 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc
ký
 Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc
ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang
 Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao: quét bản mỏng với
hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh
bằng máy tính
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
 Đánh giá SKLM - Ưu điểm
 Phương pháp đơn giản: thử tinh khiết, xác định giới hạn tạp chất, phát hiện các chất
lạ, định tính, bán định lượng và định lượng
 Sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc
 Kỹ thuật và thiết bị đơn giản
 Sử dụng linh hoạt: dễ thay đổi chất hấp phụ, dung môi khai triển cũng như thuốc thử
phát hiện, kể cả các loại thuốc thử ăn mòn mà sắc ký giấy không dùng được
 Thời gian tiến hành nhanh (15 - 30 phút, tối đa vài giờ) và độ nhạy cao hơn sắc ký
giấy
 Là một phương pháp vi phân tích
 Có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký lỏng trên cột
 Phạm vi ứng dụng rộng rãi: kiểm tra hiệu quả chiết tách của các phương pháp khác
như sắc ký cột, chiết xuất, chưng cất, tái kết tinh,…
 Phát hiện tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động
 Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
 Đánh giá SKLM - Nhược điểm
 Trị số Rf có độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi
trong quá trình khai triển sắc ký
 Tăng giãn rộng vết do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động
thấp

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM