Trình bày được

• Định nghĩa & Phân loại tannin

• Cấu trúc của 2 loại tannin chính

• Các tính chất lý hóa chính của tannin

• Các phương pháp chiết xuất tannin
• Các phương pháp định tính, định lượng tannin
• Tác dụng và Công dụng của tannin

• Ba* dược liệu tiêu biểu có tannin

(Ngũ bội tử, Măng cụt, Ổi)

1. Khái niệm & Định nghĩa về tannin 6. Định tính Tannin

2. Phân loại các tannin 6.1. Định tính vật lý
2.1. Theo tính thuộc da (tannin thực & pseudo) 6.2. Định tính hóa học
2.2. Theo cấu trúc hóa học 6.3. Định tính sắc ký
2.3. Theo khả năng thủy phân* 7. Định lượng Tannin
3. Cấu trúc hóa học
7.1. Phương pháp dùng bột da
3.1. Tannin pyrogallic (TG)
7.2. Phương pháp oxy-hóa (Lowenthal)
3.2. Tannin pyrocatechic (TC)
7.3. Phương pháp dùng Đồng acetat
3.3. Tannin phức hợp
7.4. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin
4. Tính chất của Tannin
7.5. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu
4.1. Lý tính
7.6. Phương pháp dùng HPLC
4.2. Hóa tính
5. Chiết xuất Tannin 8. Tác dụng & Công dụng của Tannin
3 4
 Đến 12/2014:
160 K hợp chất tự nhiên Phenol đơn giản
Phenylpropanoid
30 K
Flavonoid
18%
Alkaloids Lignanoid
45%
42 K Phenolics Tanninoid
27% 72 K Stilbenoid
Steroids &
Terpenoids Xanthonoid

10% Quinonoid
Khác
... ... ... ...
16 K

A. Theo E.C. Bate-Smith (1962): Tannin là

• Về nguồn gốc, tannin là những hợp chất biến dưỡng thứ cấp
- các hợp chất phenol, MW # 500 − 3.000 đvC
của các thực vật bậc cao, có bản chất polyphenol. - cho các phản ứng thông thường của phenolic.

• Về cấu tạo, tannin có thể là - tạo tủa với alkaloid, gelatin và các protein khác.

- các ester của galloyl (và dẫn chất) với nhiều loại polyol khác
nhau (glucose, acid quinic, catechin,...).
- các oligomer hoặc polymer của PAC* (và dẫn chất từ PAC),
với các liên kết flavanyl (C − C)
• Về từ nguyên, tanna = gỗ Sồi (Oak, Fir) trong tiếng Đức cổ.
Tiếng Anh: to tan, tanning (Pháp: tanner) = (sự) thuộc da...
7
B. Theo Edwin Haslam (1989): Tannin là
- các hợp chất polyphenol, MW # 500 – 20.000 đvC
- cho các phản ứng thông thường của phenolic.
- tạo tủa với alk., gelatin, protein khác và 1 số polysaccharid.
C. Theo Peter Horvath (1981): Tannin là
- các hợp chất polyphenol, MW lớn.
- chứa n × φOH & các nhóm thích hợp khác (carboxyl)
- tạo phức với protein & nhiều đại phân tử khác trong đk. đặc biệt.
 (Goldbeater's skin test)
Có nhiều cách phân loại tannin:

2.1. Theo khả năng kết hợp với protein (≈ tính thuộc da)
→ Tannin thực (true) và tannin giả (pseudo-tannin; ψT)

2.2. Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử)
→ Tannin pyrogallic (TG) và tannin pyrocatechic (TC)

2.3. Theo tính thủy phân (trong tannase hoặc acid loãng)
→ Tannin thủy phân được và tannin ko thủy phân được
= Tannin ngưng tụ = condensed tannin
9 10

Có thể chia các “tannin thực” thành 4 nhóm chính

A1. Tannin gallic (= gallo-tannin)*
Thường là polyester của vài mono-, di-, tri-galloyl (hay ∆’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...) TG TC

A2. Tannin ellagic (= ellagi-tannin)*

Thường là polyester của acid ellagic, luteolic, HHDP (hay ∆’ của
chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic...)

B. Tannin [pyro]catechic (= tannin ngưng tụ, condensed tannin)

= PAC, là các oligomer, polymer của Flavan-3-ol (nối C → C)
thường gặp kiểu liên kết (C4 → C8) hay (C4 → C6). . .

C. Tannin phức hợp (complex tannin)

Là các glycosid phức hợp từ 3 nhóm trên. 11 12
 Dựa vào tính thủy phân, tannin có 2 loại chính:
3.1. Cấu tạo các pseudo-tannin: thuộc da (−)
• Tannin thủy phân được (gồm gallo-tannin & ellagi-tannin).
• Tannin ko thủy phân được (= tannin ng. tụ, pyrocatechic).
3.2. Cấu
́ tạo các tannin thực: thuộc da (+)
thủy phân được gallo-tannin ( acid gallic)n 3.2.1. Tannin pyrogallic (TG) = Tannin thủy phân được.
(tanin pyrogallic) ellagi-tannin ellagic, luteolic a. Gallo-tannin (polyol + ∆’ acid n-gallic)
b. Ellagi-tannin (polyol + ∆’ acid ellagic)
c. hỗn hợp (polyol + acid n-gallic + acid ellagic)
ko thủy phân được
n x catechin (flavan 3-ol; 3,4-diol)n 3.2.2. Tannin pyrocatechic (TC): Không thủy phân được.
(tanin pyrocatechic)
3.2.3. Tannin phức hợp: (catechin − polyol − gallic/ellagic)
Điều kiện thủy phân: enzym tannase hay acid loãng
13

Tiếng Hy lạp: phloios (φλoιὀς) = vỏ cây (bark) acid gallic galloyl acid m-digallic digalloyl

baphe (βαφή) = chất nhuộm màu (dye)

HO HO
Hai định nghĩa thông dụng về phlobaphen: depsid + OH/glc
G1 HO COOH G2 HO CO O

• Trong hóa thực vật học: HO HO HO COOH

+ OH/glc
Phlobaphen là các hợp chất phenol có màu đỏ chiết từ thực vật. HO

Các hợp chất này tan trong cồn nhưng không tan được / nước.
HO HO
• Trong công nghệ thuộc da: depsid
G3 HO CO O HO COOH
Phlobaphen là những sản phẩm có màu đỏ (= đỏ tannin) được
tạo thành khi xử lý các dịch chiết có tannin với các acid vô cơ. HO HO CO
depsid
O
+ OH/glc
Các hợp chất này không tan đươ•c trong nước. HO

acid m-trigallic trigalloyl

15 16
 1

Là các polyphenol đơn giản, phân tử (và MW) nhỏ. Tính chất: pyrocatechin phloroglucinol pyrogallol
• cho các ph.ứng chung của polyphenol (ph.ứng của vòng thơm, HO HO HO

diazo-hóa, phản ứng của -OH như tạo phức với Pb2+, Fe3+...)
HO OH HO
• không cho phản ứng thuộc da; Chỉ khi ở nồng độ cao, đôi khi
HO HO
chúng mới có thể tạo tủa với dung dịch protein (khác tannin).
HO
• khả năng tạo phức với các đại phân tử thì rất kém (khác tannin)
HO HO CO O HO

HO COOH HO HO COOH HO COOH

• Về cấu trúc hóa học, thường gặp chúng ở dạng:
- các dẫn chất acid phenol đơn giản. HO HO

- các tổ hợp (n-caffeoyl−acid quinic); các flavo-lignan... acid pyrocatechic acid m-digallic acid gallic

- mono và dimer, trimer của acid gallic. COOH COOH HO COOH

- mono và dimer của catechin và ∆’-catechin. HO

HO
(≥ trimer được xếp vào nhóm PAC/ tannin ngưng tụ)
17 acid cinnamic acid hydroxycinnamic acid caffeic 18

2 3

(OH)
HO HO HO
OH O CH2OH
5
5 COOH COOH 5 COOH
HO 4 1 HO 4 1 HO 4 1 HO O HO O OMe
3 OH O
OH 3 OH 3
O
2 4
caf O HO caf O caf 3 OR OH OH
OH (OR) OH O
acid chlorogenic acid quinic cynarin
∆’ flavan-3-ol flavo-lignan (silybin)
(3-caffeoyl quinic) (1,3-dicaffeoyl quinic)
(OH)
H OH
caf O HO CO O OH
HO O 2
5 OH OH
5 COOH H
COOH
HO 4 1 HO 4 1 (OH)
HO 4 3
OH HO O 2
3
OH 3 OH OH OH
2
OH
HO HO
8
HO O 2 3 O OC OH
OH
acid iso-chlorogenic = (5-caffeoyl quinic) OH O
3 OH OH
OH OH

19 dimer-(epi)catechin epi-gallocatechin-3-O-gallat
 G O
G G O G
O 6 O 6
G O G
O 4 O 4
O
a. Các gallo-tannin 5
1
O
5
1
O
G O 3
2 G G O 3
2 G
O O
Vị trí trung tâm là 1 glycon ( ) có cấu trúc polyol. G O G
O
G
G
Polyol - thường gặp nhất là βD-glucopyranose (βD-Glc) G O

- ít khi là ∆’ acid quinic, acid caffeic, shikimic... penta-galloyl glucose (PGG*) penta-digalloyl glucose (PDGG*)
M = 180 + 5(152) = 940 M = 180 + 10(152) = 1700
- rất ít khi là ∆’ glucitol, hamamelose...
Mỗi -OH/polyol này có thể nối ester với 1 nhóm -COOH G G
G O 6
của phần acid n-gallic (thường thì n = 1 → 3). O
O
O
O
HO 4
5
1 OH
HO 2
H
3
O
Điển hình là các polygalloyl glucose và acid tannic có H
G OH OH
trong Ngũ bội tử (Galla chinensis), Sồi (Quercus spp.)...
aceri-tannin hamameli-tannin
(2,6-digalloyl-1,5-anhydro-D-glucitol) (∆’-hamamelose)
21 22

b. Các ellagi-tannin

OH Là các tannin pyrogallic có phần aglycon là acid ellagic

HO OH
OH hay acid luteolic, hexahydroxy diphenic acid (HHDP).
HO OH G O 6
HO OH
G O 4
O Vị trí trung tâm thường là βD-Glc (4C1 & 1C
4)
HO 5
COO 6
G O 3
2
1 O G
5 O O G G G G
COO 4 G G OH G
HO COO 3 OOC HO
2 OH 6 CH2O O O
1 O HO OH 6
O
COO βD-glc OH
HO
4
O 1 1 1
O O O
HO O OC OH (G = galloyl)
HO OH 3
OH 4 2 4 2
HO HO 1 4

OH OH OH OH O O O O
HO OOC
OH 4C 1C G G G G
HO CO OH 1 4
OH
acid meta-trigallic
HO

Khi aglycon là HHDP, nó sẽ ưu tiên nối với glucose ở dạng 1C4

Nhóm -COOH / acid meta n-gallic nối ester với 1 nhóm -OH / glc. Các ellagi tannin thường có M = 2000 → 5000.
Các đơn vị acid gallic nối meta với nhau bằng đường nối depsid. Ellagitannin có trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula),
23 vỏ quả Lựu, vỏ Sồi (Quercus spp.), lá Trà... 24
• Khi không mở vòng: nhóm -OH (♥) của acid ellagic có thể
nối với -OH của polyol (như glucose…) và tạo 1 O-glycosid. HO OH

HO
O O
OH OH HO
O OH O OH HO OH 6
COO G O 6

HO COO O O
↑ G O
HO OH HO ↑ OH HO
↑
OH
COO OH OH
(♥) (♥) O
HO HO 1 G O 1
HO O HO COO G
OH COOH COOH COOH
O ( ) ( ) ( )
HO (G = galloyl)
OH
acid ellagic acid luteolic HHDP HO OH
OH

• Khi mở 1 vòng (→ acid luteolic): tạo 1 nhóm COOH mới ( )

• Khi mở cả 2 vòng lacton (→ HHDP): tạo 2 nhóm COOH mới ( ) • Trong phân tử acid ellagic : nối ester kiểu depsid (kém bền nhất)
• Giữa acid ellagic và glucose : nối acetal (tạo O-glycosid; kém bền)
Các nhóm -COOH ( ) này sẽ nối ester với các nhóm -OH của • Giữa acid monogallic và glc : nối ester (tạo ψ-glycosid; kém bền)

polyol (như glucose…), tạo pseudo-glycosid (# ellagi-tannin). • Giữa 2 vòng thơm : nối C − C ( , rất bền!)
25

(Tham khảo) (Tham khảo)

Mỗi ph. tử HHDP có 2 nhóm -COOH. Chúng có khuynh hướng tạo G G G
G
HO
một diester với 2 nhóm -OH/glc gần nhau trong không gian, ví dụ: 6 CH2O O 6
O
O
G O 6 OH
- dạng 4C1-glc → diester ở (2 + 3), ở (4 + 6), hay ở (3 + 4)...
1 1
O O O
G O
- dạng 1C4-glc → diester ơ› (6 + 1), ở (6 + 3), hay ơ› (2 + 4)... O OH 4 2 4
3
2

G O 1 O O O O
G
G G G G

6 OH OH
HO
4
6
O (kém bền)
OH
1
Khi thủy phân các ellagi-tannin (nước nóng, acid yếu...) thì:
HO 5
5 O
HO OH
4C 1C
3
HO
2
1 1 4 4
3
2 • Các liên kết ester giữa HHDP với glucose (kém bền) dễ bị cắt đứt.
OH OH

hai dạng ghế của D-glucopyranose • Liên kết C − C ( ) giữa 2 vòng thơm (rất bền) không bị cắt.
Sản phẩm thủy phân ngừng ở acid ellagic (ko tới được acid gallic!)

Enzym tannase (ví dụ từ môi trường nuối cấy Aspergillus niger) • Phần HHDP sau thủy phân sẽ nhanh chóng sắp xếp lại cấu trúc
thì không cắt (thủy phân) được nối ester giữa HHDP & glucose. (xoay và đóng vòng) để tạo acid ellagic (ko tới được acid gallic!)
27 28
 Phần aglycon vừa có acid gallic, vừa có acid ellagic / luteolic / HHDP Còn gọi là tannin catechic (TC), tannin ngưng tụ (condensed tannin),
OH
hay proanthocyanidin (PAC), phlobatanin (ít dùng).
HO OH
Là tổ hợp nhiều đơn vị [flavan-3(4)-ol] nhờ liên kết (C−C) rất bền ( ).
OH
HHDP OH G COOH
HO
HO
CO G
G COOH PAC có thể thẳng ( nối 4/8) hoặc tạo nhánh ( nối 4/6)...
HO CO O 6 glucose OH
HO COOH
O
O 4
HO COOH
HHDP
O O OC OH
3
2
1 G (OH)
O
G OH
CO CO
OH HO extension
HHDP acid gallic OH G HO O
8 OH
HO
OH 4
OH (OH)

HO OH OH
OH OH OH
HO O
8 OH
n 4 (OH)
• Gallic có thể là mono, di, hoặc tri-galloyl OH
OH
OH terminal
• Ellagic có thể là ellagyl, luteolyl, HHDP-yl... HO
8
O
OH

• Có thể có liên kết giữa các đơn vị gallic & ellagic gần nhau 4
OH
29 OH 30

Lưu ý: Tuy chỉ là monomer, nhưng cả epigallocatechin-gallat (EGCG),

epicatechin-gallat (ECG) vẫn được gọi là “tannin catechic” / Trà xanh.
R
OH Do mật độ [-OH] cao, chúng có khả năng tạo tủa với protein và các
HO
8
O
R
hợp chất đại phân tử khác (polysaccharid...)
4
OH
OH
OH
8
HO O gallocatechin
OH

OH
OH n catechin
4
OH
OH
R HO 8
O epi epi
OH
HO
OH 6
R
4 OH gallat gallat
4 OH
R OH
O OH HO 8
O (EGCG) (ECG)
R
8
4
OH
OH OH

Với d.dịch FeCl3 loãng, E(G)CG cũng → xanh đen (# tannin gallic!)
31 32
 Tham khảo Tham khảo

Acid tannic là một hỗn hợp chủ yếu gồm các ester của βD-glucose*
với acid n-gallic (n = 1, 2, 3). Acid di- hay trigallic tạo bởi nối depsid.
βD-glucose đóng vai trò trung tâm, xung quanh là các acid n-gallic.
Tannic acid is a tannin derived from plants and in general prepared from Chinese
gall or nut gall. Although tannic acid has long been used, its structure has not yet
been well-defined and hence it varies depending on articles.

G6 O 6
G6 O 6 O G3 O G1 Shoji Tomoda (1982), Plant Pharm. Chem., p. 93, discloses that the structural
G4 O
O 4
5
5 O
1
formula of the principal component of tannic acid is as follows:
O O G1
2 4 3
G3 3 O 1 2

O G4 O G2
G2
galloyl 6 CH 2O galloyl
O Σ.G = 7 → 9 units galloyl
Acid tannic = poly-galloyl-βD-glucose = C6H12O6 . (C7H4O4)5→10 O
O O galloyl
MW = 180 + (760→1520) = (940→1700) 2
1
MW = (1244 → 1548) Da
galloyl O
Mm = *1396* Da
Do được khai thác từ các nguồn khác nhau, công thức của acid tannic (galloyl) 3, 4, 5
cũng có nhiều công bố khác biệt (về giá trị n của phần acid n-gallic).
Cũng có tài liệu nói đến sự có mặt của acid quinic (thay cho một số Tannic acid (theo S. Tomoda, 1982)
vị trí của glucose). 34

Tham khảo

Tác giả mô tả Gn (nối với các OH glucosyl) Σ galloyl MW Acid tannic có trong các tổ chức sùi ra (galls) ở lá & cành non của
rất nhiều (2010s) 5 × digalloyl = (PDGG) = 10 1700 - một số loài Sồi, Sến (Quercus infectoria, Q. lusitanica...)
- một số loài Muối tạo Ngũ bội tử (Rhus chinensis = R. semialata...)
S. Tomoda (1982) 7 → 9 galloyl =8±1 *1396*
Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và βD-glucose.
Brewster (1948) 5 × digalloyl = (PDGG) = 10 1700
Britton (1966) 4 × galloyl + trigalloyl / G2 =7 1244 Acid tannic còn có trong hạt cây Caesalpinia spinosa Fabaceae.
E. Fisher (1912) 5 × galloyl = (PGG) =5 940 Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và acid quinic.

Hagerman (2002) = (22/3) *1294*

HO OH COOH
6
4 6 OH
HO O 5 5 6
4 OH 1 OH
5
HO OH HOOC
2 2 4 3
1 1 3 2
3 OH OH
OH OH OH

βD-glucose acid quinic acid quinic

Dung dịch acid tannic 10% / nước có pH = (2,3 ± 0,1) 35 36
Cấu trúc rất phức tạp. Có thể có hoặc không có polyol (glucose...). 4.1. Lý tính
Phần aglycon đa dạng (các ∆’ catechin, các ∆’ acid gallic, ellagic...). 4.1.1. Chung của TG và TC
Vd: Các guavin / lá Ổi, camellia-tannin / lá Trà, stenophyllanin A / Sồi...
4.1.2. Riêng của TG

OH catechin ∆’ acid caffeic OH

4.1.3. Riêng của TC
HO 4'
3'
OH
OH
3 O OH
galloyl 4.2. Hóa tính
2

G O 8
O 5 OH O 7 O 2
OH
G O O
4.2.1. Chung của TG và TC
O 8 3 OH
G HHDP
O Hax
7

OH OH 4.2.2. Riêng của TG

G

4.2.3. Riêng của TC

Stenophyllanin A Cinchonain
(trong Quercus stenophylla) (trong Cinchona spp.)

37 38

4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC • Độ tan của các tannin
- (epi)-catechin monomer và dimer: dễ tan / EtOAc.
- thường là bột vô định hình, màu vàng ngà đến nâu sáng. - các PAC oligomer: kém tan / EtOAc.
- không mùi hoặc mùi rất nhẹ; có vị chát. - các PAC polymer có MW quá lớn: rất khó tan / EtOAc.
- gây săn se niêm mạc, kích ứng niêm mạc dạ dày.
- MW # 500 → 5.000+ (TG); 900 → 20.000+ (TC). • Với các dung dịch nước của protein (albumin, gelatin...):

- tính chất thay đổi tùy xuất xứ, tùy cách chiết. - tạo phức tủa bền → có tính thuộc da

- dễ tan / kiềm loãng, cồn-nước, aceton-nước. làm da bền, ít thấm nước, không bị thối rữa

- tan được* / EtOAc, glycerin, propylen glycon. (khả năng tạo tủa sẽ tối ưu tại pHi của protein)

- không tan / d.môi kém ph.cực (hexan, EP, Bz, Cf, Et2O)

Khi thử nghiệm tính tạo tủa của tannin với protein:
39
cần điều chỉnh pH của môi trường! 40
 4.1.1. Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC (cont.) 4.1.2. Lý tính của Tannin thủy phân được (TG)
Nói chung, tannin là những hợp chất rất phân cực, phân tử lớn.
- dễ tan trong nước *, cồn-nước, aceton-nước. OH

• Sắc ký hấp phụ (ví dụ với Si-gel NP): Tannin thường bị hấp phụ chặt
- MW trung bình: có thể kết tinh được. OH
vào pha tĩnh và rất khó giải hấp (≠ cơ chế phân bố trên Si-gel RP).
- MW càng lớn thì càng kém tan trong nước. OH
→ SKC si-gel NP: tannin di chuyển rất chậm; SKLM: Rf thấp + kéo vệt. - MW thường 900 – 5000, hàm lượng / cây: thường lớn.
- chưng cất khô ở # 200 oC → các pyrogallol* (tri-OH).
TG TC
- khả năng tạo tủa với protein: rõ rệt với ≥ triester của
O O O

H OH H OH H
[≥ 3 nhóm OH / glc] & [≥ 5 đơn vị galloyl] (MW ≥ 940)
OH OH OH OH OH OH
Si Si Si Si Si Si
O O O O O O O

(n) x galloyl (2) = 304 (3) = 456 (5) = 760 (8) = 1216 (10) = 1520
• Sắc ký rây phân tử: ví dụ với Sephadex (Pharmacia*)
+ 180 = MW 484 636 940 1396 1700
- với Sephadex LH-20: Rửa giải tannin với (aceton + nước).
EtOH không rửa giải các tannin được (nên dùng để loại tạp!)
(glucose = 180; acid gallic = 170; galloyl = 152 Da)
- với Sephadex G-25: Rửa giải bằng nước hoặc cồn + nước. 41 42

4.1.3. Lý tính của các tannin ngưng tụ (TC) 4.1.4. Phổ UV & Phổ IR của tannin

- tan trong cồn, trong aceton (giống TG).

- khó tan / nước, khó kết tinh (khác TG).
(OH) • Phổ UV (và phổ IR) của tannin thực tế ít được khai thác.
- các TC có MW thấp: tan được / EtOAc. OH
Nếu có, chỉ là 1 trong các tiêu chuẩn kiểm nghiệm tannin.
- MW = 500 − 20.000 (lớn hơn tannin gallic). HO OH
B
OH
- Cất khô → phloroglucinol (A), pyrocatechin (B) A

Lưu ý: TC không → glucose (khác TG) OH • Với các tannin catechic, nếu vòng B có nhóm -OH ở
OH
- các trimer trở lên (n ≥ 3) mới có tính thuộc da - 3’,4’ sẽ có λmax ~ vùng 280 nm, ví dụ (epi)catechin.
(mới được coi là Tannin Catechic chính thức) - 3’,4’,5’ sẽ có λmax ~ vùng 270 nm, ví dụ (epi)gallocatechin.

- Tính thuộc da của các TC >> TG.

• Phổ UV của các phức màu [tannin + thuốc thử] thường
- TC chiếm # 90% tổng sản lượng tannin toàn cầu.
được khai thác hơn để định lượng tannin, polyphenol
- TC có trong lá Trà, vỏ Canhkina, hạt Nho, vỏ Thông, Quebracho,
cây Dẻ, Keo Acacia & nhiều cây gỗ vùng nhiệt đới. (PP so màu th. thử vanillin-HCl, DMACA, Folin-Ciocalteu...)

43 44
 Phổ UV của phức màu [Polyphenol + Folin-Ciocalteu Reagent]

MeOH/HCl Catechin Cyanidin

PAC +
∆ (ko màu) (màu đỏ)

45 46

47 48
 B. Riêng của tannin catechic (TC)

A. Chung của 2 loại tannin TG và TC (OH) 4.2.6. Ph.ứng với ROH / H+

OH
4.2.1. Ph.ứng tạo tủa với protein 4.2.7. Ph.ứng với aldehyd / H+
HO O
OH
4.2.2. Ph.ứng kiềm phân 4.2.8. Ph.ứng với aldehyd / OH−
3
O R
4.2.3. Ph.ứng thủy phân OH 4.2.9. Ph.ứng với dung dịch Brom.

4.2.4. Ph.ứng Oxy hóa 4.2.0. Ph.ứng với

4.2.5. Ph.ứng với muối kim loại C. Riêng của tannin gallic (TG)

Gn O
4.2.a. Ph.ứng v
B. Riêng của tannin catechic (TC) Gn O
O
O O
4.2.b. Ph.ứng v
Gn
O Gn
Gn
4.2.c. Ph.ứng v
C. Riêng của tannin gallic (TG)
4.2.d. Ph.ứng v
49

4.2.1. Phản ứng của polyphenol/tannin với protein

protein tannin

NH protein
polyphenol OH O C
R NH
OH O C
R R
OH O C
NH protein

51 52
 4.2.2. Phản ứng kiềm phân
• Phức tủa [protein − tannin] sẽ dễ hình thành khi môi trường Với kiềm đặc và nóng, tannin → các mảnh đơn giản.
có pH # pHi (đẳng điện) của protein tương ứng. (dùng để nghiên cứu cấu trúc tannin)

acid n-gallic, ellagic, luteolic, HHDP (gallo)catechin

• Trong m. trường kiềm, các -OH → (O−); protein cũng ở dạng
(OH)

anion: tủa phức [protein − tannin] không được tạo thành. Gn O

OH

Gn O O
HO O
OH
Gn O O
O Gn
• Để tạo tủa với protein, k’ thước (và MW) của các tannin phải: Gn 3
O R
OH

- đủ bé để xâm nhập được vào khe của các sợi protein.

- đủ lớn để liên kết với chuỗi peptid ở nhiều vị trí.
pyrogallol pyrocatechol
acid gallic phloroglucinol
53 54

OH
HO ♥ HO OH
4.2.3. Phản ứng thủy phân (bởi acid loãng, tannase) OH
O HO O
HO CO O HO CO O OH
- PG bị thủy phân → acid phenol + (glucose, acid quinic...) HO OH

HO HO CO O
♦ OH
O OC OH
- PC bị trùng hiệp → các phlobaphen màu đỏ OH
HO ♥ ♦ OH
(OH)
OH
ester depsid (kém bền) nối ester (khá bền) nối ester (khá bền)

HO O OH
OH OH
OH
3
O OC OH
HO O
OH
OH
OH OH
OH
HO O OH
OH OH ♠
Lưu ý: 3
1'' OH HO O
O OH
Tuy thuộc nhóm tannin ko thủy phân được, nhưng các PAC có nhóm OH
♣ O OH
OH
OH
ester ở C-3 (như EGCG, ECG...) vẫn có thể bị cắt tại vị trí ester này; OH

nhưng tannase, acid/kiềm loãng ko cắt được nối C − C (C4 → C6/8). nối glycosid (khá bền) nối (C − C) flavanyl (♠, rất bền)
 G O 6 HO
thủy phân ko hoàn toàn O
G O 4
5
O G HO COO Me
O 2
MeOH/đệm acetat 3
O 1

G HO
G

G O G O 6 pentagalloyl glucose 4 x methyl gallat

O
G O G O 4
5
O G
O 2
3
O 1
MeOH H2SO4
G O G
G O G

HO 6 HO

MeOH/H2SO4 O
HO 4 5
OH HO COO Me
HO 2
thủy phân hoàn toàn 3
HO 1

HO • Nếu dùng MeOH: acid gallic thành methyl gallat

glucose 9 x methyl gallat
• Nếu dùng EtOH: acid gallic thành ethyl gallat

57 58

HHDP acid ellagic

X
acid gallic 4.2.4. Phản ứng Oxy hóa
O - oxy hóa yếu (không khí, dung dịch Fehling…),
HO OH OH OH HO O
luôn kèm theo sự trùng hiệp, tạo các sản phẩm
HO OH
HO OH
có phân tử lớn không tan / nước.
acid / base
CO CO
O
O OH
- oxy hóa mạnh (K2Cr2O7, KMnO4)
O
O O
OH
O
kèm phá vỡ cấu trúc → mảnh phân tử nhỏ hơn
OH HO
HO OH
OH βD-glucose HO
OH

Trong m.trường acid hay base, ellagi-tannin sẽ bị cắt liên kết ester → HHDP.
HHDP nhanh chóng được sắp xếp lại, đóng vòng và chuyển thành acid ellagic.
Acid ellagic này sẽ tan / môi trường (nước) và không tiếp tục cho ra acid gallic.

59 60
4.2.5. Phản ứng tạo phức với muối kim loại (của 2 loại tannin) 3+

Tannin tạo phức tủa màu với các muối Pb2+, Cu2+, Fe3+, Al3+...
O
B
Màu phức sẽ thay đổi tùy theo +
Fe
O
O
* loại muối: muối sắt → xanh rêu đến xanh đen. O O 4' O − O 4'

Fe B Fe B
B 3−
muối chì → trắng ngà đến vàng. O
O O 3' O O 3'

* số lượng nhóm OH phản ứng (ortho-di-OH, gallo-tri-OH) O

+
O

Fe B
• Ứng dụng O

- loại bỏ tannin (+ tạp polyphenol) khỏi dịch chiết.

- sơ bộ nhận định số lượng nhóm –OH.
Càng nhiều nhóm -OH lân cận, màu phức sẽ càng xanh đen. Ví dụ:
• Chú ý
• Các gallo-tannin (nhóm tannin thủy phân được)
- các phức [polyphenol - kim loại] có thể tan lại / cồn cao độ.
• Các gallo-catechin (nhóm tannin ngưng tụ, 3 nhóm OH / vòng B)
Do đó muốn loại tạp polyphenol bằng dung dịch chì acetat
hay ester 3-galloyl
(tr. tính hoặc kiềm) thì dịch cần loại tạp phải có độ cồn < 25%.
- phản ứng này không đặc hiệu cho tannin.
61 62

3+

4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)

(OH)
(OH)
B 4'
4.2.7. Phản ứng với th’ thử Stiasny (Formol + HCl đđ; 2 : 1)
OH O
8
B O O - catechin & TC → sản phẩm trùng hợp không tan / nước
HO O
OH
Fe3+
Fe B
A
OH
O O 4' - TG → không tạo tủa (ph. biệt với tannin TC).
4
(HO) 4'
O
OH (OH)
B 4.2.8. Phản ứng thế trên nhân thơm (của TC)

Fe3+ - TC + halogen (nước brom …) → sản phẩm thế khó tan

4.2.9. Phản ứng với formaldehyd/kiềm (của TC)

(OH) (OH)
- TC + HCHO/OH− → phức keo (làm keo dán gỗ!)
5' 5'
4' O O 4'

B Fe B
HO 7 O 2 2 O 7 OH
3' O O 3'

5
3 OR RO 3
5

OH OH 63 64
 ⊕

4.2.6. Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC) Trong môi trường (MeOH + HCl) hay (BuOH + HCl) nóng,

Với MeOH, EtOH, n-BuOH trong môi trường acid (HCl...) các PAC (ko màu) sẽ bị cắt đứt nối C − C ( ) để cho ra:

a. ở nhiệt độ phòng là đủ 1. các AC⊕ có màu đỏ (từ phần “ngọn” = extension) và

2. ∆’ catechin không màu (từ phần “gốc” = terminal)
Catechin (flavan 3-ol và ∆’) → AC (màu đỏ/H+)
OH
b. ở nhiệt độ nóng (phải đun vài giờ) 1
8
OH HO O
Tannin catechic (PAC) → → AC (màu đỏ/H+). OH
1
HO
8
O
ROH/H+ ∆
4
3
OH cyanidin
OH
(ngọn) OH
(280; 535 nm)
4

Đây còn được gọi là phản ứng alcol-phân (≠ thủy phân),

3
OH
OH
OH OH
2
là một phản ứng oxy-hóa cắt mạch (oxidative cleavage). HO
8
O
OH HO
8
O
2
(gốc) OH
* MeOH + acid yếu (hay dd. đệm): chỉ cắt được nối depsid 4
3 OH ROH/H+ ∆ 4
3 OH
OH
(ko cắt được nối ester bình thường) trong tannin gallic. OH

procyanidin (λmax 280 nm) catechin (277 nm)

* MeOH + acid vô cơ mạnh: cắt được cả nối depsid & ester. 65 66

4.2.7. Phản ứng với thuốc thử Stiasny* 1905, (HCHO + HCl) OH OH OH
H CH2OH
8
8 8
HO O
[Dịch TC loãng] + [th’.thử Stiasny] → tủa vón nặng, màu đỏ gạch. A
OH
HO O
OH
HO O
OH
A A

- Các catechin monomer, dimer... cũng cho tủa (rất lưu ý!).
6
H 6 OH OH HO2HC 6 OH
OH OH OH
- Các tannin pyrogallic (TG) thì không cho tủa vón nặng. + HCHO / H+
catechin 8-methylol + 6-methylol
- Đây là 1 phản ứng đơn giản để phân biệt TG và TC. methylolation

OH condensation
TC (+) là do vòng thơm A còn có H tự do (H-6 và/hay H-8): HO 3
6
A
(a). các vị trí H-6 / H-8 này sẽ cộng hợp với phân tử H-CHO, HO
O OH
8/8-dimer 8/6-dimer 6/6-dimer
8
B OH
(b). sau đó ngưng tụ lại theo nhiều cách khác nhau HO
CH2
B
8
HO O polymerization
(c). để cho nhiều tổ hợp phức polymer có màu nâu đỏ gạch. A
OH

6
3 OH
↓ tổ hợp sản phẩm ↓
OH
Thuốc thử Stiasny (Formaldehyd 37% + HCl đđ.)
được mô tả với 2 tỉ lệ (2 : 1) hay (1 : 1) tùy tài liệu. 67 ví dụ: 8/8-dimer
Theo T. Takano et als (2008), J. Wood Sci., 54, 329-331
 Tham khảo: Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz)
của [catechin − HCHO] và [catechin].
Các aldehyd thơm thường dùng: dimethyl-amino-cinnamaldehyd

HO
8
O (DMACA) hay vanillin. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid.
catechin 7
A
6 Các catechin (và PAC, TC) có H tự do ở 6/8 sẽ tạo phức với
5

OH
adehyd thơm này.
MeO
Me CHO
HCHO
DMACA: N HO CHO : VANILLIN
Me

H H H
O 8 8 8
HO HO HO 8
CH2 −H2O
Ar A A A
8
HO O Ar Ar
CHO H 6
CH 6 6
A
catechin-HCHO OH OH OH OH

OH

69 70

ảo
kh
am
OH
Th
OH Me CHO
H
8 N
HO O HO HO O
OH OH Me
H V + A
Ar C H OH MeO CHO H 6 OH
O OH OH p-dimethylamino-cinnamaldehyd = DMACA

OH OH
H
8
HO O HO HO O
OH OH
H V A

Ar C OH MeO CH 6 OH
OH OH OH OH
−H2O −H2O
OH OH
6 H
HO O O HO 8
O
OH OH
V A

Ar CH OH MeO OH
OH OH
72
 ảo ảo
kh kh
am am
Th Th
DMACA is a dye particularly useful for localization of PACs in plant p-Dimethylaminocinnamaldehyd = DMACA
histology. The use of the reagent results in blue staining.
It can also be used to titrate PACs. A colorimetric assay based upon
the reaction of A-rings with the chromogen.

DMACA has been developed for flavanoids (monomer) in beer that

can be compared with the vanillin procedure.

The DMACA reagent may be superior to the vanillin procedure for

the detection of catechins (monomer!).

DMACA (+) to monomer & polymer of catechins!

The DMACA reagent changes color over several days when exposed
to air but when refrigerated can be stored for up to 2 weeks.

The DMACA reagent # the Renz & Loew reagent.

73 74

4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3

4.2.a. Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3
Với [MeOH + H2SO4], các TG sẽ cho glucose và methyl gallat.
Methyl gallat tiếp tục bị oxy hóa bởi KIO3 → phức màu đỏ.
(đo màu ở 525 – 550 nm).
Tham khảo: methalolysis

4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)

Sau thủy phân, acid gallic tự do được tác dụng với dung dịch
rhodanin/MeOH, trong môi trường kiềm, để cho các sản phẩm
có màu hồng đỏ. (đo màu ở 520 nm).

75 LOD = 1,5 µg methyl gallat 76

 4.2.b. Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)
77
Trong nghiên cứu, việc chiết xuất / phân lập tannin nhằm mục đích:
A. Loại bỏ tannin như 1 tạp phân cực
Phương pháp: Kết tủa tannin với protein, muối kim loại, NH4SO4...
B. Thu được dịch chiết / phân đoạn giàu tannin (hỗn hợp)
Phương pháp: Chiết xuất bằng dung môi phân cực &
Loại bỏ tạp kém ph.cực bằng dung môi kém ph.cực.
C. Thu được 1 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm tannin
Phương pháp: Chiết lấy phân đoạn giàu tannin,
Kết tủa hoặc kết tinh phân đoạn.
Có thể kết hợp với sắc ký (hấp phụ, rây phân tử...)
Đôi khi: Sắc ký HPLC-chế hóa.
79
Lưu ý chung: Do có nhiều nhóm -OH nên tannin rất phân cực !
Nên chọn dung môi chiết, rửa tạp theo hướng sau:
Nói chung, hiệu suất chiết tannin sẽ:
- tăng theo to và pH, theo độ mịn của bột dược liệu.
- tăng nếu được hỗ trợ bởi siêu âm, vi ba (microwave).
- tăng khi có mặt # (5 – 10%) Na2CO3
- giảm khi có mặt của NaCl, NH4SO4
Nếu chiết bằng CO2 siêu tới hạn, cần phải có thêm EtOH, MeOH.
Có thể “thử & sai” theo 1 số cách sau
1. Kết tủa tannin bằng dung dịch protein (gelatin, BSA...)
Cho dd. protein vào dịch chiết giàu nước, khuấy đều, đun nóng,
rồi để nguội. Tannin sẽ bị vón lại (nổi lên khi dùng lòng trắng trứng)
và dễ dàng được tách khỏi dịch chiết.
Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.
2. Hấp phụ tannin vào diatomite (= diatomaceous earth, Kieselguhr)
Với Celite® 545 (Sigma-Aldrich): Dịch chiết + 5% bột Celite (w/w)
Khuấy đều, để lắng, gạn và lọc thu dịch.
Khuyết điểm: chỉ loại được 1 phần tannin.
Nếu tăng % Celite®: có thể bị hấp phụ mất 1 phần chất nghiên cứu.
80

3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat
• Chì acetat kỹ thuật (= đường chì) thường còn lẫn 1 ít PbO.
• Khi hòa tan / nước (max 30%) sẽ tạo Pb(OH)2 làm dung dịch đục
và có tính kiềm (gọi là dung dịch chì acetat kiềm, CAK).
• CAK + AcOH đến khi trong suốt → dd. chì acetat trung tính (CAT).
• CAK có thể kết tủa với hầu hết các polyphenol (CAK ít chọn lọc).
• CAT ưu tiên kết tủa các polyphenol có nhiều nhóm OH kế cận nhau
như o-diphenol, ∆’ catechin, ∆’ galloyl, gallat... (CAT chọn lọc hơn).
81
4. Kết tủa tannin bằng (NH4)2SO4
5. Các phương pháp loại bỏ tannin khác
Có thể kết tủa tannin bằng dung dịch PVPP ở pH ~ 3
83
3. Kết tủa tannin (và polyphenol) bằng dd. Chì acetat (cont.)
Tùy mức độ chọn lọc cần thiết, cho 1 lượng thừa CAK (hay CAT) vào
dịch chiết (có độ cồn < 25%, vì tủa polyphenol-chì có thể tan lại 1
phần trong môi trường chứa nhiều cồn).
Khuấy kỹ, để lắng > 12 giờ. Gạn, rồi lọc bỏ tủa bùn (polyphenol-chì)
Dịch lọc tiếp tục được loại bỏ chì thừa bằng dd. Na2SO4 15%...
......
Chú ý:
- Muối chì rất độc! Nên thận trọng & rất hạn chế sử dụng.
- Dịch chiết cồn thường được cô thu hồi bớt cồn, rồi thêm nước.
82
Không có 1 quy trình chung để chiết xuất các tannin từ mọi
dược liệu. Tuy nhiên, có thể dựa vào sơ đồ chung như sau:
- Chiết tannin = nước nóng, MeOH/EtOH-nước, aceton-nước
- Cô thu hồi bớt dung môi.
- Kết tủa tannin với d. dịch ammoni sulfat bão hòa, lọc lấy tủa.
- Chiết tannin từ tủa này với aceton, lọc lấy dịch aceton,
cô thu hồi aceton → cắn tannin thô.
- rửa cắn tannin thô với Et2O → tannin tinh khiết hơn.
84
Trên thực tế, hay sử dụng ammonium sulfat dưới dạng phân hóa học
SA (phân muối diêm), dạng rắn, để kết tủa tannin...
HPLC
85 86

(PAC) 87 88
 2 3

89 90

Trên thực tế, rất ít khi phân lập 1 tannin tinh khiết (acid tannic).
Rất khó phân lập tannin thành từng cấu tử tinh khiết riêng biệt,
ngay cả khi dùng các kỹ thuật như pHPLC...

Thường sử dụng nhất: Hỗn hợp toàn phần, chứa khoảng < 50%
tannin (công nghiệp thuộc da, keo dán gỗ, nước giải khát...).
Có khi sử dụng ph.đoạn giàu tannin tách từ hỗn hợp dịch chiết.

Có thể tham khảo một sơ đồ nguyên tắc chung như sau:

91 92
 6.1. Định tính chung 6.1.3. Phản ứng với dung dịch gelatin-muối
- 2 loại tannin + d.dịch gelatin-muối → đều cho tủa
6.1.1. Phản ứng với muối kim loại (không chuyên biệt)
(dùng để loại bỏ cả 2 loại tannin TC + TG ra khỏi dịch chiết)
- với d.dịch FeCl3 loãng → xanh rêu / lá / xanh đen
- với d.dịch chì acetat → tủa trắng ngà / vàng
6.1.4. Phản ứng thuộc da (Goldbeater’s skin test)
dd. chì acetat tr.tính → (+) với các ortho-diphenol,
- ngâm da sống vào HCl 2%, rửa = H2O
dd. chì acetat kiềm → (+) với mọi -OH phenol
- nhúng da vào dung dịch tannin trong 5 phút, rửa = H2O
(chì acetat kiềm mạnh hơn chì acetat trung tính).
- + d.dịch FeSO4 loãng → màu nâu, đen (có TG hay TC)
6.1.2. Phản ứng với d.dịch muối alkaloid (quinin ...)
- dịch tannin + d.dịch muối alkaloid → tủa bông trắng. 6.1.5. Phản ứng với dung dịch Phenazon (ít thông dụng)
- d.dịch tannin + Na2HPO4 + Phenazon 2% → tủa màu
94

Nhận diện các pseudo-tannin

6.2. Định tính phân biệt (tannin gallic vs tannin catechic)

Tính chất TG TC

thủy phân được không

độ tan/nước dễ tan kém tan

kiềm chảy → pyrogallol pyrocatechin

+ FeCl3 xanh đen xanh lá *

+ Stiasny không ↓ vón nặng

+ nước Brom không ↓

 Nhận diện tannin gallic & acid (di)gallic tự do Nhận diện catechin tự do, tannin catechic

Thường dùng phản ứng trên gỗ của que diêm (có lignin):
• Nhúng 1 que diêm gỗ (có lignin) vào 1 d.dịch tannin catechic (TC).
• Nhúng tiếp vào d.dịch HCl, hơ nóng kế ngọn lửa → màu hồng pink.
Cơ chế: TC, catechin bị phá vỡ cấu trúc bởi HCl nóng → phloroglucinol.
phloroglucinol + Lignin (của gỗ que diêm) → màu hồng

OH

HO O HO OH
OH
A + HCl ∆ A + lignin
HO HO màu đỏ hồng
Gn O 6 OH
O OH
HO COOH HO CO O Gn O OH
Gn O O Gn
HO HO HO COOH 3 O 1

Gn
(G1) (G2) HO 97 98

6.3. Sắc ký các tannin (SKLM)

Tannin rất phân cực → khó sắc ký / silica gel NP.

• Chuẩn bị mẫu: chiết mẫu bằng aceton-H2O, (ROH-H2O), cô.
Loại chlorophyll & chất béo (thêm nước, lắc với EP, CF, DCM). chebulinic acid
chebulagic acid

Chiết lấy phần tan trong EtOAc (mono & oligomer TC...).
Có thể hòa trong AcCN (acid ellagic sẽ không tan)
• Dung môi khai triển
- với PG: Bz – aceton (6:1)
- với (PG + PC): Bz – HCOOEt – formic (2:7:1)
CF – HCOOEt – formic (1:7:1)
Toluen – CF – aceton (1:1:1)
• Hiện màu: với PG + PC → phun FeCl3 1% (xanh, xanh đen)
với PC → dùng thuốc thử AS (→ đỏ gạch) 100
 6.3. Sắc ký các tannin (sắc ký phân bố)

SKG / SKLM cellulose hay polyamid: thường sắc ký 2 chiều

• Dung môi khai triển 2 chiều

- hệ 1: s-BuOH-AcOH-H2O (14:1:5) đối với TG.
t-BuOH-AcOH-H2O (3:1:1) đối với TC.
- hệ 2: AcOH 6% trong Nước

• Dung môi khai triển 1 chiều

- SKG : hệ n-BuOH-AcOH-H2O (4:1:5; ↑)
- SKLM cellulose : hệ CHCl3-AcOH-H2O (10:9:1)

101

6.3. Sắc ký các tannin (SKLM) 6.5. RP-HPLC các tannin

Nghiên cứu HPLC các tannin PC khó >> tannin PG >> flavonoid
Hiện màu bản mỏng: Phun hoặc nhúng thuốc thử
hay catechin monomer.
- FeCl3 loãng, (FeCl3 + Kali Ferricyanid)
Đã có nhiều ng.cứu HPLC về tannin TG, TC polymer có MW lớn;
- (Vanillin + HCl); VS / AS (Vanillin / Anisaldehyd Sulfuric)
nhưng đến nay (2016) ít có công bố nào cho kết quả thật tốt.
- dung dịch bão hòa KIO3
- dung dịch NaNO3 + AcOH (pha 10% / nước đá) Pha tĩnh : Silica gel RP-18,
Dung môi: (H2O – MeOH), (H2O − AcCN), (MeOH – AcCN)
6.4. Sắc ký rây phân tử các tannin (Sephadex LH-20)

Pha tĩnh : Sephadex LH-20,

Dung môi: (Me2CO – H2O), (H2O – MeOH), (Me2CO – MeOH)

103 104
 acid
chebulinic
acid
chebulagic

HPLC các tannin pyrogallic trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula)
105 106

1: gallic acid
2: gallocatechin
Các catechin chuẩn EGCG
3: epigallocatechin
epicatechin 4: catechin
5: epicatechin
acid 6: EGCG
gallic ECG 7: GCG
catechin 8: ECG
gallocatechin

acid ellagic

Dịch MeOH (0.5 mg/ml)

C2: acid ellagic

C1-4: chất 1-4

107
C.S. Buelga, p. 107
 110

• Các tannin polymer có MW lớn, độ trùng hợp cao rất khó nghiên cứu
phổ NMR (kể cả tannin pyrogallic TG lẫn tannin pyrocatechic TC).
• Các oligomer (vài monomer) đỡ phức tạp hơn.
• Các monomer thường được công bố dữ liệu phổ NMR hơn, ví dụ:

OH
4’-OH 4’3’-OH 4’3’5’-OH OH

HO O
3β-OH afzelechin catechin gallocatechin 2 OH

3 OH
3α-OH epiafzelechin epicatechin epi-gallocatechin
OH

Có thể phân biệt catechin & epicatechin bằng phổ 13C và 1H-NMR
nhờ so sánh bộ tín hiệu của nhóm oxy-methin (>CHO−) ở C-2:
111
 Tham khảo: Sự khác biệt ở C-2 của catechin & epicatechin Tham khảo: Sự khác biệt ở H-2 của catechin & epicatechin

(δc2 > 80 ppm: catechin 2R 3S) (δc2 < 80 ppm: epicatechin 2R 3R)

catechin epicatechin
OH OH
4.5 d 4.8 s
HO O HO O H ax H ax
OH 79.4
OH
82.3 HO HO
2 2

OH OH OH OH
O 3 O 3
OH OH
OH H
OH OH HO OH HO OH
eq
H ax OH
HO O HO O
83.5 OH 76.9 OH

OH OH
OH OH Tham khảo: Tóm tắt sự khác biệt ở H-2 và C-2 của catechin & epicatechin
OH OH
HO O HO O
82.0 OH OH (2R, 3S) catechin (H-2ax, H-3ax) (2R, 3R) epicatechin (H-2ax, H-3eq)
79.3

OH OH
OH OH
δC-2 > 80 ppm δH ~ 4.5 d (7-9 Hz) δC-2 < 80 ppm δH-2 ~ 4.8 s

1H-NMR, MeOD, 400 MHz 1H-NMR, MeOD, 400 MHz

H2O MeOH

H-8 H-6 4,55 d (9 Hz) catechin 4,52 d (9 Hz)

H-2
H-8 H-6

H-2

H-2
H-8 H-6

4,74 s
MeOH

H-8 H-6 H2O

epicatechin
H-2
4,80 s
 OH
H8
HO O
Có thể dùng phổ 1H-NMR để sơ bộ đánh giá về mức độ trùng hợp OH

(mDP) của PAC (tannin pyrocatechic, tannin ngưng tụ). H6 OH

OH
OH
HO O
OH
Nguyên tắc: n
H6 OH
• Cường độ của tín hiệu proton thì tỉ lệ với số lượng proton tương ứng. OH
OH

HO O
• H-6 và H-8 là các proton thơm, xuất hiện ở vùng δ 5,8 – 6,5 ppm OH

• H-4 (là CH2 của phần terminal) xuất hiện ở vùng δ 2,4 – 3,0 ppm H6 OH
OH H4 H
4

• Tỉ lệ giữa cường độ tín hiệu của [các H-6+8] / [H-4 terminal]

(2 + n) + 1 [H6 + H8] [H6 + H8]
sẽ cho ta khái niệm về mức độ trùng hợp (độ lớn) của PAC. = (n + 2) = 2 × −1
2 [H4] [H4]
• mDP càng lớn thì n (và MW) sẽ càng lớn.
(n + 2) được gọi là mức độ trùng hợp của PAC
117 118

Tham khảo chơi, có thể gặp lại ở chương trình Sau đại học

Thực hiện theo Gelotte (1960)

MeOH
- Hòa # 5 mg mẫu thử vào 5 ml nước. Nạp lên cột Sephadex G-25.
- Rửa giải cột bằng nước, tốc độ: 20 phút / 1 phân đoạn 5 ml.
- Theo dõi cột bằng phương pháp đo Abs. ở UV 280 nm.
- Ghi nhận thể tích dung môi rửa giải Vi (ml) của mẫu thử,
terminal - Ước lượng MW của mẫu thử dựa vào đồ thị chuẩn log MW = k.Vi
của 3 chuẩn gồm catechin, rutin, acid tannic (M = 290, 610, 1700)
tiến hành trong cùng điều kiện.

Phổ 1H-NMR (MeOD, 300 MHz) của các PAC / rễ Selliguea feei Ref: M. Mallika, S.C. Dhar (1980), Studies on the oxidation
(Trích Ph.D. Thesis của Fu Cali, 2010, p. 65) of tannins by Aspergillus flavus, J. Biosci., 2(1), pp. 43-48.
119 120
 Các nhóm phương pháp chính:

A. Phương pháp cân C. Phương pháp đo màu

1. Kết tủa với bột da * 5. Với thuốc thử Folin
2. Kết tủa với Đồng acetat 6. Với th’.thử Folin-Ciocalteu *

D. Phương pháp sắc ký

B. Phương pháp thể tích
7. Phương pháp dùng HPLC *
3. Phương pháp Löwenthal *
4. Phương pháp Sisley
E. Các phương pháp khác
5 mg mẫu / 5 ml H2O, cột Sephadex G-25, 20 phút / ph.đoạn 5 ml.
Tannin X (VX = 60 ml; MX ~4600); tannin Y (VY = 85 ml; MY ~1280) 121

7.1. Phương pháp kết tủa với bột da (bột dược liệu qua rây 355)

• Nguyên tắc:
- chiết kiệt tannin bằng nước sôi.
- so sánh lượng chất chiết được của
* dịch chiết chưa loại tannin
* dịch chiết đã hết tannin (tủa = bột da).
- ∆P chính là lượng tannin cần tìm.
• Thực hiện: Xem DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 233.
• Sơ đồ → xem slide kế.

123
hàm lượng tanninoid = (T1 − T2 + T0) × 10 × (100/a) % 124
 • Áp dụng: định lượng (tannin catechic + catechin)

Kết hợp phản ứng với bột da, casein... (để loại ∑ tannin)
và phản ứng với TT Stiasny (để tạo tủa)

- dịch chiết còn tannin + TT Stiasny → tủa (P1)

(X) - dịch chiết hết tannin + TT Stiasny → tủa (P2)
(tannin PC + catechin) → ∆P = (P1 – P2)
(X) là lượng tannin từ a (g) mẫu, với độ pha loãng = (250/25) = 10.
Lượng tannin từ 100 (g) mẫu, không pha loãng → T = X. 10. (100/a)%

125 126

7.2. Phương pháp tủa với đồng acetat (tham khảo) 7.2. Phương pháp tủa với đồng acetat (tiếp, tham khảo)

Có thể kết hợp với ph. pháp chuẩn độ Iod bằng Na2S2O3.
Nguyên tắc :
- chiết tannin = nước, loại pectin (nếu có) = cồn.
- Chiết tannin bằng cồn 60%.
- tannin + dd. Đồng acetat thừa → [Đồng tannat] ↓
- kết tủa tannin bằng một lượng thừa đồng acetat.
- lọc bỏ tủa [Đồng tannat].
- lọc lấy tủa Đồng tannat, sấy và cân → (P1).
- [Đồng acetat thừa / dịch lọc] + [d. dịch KI] → Iod.
- nung tủa Đồng tannat sẽ thu được CuO → (P2).
- lượng tannin trong mẫu thử = (P1 – P2) - chuẩn độ Iod mới sinh bằng dung dịch Na2S2O3.

127 128
 7.3. Phương pháp Löwenthal (1877) * Thực tập Dược liệu *

• Nguyên tắc chung:

- Mẫu được xay về cỡ bột qui định (rây 0,5 mm).
- Chiết kiệt tannin / mẫu bằng nước sôi + đun cách thủy.
- Oxy-hóa tannin / dịch chiết bằng dd. KMnO4 0,1 N / H+
- Chỉ thị màu: sulfo-indigo từ blue → green → màu vàng.
- Làm song song với mẫu trắng (không có mẫu).

• Thực hiện: (Tham khảo giáo trình thực tập).

• Tính kết quả: 1 ml KMnO4 0,1N # 4,157 mg acid tannic ***.

Tham khảo [1] Maynard Joslyn (1950), Methods in Food Analysis: Applied to Plant
Products, Academic Press Inc., New York, 1950. Ch. XIX: Tannins (pp. 471-482),
[2] D.N. Barua, E.A. Houghton Robert (1940) X. Slide kế. và [3] AOAC (1980). 129 130

Chỉ thị màu Indigo

O
N SO3H
dehydro-indigo carmine

HO3S N (dạng oxy-hóa, xanh lá)

O

O
NH SO3H
indigo carmine

HO3S NH ( màu đỏ )
O

HO
NH SO3H
leuco-indigo carmine

HO3S NH (dạng khử, vàng)

OH

131 132

7.4a. Phương pháp thể tích SISLEY (tham khảo)
- tủa tannin bằng Kẽm acetat.
- lọc thu tủa kẽm-tannat, hòa tủa / H2SO4 loãng
- chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N. Chỉ thị Carmin Indigo.
7.4b. Phương pháp thể tích JEAN cải tiến (tham khảo)
- mẫu tannin + lượng chính xác Iod trong 2 giờ.
- chuẩn độ lượng Iod thừa bằng dung dịch Na2S2O3.
- Làm song song với mẫu trắng.
1 g Iod # 1,37 g acid tannic.
133
7.6. Phương pháp so màu, dùng th. thử Folin-Ciocalteu (FCR)
• Nguyên tắc: tạo màu với th’.thử phospho-molybdo-tungstic
- Polyphenol + FCR → màu xanh (λmax 760* nm)
- Lập đường cong chuẩn của dãy d. dịch acid gallic + FCR.
- Dựa vào đường cong chuẩn, xác định hàm lượng phenol
* của d. dịch mẫu chưa loại tannin = (P1)
* của d. dịch mẫu đã loại tannin bằng casein = (P2)
- Hàm lượng taninoid toàn phần = (P1 − P2)
• Thực hiện : DĐVN IV, PHỤ LỤC 12, trang PL 234.
135
7.5. Ph. pháp so màu, dùng th. thử Folin-Denis (1915)
Thuốc thử Folin (= acid Phospho-Wolframic)
Nguyên tắc : Tannin + th.thử Folin → phức xanh
Đo Abs, so với mẫu chuẩn → hàm lượng tannin
(tính quy về một tannin chuẩn, thường là acid gallic/tannic)
Phương pháp không đặc hiệu (polyphenol toàn phần)
Có thể so với 1 mẫu đã loại bỏ tannin bằng gelatin:
• dịch thử + th.thử → phức màu (đo A) → P1
• dịch đã loại tanin + th.thử → phức màu (đo A) → P2
Lượng tannin P = (P1 – P2)
134
1. Chuẩn bị
(1) Thuốc thử Folin-Ciocalteu 1 N (FCR):
Pha loãng gấp đôi (từ lọ FCR 2 N, Merck) với nước cất.
Bảo quản trong chai nâu ở 4 °C.
Thuốc thử màu vàng: OK, có ánh màu xanh: đã hư.
(2) Dung dịch Na2CO3 (20% trong nước cất)
(3) Insoluble polyvinyl polypyrrolidone (PVPP, của Sigma).
(4) D.dịch chuẩn acid tannic (0.1 mg/ml H2O): Dùng loại mới pha.
2. Thiết lập đường cong chuẩn
(Với dãy dd. acid tannic TA, xem bảng & đồ thị ở 2 slides sau)
136
 Thiết lập đường chuẩn (theo acid tannic, TA)
Bảng số liệu đường chuẩn (FCR method)
(Để định lượng polyphenol nói chung)

TA (0,1 mg/ml) H2O FCR Na2CO3 20% Abs. TA

Ống 0,538
(ml) (ml) (ml) (ml) (ở 725 nm) (µg)

chứng 0,00 0,50 0,25 1,25 0,000 0 0,432

1 0,02 0,48 0,25 1,25 0,112 2

0,348

2 0,04 0,46 0,25 1,25 0,218 4

0,327
0,218
3 0,06 0,44 0,25 1,25 0,327 6

0,112
4 0,08 0,42 0,25 1,25 0,432 8

5 0,10 0,40 0,25 1,25 0,538 10

6,4 mg acid tannic

137 138

3. Xác định x% phenol toàn phần (nội suy)

Pha mẫu đo: Nên bắt đầu từ 0,02 − 0,05 − 0,10 ml dịch chiết.
Sau đó tuần tự:
• (+ nước vđ 0,5 ml) rồi (+ 0,25 ml FCR) rồi (+ 1,25 ml Na2CO3).
• Lắc đều, để yên đúng 30 phút và đo Abs. ở 725 nm.
• Nội suy lượng phenol toàn phần từ đường chuẩn (theo acid tannic).
• Kết quả ghi theo x% trên dược liệu đã trừ độ ẩm.
Ví dụ:
Dùng 0,05 ml dịch thử # 1,00 mg dược liệu. Đo được Abs = 0,348.
Nội suy từ đường chuẩn: Abs 0,348 tương ứng # 6,4 µg acid tannic.
Vậy 5 ml dịch thử # 100 mg dược liệu # 0,64 mg TA → x0 = 0,64%
Nếu dược liệu có độ ẩm 10% thì kết quả x = 0,64 / 0,90 = 0,71%.
139
Polyphenols react with Folin-Ciocalteu reagent (FCR) to form a blue complex that
can be quantified by visible-light spectrophotometry.
The reaction forms a blue chromophore constituted by a phosphotungstic and
phosphomolybdic complex, where the max absorption of the chromophores
depends on the alkaline solution and the concentration of phenolic compounds.
This reagent rapidly decomposes in alkaline solutions, which makes it necessary to
use an enormous excess of the reagent to obtain a complete reaction. This excess
can result in precipitates and high turbidity, making the analysis impossible.
To solve this problem, FCR included Lithium salts, which prevented the turbidity.
The reaction generally provides accurate and specific data for several groups of
phenolic compounds, because many compounds change color differently due to
differences in unit mass and reaction kinetics.
Many studies have discussed the use of the FCR to determine polyphenols, and the
general or specific value of the method, because some specific details may be
modified.
It is named after Otto Folin, Vintilă Ciocâlteu, and Willey Glover Denis.
140
 Total phenolic content (TPC / FCR).

FCR = (Phosphotungstic + Phosphomolybdic + Li+ salt)

Phenolics + FCR / basic → Blue complex (λmax ~780* nm).
0.50 mL extract + 3.0 mL H2O + 0.25 mL FCR.
Immediately, add 0.75 mL of satd. Na2CO3 + 0.95 mL H2O.
Incubate 37 ºC x 30 min., read Abs. at 765 nm.
Compared to a standard curve (gallic acid solution).
The TPC was expressed as mg of gallic acid equivalents
per gram of fresh weight (mg GAE / g FW).

141 142

Tannin khá phổ biến / thực vật bậc cao (cả Ngành Hạt kín & Hạt trần). Trong cây, thường gặp chủ yếu là 1 loại tannin (catechic >> gallic)
Trong Ngành Hạt kín, tannin có ở cả 2 Lớp (Lớp Hai & Lớp Một lá mầm) Một số cây lại chứa cả 2 loại tannin này (lá Bàng, lá Ổi, Đại hoàng...)

A. Lớp Hai lá mầm (đã gặp # 180 họ có chứa tannin), đáng chú ý:
Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Bixaceae,
Burseraceae, Combretaceae, Ericaceae, Fabaceae,
Fagaceae, Dipterocarpaceae, Myricaceae, Myrtaceae...
Khoảng 5% các cây thuộc họ Solanaceae, Asteraceae là có chứa tannin.
Hàm lượng tannin thường thì
- không cao ở họ Boraginaceae, Cucurbitaceae, Papaveraceae
- rất cao trong các hạch lá (Sồi), hạch cành (Ngũ bội tử...)
B. Lớp Một lá mầm (đã gặp # 44 họ có chứa tannin) đáng chú ý:
Họ Najadaceae & Họ Typhaceae.
143
Có thể gặp tannin trong nhiều bộ phận của cây
• rễ, rễ củ (Đại hoàng, Hà thủ ô đỏ...)
• thân (Keo Wattle = Acacia spp., Dẻ Chestnut = Castanea spp...)
• vỏ thân (Chiêu liêu, Quebracho, Hemlock Tsuga spp., Sồi, Đước...)
• lá (Chè xanh, Bàng, Bạch đàn, Ổi, Sim, Mua...)
• quả (Chiêu liêu, Cau, Dẻ, Lựu, Măng cụt, Ổi...)
• hạt (Ca cao, Cau, Keo Wattle Acacia spp., Nho...)
• hạch lá nutgalls (Sồi Quercus spp...),
• hạch cành galls (Muối, Ngũ bội tử Rhus semialata...)
144
Tannin được khai thác duy nhất từ các nguồn thực vật tự nhiên.
Các lĩnh vực tiêu thụ nhiều tannin:
Sản lượng toàn cầu hàng năm: # 200.000 tấn tannin (A. Pizzi, 2003).
- Thuộc da: # 60% (tannin chiếm #30% P của da thuộc).
Trong số này, 90% là tannin catechic.
- Làm keo dán gỗ (ván ép), dán plastic; làm mực,
Đáng chú ý nhất là từ các nguồn:
- Khoan mỏ, đánh bóng & chống ăn mòn kim loại
A. Gỗ cây Mẻ rìu Quebracho (Schinopsis balansae, S. lorentzii)
- Làm trong rượu bia & nước ép trái cây,
chủ yếu được sản xuất từ Argentina, Brazil
- Gây đông kết cao su
B. Vỏ cây Keo Wattle (Acacia mearnsii): chủ yếu từ Nam Phi, Brazil
C. Gỗ cây Dẻ Chestnut (Castanea spp.): từ Trung quốc, Châu Âu
D. Quả Chiêu liêu (Terminalia chebula): từ Ấn Độ, Châu Âu... Tannin dễ phân hủy thành các phenol đơn giản rất bền,
E. Vỏ Thông (Pinus maritima, Pháp; P. radiata, Úc & New Zealand), có thể gây ô nhiễm môi trường:
vỏ 1 số loài Hemlock (Tsuga spp.) - acid hóa & gây hại với vi sinh vật / đất, làm đất bạc màu,
- làm sậm màu các nguồn nước (và da sinh vật tại chỗ)
145 146

- tạo màng / niêm mạc → bôi ngoài làm thuốc săn da

(dạng tannoform = tannin + formol).
- trị phỏng, vết do rắn***, côn trùng cắn
- kháng khuẩn → trị loét (miệng, da; + acid picric loãng)
- cầm máu (đắp lên vết thương, xịt vào búi trĩ hậu môn).
- trị ngộ độc alkaloid, kim loại nặng (+ KMnO4 làm ddịch súc ruột)
- trị viêm ruột, trị tiêu chảy (tannat albumin, tannat gelatin) Học kỹ : Ngũ bội tử.
- antioxidant (EGCG / Chè xanh), ngừa bệnh mạch vành (rượu Nho)
Đọc thêm : Ổi, Măng cụt.
- trị sỏi thận (Quercus stenophylla → Urocalun®, Nhật, từ 1969)

However, to-date, neither the FDA nor the EFSA (European Food
Safety Authority) have approved any health claim for bioflavonoids
or approved them as pharmaceutical drugs. (FDA, Nov. 2013).
147
149 150

Nutgalls / Sồi (Quercus infectoria, Fagaceae)

151 152