TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.

HCM
KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
˗˗˗˗˗˗˗˗˗˗

BÁO CÁO CUỐI KỲ

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

HÓA SINH THỰC PHẨM
MÃ LỚP HỌC PHẦN: PFCB412750_22_2_08CLC
GVHD: TS. VŨ TRẦN KHÁNH LINH
HỌC KỲ: 2 – NĂM HỌC: 2022 – 2023
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
1. Lê Hữu Thuận 21116122
2. Nguyễn Ngọc Trinh 21116132
3. Phạm Viết Trung 21116378
4. Lê Thanh Uyên 21116380

Tp. Thủ Đức, tháng 04 năm 2023

 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA VIẾT BÁO CÁO
HỌC KỲ: 2 – NĂM HỌC: 2022 – 2023
1. Mã môn học: PFCB412750_22_2_08CLC
2. Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Trần Khánh Linh
3. Danh sách thành viên nhóm viết báo cáo cuối kỳ:
STT HỌ VÀ TÊN MSSV TỶ LỆ % HOÀN THÀNH

1 Lê Hữu Thuận 21116122 75%

2 Nguyễn Ngọc Trinh 21116132 100%

3 Phạm Viết Trung 21116378 100%

4 Lê Thanh Uyên 21116380 100%

Ghi chú:
• Tỷ lệ % = 100%: Mức độ phần trăm của từng sinh viên tham gia được đánh giá
bởi nhóm trưởng và thống nhất giữa các thành viên trong nhóm.
• Trưởng nhóm: Lê Thanh Uyên SĐT: 0356711168

Điểm số: ............................................................................................................................

Nhận xét của giảng viên:
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
TP. Thủ Đức, ngày 17 tháng 04 năm 2023
Chữ ký xác nhận của giảng viên
 MỤC LỤC
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE
THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH ............................................................... 1
1. Mục tiêu bài thí nghiệm .........................................................................................1
2. Tổng quan về enzyme alpha amylase ...................................................................1
3. Nguyên tắc...............................................................................................................1
4. Dụng cụ & thiết bị thí nghiệm...............................................................................2
4.1. Dụng cụ .............................................................................................................2
4.2. Thiết bị ..............................................................................................................2
5. Tiến hành thí nghiệm .............................................................................................2
5.1. Chuẩn bị dung dịch .........................................................................................2
5.2. Tiến hành thí nghiệm .......................................................................................3
6. Kết quả và tính toán ...............................................................................................4
6.1. Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 30 phút ở 37oC.................4
6.2. Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 20 phút ở 37oC.................5
6.3. Tính toán ...........................................................................................................5
7. Nhận xét ..................................................................................................................6
8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục .......................................................7
8.1. Nguyên nhân sai số ..........................................................................................7
8.2. Biện pháp khắc phục .......................................................................................7
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE ....................... 9
1. Mục tiêu bài thí nghiệm .........................................................................................9
2. Tổng quan về enzyme lipase ..................................................................................9
3. Nguyên tắc...............................................................................................................9
4. Dụng cụ thí nghiệm ..............................................................................................10
4.1. Dụng cụ ...........................................................................................................10
4.2. Thiết bị ............................................................................................................10
5. Tiến hành thí nghiệm ...........................................................................................10
5.3. Chuẩn bị dung dịch .......................................................................................10
5.2. Tiến hành thí nghiệm ..................................................................................... 11
6. Kết quả và tính toán .............................................................................................13
7. Nhận xét ................................................................................................................15
8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục .....................................................16
8.1. Nguyên nhân sai số ........................................................................................16
8.2. Biện pháp khắc phục .....................................................................................16
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE ............ 17
1. Mục tiêu bài thí nghiệm .......................................................................................17
2. Tổng quan về enzyme invertase ..........................................................................17
3. Nguyên tắc.............................................................................................................17
4. Dụng cụ thí nghiệm ..............................................................................................18
4.1. Dụng cụ ...........................................................................................................18
4.2. Thiết bị ............................................................................................................18
5. Tiến hành thí nghiệm ...........................................................................................18
5.1. Chuẩn bị dung dịch .......................................................................................18
5.2. Tiến hành thí nghiệm .....................................................................................20
6. Kết quả và tính toán .............................................................................................20
7. Nhận xét ................................................................................................................22
8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục .....................................................23
8.1. Nguyên nhân sai số ........................................................................................23
8.2. Biện pháp khắc phục .....................................................................................23
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH
HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE................................................................................. 24
1. Mục tiêu bài thí nghiệm .......................................................................................24
2. Tổng quan về enzyme urease...............................................................................24
3. Nguyên tắc thực hiện thí nghiệm ........................................................................24
4. Dụng cụ thí nghiệm ..............................................................................................25
4.1. Dụng cụ ...........................................................................................................25
4.2. Thiết bị ............................................................................................................25
5. Tiến hành thí nghiệm ...........................................................................................25
5.1. Chuẩn bị dung dịch .......................................................................................25
5.2. Tiến hành thí nghiệm .....................................................................................26
5.2.1. Thí nghiệm khảo sát động học................................................................26
5.2.2. Thí nghiệm xác định hoạt độ ..................................................................27
6. Kết quả và tính toán .............................................................................................27
6.1. Thí nghiệm khảo sát động học enzyme Urease ...........................................28
6.2. Thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme Urease ..............................................32
7. Nhận xét ................................................................................................................33
7.1. Khảo sát động học enzyme Urease ...............................................................33
7.2. Xác định hoạt độ enzyme Urease .................................................................34
8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục .....................................................34
 8.1. Nguyên nhân sai số ........................................................................................34
8.2. Biện pháp khắc phục .....................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 35
 DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng kết quả màu sắc của dãy ống nghiệm có thời gian thủy phân 30 phút ..4
Bảng 1.2. Bảng kết quả màu sắc ống nghiệm có thời gian thủy phân 20 phút ...............5
Bảng 2.1. Kết quả chuẩn độ của ba bình kiểm chứng ...................................................13
Bảng 2.2. Kết quả chuẩn độ của ba bình thí nghiệm .....................................................13
Bảng 3.1. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành .........20
Bảng 3.2. Kết quả định phân .........................................................................................20
Bảng 4.1. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo sát
động học ........................................................................................................................27
Bảng 4.2. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo sát
hoạt độ enzyme ..............................................................................................................27
Bảng 4.3. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung
dịch sau quá trình thủy phân ở 30oC..............................................................................28
Bảng 4.4. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung
dịch sau quá trình thủy phân ở 40oC..............................................................................28
Bảng 4.5. Kết quả tính toán khảo sát động học ở 300C: ................................................29
Bảng 4.6. Kết quả tính toán khảo sát động học ở 400C .................................................30
Bảng 4.7. So sánh số mol ure bị thủy phân theo nồng độ ban đầu ở 300C và 400C ......31
Bảng 4.8. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ ba bình erlen chứa hỗn hợp dung dịch
sau quá trình thủy phân ở 40oC .....................................................................................32
 DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 20 phút ở 37oC ..................5
Hình 1.2. Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 20 phút ở 37oC ..................5
Hình 2.1. Phản ứng thủy phân của lipid xúc tác bởi enzyme Lipase ..............................9
Hình 2.2. Sáu bình erlen chứa bột đậu nành sau khi cho phản ứng hoàn toàn (sau 24 giờ)
ở 300C ............................................................................................................................13
Hình 2.3. Bình kiểm chứng sau khi chuẩn độ bằng NaOH ...........................................14
Hình 2.4. Bình thí nghiệm sau khi chuẩn độ bằng NaOH .............................................14
Hình 3.1 Ba bình erlen trước khi định phân với Na2S2O3 0,05N ..................................22
Hình 4.1. Phản ứng thủy phân urea xúc tác bằng urease...............................................24
Hình 4.2. Phản ứng tạo acid carbonic............................................................................24
Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 300C ............29
Hình 4.4. Dãy erlen khảo sát động học enzyme urease ở 300C sau khi định phân với
NaOH 0,05N ..................................................................................................................30
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 400C ............30
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn lượng ure bị thủy phân theo nồng độ ure ban đầu ở 300C và
400C ...............................................................................................................................31
Hình 4.7. Dãy erlen khảo sát hoạt độ enzyme urease ở 300C .......................................33
 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE
THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

1. Mục tiêu bài thí nghiệm

Bài thí nghiệm được thực hiện nhằm mục tiêu xác định khả năng thủy phân thủy
phân tinh bột thành các dextrin ngắn.
Khảo sát được hoạt độ của enzyme 𝛼-amylase có trong malt.
Nắm được các bước tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme 𝛼-amylase.

2. Tổng quan về enzyme alpha amylase

Enzyme alpha amylase có số EC: EC 3.2.1.1. Đây là một enzyme có khả năng
thủy phân ngẫu nhiên liên kết 𝛼-1,4 glycosidic trong tinh bột để tạo thành các đoạn
dextrin ngắn.
Vai trò của enzyme amylase:
+ Alpha amylase có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân của tinh bột có trong
các hạt thành các đoạn dextrin ngắn giúp cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết
cho việc nảy mầm.
+ Xúc tác cho quá trình tiêu hóa và hấp thu tinh bột ở ruột non dễ dàng hơn.
+ Đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp, nhất là ngành công nghệ thực
phẩm. Sử dụng nhiều nhất trong sản xuất rượu bia, mạch nha và bánh mì...
Enzyme 𝛼-amylase phổ biến, rộng rãi trong các sinh vật sống. Có trong hệ thống
tiêu hóa của con người và nhiều động vật có vú khác. Đối với thực vật, 𝛼-amylase có
trong các loại hạt nói chung và đại mạch nói riêng. Thông thường những hạt đại mạch
chưa nảy mầm không có hoặc có rất ít hoạt độ amylase, tuy nhiên trong suốt quá trình
nảy mầm của hạt hoạt độ amylase tăng đáng kể.

3. Nguyên tắc
Sự thủy phân tinh bột của 𝛼 – amylase có thể được tóm gọn thông qua phương
trình phản ứng sau:
α−amylase
Tinh bột → Dextrin phân tử lượng thấp
Bài thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp Wohlgemuth dựa trên nguyên
tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột thành dextrin.
Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh
bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa. Dùng Iodine 0,3% để kiểm
1
tra sự có mặt của tinh bột, nếu trong mẫu thí nghiệm vẫn còn xuất hiện phức chất màu
tím xanh chứng tỏ enzyme alpha-amylase vẫn chưa thủy phân hết lượng tinh bột có
trong mẫu.

4. Dụng cụ & thiết bị thí nghiệm

4.1. Dụng cụ
Ống nghiệm – 21 ống Phễu thủy tinh
Erlen 100 – 250mL Giấy lọc
Pippet 1mL Cối chày sứ
Micropipet 1000μm
4.2. Thiết bị
Tủ sấy Memmert
Máy lắc ổn định nhiệt Jeio Tech

5. Tiến hành thí nghiệm

5.1. Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha
Cân 0.5g NaCl trong becher 50mL sau đó hòa tan NaCl
với nước cất, cho dung dịch trên vào bình định mức
NaCl 0.5% 100mL
100mL, tráng đều becher 3 lần và định mức dung dịch
đến 100mL.

Cân 0.5g tinh bột trong becher và cho 100mL nước vào,
khuấy đều sau đó đun cách thủy trong 15 phút, trong quá
Tinh bột
100mL trình đun luôn dùng đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch
0.5%
cho đến khi dung dịch trong. Để dung dịch nguội rồi cho
vào bình định mức định mức đến 100mL.
Cân 3g KI trong becher 100mL sau đó hòa tan với 50 mL
nước, khuấy đều cho KI tan hết sau đó cân 0.3g I2 và cho
Iodine 0,3% vào dung dịch KI (do I2 không tan trong nước), khuấy
100mL
trong KI 3% đều để I2 tan hoàn toàn, chuyển dung dung dịch vào bình
định mức, tráng becher và định mức với nước cất cho đủ
100mL.

2
5.2. Tiến hành thí nghiệm

a) Chuẩn bị dịch chiết amylase

10(g) malt Nghiền

(cả vỏ)

Nước cất Bình định

Định mức lên 100ml
mức

Lắc kỹ
(15 phút)

Lọc Dịch chiết

(2 lần giấy lọc) amylase

Sơ đồ 1.1. Sơ đồ quy trình chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase

b) Thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme amylase

Sơ đồ 1.2. Sơ đồ quy trình khảo sát hoạt độ enzyme amylase

3
 ‾ Lấy 21 ống nghiệm đánh số thứ tự để chia thành hai dãy ống nghiệm
Một dãy đánh số từ 1 đến 10 có thời gian thủy phân 30 phút
Một dãy đánh số từ 1’ đến 10’ có thời gian thủy phân 20 phút
‾ Hút 10mL dung dịch NaCl 0,5% vào mỗi ống nghiệm
‾ Cho 1mL dung dịch chứa amylase vào ống nghiệm (1) và (1’), lắc kỹ
‾ Hút 1mL dung dịch từ ống nghiệm (1) (hay (1’)) vào ống nghiệm (2) (hay (2’)),
lắc kỹ.
Tiếp tục tiến hành lần lượt cho đến ống nghiệm (10) (hay (10’))
‾ Hút bỏ 1mL dung dịch trong ống nghiệm (10) và (10’)
‾ Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1mL hồ tinh bột 0,5%
(Tiến hành tương tự với dãy 1’ đến 10’)
‾ Chuyển các dãy ống nghiệm vào máy lắc ở 370C trong đó:
Dãy 1 đến 10 : lắc 30 phút
Dãy 1’ đến 10’ : lắc 20 phút
‾ Sau khi lấy ống nghiệm ra, cột các ống nghiệm thành từng cụm theo số chẵn,
dùng giấy bạc để bịt miệng ống nghiệm và đem đi đun cách thủy trong 10 phút.
‾ Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 2 giọt Iodine trong KI, lắc đều
‾ Đối với ống kiểm chứng (ống nghiệm thứ 11) cho 3mL nước cất và 3 giọt thuốc
thử Iodine.
‾ So sánh màu của các ống nghiệm trong cùng một dãy. Xác định ống nghiệm có
nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột.

6. Kết quả và tính toán

6.1. Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 30 phút ở 37oC

Bảng 1.1. Bảng kết quả màu sắc của dãy ống nghiệm có thời gian thủy phân 30 phút

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Độ pha loãng 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

Nồng độ
n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
enzyme
Màu V V V V V N Đ T X X

Chú thích: vàng (V), nâu (N), đỏ (Đ), xanh (X), tím (T)

4
 Hình 1.1. Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 30 phút ở 37oC
6.2. Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 20 phút ở 37oC
Bảng 1.2. Bảng kết quả màu sắc ống nghiệm có thời gian thủy phân 20 phút
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Độ pha loãng 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Nồng độ
n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
enzyme
Màu V V V V N Đ T X X X
Chú thích: vàng (V), nâu (N), đỏ (Đ), xanh (X), tím (T)

Hình 1.2. Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 20 phút ở 37oC
6.3. Tính toán
Lượng enzyme cho vào ống nghiệm 1:
V1 1
n=m × = 10000 × = 125 (mg)
V2 80

Một đơn vị Wohlgemuth (W):

Gọi W1, W2 lần lượt là một đơn vị Wohlgemuth ở 20 phút và 30 phút
5
 n 125
W1 = = = 3,125
F ×5 8 ×5
n 125
W2 = = = 3,125
F ×5 8 ×5
Một đơn vị Wohlgemuth có trong 1mL dịch chiết enzyme (NW):
Gọi NW1, NW2 lần lượt là một đơn vị Wohlgemuth có trong 1mL dịch chiết
enzyme ở 20 phút và 30 phút
n 125
NW1 = = = 40
V1 × W 1 × 3,125
n 125
NW2 = = = 40
V1 × W 1 × 3,125
Trong đó:
V1 : Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm 1 (1mL)
V2 : Thể tích dịch chiết enzyme (100mL)
m : Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg)
F : Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân
hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với ống nghiệm 11).
(ống nghiệm số 3 là ống nghiệm có màu trùng với ống nghiệm số 11).

7. Nhận xét
Cho mỗi ống 1mL dd NaCl 0,5% để tạo môi trường cho enzyme phân giải vì
muối NaCl là muối acid mạnh nên phân ly hoàn toàn trong nước tạo thành ion Cl-. Cl-
là chất hoạt hóa để làm tăng hoạt độ của enzyme alpha amylase.
Các ống nghiệm có màu vàng vì tinh bột trong ống nghiệm đã được thủy phân
thành dextrin hoàn toàn. Do đó dung dịch trong ống nghiệm không tạo phức với Iodine.
Vì vậy dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng của dung dịch iodine.
Các ống nghiệm cho màu xanh vì tinh bột trong ống nghiệm không thủy phân
hoặc thủy phân rất ít. Do đó dung dịch chứa tinh bột trong ống nghiệm tạo phức với
iodine làm cho dung dịch có màu xanh.
Các ống nghiệm cho nàu nâu vì tinh bột trong ống nghiệm chưa được thủy phân
hoàn toàn, một phần tinh bột được thủy phân thành Dextrin. Vì vậy, dung dịch có màu
nâu.

6
 Các ống nghiệm cho màu đỏ vì tinh bột trong ống nghiệm chưa được thủy phân
hoàn toàn. Lượng tinh bột bị thủy phân ít hơn so với những ống có màu nâu. Vì vậy
dung dịch có màu đỏ.
Ống nghiệm có màu xanh càng đậm chứng tỏ lượng tinh bột bị thủy phân càng ít
và lượng enzyme càng loãng.
Thời gian cũng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme. Thời gian càng
tăng thì tinh bột thủy phân càng nhiều. So sánh ống nghiệm số 6 của hai quá trình ta
thấy:
+ Ống nghiệm 6 (20 phút) có màu nâu đỏ chứng tỏ rằng lượng tinh bột bên trong
tinh bột vẫn còn nên có phản ứng tạo phức với I2.
+ Ống nghiệm 6 (30 phút) có màu vàng nâu chứng tỏ rằng lượng tinh bột bên trong
chưa được thủy phân hoàn toàn nên có phản ứng tạo phức với I2 và màu vàng là
màu của I2 trong KI nhưng có thể do bên trong nó còn amylopectin nên có màu
vàng đậm hơn các ống còn lại. Vì amylopectin phản ứng với I2 tạo màu đỏ cam
nhưng với một lượng ít nên màu đỏ cam không thể hiện rõ nên chúng ta chỉ thấy
màu vàng đậm hơn.
Thao tác của phương pháp Wohlgemuth dễ thực hiện và kết quả dễ quan sát
nhưng phương pháp này cũng dễ sai do thao tác chiết dịch không đúng hoặc lấy mẫu sai
hoặc do hoặc nhầm lẫn trong lúc pha loãng dung dịch qua các ống nghiệm.

8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục

8.1. Nguyên nhân sai số
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có thể nhóm chúng em đã gặp phải một số
sai sót dẫn đến màu của dung dịch chưa chuẩn, nguyên nhân có thể do:
‾ Tính toán thời gian chưa thật sự chính xác
‾ Chưa phối hợp nhịp nhàng, các thao tác chưa chuẩn
‾ Dụng cụ thí nghiệm chưa được vệ sinh kỹ
‾ Lượng dung dịch được lấy có thể có sự chênh lệch nhỏ dẫn đến sai số
‾ Nhầm lẫn trong quá trình pha loãng mẫu qua các ống nghiệm
‾ Chuẩn bị dịch chiết enzyme sai
8.2. Biện pháp khắc phục
‾ Vệ sinh thật sạch các dụng cụ thí nghiệm
‾ Tiến hành thí nghiệm nhanh chóng, cẩn thận, chính xác
7
‾ Luyện tập lấy hóa chất chuẩn và chính xác
‾ Cẩn thận trong quá trình pha loãng mẫu

8
 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE

1. Mục tiêu bài thí nghiệm

Xác định hoạt độ lipase có trong mẫu
Hiểu và giải thích được các hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm
Nắm rõ các thao tác trong thí nghiệm
2. Tổng quan về enzyme lipase
Lipase (Triacylglycerol Acylhydrolase) có EC 3.1.1.3 thuộc lớp hydrolase, là
enzyme hoạt động trong các mô lưu trữ lipid trong hạt trong quá trình nảy mầm
Lipase có thể tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol lưu trữ
thành acid béo, được chuyển thành đường, acid amin và chuỗi carbon cần thiết để hỗ trợ
sự phát triển của phôi.
Lipase được phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật
Lipase vi sinh vật được một số tác giả thu nhận được từ Pseudomonas, Bacillus
sp. LBN 4, …
Ở động vật, lipase được thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn và
một số loại cá.
Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng nhờ vào giá thành thấp, có
tính đặc hiệu, dễ dàng được chấp nhận, …

3. Nguyên tắc
Dưới tác động của enzyme lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo. Hàm
lượng acid được chuẩn độ bằng dung dịch kiềm (NaOH). Hoạt độ của enzyme là lượng
kiềm cần để trung hòa acid mới được hình thành.

Hình 2.1. Phản ứng thủy phân của lipid xúc tác bởi enzyme Lipase

9
4. Dụng cụ thí nghiệm
4.1. Dụng cụ
Cối xay Ống đong 100mL
Erlen 100mL Burret 25mL
Pippet 5mL, 10mL Becher 100mL, 250mL
4.2. Thiết bị
Tủ hút
Tủ sấy Memmert
Máy lắc ổn định nhiệt Jeio Tech

5. Tiến hành thí nghiệm

5.3. Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha
Chế 50mL dung dịch đệm acetate pH = 4,7 vào becher
50mL.
Đệm acetate (Để pha dung dịch đệm acetate có pH = 7 cần tiến hành
50mL
pH = 4,7 trộn CH3COOH 0,1N cùng với CH3COONa 0,1N theo
tỷ lệ 1:1)

Cồn 960 200mL Dùng ống 100mL đong để đong 2 lần cồn 960

Chế khoảng 10mL dung dịch Toluen vào becher 50mL

Toluen 100mL (Tiến hành trong tủ hút)

Chế 100mL dung dịch ether ethylic vào becher 100mL

(Không nên chế quá sớm do dung môi có thể bay hơi,
Ether ethylic 100mL
hoặc chế vào becher và dùng giấy bạc bọc lại)

Dầu đậu nành

10mL Chế 10mL dầu đậu nành vào becher 50ml
tinh khiết

10
 Cân 0,4g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với
nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức 100mL,
NaOH 0,1N 100mL tráng đều becher và định mức với nước cất cho đủ
100mL dung dịch.

Cân 5g đậu nành trên becher 50mL sau đó chuyển vào

cối xay đã được làm mát trong tủ lạnh, xay hạt đậu nành
thành bột mịn. (Quá trình xay cần nhấn nút xay từ từ,
đợt, không nên xay liên tục do lực ma sát lớn làm tăng
Mẫu đậu nành 100mL nhiệt độ bên trong sẽ làm mất hoạt tính của enzyme
lipase).
Rửa sạch cối xay và lau khô, cho 5g đậu nành và tiến
hành tương tự cho những bình còn lại.

5.2. Tiến hành thí nghiệm

‾ Cho vào sáu erlen chứa đậu nành đã xay mịn 10mL nước cất, lắc đều trong 15
phút ở 30oC.
‾ Lấy ra 3 bình đánh số (1), (2) và (3) để đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt
tính enzyme trước khi cho cơ chất vào.
‾ Thêm 1mL dầu đậu nành vào 6 erlen để làm cơ chất, 5mL đệm acetate và nhỏ ba
giọt toluen vào (cần tiến hành nhanh chóng, chính xác) sau đó cho vào máy lắc
chỉnh nhiệt độ ở 30oC trong 24 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
‾ Khi hết thời gian phản ứng, lấy 6 erlen ra và cho vào mỗi bình 25ml cồn 96o và
15mL ether, lắc đều và để yên 2 phút.
‾ Chuẩn độ dung dịch trong erlen bằng NaOH 0,1N
Do sự thay đổi màu khó quan sát do đó không dùng phenolphthalein 1% làm chỉ
thị, thay vào đó vừa tiến hành chuẩn độ vừa đo pH, khi pH = 7 thì dừng lại.
‾ Đọc thể tích NaOH dùng để chuẩn độ.

11
 Đậu nành

Định lượng (5g)

Xay mịn

Chuyển vào erlen

Cho 10mL nước cất

Lắc đều (15 phút)

Bình kiểm chứng Bình thí nghiệm

Đun cách thủy

Cho 5mL đệm
(10 phút) acetate
Dầu đậu nành
0
Lắc (30 C, 24h) (1mL)
Cồn 960
(25mL)
Cho 25mL ether Toluen
Ether ethylic (3 giọt)
ethylic
Lắc (2 phút)
(15mL)

Chuẩn độ bằng
NaOH 0,1N

Đọc thể tích NaOH

Sơ đồ 2.1. Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme lipase

12
6. Kết quả và tính toán
Bảng 2.1. Kết quả chuẩn độ của ba bình kiểm chứng
Bình (1) (2) (3)

Thể tích NaOH dùng để 2,25 1,96 2,7

chuẩn độ (mL)
pH ban đầu của dung dịch 6,45 6,65 6,45
pH lúc sau của dung dịch 7,01 7,01 7,00

Bảng 2.2. Kết quả chuẩn độ của ba bình thí nghiệm

Bình (5) (6) (7)

Thể tích NaOH dùng để 18,55 16,5 17,3

chuẩn độ (mL)
pH ban đầu của dung dịch 5,58 5,67 5,57
pH lúc sau của dung dịch 7,01 7,07 7,02

Hình 2.2. Sáu bình erlen chứa bột đậu nành sau khi cho phản ứng hoàn toàn (sau 24
giờ) ở 300C
13
 Hình 2.3. Bình kiểm chứng sau khi chuẩn độ bằng NaOH

Hình 2.4. Bình thí nghiệm sau khi chuẩn độ bằng NaOH
Hoạt độ của enzyme lipase (X) được biểu thị bằng số mL NaOH 0.1N dùng để
chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra bởi enzyme Lipase trích được từ 10g hạt đậu nành

14
thủy phân trong 24 giờ.
X = (a – b) × 10 × k/m
Trong đó:
a: số mL NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm
b: số mL NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng
k: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
m: khối lượng hạt sử dụng
Khối lượng NaOH cân được để pha 100mL dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ sáu bình:
0,4041 (g)
Nồng độ NaOH tính được từ khối lượng cân được:
m 0,4041 100
CM (thực tế) = ( ) /V = ( )/( ) = 0,101 (M)
M 40 1000
Do hệ số đương lượng bằng 1 nên nồng độ đương lượng thực tế của NaOH
CN (thực tế) = CM (thực tế) = 0,101 (N)
CN (thực tế) 0,101
Hệ số hiệu chỉnh: k = = = 1,01
CN (lý thuyết) 0,1

Thể tích NaOH trung bình khi chuẩn độ ba bình kiểm chứng:
V1 + V2 +V3 2,25 + 1,96 + 2,7
VTB = ( )=( ) = 2,3033 (mL)
3 3
Thể tích NaOH trung bình khi chuẩn độ ba bình thí nghiệm:

'
V '1 + V ' 2 +V ' 3 18,55 + 16,5 + 17,3
V TB =( )=( ) = 17,45 (mL)
3 3
Thay các giá trị vào công thức trên, ta thu được hoạt độ lipase:
10 10
X = (V ' TB − VTB ) × k × = (17,45 − 2,3033) × 1,01 × = 30,6038 (mL)
m 5
7. Nhận xét
So sánh số mL NaOH dùng để chuẩn độ đối với ba bình thí nghiệm và ba bình
kiểm chứng nhóm chúng em nhận thấy thể tích NaOH cần dùng để chuẩn độ các bình
thí nghiệm nhiều hơn so với các bình kiểm chứng. Nguyên nhân là do ở ba bình kiểm
chứng đã được đun cách thủy trong 10 phút để làm bất hoạt enzyme lipase trước khi cho
cơ chất vào, vì vậy chất béo có trong đậu nành không bị thủy phân để sinh ra acid béo,
để pH = 7 lượng NaOH cần dùng sẽ ít hơn. Đối với các bình thí nghiệm, enzyme không

15
bị bất hoạt, chất béo trong đậu nành bị thủy phân và giải phóng các acid béo, lượng
NaOH sẽ nhiều hơn để chuẩn độ dung dịch về pH = 7.
Quan sát các kết quả thu nhận được từ những lần chuẩn độ, các kết quả có sự
chênh lệch lượng NaOH cần dùng khá đáng kể. Đối với ba bình kiểm chứng, sự chênh
lệch trung bình rơi vào khoảng 0,5mL. Ở ba bình thí nghiệm, độ chênh lệch tăng đáng
kể, sự chênh lệch ở ba bình này khoảng 1,37mL.

8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục

8.1. Nguyên nhân sai số
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm nhóm chúng em đã gặp phải một số sai sót
dẫn đến kết quả chuẩn độ chưa chính xác, mức độ sai số khá lớn, nguyên nhân có thể
do:
− Enzyme Lipase chưa được trích ly hiệu quả hoặc do đậu nành để trong thời gian
dài. Enzyme bị có thể bị mất một phần hoạt tính do quá trình xay xảy ra sự ma
sát làm tăng nhiệt độ và do trong quá trình lắc ở 300C trong 24h, nhiệt độ có thể
tăng > 300C.
− Phản ứng thủy phân không xảy ra hoàn toàn.
− Sai số trong quá trình cân mẫu và lấy hóa chất.
− Dụng cụ chưa vệ sinh sạch sẽ, dễ bị nhiễm tạp chất.
− Các thao tác thí nghiệm chưa thuần thục, chính xác
8.2. Biện pháp khắc phục
− Lấy hóa chất và mẫu chính xác, hạn chế tối đa sai số trong quá trình cân
− Sử dụng mẫu đậu nành mới
− Vệ sinh dụng cụ thí nghiệm sạch sẽ
− Thao tác thí nghiệm chính xác, cẩn thận

16
 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE

1. Mục tiêu bài thí nghiệm

Bài thí nghiệm được thực hiện nhằm mục tiêu xác định hoạt độ của enzyme
invertase có trong men bánh mì.
Biết được cách pha chế các loại hóa chất cần sử dụng trong thí nghiệm.
Nắm rõ các quy tắc, các bước tiến hành khi thực hiện thí nghiệm.

2. Tổng quan về enzyme invertase

Enzyme invertase (ꞵ-fructofuranosidase) có số EC: EC 3.2.1.26. Đây là một
enzyme có khả năng thủy phân saccharose thành 2 monomer glucose và fructose
Invertase có mặt trong tế bào chất, không bào và thành tế bào
Vai trò của enzyme invertase:
+ Invertase tách saccharose thành glucose và fructose nhằm cung cấp cho tế bào
+ Làm nhiên liệu cho quá trình hô hấp
+ Là nguồn cung cấp carbon và năng lượng
+ Invertase hòa tan đóng vai trò là một chất điều chỉnh thành phần đường trong
sản phẩm sau thu hoạch
Ưu điểm: xuất phát từ ưu điểm của đường nghịch đảo, invertase thủy phân
sucrose tạo ra glucose và fructose có:
+ Độ ngọt cao hơn sucrose
+ Có khả năng chống kết tinh
+ Hoạt độ nước thấp, do đó khả năng bảo quản các sản phẩm thực phẩm sử dụng
đường nghịch đảo sẽ tốt hơn, thời gian bảo quản dài hơn.

3. Nguyên tắc
Bài thí nghiệm được tiến hành dựa trên tính chất Iodine có trong dung dịch kiểm
có khả năng oxi hóa glucose sinh ra bằng cách định phân lượng iodine dư với dung dịch
Na2S2O3 (natri thiolsunfat).
Đầu tiên khi khi iodine trong môi trường kiềm chúng sẽ tác dụng với dung dịch
kiềm (NaOH)
I2 + 2NaOH NaIO + NaI + H2O (1)
NaIO tạo thành từ phản ứng (1) sẽ phản ứng với đường glucose
NaIO + CH2OH-(CHOH)4-CHO NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH (2)
17
 NaIO dư sẽ tác dụng với NaI được sinh ra từ phản ứng (1) và (2) tạo sản phẩm
là I2
2NaIO + 2NaI + H2SO4 I2 + Na2SO4 + 2H2O
Cuối cùng lượng I2 dư sẽ phản ứng với dung dịch Na2S2O3
I2 + Na2S2O3 NaI + Na2S4O6
4. Dụng cụ thí nghiệm
4.1. Dụng cụ
Becher 100 – 250mL Phễu thủy tinh
Erlen 100 – 250mL Giấy lọc
Pippet 5mL – 10mL Buret 25mL
4.2. Thiết bị
Tủ sấy Memmert

5. Tiến hành thí nghiệm

5.1. Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha

Cân 10g đường saccharose trong becher 50mL sau đó

Saccharose hòa tan đường với nước cất, chuyển dung dịch trên vào
100mL
10% bình định mức 100mL, tráng đều becher và định mức
dung dịch đến 100mL.

Cân 1g tinh bột trong becher và cho 100mL nước vào,

khuấy đều sau đó đun cách thủy trong 15 phút, trong quá
Hồ tinh bột
100mL trình đun luôn dùng đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch.
1%
Sau đó để nguội hồ tinh bột và định mức lại cho đủ
100mL.
Cân 4g KI trong becher 50mL sau đó hòa tan với nước,
khuấy đều cho KI tan hết sau đó cân 1,27g I2 và cho vào
dung dịch KI (do I2 không tan trong nước), khuấy đều để
Iodine 0,1N 100mL
I2 tan hoàn toàn thì nhỏ 3 giọt HCl 37%, chuyển dung
dung dịch I2 vào bình định mức, tráng đều becher và định
mức với nước cất cho đủ 100mL.

18
 Hút một ít nước cất cho vào becher 50mL sau đó dùng
pipet hút khoảng 2,77mL H2SO4 96% nhỏ từ từ vào nước,
H2SO4 1N 100mL
khuấy đều và chuyển dung dịch acid vào bình định mức
100mL định mức với nước cất đến 100mL.
Cân 6,2g Na2S2O3.5H2O trong becher 50mL và hòa tan
với nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức
Na2S2O3 250mL, tráng đều becher và định mức nước cất cho đủ
500mL
0,05N 250mL, đổ dung dịch này vào becher 500mL và dùng
bình định mức 250mL tiếp tục định mức nước cất cho đủ
250mL và cho vào becher, khuấy đều.

Cân 2,4g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với
nước cất, chuyển dung dịch NaOH vào bình định mức
250mL, tráng đều becher và định mức lên 250mL và cho
NaOH 0,1N 600mL dung dịch này vào becher 500mL, tiếp tục dùng bình định
mức 250mL và 100mL và định mức nước cất lên đến
vạch sau đó chuyển tất cả lượng nước cất trên vào becher
500mL có chứa NaOH trước đó, khuấy đều dung dịch.

Cân 2g men bánh mì trong becher 50mL, cho nước cất

vào khuấy đều vào chuyển vào bình định mức 100mL,
tráng sạch becher và định mức nước cất cho đủ 100mL,
lắc đều trong vòng 5 phút. Sau đó chuyển dung dịch này
vào becher 250mL và dùng bình định mức 100mL tiếp
tục định mức nước cất lên đến vạch cho bào becher
Dịch lọc
150mL, khuấy đều dung dịch. Dung dịch chứa men sẽ để
chứa enzyme 200mL
lắng và lọc qua giấy lọc thu được dịch lọc có chứa
Invertase
enzyme invertase.
Lượng dịch lọc (không chứa xác men khô) thu được thực
tế là 150mL.
Chuyển 50mL dịch enzyme vừa lọc được vào một erlen
100mL và đem đi đun cách thủy trong 10 phút để làm bất
hoạt enzyme invertase.

19
 5.2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị 9 ống nghiệm (mỗi số ống nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần) theo bảng
dưới đây:
Bảng 3.1. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành
khảo sát hoạt độ invertase
Số ống 1 2 3
Dung dịch saccharose 10% (mL) 0 5 5
Nước cất (mL) 5 0 0
Dịch enzyme (mL) 5 5 0
Dịch enzyme đã đun cách thủy 10 phút (mL) 0 0 5

‾ Để các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong chính xác 30 phút

‾ Cột các ống nghiệm thành từng cụm 3 ống, dùng giấy bạc để bịt miệng ống
nghiệm và đem đi đun cách thủy trong 10 phút.
‾ Ở từng ống nghiệm sau khi đun, hút ra 2,5mL dung dịch Iodine 0,1N và 7,5mL
NaOH 0,1N. Để erlen trong bóng tối 20 phút bằng cách cho vào tủ và đóng cửa
Lưu ý: Thời gian pha NaOH kéo dài 2 phút và nhỏ đều tay
Thời gian nhỏ iodine và NaOH mỗi bình cách nhau 5 phút
‾ Sau khi đủ 20 phút, lấy erlen ra và dùng micropipet nhỏ 1mL dung dịch H2SO4
1N
‾ Cột buret rửa sạch và tráng cột với Na2S2O3 0,05N sau đó cho dung dịch Na2S2O3
0,05 lên đến vạch 0mL, nhỏ 2 giọt Na2S2O3 từ buret vào dung dịch trong erlen để
dễ quan sát sự thay đổi màu, sau đó nhỏ 3 giọt hồ tinh bột 1% để làm chất chỉ thị.
‾ Định phân dung dịch bằng Na2S2O3 0,05N từ buret cho đến khi dung dịch trong
erlen mất màu
‾ Đọc thể tích Na2S2O3 dùng để định phân

6. Kết quả và tính toán

Bảng 3.2. Kết quả định phân
Bình 1 2 3
Lần 1 9,2mL 5,85mL 8,85mL
Lần 2 9,3mL 5,95mL 8,9mL
Lần 3 9,25mL 6,05mL 8,85mL

20
 Hoạt độ của enzyme invertase sẽ được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy
phân bởi lượng enzyme có trong 1g men bánh mì trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ
phòng thí nghiệm, và được tính toán theo công thức:

(V1 − V2 ) × A × B/(1000 × 20 × 2 × a × b × t × m)

Trong đó:
V1 : Số mL Na2S2O3 dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1
V2 : Số mL Na2S2O3 dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2
A : Thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (mL)
B : Tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (mL)
a : Thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (mL)
b : Thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (mL)
t : Thời gian thủy phân (phút)
m : Khối lượng mẫu cân (men bánh mì)

Gọi HI: là hoạt độ enzyme invertase.

Thay các giá trị vào công thức trên ta thu được các kết quả dưới đây:
Lần 1:
HI (1) = (9,2 − 5,85) × 10 × 200/(1000 × 20 × 2 × 5 × 2,5 × 30 × 2)
mol
= 2,233 × 10−4 ( )
g. phút
Lần 2:
HI (2) = (9,3 − 5,95) × 10 × 200/(1000 × 20 × 2 × 5 × 2,5 × 30 × 2)
mol
= 2,233 × 10−4 ( )
g. phút
Lần 3:
HI (3) = (9,25 − 6,05) × 10 × 200/(1000 × 20 × 2 × 5 × 2,5 × 30 × 2)
mol
= 2,133 × 10−4 ( )
g. phút
Trung bình:
HI(1) + HI(2) + HI(3) 2,233 × 10−4 + 2,233 × 10−4 + 2,133 × 10−4
̅̅̅
HI = =
3 3
mol
= 2,2 × 10−4 ( )
g. phút
21
 Hình 3.1 Ba bình erlen trước khi định phân với Na2S2O3 0,05N
Dung dịch trong erlen sau quá trình định phân với Na2S2O3 0,05N bị mất màu.

7. Nhận xét
Ống nghiệm số 1: ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme, không chứa
dung dịch saccharose 10% làm cơ chất, vì vậy khi cho enzyme invertase vào sẽ không
tham gia phản ứng thủy phân saccharose tạo glucose. Khi đó 5mL iodine 0,1N được
thêm vào sẽ không tham gia phản ứng oxi hóa glucose trong môi trường kiềm, toàn bộ
lượng iodine sẽ được định phân bằng dung dịch Na2S2O3 0,05N.
Như vậy ở bình số 1 cần dùng nhiều thể tích Na2S2O3 0,05N hơn để định phân.
Ống nghiệm số 2: trong các ống nghiệm số 2 có chứa dịch enzyme và cả dung
dịch saccharose 10% làm cơ chất để invertase thủy phân tạo thành glucose. Một phần
iodine 0,1N sẽ thực hiện phản ứng oxi hóa glucose, iodine dư sẽ được định phân bằng
dung dịch Na2S2O3 0,05N. Từ đây có thể xác định được lượng glucose được tạo ra
Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,05N cần dùng để định phân iodine 0,1N nhỏ hơn.
Ống nghiệm số 3: mặc dù trong ống nghiệm số 3 có chứa cả dịch enzyme và cơ
chất là saccharose 10%, tuy nhiên enzyme invertase có trong dịch lỏng đã bị bất hoạt do
đun cách thủy 10 phút. Saccharose không bị thủy phân để sinh glucose, vì vậy toàn bộ
5mL iodine 0,1N sẽ được định phân bằng dung dịch Na2S2O3 0,05N
Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,05N cần dùng để định phân iodine 0,1N nhiều hơn
Như vậy, sau khi tiến hành khảo sát hoạt độ của enzyme invertase trong 3 ống
nghiệm, nhóm chúng em nhận thấy rằng trong trường hợp thiếu đi cơ chất hoặc enzyme

22
đã bị gia nhiệt để làm bất hoạt thì sẽ không diễn ra phản ứng thủy phân saccharose tạo
glucose và fructose.

8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục

8.1. Nguyên nhân sai số
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có thể nhóm chúng em đã gặp phải một số
sai sót dẫn đến màu của dung dịch chưa chuẩn, nguyên nhân có thể do:
‾ Tính toán thời gian chưa thật sự chính xác
‾ Hóa chất có chứa tạp chất hoặc nhiễm chéo
‾ Chưa phối hợp nhịp nhàng, các thao tác chưa chuẩn
‾ Dụng cụ thí nghiệm chưa được vệ sinh kỹ
‾ Lượng dung dịch được lấy có thể có sự chênh lệch nhỏ dẫn đến sai số
8.2. Biện pháp khắc phục
‾ Vệ sinh thật sạch các dụng cụ thí nghiệm
‾ Tiến hành thí nghiệm nhanh chóng, cẩn thận, chính xác
‾ Luyện tập lấy hóa chất chuẩn và chính xác và rèn luyện các kỹ năng khác khi
thực hiện thí nghiệm

23
 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH
HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE

1. Mục tiêu bài thí nghiệm

Khảo sát, vẽ phương trình động học của enzyme Urease
Xác định hoạt độ urease có trong mẫu đậu nành
Nắm được các bước, quy trình tiến hành thí nghiệm khi thực hiện khảo sát động
học và hoạt độ của enzyme urease.

2. Tổng quan về enzyme urease

Urease (Carbamine amidohydrolase) có mã hiệu EC 3.5.1.5, là một enzyme xúc
tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic. Nó thuộc nhóm enzyme
hydrolase (enzyme thủy phân).
Trong thực vật, enzyme urease đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá
trình thủy phân urea nhằm cung cấp nguồn ni-tơ thiết yếu cho cây. Urease có ứng
dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghiệp thực phẩm, urease được ứng
dụng trong việc loại bỏ urea còn tồn dư trong rượu vang, đảm bảo độ an toàn và chất
lượng cảm quan cho sản phẩm.
Ngoài thực vật, enzyme urease cũng được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác
nhau (Helicobacter pylori), nấm, tảo và thậm chí một số động vật không có xương sống.

3. Nguyên tắc thực hiện thí nghiệm

Urease sẽ thủy phân urea thành ammoniac và carbon dioxide.
Phản ứng thủy phân urea dưới xúc tác urease được biểu diễn theo phương trình:

Hình 4.1. Phản ứng thủy phân urea xúc tác bằng urease
Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và
giải phóng acid carbonic (H2CO3).

Hình 4.2. Phản ứng tạo acid carbonic

24
 Nguyên tắc dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành để tiến
hành tính toán lượng urea bị thủy phân.

4. Dụng cụ thí nghiệm

4.1. Dụng cụ
Becher 100ml, 250ml Bình định mức 100ml
Erlen 100ml Cối chày sứ
Ống đong 50ml Ống nghiệm
Pippet 5ml, 10ml
4.2. Thiết bị
Tủ sấy Memmert
Máy lắc ổn định nhiệt Jeio Tech

5. Tiến hành thí nghiệm

5.1. Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha

Cân 2g ure trong becher 50mL và hòa tan với nước cất

Ure 2%, 1/3M 100mL sau đó chuyển vào bình định mức 100mL, tráng sạch
becher và định mức với nước cất cho đủ 100mL.

Dùng ống đong 100mL để đong 62,5mL formol 40%

cho vào becher 250mL, sau đó tiếp tục dùng ống đong
đong 187,5mL (chia 2 lần đong) nước cất cho vào
becher chứa formol, khuấy đều dung dịch thu được
dung dịch formol 10%
Formol trung (Quá trình này được tiến hành trong tủ hút)
250mL
tính Dùng pippet hút 10mL formol 10% cho vào erlen
100mL và chuẩn độ bằng NaOH 0,2N. Dựa vào thể
tích NaOH 0,2N đọc được sau khi định phân để xác
định tỷ lệ giữa formol 10% và NaOH 0,2N cần dùng
để tiến hành pha dung dịch formol trung tính.

25
 Cân 0,8g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với
nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức
NaOH 0,2N 100mL
100mL, tráng sạch becher và định mức với nước cất
cho đủ 100 ml nước cất.
Cân 0,2g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với
nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức
NaOH 0,05N 100mL 100mL, tráng sạch becher và định mức với nước cất
cho đủ 100 ml nước cất.

Cân 1g phenolphthalein cho vào becher 100mL sau đó

dùng ống đong 100mL đong 50mL cồn 960 cho vào
Phenolphthalein becher, khuấy cho phenolphthalein tan hoàn toàn, tiếp
100mL
1% tục đong 50mL nước cất cho vào becher và khuấy đều.
Dùng giấy bạc bọc phận miệng becher.

Dùng pippet 5mL hút 5mL dung dịch phenolphthalein

1% cho vào becher 50mL sau đó dùng pippet 5mL
Phenolphthalein
10mL khác hút 2,5mL cồn 960 vào becher, khuấy đều và hút
0,5%
tiếp 2,5mL nước cất, khuất đều.
Dùng giấy bạc bọc phần miệng becher

Cân 20g đậu nành đã được xay mịn chuyển vào becher
250mL, dùng ống đong 100mL đong 150mL nước cất
(đong 2 lần) cho vào becher chứa bột đậu nành, khuấy
Dịch lọc chứa
500mL đều hỗn hợp và chuyển vào bình định mức 250mL,
enzyme Urease
tráng sạch becher và định mức với nước cất cho đủ
250mL dung dịch. (Tiến hành 2 lần với bình định mức
250mL để thu 500mL dung dịch).

5.2. Tiến hành thí nghiệm

5.2.1. Thí nghiệm khảo sát động học
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống. Ở từng dãy cho lần lượt các dung
dịch vào theo bảng sau:

26
 Bảng 4.1. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo
sát động học
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Ure 1/3 M (mL) 0 1 2 3 4 5
Nước cất (mL) 5 4 3 2 1 0
dd urease (mL) 5 5 5 5 5 5

Đặt dãy thứ nhất vào bể ổn nhiệt 40oC, dãy thứ 2 vào tủ ấm 30oC trong chính xác
20 phút
Sau khi kết thúc thời gian thủy phân thì thêm vào mỗi ống nghiệm 5mL formol
trung tính, lắc đều trong 2 phút
Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước
cất.
Nhỏ 3 giọt phenolphthalein 1%, lắc đều sau đó định phân với NaOH 0,05N.
(Lặp lại thí nghiệm 3 lần)
Đọc thể tích NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ.
5.2.2. Thí nghiệm xác định hoạt độ
Thực hiện các ống nghiệm sau:
Bảng 4.2. Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo
sát hoạt độ enzyme
Ống nghiệm 1 2 3
Ure 2% (mL) 0 5 5
Nước cất (mL) 5 0 0
Dd urease (mL) 5 5 0
Dd urease đã đun cách thủy (mL) 0 0 5

Sau đó mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40oC.

Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5 mL formol trung tính, lắc đều trong 2 phút.
Đổ lần lượt mỗi ống ra một erlen 100mL. Định phân bằng NaOH 0,05N với
phenolphtalein 1% làm chỉ thị. (Lặp lại thí nghiệm 3 lần)
Đọc thể tích NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ.

6. Kết quả và tính toán

27
 6.1. Thí nghiệm khảo sát động học enzyme Urease
Bảng 4.3. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung
dịch sau quá trình thủy phân ở 30oC
Ống nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 0,85 0,8 0,9
2 1,85 1,95 1,85
3 2,05 2 2,05
4 2,35 2,3 2,3
5 2,55 2,6 2,5
6 2,8 2,75 2,75

Bảng 4.4. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung
dịch sau quá trình thủy phân ở 40oC
Thể NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ (ml)
Ống nghiệm
Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 0,9 0,95 0,95
2 3 3,05 3,05
3 3,6 3,65 3,65
4 4,05 4,1 4,05
5 4,3 4,35 4,4
6 4,8 4,75 4,8

Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biểu diễn lượng cơ chất bị thủy
phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ ( Y1 và Y2 theo [S]).
Vẽ đường thẳng biểu diễn sự biến thiên của 1/V theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy phân.
Trong đó: v = d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân)
Động học của phản ứng enzyme được tính toán dựa theo đồ thị Lineweaver –
Burk.
1 1 Km 1
= + ×
V Vmax Vmax [S]
Trong đó Vmax : vận tốc thủy phân cực đại
[S] : nồng độ cơ chất
Km : hằng số Michaelis-Menten
Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo của
28
 Km và Vmax.
Bảng 4.5. Kết quả tính toán khảo sát động học ở 300C:
Bình Y= số mol urea bị thủy phân [S] = nồng Vận tốc phản ứng thủy phân
(mol) =nNaOH/2 độ ure ban V=d(S)/dt=Y/20
Lần 1 Lần 2 Lần 3 đầu (M) Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 0 0 0 0 0 0 0
-5 -5
2 4,625.10 4,75.10 4,625.10-5 0,03333333 2,31.10-6 2,375.10-6 2,313.10-6
3 5,125.10-5 5.10-5 5,125.10-5 0,06666667 2,56.10-6 2,5.10-6 2,563.10-6
4 5,875.10-5 5,75.10-5 5,75.10-5 0,1 2,94.10-6 2,875.10-6 2,875.10-6
5 6,375.10-5 6,5.10-5 6,25.10-5 0,13333333 3,19.10-6 3,25.10-6 3,125.10-6
6 7.10-5 6,875.10-5 6,875.10-5 0,16666667 3,5.10-6 3,438.10-6 3,438.10-6
Từ những dữ kiện ở bảng số liệu trên ta thu được đồ thị dưới đây:

Phương trình động học của enzyme urease ở 30°C

500000
450000
y = 5407.3x + 280016
400000
R² = 0.8444
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0 5 10 15 20 25 30 35

Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 300C
Theo biểu đồ ta có phương trình động học của enzyme urease:
y = 5407,3x + 280016
Từ đây ta tiến hành tính toán:
1 1
= 280016 → Vmax = = 3,5712 × 10−6
Vmax 280016

Km
= 5407,3
Vmax
Khi đó: K m = 5407,3 × Vmax = 5407,3 × 3,5712 × 10−6 = 0,0193
Vậy khi khảo sát động học của enzyme urease tại nhiệt độ 30oC ta thu được kết quả là:
Vmax = 3,5712 × 10−6 mol/phút

29
 Hình 4.4. Dãy erlen khảo sát động học enzyme urease ở 300C sau khi định phân với
NaOH 0,05N
Bảng 4.6. Kết quả tính toán khảo sát động học ở 400C

Y= số mol urea bị thủy phân (mol) [S] = nồng Vận tốc phản ứng thủy phân
Bình = nNaOH/2 độ ure ban V = d(S)/dt = Y/20
Lần 1 Lần 2 Lần 3 đầu (M) Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 0 0 0 0 0 0 0
-5
2 7,5.10-5 7,625.10 7,625.10-5 0,03333333 3,75.10-6 3,813.10-6 3,813.10-6
3 9.10-5 9,125.10-5 9,125.10-5 0,06666667 4,5.10-6 4,563.10-6 4,563. 10-6
4 1,0125.10-4 1,025.10-4 1,0125.10-4 0,1 5,06.10-6 5,125.10-6 5,063. 10-6
5 1,075.10-4 1,0875.10-4 1,1.10-4 0,13333333 5,38.10-6 5,438. 10-6 5,5. 10-6
6 1,2.10-4 1,1875.10-4 1,2.10-4 0,16666667 6.10-6 5,938. 10-6 6.10-6
Từ những dữ kiện ở bảng số liệu trên ta thu được đồ thị dưới đây:

Phương trình động học của enzyme urease ở 40°C

300000

250000

200000
y = 3773.4x + 154675
150000 R² = 0.9593
100000

50000

0
0 5 10 15 20 25 30 35

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 400C

30
 Theo biểu đồ ta có phương trình động học của enzyme urease:
y = 3773,4x + 154675
Từ đây ta tiến hành tính toán:
1 1
= 154675 → Vmax = = 6,4652 × 10−6
Vmax 154675

Km
= 3773,4
Vmax
Khi đó: K m = 3773,4 × Vmax = 3773,4 × 6,4652 × 10−6 = 0,0244
Vậy khi khảo sát động học của enzyme urease tại nhiệt độ 30oC ta thu được kết quả là:
Vmax = 6,4652 × 10−6 mol/phút

Bảng 4.7. So sánh số mol ure bị thủy phân theo nồng độ ban đầu ở 300C và 400C
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ ure ban đầu
0 0,0333333 0,0666667 0,1 0,1333333 0,1666667
[S]
Số mol ure bị thủy
0 4,667.10-5 5,083.10-5 5,792.10-5 6,375.10-5 6,917.10-5
phân ở 30°C (Y1)
Số mol ure bị thủy
0 7,583.10-5 9,083.10-5 1,017.10-4 1,088.10-4 1,196.10-6
phân ở 40°C (Y2)

Đồ thị biểu diễn lượng ure bị thủy phân theo nồng độ ure ban
đầu ở 30°C và 40°C
0.00014

0.00012

0.0001

0.00008

0.00006

0.00004

0.00002

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18

Y1 Y2

Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn lượng ure bị thủy phân theo nồng độ ure ban đầu ở 300C và
400C

31
 6.2. Thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme Urease
Bảng 4.8. Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ ba bình erlen chứa hỗn hợp dung
dịch sau quá trình thủy phân ở 40oC

Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2 Ống nghiệm 3 Đơn vị

Lần 1 1,35 4,2 1,3 mL

Lần 2 1,35 4,25 1,35 mL

Lần 3 1,3 4,3 1,3 mL

Trung bình 1,33 4,25 1,32 mL

Hoạt độ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme
urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.

(V2 – V1)×A×k/(20×103×2×t×a×m)

Trong đó:
V1 : số mL NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1
V2 : số mL NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 2
a : Thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm
A : Tổng thế tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành
T : thời gian thủy phân (phút)
m : khối lượng mẫu cân
k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N
Gọi X1, X2, X3 lần lượt là hoạt độ của urease trong lần thí nghiệm thứ nhất, thứ
hai và thứ ba. Thay các giá trị vào công thức trên ta được:
Lần 1:
𝑋1 = (4,2 − 1,35) × 350 × 1/(20 × 103 × 2 × 20 × 5 × 20)
mol
= 1,2469 × 10−5 ( )
g. phút
Lần 2:
𝑋2 = (4,25 − 1,35) × 350 × 1/(20 × 103 × 2 × 20 × 5 × 20)

32
 mol
= 1,2688 × 10−5 ( )
g. phút
Lần 3:
𝑋3 = (4,3 − 1,3) × 350 × 1/(20 × 103 × 2 × 20 × 5 × 20)
mol
= 1,3125 × 10−5 ( )
g. phút
Trung bình:
𝑋1 + 𝑋2 + 𝑋3 1,2469 × 10−5 + 1,2688 × 10−5 + 1,3125 × 10−5
𝑋̅ = =
3 3
mol
= 1,2760 × 10−5 ( )
g. phút

Hình 4.7. Dãy erlen khảo sát hoạt độ enzyme urease ở 300C
7. Nhận xét
7.1. Khảo sát động học enzyme Urease
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng. Theo như kết quả thí nghiệm,
ta thấy tốc độ thủy phân Vmax ở nhiệt độ 40oC nhanh hơn nhiều so với Vmax ở nhiệt độ
30oC (gấp khoảng 2 lần). Như vậy enzyme urease xúc tác cho quá trình thủy phân của
cùng môt cơ chất tại nhiệt độ 40oC tốt hơn ở nhiệt độ 30oC.
Tóm lại, enzyme urease hoạt động tốt ở 400C, nhiệt độ càng tăng thì enzyme sẽ
thủy phân càng nhiều ure để sinh ra ammoniac và carbodioxide. Tuy nhiên, đến một
nhiệt độ nhất định enzyme sẽ bị bất hoạt, do đó không còn khả năng thủy phân cơ chất.

33
 7.2. Xác định hoạt độ enzyme Urease
Ống nghiệm số 1: ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme urease, không
chứa dung dịch ure 2% làm cơ chất, vì vậy ở ống nghiệm này sẽ không có phản ứng
thủy phân để sinh ra amoniac và CO2. Do đó khi thêm 5mL formol trung tính vào và
định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphatlein 1% làm chất chỉ thị thì dung dịch sẽ
đổi màu sang màu hồng rất nhanh.
Ống nghiệm số 2: ống nghiệm 2 chứa dung dịch ure 2% và dịch enzyme urease,
vì vậy ở ống nghiệm này sẽ phản ứng thủy phân ure được xúc tác bởi urease sinh ra
amoniac và CO2. Do đó khi thêm 5mL formol trung tính vào và định phân bằng NaOH
0,05N với phenolphatlein 1% làm chất chỉ thị thì cần 1 lượng NaOH nhiều hơn ống
nghiệm 1 để dung dịch đổi sang màu hồng.
Ống nghiệm số 3: ống nghiệm 3 chứa ure 2% và dịch enzyme urease đã đun
cách thủy, lúc này enzyme urease dưới tác dụng của nhiệt độ cao sẽ bị bất hoạt, vì vậy
ở ống nghiệm này sẽ không có phản ứng sinh ra amoniac và CO2. Do đó khi thêm 5mL
formol trung tính vào và định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphatlein 1% làm chất
chỉ thị thì dung dịch sẽ đổi màu sang màu hồng rất nhanh.
8. Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục
8.1. Nguyên nhân sai số
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có thể nhóm chúng em đã gặp phải một số
sai sót dẫn đến màu của dung dịch chưa chuẩn, thể tích NaOH 0,05N dùng để định phân
có thể có sự sai lệch, nguyên nhân có thể do:
‾ Sai số trong quá trình cân mẫu và lấy hóa chất.
‾ Pha hóa chất chưa đúng nồng độ
‾ Nồng độ enzyme cho vào mỗi ống nghiệm khác nhau
‾ Thời gian thủy phân chưa chính xác
‾ Cho dư NaOH khi chuẩn độ
8.2. Biện pháp khắc phục
‾ Vệ sinh thật sạch các dụng cụ thí nghiệm và cân trước khi sử dụng
‾ Thao tác thí nghiệm cẩn thận
‾ Lắc đều cốc chứa enzyme trước khi hút và cho vào ống nghiệm
‾ Tính toán thời gian hợp lý, để sai số là nhỏ nhất
‾ Khi đến gần điểm chuẩn độ, thì ta cho từ từ NaOH vào trong ống nghiệm
34
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TS. Trịnh Khánh Sơn, ThS. Nguyễn Quang Duy và ThS. Phạm Thanh Tùng, 2019.
Giáo trình Thực hành Hóa sinh Thực phẩm. Khoa Công nghệ Hóa học & Thực phẩm
trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM.
2. Các biên tập viên của Encyclopaedia Britannica, 1998. Amylase. Truy cập ngày:
15/04/2023. Đường dẫn: https://www.britannica.com/science/amylase.
3. Phan Thị Việt Hà, 2021, Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật
và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học
Đà Nẵng, Việt Nam.
4. S. Bielecki và R.I. Somiari, 2014. Enhancement of invertase activity in organic media
for oligosaccharide synthesis, Progress in Biotechnology 15: 423-428.
5. Iwona Konieczna và cộng sự, 2012. Bacterial Urease and its Role in Long-Lasting
Human Diseases, Current Protein & Peptide Science 13(8): 789-806.