Фармакокинетични и фармакодинамични особености на моноклоналните антитела,

фузионните протеини и на средствата за генна терапия.

Биологична терапия:

 Средства за биологична терапия – основно протеини, за да се свързват със специфични

екстрацелуларни мишени, което на свой ред води до блокиране на активирането на
ключови клетъчни каскади.
 Моноклонални антитела (mAbs) – хомогенна популация от антитела, разпознаващи
специфичен, единствен епитоп.
 Фузионни протеини – разработени посредством сливане (фузия) на два или повече
гени, които нормално кодират отделни протеини.

Биологичните продукти се получават от живи клетъчни/тъканни култури (растителни,

животински или микробиологични) като нативни природни продукти или чрез генно
инженерство. Обикновено са пептиди/протеини или нуклеинови киселини. Използват като
терапевтични/диагностични/ имунопрофилактични средства в хуманната медицина.
Биологичните продукти са коренно различни от нискомолекулните лекарства (т.нар. “малки
молекули”).
o Състав, размери, структура: По-големи, със сложна структура, по-хетерогенни
o Производство: Генно инженерство vs. Органичен синтез. Продуцират се от живи
клетки/организми
o Клинична безопасност: Видовата специфичност, особено при терапевтичните пептиди,
лимитира приложимостта на стандартните модели за предклинична оценка.
Парентерално приложение. Имуногенност.

Малките молекули се получават чрез смесване на реагенти – прекурсори, разтворители и

катализатори с дефиниран състав, посредством серии от контролирани и предвидими химични
реакции. (Органичен химичен синтез) Не се повлияват от малки модификации в
производствения процес, стабилни молекули. р.о. i.v. i.m.
Биологичните продукти се получават от нативни или генетично манипулирани
тъканни/клетъчни култури. (Биотехнологии и генно инженерство). Чувствителни на топлина и са
склонни да агрегират и преципитират. Наблюдава се рецептор-медиирана токсичност. Високо
чувствителни са към минимални промени в производствения процес и средата. Основно i.v. i.m.
Производствени особености
в биотехнологичния процес:
API получен от живи клетки,
културелни условия,
материали използвани за
ЛФ, Пречистване и
съхранение.
Уникални характеристика за
безопасност, ефикасност и
качество.
Фармакодинамика на MAB

Като цяло интактните антитела не се интернализират в клетките и не са в състояние да

преминават кръвно-мозъчната бариера. Следователно подбора на терапевтичните им мишени
трябва да бъде направен, като се имат предвид тези ограничения.
Антителата могат да са насочени към разтворими медиатори (напр. Infliximab е анти-TNF-
α); Omalizumab анти-имуноглобулин Е (анти-IgE)), както и към рецептори и протеини,
експресирани на повърхността на клетките които имат относително стабилна конформация
(напр. Trastuzumab се свързва с рецепторите на епидермалния растежен
фактор; Ipilimumab anti-CTLA4; Nivolumab anti-PD-1).

Фармакокинетика:
mAbs имат дълъг полуживот (дни/седмици) и се прилагат парентерално. Такава характеристика
може да бъде положителен атрибут, в зависимост от заболяването и патологията.
Те не се елиминират чрез чернодробни, бъбречни или жлъчни механизми, което на практика
прави невъзможни конвенционалните взаимодействия с едновременно прилагани лекарства
на ниво фармакокинетика;
mAbs се елиминират по различни механизми - бавно неспецифично елиминиране под действие
на чернодробната ретикулоендотелна система (линеен клирънс) и евентуално бързо
сатурационно елиминиране (т.е. нелинеен клирънс) – при антителата, свързващи се с
рецептори - медиирано от разграждане или интернализация на комплекса mAb-рецептор.

Производството на антитела в тялото на имунизираните животни ще произвежда поликлонални

антитела (PAbs). Това са поливалентна смес от всички клонове на плазмени клетки, които са
реагирали на антигена, които имат различни афинитети и физически характеристики. През 1975
г. Milstein, Kӧhler и Jerne създават метод за производство на mAbs от имунизирани мишки,
използвайки хибридоми. Такива антитела могат да повишат имуногенността срещу
гостоприемника и да имат кратък полуживот в кръвообращението.

Висока имуногенност имат мишите антитела (-omab).

Ниска имуногенност е характерна за химерните (-ximab; Infliximab, Rituximab), хуманизирани (-
zumab; Tolicizumab) и напълно човешките (-umab; Adalimumab).
Клинична безопасност:
Специфична токсичност – “грипоподобен” синдром при цитокините, активиране на латентна
туберкулоза при анти-TNF-alpha лекарствата; проблеми с неактивните компоненти – албумин,
вещества екстрахирани от опаковката, напр. от каучуковите запушалки.
Макромолекулите, в т.ч. БЛП са способни да отключват имунологични реакции, в т.ч.:
o Антитела неутрализиращи терапевтичния протеин – компрометиране на терапевтичния
ефект
o Редки, но потенциално животозастрашаващи реакции на свръхчувствителност
o Имуногенността на макромолекулите е непредвидима

Биологична терапия на РА и други колагенози:

TNF-alfa inhibitors: Golimumab, Infliximab, Adalimumab, Etanercept
Anti IL-6: Tocilizumab
Anti CD-20: Rituximab
JAK inhibitors: Tofacitinib, Baricitinib

MABs в онкохематологията:
Anti CD 19: Blinatumomab
Anti CD 20: Obinutuzumab, Ofatumumab, Rituximab

MABs в онкологията:
VEGF (Bevacizumab) и VEGFR (Ramucirumab) свързващи
EGFR (HER) свързващи: Pertuzumab, Trastuzumab (Her2), Cetuximab

Аптамерите са едноверижни молекули на дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) или

рибонуклеинова киселина (РНК), които се свързват с протеинови мишени чрез сгъване в
триизмерна конформация, подобна на антителата.
Думата аптамер идва от латинското aptus, означаващо прилягане, и
гръцкото meros, означаващо част или регион.
Аптамерите най-често се изолират чрез метод, наречен систематична еволюция на лиганди
чрез експоненциално обогатяване (SELEX), описан за първи път преди 25 години. Един аптамер
е получил одобрение от FDA за лечение на макулна дегенерация на окото, а много други са в
предклинични или клинични изпитвания.

Pegaptanib (Macugen) е пегилиран аптамер, свързващ се със съдовия ендотелен растежен

фактор (VEGF). Пегаптаниб специфично се свързва с 165 изоформата на VEGF, протеин, който
играе ключова роля в ангиогенезата (образуването на нови кръвоносни съдове) и повишената
пропускливост, два от основните патологични процеси, отговорни за загубата на зрение,
свързана с неоваскуларната форма на макулна дегенерация. Пегаптаниб действа като
антагонист на VEGF, който при инжектиране в окото блокира действията на VEGF. Това намалява
растежа на кръвоносните съдове, разположени в окото, и позволява ограничаването на
локалното тъканно ремоделиране.

РНК-интерференция:
РНК интерференцията (РНКи), известна още като пост-транскрипционно „заглушаване“ на гени,
е биологичен феномен, представляващ консервативен регулаторен механизъм за изключване
на генната експресия. Пускова роля в този процес имат екзогенните ДНК молекули,
двойноверижни РНК-и от вирусен произход, аберантни РНК-транскрипти от повтарящи се в
генома секвенции и т.нар. пре-микроРНК-и.
Малките интерфериращи РНКи (миРНКи) са 21-24-мерни двуверижни РНК молекули, които с
помощта на комплекс от протеини индуцират нарязване на комплементарни информационни
РНК-транскрипти, кодиращи определни гени. Често тези процеси повлияват и механизмите на
епигенетична регулация като системата за метилиране на гени (РНК-зависимо метилиране на
ДНК).
Механизъм на действие на антисенс олигонуклеотидите (ASO): ASO действат като причиняват
(1) разцепване на РНК или (2) блокиране на РНК. (1a) РНКаза H1 медиирано разцепване, (1b)
РНК интерференция (RNAi), (2a) Стерично препятствие и (2b) Модулация на снаждане. (1a) ASO-
mRNA хетеродуплекс се свързва с RNase H1 ензим и този ензим разцепва целевата иРНК. (1b)
разграждане на иРНК от siRNA, свързано с РНК индуциращ заглушаващ комплекс (RISC). (2a)
ASO-mRNA комплекс стерично блокира и предотвратява взаимодействието на mRNA с
рибозоми за протеинова транслация. (2b) е пример за сплайс превключващи олигонуклеотиди
(SSO).
Разрешени за употреба антисенс олигонуклеотиди:
Fomivirsen (Virtavene) – i.v. CMV infection
Mipomersen – s.c. при хомозиготна хиперхолестеролемия
Nusinersen (Spinraza) – i.t. при спинална мускулна атрофия
Inotersen (Tegsedi) – s.c.
Транскрипция на Pri-miRNA, от която ензим, наречен Drosha отцепва двойноверижен фрагмент,
наречен Pre-miRNA. Pre-miRNA напуска ядрото и се прихваща от мултипротеинен комплекс,
съдържащ ендонуклеазата дайсер. Pre-miRNA се нарязва от дайсер на множество миРНКи
(малки интерфериращи РНКи, small interfering RNAs), които се разплитат под действието на
хеликаза и се включват като едноверижни фрагменти в състава на рибонуклеопротеинов
комплекс (RNA-induced silencing complex, RISC, РНК-индуциран репресиращ комплекс, РИРК).
Молекулен субстрат на RISC е иРНК, която бива разпозната от комплементарни участъци в
миРНКи. Ензими от РИРК с ендонуклеазна активност нарязват иРНК-мишената и блокират
нейната транслация. Свързването на миРНКи с аргонавт-протеини (AGO) може индиректно да
активира пътищата на транскрипционно генно „заглушаване“ в резултат на епигенетични
промени като РНК-зависимо ДНК метилиране.

2018 - FDA и EC одобряват за употреба ONPATTRO® (patisiran, ALN-TTR02) като първия

лекарствен продукт за РНКи за лечение на транстиретинова фамилна амилоидна
полиневропатия при възрастни.
FDA GIVLAARI™ (givosiran, ALN-AS1) за лечение на възрастни с остра чернодробна порфирия
(AHP).
2020 - Inclisiran (Leqvio®)

миРНК имат:
 Голяма молекулна маса и заряд, налагащи парентерално приложение и недостатъчно
клетъчно акумулиране
 Свързване с нефармакологични мишени
 Разграждане от убиквитерните нуклеази
 Разпознаване от имунната система
 Бързо елиминиране посредством гломерулна филтрация
 Химична модификация на молекулите на siRNA.
 Йонизируеми липидни наночастици (iLNPs) се натрупват предимно в черния дроб чрез
взаимодействие със серумните липопротеини

Лекарство-доставящи системи:
Имат голяма молекулна маса и полианионна природа, необходимост от формиране на
конюгати или включване в лекарство доставящи системи.

Inclisiran (Leqvio®): генно заглушаване на PCSK9

EMA, 2020 – първична хиперхолестеролемия и смесена дислипидемия
Inclisiran – тропизъм към таргетната тъкан:
 siRNA, конюгирана с N-ацетилгалактозамин
 s.c.
 Прицелно доставяне до хепатоцитите
 Трето поколение с подобрена химична стабилност
 Азиалогогликопротеинов рецептор (ASGPR)
 Изразена експресия предимно в хепатоцитите.

Концентрацията на LDL-C до голяма степен се регулира от нивото на експресия на LDLR в

хепатоцитите:
Разграждане на LDL-C и рециклиране на рецепторите:
1. В кръвотока LDL-C се пренася в състава на LDL-частиците
2. LDL рецепторите (LDLR) на повърхността на хепатоцитите се свързват и отстраняват LDL-
частиците от кръвотока
3. Свързаните LDL-частици се интернализират чрез ендоцитоза и се пренасят до
лизозомите
4. След интернализацията LDLR се рециклира към клетъчната повърхност

Терапевтични подходи за понижение на LDL-C: малки молекули срещу LDL-R, моноклонални

антитела, миРНКи
Намиращите се по хепатоцитите LDL-R рецептори играят ключова роля в поддържането на
плазмените нива на LDL-С. Всеки LDL-R се рециклира до 100 пъти в рамките на 24 часа
съществуване.
PCSK9 регулира експерсията на LDL-R рецептори по повърхността на хепатоцитите. Липсата на
PCSK9 води до съществено повишаване броя на LDL-R.
Анти-PCSK9 моноклоналните антитела блокират изграждането на комплекса на PCSK9/LDL-R и
така намаляват LDL-С в плазмата. Повишаването на активността на LDL-R със статини се
компрометира от повишаване на PCSK9. Инхибирането на PCSK9 повишава експерсията на LDL-
R и намалява LDL-С.

Генна терапия – подходи и вектори:

Генната терапия се дефинира като въвеждане на генетичен материал (ДНК или РНК) в клетката-
гостоприемник с цел коригиране на генетичен дефект.

Подходи за реализиране целите на генната терапия:

  Нормален ген може да бъде вмъкнат в генома на клетката, за да допълни липсващ ген.
 Абнормен ген може да бъде заменен с нормален ген.
 Регулиране степента на експресия на гените.

Условия за успешна генна

Точно определяне на
биологичната мишена

терапия:
Подбор на
терапевтичен ген

Оптимален вектор!!!

Основно предизвикателство пред генната терапия:

Доставянето на генетичния материал до прицелните клетки!!!

Биологични бариери:
Ексрацелуларни:
 Имунната система на гостоприемника;
 Екстрацелуларни нуклеази
Интрацелуларни:
 Клетъчна мембрана
 Ендозоми и ендозомални разграждащи ензими
 Цитоплазмени нуклеази
 Ядрена мембрана

Идеалният вектор за трансфекция:

 ниска токсичност
 ниска имуногенност
 осигурява висока стабилност на
терапевтичните гени
 висок капацитет на трансфекция
 специфичност
 силна експресия на
терапевтичния ген за достатъчно
дълъг период от време

Видове вектори за доставяне на ДНК:

o Вирусни вектори:
 Аденовируси
 Адено-асоциирани вируси
 Лентивируси
 Ретровируси
  Херпес симплекс вируси
 Висока ефективност
 Дозо-лимитираща токсичност
 Имуногенност

o Невирусни вектори:
 Неорганични частици
 Липозоми
 Катионни полимери или полимерни наночастици
 Ниска токсичност
 По-слабо имуногенни
 По-ниска ефективност

Вирусните вектори са естествено срещащи се вируси, които са били променени: по-голямата

част от първоначалните вирусни гени са заменени с желан трансген. Отстраняването на вирусни
гени означава, че този вирус не се репликира или не предизвиква същия имунен отговор като
естествено срещащия се вирус.