Microbiologie

Curs 6
Plasmide
 Plasmide

Impachetarea moleculei de ADN prin pliere si

supraspiralizare (tensiune de torsiune la capetele
domeniului)
 Plasmide
Materialul genetic bacterian prezinta:
❑ Nucleoidul (corespunde cromosomului)
❑ Este circular
❑ 1, 2 cromosomi
❑Plasmide
❑ ADN dublucatenar
❑ Circular (rar liniar la Streptomyces, Rhodococcus)
• Forma circulara inchisa (CCC=Covalently Closed Circular)
cu aspectul de suprahelice, rezistent la nucleaze
• Forma circulara deschisa
• Plasmide concatenate – complex format din cateva
plasmide unite
 Plasmide
❑ Replicare independenta de cromosomul bacterian
❑ Replicare controlata de gene cromosomale
❑ Elimina din celula plasmidele inrudite (principiul
incompatibilitatii)
In functie de capacitatea de transfer a materialului
genetic:
- Plasmide conjugative (“factori fertilitate”) transfera
materialul genetic de la donator (celula “mascul”) catre
celula acceptor (celula “femela”)
Ex. plasmide F, F', Hfr
 Plasmide
In functie de capacitatea de transfer a materialului
genetic:
- Plasmide neconjugative (nu sunt autotransmisibile si
necesita pentru transfer fagi sau alte plasmide
conjugative), unele Col si R
In functie de capacitatea de integrare in cromosomi:
- Plasmide episomale
- Plasmide neintegrative
 Plasmide
Functii:
❑ Rezistenta la antibiotice

❑ Rezistenta la metale grele

❑ Rezistenta la alti compusi si radiatii UV
❑ Metabolismul unor glucide sau proteine
❑ Producerea unor toxine (enterotoxina la E. coli, neurotoxina
la Clostridium tetani)
❑ Inducerea tumorilor la plante
❑ Sinteza bacteriocinelor (colicine la E. coli, pesticine la
Yersinia pestis) inhiba sau distrug specii sau tulpini
asemanatoare
 Plasmide
Eliminarea plasmidelor (“vindecarea”)
- cu substante care inhiba replicarea
- nu distruge celula
- importanta pentru eliminarea plasmidelor care confera
rezistenta la antibiotice
- quinolonele sunt eficace pentru eliminarea plasmidelor dar
nu exista substante pentru eliminarea tuturor plasmidelor
- cloramfenicolul (inhibitor al sintezei proteice) inhiba initierea
replicarii ADN cromosomal dar nu a ADN plasmidial
ducand la cresterea numarului de plasmide/celula
 Mecanisme de transfer
al materialului genetic la
bacterii
• Transformarea
• Transfer de material genetic de la o celula donor la o celula acceptor
• Conditionata de “starea de competenta”
• Celulele E. coli nu sunt competente, insa in anumite conditii de mediu pot
prelua ADN exogen
• Transductia
• Transfer de gene
• Mediata de fagi
• Conjugarea
• Transfer de cromosomi, plasmide de la o celula donor la o celula acceptor
• Mediat de pili
• Transpozitia
• Integrarea in genom a componentelor transpozabile (fragmente scurte de
insertie – nu codifica proteine, modifica expresia genica sau transpozoni –
codifica 1 sau mai multe proteine)
 Transformarea genetica
• Transferul materialului genetic eliberat prin
plasmoliza, extractie enzimatica sau chimica
• Are loc inter- si intraspecific si chiar la genuri
diferite
• Transformarea propiu-zisa este un eveniment mai
rar in care ADN-ul exogen se integreaza in
genomul celulei receptoare
• Introduce diversitatea genetica in populatie
• Descoperit de Frederick Griffith (1928) la
Streptococcus pneumoniae (diplococ capsulat –
virulent - colonii de tip S si necapsulat – nevirulent
- colonii de tip R); Celule de tip R transformate in
celule de tip S
 Transformarea genetica

• Inocularea intraperitoneala la soareci a unei

suspensii celulare cu tulpini de tip S duce la
moartea animalului de laborator
• Din sange s-au izolat celule care pe mediu
solidificat au format colonii de tip S (celule
capsulare)
 Transformarea genetica

• Verificarea ipotezei:
• A inoculat un numar mic de celule vii dintr-o tulpina
de tip R, avirulente cu un numar mare de celule
dintr-o tulpina de tip S, distruse prin caldura
• Ce a constatat?
Transformarea genetica
Mecanismul transformarii la
bacteriile Gram pozitive
 Conjugarea bacteriana
• Transferul materialului genetic de la o celula
donoare la una receptoare prin intermediul unei
legaturi celulare directe (canal de conjugare)
• Procesul depinde de existenta in celula donoare
a unei plasmide numita conjugon (plasmide
conjugative sau plasmide de sex care sunt
factorii F). Aceasta codifica structurile necesare
realizarii contactului celular si pregateste
transferul in celula receptoare (plasmida
mobilizabila)
• Descoperit de Lederberg si Tatum (1944)
 Conjugarea bacteriana
• Este conditionata de prezenta plasmidei F in
celula donor care contine secventa ori T la care
se initiaza originea transferului, gene necesare
pentru asamblarea pilului functional, gene
pentru sinteza pilinei, gene pentru sinteza
moleculelor de recunoastere intre celula
donoare si cea receptoare, replicarea plasmidei

In functie de prezenta plasmidei F si de raportul cromosomului cu plasmida

F exista 4 tipuri de cellule:
• Celule F- fara plasmide F
• Celule F+ cu plasmida F autonoma (celula mascul)
• Celule Hfr (high frequency of recombination) cu plasmida F integrata in
cromosomul bacterian
• Celule F’ contin plasmide F modificate prin procesul de recombinare cu
cromosomul. Factorul F are proprietati episomale si dupa excizie se
desprinde cu un mic fragment de ADN din cromosom. In conjugare se
comporta ca si cellule F+
• Etape:
• Initierea este conditionata de prezenta pililor (sinteza este codificata de
plasmidele conjugoni) care sunt recunoscuti de fagi filamentosi si fagii ARN
“masculi” (deoarece infecteaza numai celulele donor mascul) (se leaga de
proteinele receptor de la suprafata pililor)
• Dupa amestecul populatiilor de celule conjugante se stabilesc contacte
intamplatoare intre cellule
• Se formeaza cupluri specifice instabile care prin agitare usoara se disperseaza
• Pilii prin intermediul extremitatii libere se leaga la o zona din celula receptoare F-

• Dupa cateva secunde se formeaza cupluri stabile rezistente la dispersie. Are loc
transferul de material genetic prin formarea canalului de conjugare
• La bacteriile Gram negative conjugarea este mediata de un complex
macromolecular numit sistem de secretie de tip IV (T4SS) implicat in transferul
materialului genetic si in sinteza pililor
• Celulele donoare prezinta pili
Transferul plasmidei prin conjugare
Transferul plasmidei prin conjugare
 Conjugarea bacteriana
• Tulpinile auxotrofe de bacterii (nu pot sintetiza substantele
necesare - esentiale) si de aceea necesita in mediu factorii
de crestere (vitamine, aa)
• Tulpinile prototrofe sintetizeaza compusii esentiali astfel
incat cresc pe medii sarace in nutrienti formand astfel colonii

• Au mentinut 2 tulpini (A-, B-, C-, D+, E+, F+; A+, B+, C+, D-, E-,
F-) in mediu lichid apoi le-au insamantat pe mediu solid
minimal. Dupa 24h s-au obtinut tulpini prototrofe
• Initial au crezut ca apar mutatii insa frecventa acestora este
foarte mica. De aceea au utilizat un tub in forma de U cu
brate separate de o membrana filtranta
Aplicatii
 • Vectori ne-integrativi
Soman SS, Vijayavenkataraman S, 2020, Applications of 3D Bioprinted Induced Pluripotent Stem Cells in Healthcare, Int J Bioprint, 6(4): 280.

• Vector din virusul Sendai (SeV, continue ARN ce nu se

integreaza in genom) si episomii (ADN dublucatenar

circular)

• Sistem de reprogramare pe baza Epstein-Barr Nuclear

Antigen-1 (oriP/EBNA-1) ce contine: cluster Oct4,

Sox2, Klf4, L-myc, Lin28, shRNA-p53, miR302/367 si

GFP (https://www.systembio.com/wp-content/uploads/Episomal-iPSC-kit-prod-

sheet.pdf)
Citoscheletul la
Procariote
 Citoscheletul
Proteina MreB
- Similara actinei (eucariote)
- Gena MreB identificata la bacilli, lipseste din cromosomul
cocilor, identificata si la Archaea
- Asigura forma celulei, realizeaza segregarea cromosomilor
impreuna cu alte proteine (Proteinele Par sunt similare
aparatului mitotic de la eucariote, se fixeaza la Originea
replicarii si dupa replicare imping cromosomii spre cei 2
poli ai celulei; Proteina FtsZ - similara tubulinei de la EK,
identificata si la Archaea, se dispune sub forma de inel in
celula bacteriana iar la coci reprezinta un element cheie la
care incepe sinteza peretelui celular.
- Se organizeaza in benzi spiralate dispuse sub membrana
plasmatica si formeaza “puncte de contact” cu aceasta
- Sinteza noului perete celular se realizeaza in aceste zone
 Citoscheletul
Proteinele MreB si FtsZ la Bacillus subtilis (puncte de
contact cu membrana plasmatica – zone
luminoase)

Sinteza peretelui celular la bacteriile Gram positive. Benzile de crestere la Streptococcus

hemolyticus
 Citoscheletul
Crescentin
- Similara keratinei (filament intermediar la eucariote)
- Formeaza filamente (diametru de 10 nm) dispuse pe fata
concava
- Intalnita la Caulobacter crescentus si Helicobacter sp.
- Caulobacter crescentus dezvolta un peduncul pentru
aderarea la substrat
- Determina forma celulei

Proteina Crescentin (roz) la

Caulobacter crescentus. Nucleoidul
marcat cu DAPI
CITOSCHELETUL LA EUCARIOTE

➢ microtubuli (verde),
➢ filamente de actina (rosu),
➢ nucleul (albastru)

➢ Citoscheletul reprezinta o retea de filamente

(proteine) intracitoplasmatice ce asigura
stabilitatea si forma celulei, participa la
deplasarea pe substrat, diviziune celulara,
polarizare functionala a celulei, ancorarea
organitelor celulare, transport intracelular de
vezicule mediat de alte proteine.
➢ 1. Filamentele intermediare – suport mecanic
➢ 2. Microtubulii – transportul intracelular de
organite citoplasmatice
➢ 3. Filamente de actina – determina forma celulei
si intervin in locomotie.
➢ 4. Proteinele accesorii intervin in atasarea
filamentelor de componentele citoplasmatice
Alberts et al., 2008
CITOSCHELETUL LA EUCARIOTE
ACTINA

➢ Prezinta polaritate (capat plus si minus;

capacitatea de a se autoasambla la (+) si
dezasambla la (-)

➢ Monomeri de actina G se organizeaza in

filamente de tip F (dublu helix)
➢ Prezenta in structuri de tip pseudopode,
lamelipodii/filopodii unde se asociaza cu
miozina (tip V sau VI)
➢ Se asociaza cu fimbrina in microvilli
➢ Intervine in citokineza prin asocciere cu
miozina de tip II
➢ Formeaza fibrele de stress cu rol in
stabilirea jonctiunilor focale
Protofilamente

PDB-101: Molecule of the Month: Actin (rcsb.org)

 CITOSCHELETUL LA EUCARIOTE
ACTINA
CITOSCHELETUL
➢ Filamente de actina ACTINA
➢ structuri flexibile,
➢ diametru de 5-9 nm
➢ sunt organizate in aglomerari liniare
➢ retele bi si tri-dimensionale
➢ dispuse in intreaga citoplasma insa preponderent
se intalnesc in cortex, sub membrana
citoplasmatica

➢ Blocanti: inhibitori ai polimerizarii -

Citocatalazinele B, C si D (micotoxine) inhiba
diviziunea celulara, fragmentarea ADN; inhibitori
ai depolimerizarii - Faloidina, un alcaloid extrem
de toxic, sintetizat de Amanita phalloides sp.

➢ Microscopia de fluorescenta (faloidina-

fluorocrom, anticorpi-fluorocrom) Filamentele de actina (verde) si nucleul (albastru) in osteoblaste
fetale umane cultivate in mediu cu pH 7.4 evidentiate la
microscopul confocal (Facultatea de Inginerie Medicala)
CITOSCHELETUL LA EK - MICROTUBULII
Proteina ce destabilizeaza
CITOSCHELETULmicrotubulii sau inhiba
- MICROTUBULII
asamblarea

Stathmin

➢ Microtubulii
➢ polimeri formati din dimeri de α si β tubulina
➢ se autoasambleaza in structuri cilindrice formate din
13 protofilamente
➢ intervin in diviziunea celulara
➢ sunt mai rigide decat filamentele de actina si au un
diametru de 25 nm
➢ se conecteaza cu alte structuri celulare prin
GTP
intermediul unor protein asociate
➢ Blocanti
β tubulina ➢ colchicine and vinblastine – blocheaza asamblarea
➢ Medicamentul antineoplazic paclitaxel (Taxol) –
promoveaza asamblarea si blocheaza irevesibil
depolimerizarea

PDB-101: Molecule of the Month: Microtubules (rcsb.org)

 CITOSCHELETUL LA EK
FILAMENTELE INTERMEDIARE

➢ Filamentele intermediare – sunt proteine filamentoase (diametru de apr. 10 nm). Pot forma
lamina nucleara, o retea fibroasa localizata sub membrana interna a anvelopei nucleare
(membrana dubla ce inconjoara nucleul) sau pot contribui la asigurarea stabilitatii mecanice. La
nivelul epiteliului, trec de la o celula la alta prin intermediul jonctiunilor intercelulare.
➢ structuri proteice stabile cu diametru intermediar între filamentele de actina şi miozina
➢ nu prezinta polaritate
➢ pot reprezenta markeri moleculari pentru identificarea celulelor specifice
➢ rezistente la intindere, confera integritate structurala
➢ se gasesc in jonctiunile celula-matrice in joncţiunile de atasare celula-celula

➢ Laminele nucleare A, B, C
➢ Laminele A şi C se leaga la cromatina iar Lamina B
se atasaza la receptorii anvelopei nucleare (proteină
integrala)
➢ Afectarea acestor filamente inhiba replicarea ADN
FILAMENTELE INTERMEDIARE
CITOSCHELETUL LA EK

RIBOSOMI

➢ digestia proteinelor
structurale sau reglatoare
➢ 1 subunitate de 20S –
proteolitica
➢ 2 subunitati 19S –
reglatoare

PROTEAZOMI
 Bibliografie
Madigan et al., Brock Biology of microorganisms, 2011 (13th ed.)
Alberts Bruce et al., Molecular biology of the cell, 5th ed., 2008