Week 3

Green Fluorescent Protein (GFP) is geisoleerd uit de kwal Aequoria victoria. Geeft licht. De kwal
fluoresceert groen onder UV licht. GFP is een vaatje opgebouwd uit betasheets. GFP is een eiwit dat
groene fluorescentie produceert. Binnen het vaatje is een katalytisch domein, waar de fluorescentie
geproduceerd wordt.
Je gebruikt licht van een bepaalde golflengte om iets aan te stralen-> Een elektron van het molecuul
gaat naar een hogere energieschil->als het elektron daar blijft gebeurt er niets/ als het elektron weer
terugvalt naar een lagere energieschil dan wordt er fluorescentie geproduceerd en krijg je een foton
dat uitgezonden wordt. Die fluorescentie heeft altijd een hogere golflengte dan het licht dat je
gebruikt om fluorescentie aan te stralen. Een lagere golflengte heeft een hogere energie en een
hogere golflengte heeft een lagere energie. Mutaties maken in GFP zorgt voor andere kleuren
fluorescentie.
Door de coding sequence van GFP vast te plakken aan de promotor, kan het GFP tot expressie
worden gebracht: Organismen worden groen. GFP DNA introduceren in het DNA van een organisme
zorgt er voor dat er GFP mRNA en eiwit wordt geproduceerd.

Door GFP DNA te fuseren met een andere DNA sequentie kan het naar een bepaalde intracellulaire
locatie gericht worden.

Confocale microscopie: Je gebruikt een laser om het preparaat aan te stralen. Voor de detector zit
een metalen plaatje die een pinhole genoemd wordt. Door de pinhole maakt een confocale laser
scanning microscoop optische coupes door een sample. Je kan alleen de dingen zien die in focus zijn.
Optische coupes verwijderen fluorescentie die niet in focus is en maken het mogelijk om naar 1 laag
van een cel te kijken. Door optische coupes te stapelen is het mogelijk om de hele cel tegelijkertijd in
focus te zien.

GFP in levende cellen: dynamiek van intracellulaire structuren kan gevolgd worden
Als je het GFP target naar het ER. Er zit een targetsequentie aan het DNA gepakt waardoor
ribosomen getransporteerd worden naar het ER en het GFP blijft daar hangen.

Het cytoskelet

Bestaat uit:

Microtubuli (polymeer van het eiwit tubuline), polair, dikst, planten, dieren en schimmels
Actine-filamenten (polymeer van het eiwit actine), polair, dunst, planten, dieren en schimmels
Intermediaire filamenten (o.a. lamine en keratine), niet polair, alleen bij dieren, worden niet gebruikt
voor transport: zorgen voor mechanische sterkte

Microtubuli zijn opgebouwd uit hetero dimeren: alfa en beta-tubuline dimeren. GTP binding site.
Actinefilamenten bestaan uit mono eiwit actine. ATP bindingsite.

Actine filamenten en microtubuli vertonen dynamische instabiliteit. Polymeren kunnen groeien en

krimpen. Fases van groei en krimp wisselen elkaar af.
Dynamische instabiliteit bij microtubuli:
Aan te min kant steken de alfa-tubulines uit en aan de plus-kant steken de beta-tubulines uit. Als de
min-kant niet gestabiliseerd is dan depolymeriseerd hij langzaam. Als hij wel gestabiliseerd is, door
bijvoorbeeld gamma-tubuline complexen dan blijft hij stabiel en krimpt hij niet. Stabilisatie aan de
min kant is een manier om de microtubel te laten groeien. Gamma-tubuline stabiliseert de minkant
en is vaak een beginpunt van polymerisatie. De + kant bindt beter GTP-tubuline dan de –kant, er is
meer groei aan de +-kant. GTP is de brandstof bij microtubuli, alle vrije tubuline kunnen uitgerust
worden met GTP en als ze GTP tubuline zijn geworden dan zitten ze het liefst in de buis. Dan is het
energetisch het gunstigst om in een microtubel te zitten, dus deze GTP tubulines verplaatsen naar de
microtubel toe. Zo gauw die GTP tubuline dimeren gecoöpereerd worden in de microtubel dan wordt
de GTP gehydrolyseerd, er ontstaat GDP tubuline. GDP tubuline zit liever niet in de buis en wil er uit,
maar dat kan niet doordat er een GTP tubuline cap aan het uiteinde zit, die willen juist in de buis. Op
het moment dat de GTP tubuline dimeren op zijn dan gaat die GTP hydrolyse door, uiteindelijk eindig
je met GDP tubuline aan het uiteinde van de buis. Als dat gebeurt heb je aan het uiteinde van de buis
tubuline dimeren zitten die er uit willen en het moment van die switch (catastophe) gaat de
microtubel van groei naar krimp. De krimp gaat net zo lang tot dat er een rescue is.

Om op een glaasje of in een microkamertje microtubuli te laten polymeriseren is nodig: een stukje
microtubulus, alfa-beta tubuline dimeren, GTP voor energie en de juiste Mg2+ concentratie.

Actine polymerisatie

ATP kan binden aan actine monomeren. ATP-actine mononomeren incorporeren aan het plus einde
van een actine filament (is energetisch gunstig)-> ATP wordt gehydrolyseerd-> ADP-actine wordt
afgescheiden aan de uiteinden van de filamenten (min kant), ADP-actine wil namelijk uit het
filament-> Gebonden ADP wordt ontbonden van de actine monomeren. Als er aan de plus kant de
ATP-actine cap weg is kan daar ook gedepolymeriseerd worden.

Treadmilling (speciale vorm van dynamische instabiliteit): Tredmolen: als polymerisatie aan de +kant
gelijk is aan depolymerisatie aan de –kant, lijkt het actine filament te bewegen.

Waarom is dynamische instabiliteit zo belangrijk?

Dynamische instabiliteit maakt snelle reorganisatie van het cytoskelet na het ontvangen van signalen
mogelijk. De polymerisatie van microtubuli kost geen energie, maar wel de dynamische instabiliteit.

Cytoskelet visualisatie: GFP gekoppeld aan tubuline maakt microtubuli zichtbaar in levende cellen.
Dan geven microtubuli licht als je er met een fluorescentie microscoop op schijnt.

Microtubuli zit alleen vast aan het plasmamembraan (planten). “Contact” tussen microtubuli om te
weten in wat voor organisatie ze bewegen door: tegen elkaar aan te knallen en over elkaar heen te
groeien.

Detectie van groeiende microtubuli (dierlijke cel): EB1 is een eiwit dat bindt aan de top van een
groeiende microtubuli. Door GFP aan EB1 te koppelen, is de dynamiek van microtubuli in een levende
cel goed te volgen. Als microtubuli vanuit een centrosoom vlakbij de kern groeien naar andere
plekken in de cel, zou het een handig transportmiddel kunnen zijn voor bijvoorbeeld mRNA of
eiwitten.
Microtubuli (plantencel): Corticale microtubuli in een plantencel groeien vooral langs bestaande
microtbuli.

Zoogdierparasiet Listeria mobiliseert het actine cytoskelet van de gastheercel om zich te bewegen in
de cel. Door de vele actine filamenten die aan zijn kont blijven kleven wordt er veel kracht
gegenereerd. Listeria beweegt door actine polymerisatie.

Migratie van fibroblasten voor wondheling: beweging door actine polymerisatie. De cel migratie
berust op gecoördineerde actine polymerisatie tegen het plasmamembraan. Polymerisatie vindt
plaats door meerdere filamenten tegelijk: 1 filament kan niet genoeg krachten genereren om het
membraan te kunnen vervormen.

Amoebe beweging: vorming van pseudopodien en beweging door actine polymerisatie.

Actine filamenten bepalen de celvorm en vormt membraanprotusies in dierlijke cellen.

Microtubuli zorgen in dierlijke cellen voor transport.

Motoreiwitten

Ieder motoreiwit is gespecialiseerd voor zijn eigen cytoskelet element. Myosine eiwitten lopen over
actine filamenten heen. Myosine eiwitten hebben 3 domeinen ze hebben een motor domein, nek
domein en carboxyterminal domein, daarmee kunnen ze aan dingen binden. Het zijn enzymen,
ATPases: De energie voor de beweging is afkomstig van de hydrolyse van ATP. Motoreiwitten kunnen
zichtbaar worden gemaakt door een elektronenmicroscoop.

Als er op een glaasje myosine en actine-filamenten zijn aangebracht en er wordt ATP toegevoegd,
dan gaan de actine-filamenten “kruipen”. Actine filamenten (de)polymeriseren niet, maar worden dit
maal door motoreiwitten bewogen onder invloed van ATP.

Door binding aan organellen kunnen motoren organellen transporteren, via de microtubuli.
(Bij dieren) Motoreiwitten die kunnen lopen over microtubuli:
Kinesine: Beweegt naar de + kant van de microtubuli
Dyneine: Beweegt naar de – kant van de microtubuli
Hebben allemaal een C-terminaal domein, een ‘voetje (N-domein)’en een nek domein, net als bij
Myosine dus. Planten hebben bepaalde kinesines die naar de pluskant kunnen bewegen en bepaalde
kinesines die naar de minkant kunnen bewegen.

In dierlijke cellen doen de microtubuli van alles met transport, in plantencellen doen juist de actines
van alles met transport.

Spiersamentrekking in dieren: myosine beweging over actinefilamenten

Contractie (samentrekking): myosinebeweging trekt actinefilamenten in een sacromeer naar elkaar
toe
Ontspanning: de myosine laat los van de actine filamenten en de spier verlengt.
Dit proces in afhankelijk van de hoeveelheid calcium.
Corticale microtubuli in plantencellen: Microtubuli die in een plantencel in de interfase tegen de
cortex aangeplakt liggen. Alle plantencellen hebben een celwand.

Celwandvorming bij plantencellen

De celwand van plantencellen bestaat uit cellulose microfibrillen en celwandmatrix (alle andere
stoffen die in de celwand zitten). De combinatie van sterke stoffen (cellulose microfibrillen) en de
vulstof (matrix) zorgt voor een hele sterke celwand.

De oriëntatie van cellulose microfibrillen in de celwand bepaalt de groeirichting van de plantencellen.

Turgordruk is hetzelfde in alle richtingen. De elasticiteit van een celwand wordt bepaald door de
richting van de cellulose microfibrillen. De richting waarin de cellulose microfibrillen in de celwand
zijn afgezet bepaalt in welke richting de cel groeit. Als ze horizontaal zijn afgezet, wordt de cel langer.
Als ze verticaal zijn afgezet wordt de cel breder.

Celwandmatrix wordt gemaakt in het golgi en wordt door middel van vesikels door exocytose in de
celwand gebracht.

Cellulose microfibrillen worden gemaakt door cellulose synthasen, eiwitcomplexen in het

plasmamembraan.

De bewegingsrichting van cellulose synthase complexen wordt bepaald door de corticale microtubuli.
Corticale microtubuli zitten vastgeplakt aan het plasmamembraan, het cellulose synthase complex
zet een microfibril af tegen de celwand aan en door de polymerisatiekracht waarmee de cellulose
microfibril gevormd wordt beweegt het complex vooruit door het membraan heen. Het complex
beweegt vooruit tot het een microtubel tegenkomt. Vervolgens gaat hij het microtubel volgen,
omdat het complex anders geen kant op kan.

Celdeling:

Celdeling is het proces waarbij uit een cel twee cellen ontstaan met dezelfde genetische
eigenschappen als de oorspronkelijke cel.
Voorafgaand aan de celdeling vindt er een verdubbeling plaats van de chromosomen.
Tijdens de kerndeling (mitose) gaan twee sets van chromosomen uit elkaar, zodat de dochtercellen
een complete set van chromosomen krijgen.
Daarna vindt scheiding plaats van het cytoplasma (cytokinese)

In planten en dierlijke cellen mitose hetzelfde, cytokinese verschillend. (telofase)

Cytokinese bij dierlijke cellen: insnoering van het plasmamembraan , door actine en myosine
Cytokinese bij planten cellen: Ophoping van vesikels die een nieuwe celwand vormen; celplaat. Door
fragmoplast, een bipolaire microtubule structuur. De microtubuli zijn anti-parallel georganiseerd en
liggen met de +kanten naar elkaar toe, daar waar de pluskanten tegen elkaar aan liggen hopen de
vesikels zich op. De vesikels fuseren met elkaar, celwand wordt gevormd.

De spoelfiguur is een bipolaire structuur bestaande uit microtubuli

Na afbraak van de kernenvelop in de prometafase groeien de microtubuli vanuit beide spoelpolen
Er vindt interactie plaats tussen microtubuli van beide polen
Antiparallele microtubuli binden aan elkaar en worden gestabiliseerd.
Andere microtubuli (prometafase) worden aan de kinetochore (bij de centromeer regio )van de
chromosomen gekoppeld. Weer andere microtubuli (metafase), asters, zorgen er voor dat
chromosomen uit elkaar worden getrokken en niet naar elkaar toe dus. Anafase: chromatiden
worden uit elkaar getrokken door microtubuli.

Kernen kunnen worden gekleurd met DAPI en microtubuli met GFP.

Hoe wordt de positie van de celplaat bepaald?

Preprofase: de corticale microtubuli in plantencellen reorganiseren tot de preprofaseband (ophoping

van corticale microtubuli).
De preprofaseband geeft de plaats aan waar de celplaat gevormd moet worden.