‫יחידה ‪ – 4‬חלבונים‬ ‫בס"ד‬

‫)המשך(‬

‫טובה יותר כאשר משתמשים בלחץ ודוחסים את מולקולות החלבון‬

‫יחידה ‪ – 4‬חלבונים )ב'(‬
‫דרך המבחנה )‪.(HPLC‬‬
‫‪ – (Size exclusion (gel filtration‬מבוסס על גודל‬ ‫‪.II‬‬ ‫הפרדת וניקוי חלבונים‬ ‫‪.1‬‬
‫החלבונים‪ ,‬כאשר בפאזה הנייחת יש מעין "חורים" שמעכבים את‬
‫המטרה של תהליך ההפרדה והניקוי היא בידוד חלבון יחיד שאותו אנו‬
‫החלבונים הקטנים יותר‪ ,‬ואילו הגדולים יותר יורדים במסלול יותר‬
‫מעוניינים לחקור מתוך ריכוז )למשל – רקמה או תא בודד( של חלבונים‪.‬‬
‫מהיר וישיר‪.‬‬
‫כיצד נבודד את החלבון שבו אנו מעוניינים?‬
‫‪ – Affinity‬הפאזה הנייחת כוללת ליגנדים שידועים‬ ‫‪.III‬‬
‫)‪crude‬‬ ‫השלב הראשון בתהליך ההפרדה הוא יצירת תמיסת גולמית‬
‫כקושרי החלבון המסויים‪ ,‬ולאחר שכל החלבונים האחרים נשטפים‬
‫‪ (extract‬שכוללת שברי תאים ותכולתם‪ .‬לשם כך אנו שוברים את התא‬
‫החוצה‪ ,‬מוחדרת תערובת של ליגנדים חופשים למבחנה ועמה‬
‫שבו החלבונים ותכולתו מתרוקנת לתוך התמיסה הגולמית )ניתן להעזר‬
‫נשטף החוצה החלבון שחפשנו )כלומר‪ ,‬זה משחרר אותו מהקישור‬
‫בצנטרפוגה(‪ .‬השלב הבא הוא ‪ – fractionation‬בידוד של החלבון‬
‫אל הפאזה הנייחת(‪.‬‬
‫המסויים שמעניין אותנו על בסיס תכונות ספציפיות‪.‬‬
‫כדי לקבוע את השיטה הדרושה להפרדת חלבון לא ידוע בד"כ מנסים‬
‫מסיסות‪ ,‬למשל‪ ,‬היא תכונה כזו‪ .‬המסיסות של חלבונים בדרך כלל יורדת‬
‫באופן אמפירי כמה שיטות שונות‪ ,‬כאשר ניתן לצמצם את תהליך הניסוי‬
‫בסביבה מלוחה‪ ,‬וע"י העלאת ריכוז המלח )‪ (salting out‬לרמה הנדרשת‬
‫והטעייה ע"י שימוש בטכניקות שמתאימות לחלבונים דומים‪ .‬בד"כ‬
‫נוכל ליצור שקיעה מבוקרת של חלבונים מסויימים‪ .‬כדי להגביר מליחות‬
‫ההפרדה נעשית בשלבים‪ ,‬כאשר לאחר כל שלב נותר פחות תכשיר‬
‫משתמשים בדרך כלל באמוניאום סולפט )‪ .-NH4+)2SO42‬לעתים יש צורך‬
‫להפריד‪ ,‬ההפרדה נעשית יעילה יותר‪ ,‬ואפשר להשתמש בשיטות יותר‬
‫בניקוי יותר משמעותי של התמיסה ולשם כך אפשר לבצע דיאליזה שלה –‬
‫ספציפיות ומתוחכמות‪.‬‬
‫הפרדת חלבונים על בסיס גודלם‪ .‬הדבר נעשה בעזרת ממברנה חדירה‬
‫אלקטרופורזיס ‪((PAGE – polyacrylamide gel‬‬ ‫באופן חלקי ויצירת מאזן אוסמוטי שיגרום לתנועה של המים החוצה והותרת‬
‫החלבונים בצד השני‪.‬‬
‫שיטה זו מתבססת על מטען החלבונים ותנועתם‬
‫בשדה חשמלי‪ .‬החסרון שבה הוא‬ ‫כרומוטוגרפיה‬
‫שהשדה עשוי לגרום לשינוי במבנה‬
‫השיטה החזקה ביותר להפרדת חלבונים היא כרומוטוגרפיה בעזרת קולונה‬
‫החלבון‪ ,‬וממילא בתפקודו‪ .‬מצד שני‬
‫)מבחנה(‪ ,‬משום שהיא מנצלת מספר תכונות של חלבונים‪ :‬מטען‪ ,‬גודל‪,‬‬
‫היא יעילה ביותר ככלי אנליטי‪ :‬היא‬
‫אפיניות וקשירה ועוד‪ .‬ראינו את השיטה ואופן פעולתה כאשר דנו על‬
‫מאפשרת לקבל תצוגה ויזואלית של‬
‫הפרדת חומצות אמינו )יחידה ‪ .(2‬באופן כללי נזכיר כי השיטה הזו יכולה‬
‫החלבונים בתערובת‪ ,‬היא מאפשרת‬
‫לפעול בכמה דרכים‪:‬‬
‫להעריך בקלות את מספר החלבונים‬
‫בתערובת ואת מידת הנקיות שלה והיא‬ ‫‪ – Ion exchange‬הפאזה הנייחת טעונה במטען חיובי או‬ ‫‪.I‬‬
‫מאפשרת לקבוע תכונות כמו הנקודה‬ ‫שלילי‪ ,‬והחלבונים שטעונים במטען הפוך לזה של הפאזה הנייחת‬
‫האיזואלקטרית של החלבון ומשקלו‬ ‫ירדו לאט יותר‪ .‬שיטה זו משוכללת ומאפשרת רזולוציית הפרדה‬
‫המולקולרי המוערך‪.‬‬

‫© נדב וילנר‬ ‫‪1‬‬

 ‫יחידה ‪ – 4‬חלבונים‬ ‫בס"ד‬
‫)המשך(‬

‫)‪ (1‬המשוואה של הריאקציה‪ (2) ,‬פרוצודרה אנליטית שמאפשרת לבדוק‬ ‫האלקטרופורזיס נעשית בדרך כלל על ג'ל המורכב מהפולימר‬
‫כמות תוצרים ומגיבים‪ (3) ,‬האם האנזים זקוק לקופקטורים‪ (4) ,‬הקשר בין‬ ‫פוליאקרילאמיד‪ .‬מיקומו הסופי של החלבון בתהליך נקבע בהתאם לשתי‬
‫פעילות האנזים וריכוז הסובסטרט‪ Ph (5) ,‬אופטימלי ו‪ (6) -‬טווח הטמפ'‬ ‫תכונות נוספות מלבד המטען‪ :‬הנפח והצורה‪" .‬הגובה" הסופי של החלבון‬
‫הרצוי‪.‬‬ ‫בעמודה )כמו בתמונה( הוא היחס בין הנפח לשדה החשמלי השווה גם‬
‫בכל אופן ההגדרות הדרושות לתהליך הן‪:‬‬ ‫ליחס בין מטען החלבון למקדם החיכוך בינו ובין הג'ל )המושפע כמובן‬
‫מצורת החלבון(‪ .‬כל זה במצב הנטורטיבי של החלבון‪.‬‬
‫‪ o‬פעילות אנזימתית – יחידה אחת של פעילות אנזימתית היא כמות‬
‫האנזימים שגורמים לטרנספורמציה של ‪ 1‬מיקרומול לדקה ב‪25 -‬‬ ‫‪ – Sudium dodecyl sulfate‬את השיטה ניתן לשכלל כדי להעריך איכות‬
‫מעלות ותנאים אופטימליים‪.‬‬ ‫ניקוי ומשקל מולקולרי של חלבון ע"י שימוש בדטרגנט ‪ .SDS‬דטרגנט זה‬
‫נקשר לרוב סוגי החלבונים‪ ,‬כאשר הוא מאופיין בשני דברים‪ :‬ראשית‪,‬‬
‫פעילות טוטלית – כמות הטוטלית של יחידות אנזימים בתמיסה‬ ‫‪o‬‬
‫המטען של החלבון עצמו ממוסך ע"י מטענו השלילי הגדול של ה ‪,SDS‬‬
‫פעילות ספציפית – כמות יחידות האנזימים למיליגרם של החלבון‪.‬‬ ‫‪o‬‬ ‫ושנית‪ ,‬יחס הקשירה הוא בדרך כלל מולקולה אחת של ‪ SDS‬לכל שתי‬
‫יש לשים לב שכמות זו תעלה תוך כדי ניקוי החלבון‪ ,‬משום שהכמות‬ ‫חומצות אמינו‪ .‬ומשמעות הדבר שלכל החלבונים בתמיסה הכוללת את ה‬
‫היחסית של האנזים שאנו מחפשים עולה עד שהאנזים מנוקה ואז הערך‬ ‫‪ SDS‬מטען זהה‪ ,‬וההפרדה ביניהם תתבסס על משקל מולקולרי בלבד‬
‫הזה קבוע‬ ‫– אלו תנאים דנטורטיביים‪ .‬כך ניתן לאתר גם משקל מולקולרי של חלבון‬
‫‪ o‬מידת הניקוי והניצולת – מידת‬ ‫חדש ולא ידוע )ע"י השוואה למשקלים של חלבונים ידועים‪ ,‬או ע"י שימוש‬
‫הניקוי היא הפעילות הספציפית בכל‬ ‫בגרף ליניארי ידוע שנותן את היחס בין המיקום על מכשיר האלקטרפורזיס‬
‫שלב חלקי הפעילות הספציפית‬ ‫למשקל המולקולרי(‪.‬‬
‫ההתחלתית‪ ,‬והניצולת היא הפעילות‬ ‫‪ – Isoelectric focusing‬זוהי פרוצדורה לקביעת הנק' האיזואלקטרית של‬
‫הטוטלית בכל שלב חלקי הפעילות‬ ‫החלבון‪ .‬גם כאן משתמשים במבחנה מלאה בג'ל אלא שהפעם הג'ל מצוי‬
‫הטוטלית ההתחלתית‬ ‫בגרדיאנט ‪ Ph‬קבוע‪ .‬המבחנה נתונה בשדה חשמלי‪ ,‬וכל חלבון בפועל‬
‫לאחר כל שלב ניקוי בודקים את‬ ‫מסתדר ב ‪ Ph‬שהוא הנקודה האיזואלקטרית שלו‪.‬‬
‫האקטיביות ואת הכמות הכללית של‬ ‫‪ – two-dimensional‬שיטה זו היא פשוט שילוב שתי השיטות הקודמות )‬
‫החלבון בתמיסה והיחס ביניהם נותן לנו‬ ‫‪ + SDS‬איזואלקטרית(‪ .‬מבצעים הפרדה מסוג מסויים ולאחר מכן את‬
‫את הפעילות הספציפית‪ .‬הפעילות‬ ‫השניה‪ ,‬על אותה מבחנה‪ .‬כך ניתן להבחין בין חלבונים בעלי משקל‬
‫הטוטלית יורדת בתהליך משום שיש‬ ‫מולקולרי זהה על בסיס מטען‪ ,‬או בעלי מטען זהה על בסיס משקל‪.‬‬
‫איבוד של אנרגיה בגלל אנזימים לא‬
‫פעילים או אינטרקציות עם מולקולות‬ ‫אנזימים‬
‫אחרות בתמיסה‪ .‬הכמות הכללית של‬
‫אם החלבון שאנו מחפשים הוא אנזים‪ ,‬ניתן לקבוע את כמותו היחסית‬
‫החלבון יורדת אף היא משום שיש סילוק‬
‫בתערובת ע"י בדיקת כמות התוצרים שנוצרים בריאקציה שבה משתתף‬
‫מתמיד של החלבונים שאינם רצויים‪.‬‬
‫האנזים‪ .‬כך נוכל בסופו של דבר לזהות את החלבון‪ .‬דבר זה מצריך בכל‬
‫כאשר התהליך מוצלח יש יותר איבוד של‬
‫זאת ידע מקדים וכמה וכמה הנחות‪:‬‬

‫© נדב וילנר‬ ‫‪2‬‬

 ‫יחידה ‪ – 4‬חלבונים‬ ‫בס"ד‬
‫)המשך(‬

‫האמינית שחפשנו‪ .‬הפרוצדורה הזו‬
‫אינה מאפשרת לקבוע את המשך‬
‫הרצף‪ ,‬אבל היא עשויה לחשוף בפנינו‬
‫כמה פוליפפטידים כולל החלבון‬
‫הנבדק‪.‬‬
‫חלבונים לא רצויים מאשר של פעילות טוטלית‪ ,‬וכך נשמרת עלייה של‬
‫הפעילות הספציפית‪ .‬התהליך מסתיים כאשר אי אפשר להעלות את‬
‫הפעילות הספציפית או כאשר סוג יחיד של חלבון כבר זוהה‪.‬‬
‫קביעת רצף החלבון‬ ‫‪.2‬‬

‫ב‪ .‬ריאקצית אדמן‬
‫ריאקצית אדמן גם היא מתבססת על יצירת קשר קוולנטי בין הקצה האמיני‬
‫ובין הראגנט )‪ ,(phenyllisothiocyanate‬ולאחר מכן הוספת ‪ HCL‬לתמיסה‪ ,‬אלא‬
‫שבשיטה זו שאר החלבון נשאר שלם‪ ,‬ונוצר קצה אמיני חדש‪ .‬בשלב‬
‫הזה אפשר לבודד את המולוקולה שנוצרה מהקצה האמיני הקודם ולזהות‬
‫את החומצה‪ .‬הפרצודרה נעשית במכונה‪ ,‬שחוזרת על התהליך שוב ושוב‬
‫וכל פעם מזהה את הקצה האמיני החדש‪ ,‬עד לפענוח רצף החלבון כולו‪.‬‬
‫הבעיה בשיטה זו היא שבכל שלב התגובה הכימית לא מכסה ‪100%‬‬
‫מהקצוות האמיניים שבתמיסה‪ .‬משמעות הדבר שבכל פעם שאנו חוזרים‬
‫על התהליך‪ ,‬תתקבלנה תוצאות של קצוות אמינים שהגיבו רק עכשיו ולא‬
‫קודם‪ ,‬ובעצם נקבל את החומצה האמינית הקודמת שכבר קבלנו‪ .‬לכן‪,‬‬
‫השיטה הזו יעילה לזיהוי רצף של פוליפפטידים שאינם עולים על ‪50‬‬
‫חומצות אמינו‪ .‬יותר מזה – "רעש הרקע" המתקבל לא מאפשר זיהוי נכון‬
‫של החומצה‪.‬‬
‫‪ – substitutions‬איזורים בהם ישנו מספר מוגבל וברור של חומצות‬
‫קביעת הרצף הראשוני של חלבונים גדולים‬
‫בחלבונים גדולים נצטרך לבצע קודם כל שבירת קשרים דיסולפידיים וכן‬
‫חיתוך של החלבון לכמה פוליפפטידים בגדלים שעליהם נוכל לבצע את‬
‫ריאקצית אדמן‪ .‬השלבים‪:‬‬
‫שבירת קשרים דיסולפידיים – נעשית בשתי טכניקות‬ ‫‪.1‬‬
‫מרכזיות‪:‬‬
‫חמצון‬
‫)בעזרת‬
‫חומצה( או‬
‫חיזור‬
‫)בעזרת‬
‫כפי שכבר ראינו ביחידות בעבר‪ ,‬מבנה החלבון – ואם כן גם תפקודו – נקבע‬
‫בסופו של דבר על ידי רצף חומצות האמינו‪ .‬להנחה זו יש שלוש הוכחות‬
‫מרכזיות‪ :‬הראשונה‪ ,‬לחלבונים בעלי תפקיד שונה יש רצף ראשוני שונה‪,‬‬
‫השניה‪ ,‬מחלות רבות קשורות לחלבונים לא מתפקדים שבהם נתגלה שינוי‬
‫קטן ברצף‪ ,‬ולבסוף – חלבונים בעלי תפקיד דומה אצל מינים שונים של‬
‫יצורים חיים מציגים רצפים דומים‪.‬‬
‫עם זאת‪ 30%-20% ,‬מהחלבונים של האדם הם פולימורפיים – כלומר‪,‬‬
‫בעלי תפקוד דומה אך רצף שונה‪ .‬ישנם איזורים קריטיים שקובעים את‬
‫תפקוד ומבנה החלבון והם זהים‪ ,‬אך בשאר האיזורים עשוי להיות שינוי‬
‫מסויים‪ ,‬שלא ישפיע על מבנה ותפקוד‪.‬‬
‫חלבונים המולוגיים מוגדרים כחלבונים שקשורים אבולוציונית; בד"כ הם‬
‫בעלי תפקוד דומה בקרב מינים שונים‪ .‬יש בהם איזורים שנקראים‬
‫‪ invariant residues‬שהם האיזורים הזהים בכל החלבונים ההומולוגיים‪,‬‬
‫יש בהם איזורים משתנים‪ ,‬ויש איזורים שנקראים ‪conservative‬‬
‫היכולות להתחלף ביניהן‪ .‬הטענה המחקרית היא שמינים קרובים יותר‬
‫באיזורים המשתנים כנראה קרובים יותר מבחינה פילוגנטית )אבולוציונית(‪.‬‬
‫קביעת הרצף הראשוני של חלבונים קטנים‬
‫א‪ .‬ראגנט סנגר – מציאת החומצה האמינית בקצה האמיני‬
‫סנגר פיתח פרוצדורה בעזרתה ניתן לגלות מיהי החומצה בקצה האמיני של‬
‫החלבון‪ ,‬זאת ע"י שימוש בריאגנט ‪-1‬פלורו‪-2,4-‬דיניטרובנזן שמתחבר אל‬
‫הקצה האמיני )ישנם כמה ריאגנטים נוספים שאפשר להשתמש בהם(‪.‬‬
‫לאחר יצירת הקשר אל הקצה האמיני מפורק החלבון בעזרת חומצת‬
‫‪ ,HCL‬מבודדים את המולקולה שבה הריאגנט ומוצאים את החומצה‬

‫© נדב וילנר‬ ‫‪3‬‬

 ‫יחידה ‪ – 4‬חלבונים‬ ‫בס"ד‬
‫)המשך(‬

‫סוכני חיזור(‪ .‬כאשר בוחרים לחזר יש לבצע אצילציה )=יצירת קצה‬

‫קרבוקסילי( לציסטאין כדי למנוע הווצרות חוזרת של הקשרים‬
‫הדיסולפידיים‪.‬‬
‫חיתוך החלבון – ישנן מספר טכניקות חיתוך‪ ,‬רובן‬ ‫‪.2‬‬
‫משתמשות באנזימים שחותכים את הפוליפפטיד בסמוך לחומצה‬
‫אמינית ידועה )כפי שניתן לראות בטבלה(‪ .‬כך‪ ,‬למשל‪ ,‬טריפסין‬
‫חותך באופן שהקצה הקרבוקסילי של הפפטידים הנוצרים הוא‬
‫תמיד ליזין או ארגינין‪ .‬לכן‪ ,‬בחלבון בעל ‪ 5‬הופעות של ליזין או‬
‫ארגינין‪ ,‬לאחר החיתוך מתקבלים ששה פפטידים‪ ,‬שחמישה מהם‬
‫מסתיימים בליזין או ארגינין‪.‬‬
‫קביעת הרצף הספציפי – קביעת הרצף של כל פפטיד‬ ‫‪.3‬‬
‫שנוצר בחיתוך נעשית כפי שכבר ראינו בראקציית אדמן‬
‫קביעת הסדר של הפפטידים – כעת יש לקבוע מהו‬ ‫‪.4‬‬
‫הסדר של שברי החלבון )הפפטידים( שמצאנו את הרצף שלהם‪.‬‬
‫ראשית כל‪ ,‬אנו יכולים לקבוע בעזרת ראגנט סנגר את החומצה‬
‫בקצה האמיני של החלבון כולו‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬כדי לקבוע את הסדר‬
‫בין הפפטידים אנו חותכים את החלבון בעזרת כמה שיטות חיתוך‪,‬‬
‫משום שכל שיטה חותכת את הפוליפפטיד באופן שונה‪ .‬לבסוף‪,‬‬
‫מחפשים איזורי חפיפה בין הפפטידים שנמצאו בשיטות החיתוך‬
‫השונות‪ .‬ניתן להשתמש בכמה וכמה שיטות חיתוך עד לקבלת‬
‫חפיפה שמאפשרת חשיפה של הרצף‪.‬‬
‫איתור מיקום הקשרים הדיסולפידיים – כדי לעשות‬ ‫‪.5‬‬
‫זאת מבצעים שוב חיתוך על חלבון שלא שברו בו את הקשרים‬
‫הדיסולפידיים מלכתחילה‪ .‬לאחר מכן מוצאים את הרצפים של‬
‫הפפטידים שנוצרו‪ ,‬ומשווים את הרצפים לחלבון שבו שברו את‬
‫הקשרים הדיסולפידיים‪ .‬ההשוואה תגלה כי פפטידים מסויימים‬
‫שמופיעים בנפרד בחלבון ששברו לו את הקשרים מופיעים כפפטיד‬
‫אחד ארוך בחלבון שלא שברו לו את הקשרים‪ .‬נקודת החיבור היא‬
‫הנקודה ברצף שבו קיים קשר דיסולפידי‪.‬‬

‫© נדב וילנר‬ ‫‪4‬‬