13-9-2023

La enginyeria de proteïnes pretén a obtenir una proteïna amb propietats noves i millorades.
Això s’aconsegueix amb tres estratègies.

- Buscar a la natura un enzim que sigui adequat (candidat).

- Disseny racional de proteïnes si es coneix bastant sobre la proteïna com on està el
centre actiu, la estructura.
- Mutagènesis dirigida quan no conec gaire sobre el plegament de la proteïna per
exemple. És un mecanisme aleatori però que es pugui controlar ja que sinó tindríem
molt poca probabilitat. Eines de biologia molecular a nivell de DNA.

L’element de selecció natural d’un enzim sobre un individu és multifactorial.

La metagenòmica es accedir a la comunitat bacteriana per obtenir la seqüència genètica sense

necessitat d’aïllar el bacteri.

15-9-2023

Metodologia: procés reiteratiu

- Tenir el gen clonat

- Expressar la proteïna
- Determinar la estructura
- Formular hipòtesis sobre estructura i funció

ANALISIS ESTRUCTURAL I FUNCIONAL

EXEMPLE 1-3: identificació dels residus catalítics

Tindré un coneixement previ però tenim coneixement estructural i quan de fiable és (alfa-fold)?

Casos:

- No tinc la estructura 3D: Side Directed Mutagenesis a residus específics o

HIV-1 proteasa

Tècnica alanine scanning mutagènesis: substituir cada aminoàcid per un neutre que faci que
anuli la funció del aminoàcid original. Podria fer moltes substitucions. Per exemple la glicina fa
que s’elimini tota la cadena lateral, però aquesta no es fa servir perquè és molt flexible i podria
perdre l’estructura de la proteïna. Aleshores podem fer servir l’alanina. Jo tinc la meva
seqüencia i preparo mutants en que cada aminoàcid el substitueixo per alanina. Si tinc 100
aminoacids faré 100 mutants en que cada mutant té un aminoàcid d’alanina que substitueix la
posició. Ara faig amb els mutants un estudi sobre la seva activitat. Tinc unes línies que si son
llargues vol dir que l’alanina no afecta a l’original. Si són curtes vol dir que l’alanina elimina
dràsticament la funció de l’aminoàcid.
Hormona del creixement

Coneixíem la estructura prèviament però no coneixíem l’estructura del receptor. Es una

proteïna terapèutica però es molt inestable. Podríem fer mimètics o quedar-nos en les parts
essencials. La meva pregunta es quina zona interacciona amb el receptor i d’aquesta manera
podríem fer simplificacions per fer-la més estable. Però no coneixia el receptor. Faig una altra
vegada la alanine scanning. Ara represento la KD mutant/KD wt vs aminoàcid. KD baixa més
afinitat. Al fer el gràfic si tinc barres altes vol dir que perdo afinitat amb el receptor. Vol dir que
realment son els residus importants per al receptor. Ara mirant el mapa de la proteïna puc
veure on estan els residus que interaccionen amb el receptor.

Ara ja no fem servir tant la tècnica perquè ja coneixem més coses però es una tècnica que
serveix per conèixer la importància de la funció.

Les glicosidasas son enzims que hidrolitzen sucres per l’enllaç o-glicosidic.

Poden actuar mecanisticament amb retenció (comencem i acabem amb la mateixa

configuració) o inversió (mecanisme acid-base i canvien la configuració del substrat).

Acid base: tenim l’aigua que es poc nucleòfila. Aleshores necessitem una base perquè extregui
el proto de l’aigua i sigui més nucleòfila per atacaar al sucre. També vull que el carboni 1 o
anomèric del sucre sigui més electròfil per tant necessito que li cedeixi el proto a un àcid. l’acid
activa el sucre que es el substrat i la base ajuda a augmentar la nnucleofila de l’aigua perquè
pugui atacar el substrat.

Retenció: aquí no cap l’aigua perquè els residus estan més aprop del sucre. El mecanisme
funcioa amb un mecanisme de doble desplaçament (2 etapes). Ara tinc un residu amb cadena
acid carboxílic que es força nucleòfil i pot actuar directament atacant el sucre. Aleshores es
forma un intermedi entre el nucleòfil i el sucre (intermedi covalent glicosil-enzim). En aquest
s’ha eliminat una part del centre actiu. Ara l’acid esta protonat gracies a la hidròlisi de l’aigua i
aleshores ja torna el OH al sucre.

Article

Els cereals tenen molt beta-glucans (polimers de glucosa però els enllaços son beta-1-4 o beta-
1-3). No podem dirigir-los. Quan els volem degradar per fer cervesa i perquè els monosacàrids
fermentin necessitem maltejar (polisacàrids a monosacàrids) i aleshores els monosacàrids
podran fermentar.

El procés de malteig es copiar el procés de la natura que fan les llavors al germinar.

Poso el gra a germinar i despres faig un xoc tèrmic per matar al embrió perquè no consumeixi
el sucre.
Quan estan germinant les llavors necessitem que la paret que conte el mido es degradi i pugui
arribar alfa milasa.

La paret esta formada per beta glucans. A vegades amb el xoc tèrmic no es suficient per
degradar tots els beta glucans i això fa que la cervesa no surti bé. Aleshores quan fem la
cervesa podem afegir les beta glucanases per degradar els beta glucans en cas que en quedin.

Sabem que es una glicosidasa es retaining (dos acids). Ara vull saber els llocs actius. No cal fer
l’alanine scanning perquè se que nomes serà aspartat o glutamat els importants. Ara buscaré la
D i R. Faig una alineament de sequencia per localitzar posicions conservades de D i E. Ara de
tots els que trobo necessito saber quin son els importants. I després els localitzo a l’estructura.