SẮC KÝ LỚP MỎNG

– Thin layer chromatography – TLC-

12/ 2023
Dành cho lớp Cao đẳng Dược 1
 SẮC KÝ LỚP MỎNG
MỤC TIÊU

1/- Nêu được nguyên lý tách của sắc ký lớp mỏng

2/- Trình bày được pha tĩnh, pha động sử dụng trong sắc ký lớp mỏng
3/- Liệt kê các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng, nêu chi tiết từng giai đoạn
4/- Nêu vài ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong ngành Dược

2
 SẮC KÝ LỚP MỎNG
NỘI DUNG
1/- LỊCH SỬ
2/- NGUYÊN TẮC
3/- PHA TĨNH
4/- PHA ĐỘNG
5/- CƠ CHẾ
6/- TIẾN HÀNH SẮC KÝ
6.1. DỤNG CỤ
6.2. CHUẨN BỊ BÌNH KHAI TRIỂN
6.3. CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH LÊN BẢN MỎNG
6.4. TRIÊN KHAI SẮC KÝ
6.5. PHÁT HiỆN VÀ THU NHẬN KẾT QUẢ
7/- ƯU NHƯỢC ĐIỂM
8/- ỨNG DUNG
1/- LỊCH SỬ SẮC KÝ LỚP MỎNG
1939 Izmailov và Schraiber đã xây dựng và sau đó năm 1958 Stahl đã
hoàn thiện phương pháp sắc ký lớp mỏng.

4
2. NGUYÊN TẮC
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho
pha động di chuyển qua pha tĩnh (giá mang là bản mỏng bằng kim
loại,thủy tinh, nhựa…) mà trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.

5
3. PHA TĨNH

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân
tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến
kính hoặc phiến kim loại.

6
4. PHA ĐỘNG
o
Solvent MF Bp ( C) Hazards* Dipole Elution
MW Density (g/mL) Stength
()
Hexane C6H14 68.7 Flammable 0.08 0.01
CH3(CH2)4CH3 86.17 0.659 Toxic
Pha động là một hệ dung
Toluene C7H8 110.6 Flammable 0.31 0.22
môi đơn hoặc đa thành C6H5CH3 92.13 0.867 Toxic

phần được trộn với nhau Diethyl ether

CH3CH2OCH2CH3
C4H10O
74.12
34.6
0.713
Flammable
Toxic, CNS
1.15 0.29

theo tỷ lệ quy định trong Depressant

Dichloromethane CH2Cl2 39.8 Toxic, Irritant 1.14 0.32

từng chuyên luận. Trong CH2Cl2 84.94 1.326 Cancer suspect

quá trình di chuyển qua Ethyl Acetate

CH3CO2CH2CH3
C4H8O2
88.10
77.1
0.901
Flammable
Irritant
1.88 0.45

lớp hấp phụ, các cấu tử Acetone C3H6O 56.3 Flammable 2.69 0.43

trong hỗn hợp mẫu thử CH3COCH3 58.08 0.790 Irritant

Butanone C4H8O 80.1 Flammable 2.76 0.39

được di chuyển trên lớp CH3CH2COCH3 72.10 0.805 Irritant

mỏng, theo hướng pha 1-Butanol

CH3CH2CH2CH2OH
C4H10O
74.12
117.7
0.810
Flammable
Irritant
1.75 0.47

động, với những tốc độ Propanol C3H8O 82.3 Flammable 1.66 0.63
khác nhau. Kết quả, thu CH3CH2CH2OH 60.09 0.785 Irritant

được một sắc ký đồ trên

Ethanol C2H6O 78.5 Flammable 1.70 0.68
CH3CH2OH 46.07 0.789 Irritant

lớp mỏng. Methanol CH4O 64.7 Flammable 1.7 0.73

CH3OH 32.04 0.791 Toxic

Water H2O 100.0 1.87 >1

HOH 18.02 0.998
7
5. CƠ CHẾ

của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính
chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm 8
6. TiẾN HÀNH SẮC KÝ
6.1. DỤNG CỤ
Các bình khai triển - Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt
có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng
và có nắp đậy kín. hình hộp hay hình trụ, có nắp
đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của
các bản mỏng sử dụng.
- Tủ hút hơi độc.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để
sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm
nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất
cần phân tích.
- Một máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày
(với ống kính Macro) với khoảng cách 30-50 cm.

- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.

- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản
hoặc dụng cụ thích hợp.
- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp.
9
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước
sóng dài 365 nm.
- Dụng cụ để phun, nhúng thuốc thử.

•Dụng cụ để phun thuốc thử.

Bình phun thuốc thử hình trụ Bình phun thuốc thử hình tam giác

10
6. TiẾN HÀNH
6.2. CHUẨN BỊ BÌNH KHAI TRIỂN
- Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh
thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc
rồi để giấy lọc thấm đều dung môi.
- Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một
lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. - Ðậy kín nắp bình và để
yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC.

11
6. TiẾN HÀNH
6.2. CHUẨN BỊ BÌNH KHAI TRIỂN

Muốn thu được những kết quả lặp lại, chỉ nên
dùng những dung môi thật tinh khiết, loại dùng
cho sắc ký.
Những dung môi dễ bịến đổi về hóa học chỉ nên
pha trước khi dùng.
Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp phải
chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm
thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến
hiện tượng không lặp lại của trị số Rf.

12
6. TiẾN HÀNH
6.3. CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH LÊN BẢN MỎNG

Lượng chất Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết
hoặc hỗn
hợp chất của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp.
đưa lên bản
mỏng có ý Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của
nghĩa quan thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên
trọng đối với
hiệu quả 0,005 mg).
tách sắc ký, Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở
đặc bịệt ảnh dạng dung dịch trong ether, cloroform, nước hay dung môi thích
hưởng rất hợp khác.
lớn đến trị
số Rf.

13
6. TiẾN HÀNH
6.3. CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH LÊN BẢN MỎNG

Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu
lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản
mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế.
Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg. Ðối với
các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản
mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần
chấm.

14
6. TiẾN HÀNH
6.3. CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH LÊN BẢN MỎNG

Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và
cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của
bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ.

15
6. TiẾN HÀNH
6.3. CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH LÊN BẢN MỎNG

Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của
kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của
lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch
chấm lên bản mỏng.
Do đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng phải
dùng các mao quản định mức chính xác.
Khi không cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mao
quản thường.

16
6. TiẾN HÀNH
6.4. TRIÊN KHAI SẮC KÝ

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các
vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển.
Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi.
Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn
theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình,
đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại
trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận
riêng.

17
Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến
hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy
định trong chuyên luận riêng.
Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn
hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay người ta
thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký
lớp mỏng hiệu năng cao

Ðại lượng đặc trưng cho

mức độ di chuyển của chất
phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng
tỷ lệ giữa khoảng dịch
chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của
dung môi: 18
a là khoảng cách từ điểm xuất
phát đến tâm của vết mẫu
thử, tính bằng cm.
a’ là khoảng cách từ điểm
xuất phát đến tâm của vết
mẫu đối chiếu, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất
phát đến mức dung môi đo
trên cùng đường đi của vết,
tính bằng cm.

Rf: có giá trị từ 0 đến l

19
 2.0 cm
Rf (A) = = 0.40
5.0 cm
Solvent Front

Rf (B) = 3.0 cm = 0.60

5.0 cm
Distance solvent
migrated = 5.0 cm
4.0 cm
Distance A
migrated = 3.0 cm Rf (C) = 0.8 cm = 0.16
5.0 cm

Distance B
migrated = 2.0 cm 3.0 cm Rf (D) = 4.0 cm = 0.80
5.0 cm
Distance C
migrated = 0.8 cm
0.8 cm Rf (U1) = 3.0 cm = 0.60
Origen
x x x x x 5.0 cm
A B U C D
0.8 cm
Rf (U2) = = 0.16
5.0 cm

20
6. TiẾN HÀNH
6.5. PHÁT HiỆN VÀ THU NHẬN KẾT QUẢ

6.5/- Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả

trong sklm điều chế:
6.5.1/- Phun xịt với thuốc thử đặc trưng :
Giúp biết được vị trí của vết mẫu trên tấm bản.

21
6. TiẾN HÀNH
6.5. PHÁT HiỆN VÀ THU NHẬN KẾT QuẢ
6.5.2/- Soi bản dưới đèn UV :

Nhanh, tiện lợi, nhìn được vết mà

không gây hao hụt mẫu.
Tuy nhiên, vết có thể ở vị trí x
trên bản, nhưng mắt lại nhìn
thấy vị trí biểu kiến của nó, nghĩa
là ở một vị trí khác. Cần kiểm tra
một vài lần bằng cách che môt
phần bản và phun xịt các thuốc
thử để nhìn rõ vị trí của các vết.
22
6. TiẾN HÀNH
6.5. PHÁT HiỆN VÀ THU NHẬN KẾT QuẢ

6.5.3/- Hơ hơi iod :

Đặt bản trong một buồng có hơi iod, khi thấy vết hiện lên trên
bản, lấy bản ra khỏi buồng, đánh dấu vị trí của vết, phơi bản ngoài
quạt hơi iod sẽ bay đi mất.

23
7. ƯU NHƯỢC ĐIỂM
7.1. ƯU ĐiỂM
Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, có thể thực hiện ở mọi phòng thí
nghiệm.
Thời gian thực hiện nhanh, tối đa vài giờ.
Do cách thực hiện đơn giản nên có thể dùng SKLM để khảo sát các hệ
dung môi cho các phương pháp sắc ký khác.
Nhìn chung SKLM là phương pháp có tính ứng dụng rất cao, thông dụng
nhất hiện nay.
Nhanh, dễ tìm được các dung môi thích hợp để tách các chất.
Các vùng có chứa chất cần thiết sẽ tập trung tại 1 vị trí nhất định dễ
dàng phát hiện, dễ dàng nhận biết
SKLM tách tốt là nhờ tỷ lệ lớn giữa chất tách : chất hấp thu silicagel từ
1:1000 đến 1:10000 trong khi tỷ lệ này ở sắc ký cột là 1:50 đến 1:100

7.2/ NHƯỢC ĐiỂM

Thành phần pha động dễ thay
filter paper

đổi trong quá trình khai triển.

Các vết sau khai triển thường
bị kéo đuôi. A B U C D B U
A C D
24
8. ỨNG DỤNG

Là kỹ thuật sắc ký phổ biến và thông dụng nhất để định tính; phát
hiện một chất trong hỗn hợp phức tạp

TLC - Optimizing for column chromatography

25
The END

26
Minh họa hình ảnh
thực tập sắc ký lớp mỏng

27
28
Animation Animation Animation
https://www.youtu https://www.yout https://www.yout
be.com/watch?v=C ube.com/watch?v ube.com/watch?v
mHFVxTxkGs =U2BKeT8toLQ =pSUW4s75QpI

31