‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA‬‬
‫המונומרים של ה‪ DNA -‬הם נוקלאוטידים‪ .‬כל נוקלאוטיד מורכב מבסיס‪ ,‬סוכר‬
‫ופוספט‪ .‬הסוכר ב‪ DNA-‬הוא דאוקסי ריבוז‪ .‬הבסיסים‪:‬‬
‫• פירימידינים‪ .C ,T :‬טבעת חנקנית אחת‪.‬‬
‫ב‪ RNA -‬יש ‪ U‬במקום ‪.T‬‬
‫• פורינים‪ .A ,G :‬שתי טבעות חנקניות‪.‬‬

‫הנוקלאוטיד בתמונה הינו מונופוספט‪.‬‬

‫הסוכר הוא ריבוז ‪ -‬בעל חמישה פחמנים‪ .‬על כל אחד מהפחמנים יש קבוצת ‪.OH‬‬
‫אם בפחמן ‪ 2‬יש רק ‪ ,H‬הוא ייקרא דיאוקסי ריבוז‪.‬‬
‫‪ - DNA‬דיאוקסי ריבוז‪ - RNA .‬ריבוז‪.‬‬
‫הקשר בין הסוכר לבסיס הוא קשר ‪ N‬גליקוזידי‪.‬‬
‫לכל נוקלאוטיד יש ‪ 2‬קצוות‪ 3 :‬ו‪ .5-‬והם נקשרים זה לזה בקשר פוספודיאסטרי‪,‬‬
‫הפוספט בקצה ‪ 5‬נקשר ל‪ OH -‬בקצה ‪ .3‬ל ‪ DNA‬יש כיווניות‪.‬‬
‫נומנקלטורה‬
‫נוקלאוטיד – סוכר ‪ +‬בסיס ‪ +‬פוספט‬
‫נוקלאוזיד – סוכר ‪ +‬בסיס‬

‫המבנה של ה‪:DNA -‬‬

‫רוזלינד פרנקלין גילתה את המבנה של ה‪ DNA‬ב‪ .X-ray -‬ווטסון וקריק מצאו את‬
‫המודל של ה ‪.Double strand‬‬
‫• ה‪ DNA -‬הוא דו גדילי ‪ -‬גדיל אחד מורכב מפוספט סוכר שחוזר על עצמו‬
‫והבסיסים אינם יוצרים קשר בינהם‪.‬‬
‫• ה‪ DNA -‬הוא אנטי פרללי ‪ -‬הגדילים מחוברים בקשרי מימן בין הבסיסים בלבד‪,‬‬
‫תמיד מול פורין יהיה פירימידין ולהפך‪ .‬זה חשוב כי כך המרחק בין שני‬
‫הגדילים נשאר קבוע (‪ 3‬טבעות) ויש סימטריה‪ .‬בין ‪ A‬ל‪ T -‬יש ‪ 2‬קשרי מימן ובין‬
‫‪ G‬ל‪ C -‬יש שלושה קשרי מימן‪ .‬מספר הנוקלאוטידים של ‪ T‬יהיה שווה ל‪ ,A -‬וכך‬
‫גם לגבי ‪ G‬ו‪ .A+G=T+C .C -‬גדיל אחד בכיוון ‪ 5‬ל‪ 3‬והשני בכיוון ההפוך‪.‬‬
‫• מבנה ה‪ DNA -‬הינו ‪ - Double helix‬בצורה סלילית‪.‬‬

‫תכולת נוקלאוטידים באדם‪ A :‬ו‪ T‬מהווים כל אחד ‪ G ,30%‬ו‪ C‬מהווים כל אחד ‪ .20%‬באורגניזמים שונים‪ ,‬כמו‬
‫חיידקים‪ ,‬התכולה שונה‪ ,‬תלוי באדפטציה שלהם לסביבה‪ .‬לדוגמא‪ :‬אם ניקח שני חיידקים ‪ -‬אחד בודד ממעיינות‬
‫חמים ואחד מהכינרת‪ :‬בחיידק שבודד מהמעיינות החמים יהיו יותר קשרי ‪ G‬ו‪ C -‬כי הקשר בינהם יותר חזק והוא מונע‬
‫פירוק של ה‪ DNA‬בעת חימום‪.‬‬

‫תשובות לשאלות‪:‬‬

‫‪ - dsDNA .1‬דנא דו גדילי‪.‬‬

‫תימידין ‪ 15‬אחוז ‪ 15 ‬אחוז אדנין‪.‬‬
‫‪ 70 ‬אחוז ציטוזין וגואנין ‪ 35 ‬אחוז גואנין‪.‬‬

‫‪ 48 .2‬אחוז ‪ 24  G-C‬אחוז מכל אחד מהם‪.‬‬

‫‪ 52 ‬אחוז ‪ 26  T-A‬אחוז מכל אחד מהם‪.‬‬

‫‪ - dsDNA .3‬דנא חד גדילי‪.‬‬

‫בחד גדילי לא ניתן לדעת מה התכולה!!‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫המבנה של ההליקס‪:‬‬

‫בעל ‪ 3‬צורות אפשריות‪:‬‬

‫‪ - A form .1‬מסובב ימינה‪.‬‬
‫‪ - B form .2‬מסובב ימינה‪.‬‬
‫‪ - Z form .3‬מסובב שמאלה‪.‬‬

‫ההבדל בין ‪ A‬ל‪:B‬‬

‫‪ .Major and Minor groove‬יש מגרעת (‪ )groove‬גדולה וקטנה‪ .‬המגרעת הגדולה ברוחב ‪ A' 22‬ואילו‬
‫הקטנה היא ‪.A' 12‬‬
‫המגרעות חשובות כי שם נקשרים חלבוני בקרה או ‪.Transcription factors‬‬
‫חלבונים לא ספציפים (נגיד היסטונים) יקשרו בכל מקרה לדנ"א אולם חלבונים ספציפיים יקשרו בעיקר‬
‫ל‪.major‬‬
‫אחוז הלחות\המים ישפיעו על הצורה של הגדיל‪.‬‬
‫לדוגמא‪ :‬הרבה מים יגרמו לצורת ‪ .B‬בגוף התאים מלאים במים ולכן זאת תהיה הצורה‪ ,‬אולם ישנם‬
‫אזורים ספציפים שהצורה יכולה להיות שונה‪ ,‬נגיד חלק מהדנא יכול להסתדר כ‪( Z‬בעיקר באזורים‬
‫שעשירים מאוד ב‪ .)G=C‬אם נעלה את ריכוז היונים ונוריד את הלחות אז הוא יסתדר כ‪( A‬יכול להיווצר גם‬
‫בהיבריד של דנא ורנא)‪ .‬כאשר מפיקים ‪ DNA‬ורוצים לעשות מניפולציות המבנה שלו ישתנה בהתאם‬
‫לתנאים שבהם הוא יימצא‪.‬‬

‫סיכומון המבניים האפשריים‪:‬‬

‫‪ -Helix sense‬סיבוב ימינה\שמאלה‪.‬‬ ‫•‬

‫‪ -bp/turn‬מספר הנוקלאוטידים סביב סיבוב אחד‪.‬‬ ‫•‬
‫‪ -Rise/bp along axis‬מה המרחק בין הנוקלאוטידים‪.‬‬ ‫•‬
‫‪ Z‬הכי ארוך‪.‬‬
‫‪ -Pitch/ turn of helix‬המרחק בין סוף סיבוב אחד לתחילת‬ ‫•‬
‫הסיבוב הבא‪ .‬הכפלה בין השניים הקודמים‪.‬‬
‫‪ -Diameter‬קוטר‪ A .‬הוא בעל הקוטר הכי רחב והוא גם הכי‬ ‫•‬
‫קצר‪ B ,‬הוא בינוני ברוחב ובאורך‪ Z ,‬הינו הכי צר וארוך‪.‬‬
‫‪ -Groove‬ל‪ A‬ו‪ B‬יש את שני הסוגים‪ .‬ל‪ Z‬יש רק ‪.minor‬‬ ‫•‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪The Central Dogma‬‬

‫‪ DNA‬יכול לעבור שעתוק ל‪ RNA -‬והוא עובר תרגום לחלבון‪ .‬נעשה בכל התאים כל‬ ‫•‬
‫עוד יש דנא בגרעין‪ .‬נגיד בתאי דם אדומים אין גרעין ולכן לא יהיה שעתוק ותרגום‪.‬‬
‫‪ DNA‬עובר רפליקציה ‪ -‬לא בכל התאים מתבצעת רפליקציה‪ ,‬כי לא כל התאים‬ ‫•‬
‫מתחלקים‪.‬‬
‫קיימת אפשרות של מעבר אינפורמציה מ‪ RNA -‬ל‪ .DNA -‬התהליך נקרא‪Reverse :‬‬ ‫•‬
‫‪ .transcription‬לדוגמא ווירוס ה‪ :HIV -‬הגנום של ווירוס ה‪ HIV -‬הינו ‪ ,RNA‬ובמחזור‬
‫החיים הוא הופך ‪ RNA‬ל‪ DNA -‬וכך עובר אינטגרציה לגנום של המאחסן‪ .‬לאחר מכן‬
‫עושה טרנסקריפציה רגילה כדי ליצור יותר מהגנום שלו‪ .‬ייחודי לרטרו ווירוסים‪.‬‬

‫‪Replication Facts‬‬

‫הדנ"א חייב להיות מוכפל לפני שהתא מתחלק‪ .‬הדנ"א עובר שכפול רק כאשר התא‬ ‫•‬
‫צריך להתחלק‪ .‬בגופנו מרבית התאים אינם מתחלקים‪.‬‬
‫הדנ"א משוכפל בשלב ‪ S‬של ה‪ Cell cycle‬בזמן ה‪.Interphase -‬‬ ‫•‬
‫תאים חדשים יצטרכו גדילי ‪ DNA‬זהים‪.‬‬ ‫•‬

‫‪DNA Replication mechanism‬‬

‫מנגנון הרפליקציה של ה‪ DNA -‬הינו סמי קונסרבטיבי ‪ -‬משמר למחצה‪.‬‬
‫הגדילים החדשים בנויים מגדיל ישן ומגדיל חדש‪.‬‬

‫הניסוי של ‪:Meselson & Stahl‬‬

‫חיידקים גודלו עם ‪ N14‬במשך הרבה דורות‪.‬‬
‫לאחר מכן העבירו דור אחד בלבד לנוקלאוטידים‬
‫שיש בהם ‪.N15‬‬
‫שמים במבחנה ריכוז גבוה של צזיום כלוריד‪-‬‬
‫‪( CsCl‬הוספת מלח מהווה מעין סולם ‪ -‬למטה‬
‫הצפיפות הכי גבוהה וכל שעולים הצפיפות‬
‫נמוכה יותר) ולאחר סירכוז במהירות גבוהה‬
‫נוצר מעין גרדיאנט ‪ -‬ככל שהחלקיקים יותר‬
‫כבדים כך הם יותר ישקעו‪.‬‬

‫האופציות במנגנון הרפליקציה‪:‬‬

‫• קונסרבטיביות שלמה ‪ -‬דנא עם שני גדילים‬
‫חדשים ‪ +‬דנא עם שני גדילים ישנים‪.‬‬
‫• סמי קונסרבטיבי ‪ -‬שתי מולק' דנא עם גדיל אחד‬
‫ישן וגדיל אחד חדש‪.‬‬
‫• דפרסיב ‪ -‬יש ערבוב של הגדילים‪.‬‬

‫התקבלה התוצאה הימנית ביותר‪.‬‬

‫מתאר סמי קונסרבטיבי ודפרסיב‪.‬‬
‫כלומר הוכחנו בניסוי הזה שזה לא קונסרבטיב שלם‪.‬‬
‫על מנת להוכיח שמדובר בסמי קונסרבטיביות נצטרך‬
‫לעשות עוד הכפלה עם ‪.N14‬‬
‫בדפרסיב יהיה בנד ‪ 1‬שהוא קצת למטה מהאמצע‪.‬‬
‫בסמי קונסרבטיב נקבל ‪ 2‬פסים אחד לייט‪-‬לייט ואחד‬
‫לייט‪-‬הבי‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA denaturation & annealing‬‬

‫כדי לעשות רפליקציה יש לבצע הפרדה בין הגדילים‪ ,‬לשם כך יש לבצע דנטורציה‪ .‬ב‪ ,DNA -‬בניגוד לחלבונים‪ ,‬ברגע‬
‫שתהיה דנטורציה כל הגדילים ייפתחו ל‪ ,Single strand -‬ולאחר קירור הם יחזרו חזרה לדו גדיל ‪ -‬כל אחד יימצא את‬
‫הגדיל הקומפלימנטרי לבד ויעברו ‪.Annealing‬‬

‫דנטורציה בתנאים טבעיים‪:‬‬

‫יצירת ‪ RNA‬מ‪DNA‬‬ ‫•‬
‫התרה על ידי חלבונים‬ ‫•‬
‫התרה על ידי טופולוגית ‪DNA‬‬ ‫•‬
‫בתנאי ‪ - In vivo‬עושים הפרדה לצורך רפליקציה או טרנסקריפציה‪.‬‬
‫בגוף דנטורציה ל‪ DNA -‬נעשית רק בעזרת חלבונים (אנזימים)‪ ,‬שכן‬
‫בתנאי ‪ In vivo‬לא ניתן להרתיח\לשנות ריכוז מלחים וחומציות‪.‬‬

‫דנטורציה בתנאי מעבדה‪:‬‬

‫הרתחה‪ :‬מרתיחים את ה‪ DNA -‬ואז מחזירים לטמפ' החדר‪ ,‬ה‪-‬‬ ‫•‬
‫‪ DNA‬עובר ‪.Annealing‬‬
‫ריכוז יונים נמוך‪ :‬במידה וריכוז היונים יהיה נמוך תהיה דנטורציה‪.‬‬ ‫•‬
‫הפרעה לקשרי המימן‪ :‬כל דבר שיפריד את קשרי המימן בין‬ ‫•‬
‫הגדילים כמו‪ ,PH :‬אוריאה‪ ,‬חומרים בסיסיים‪.Formamide ,‬‬

‫ספקטרוגרפיה‪:‬‬
‫כאשר מרתיחים ‪ DNA‬ניתן לבדוק את רמת הבליעה בעזרת ספקטרופוטומטר‬
‫אשר בודק את עכירות התמיסה‪ ,‬בליעה באזור ה‪ 260‬ננומטר‪ .‬הבליעה תהיה‬
‫שונה אם הדנ"א הוא חד או דו גדילי‪ .‬ברגע שהדנ"א מופרד מספר מולקולות‬
‫ה‪ DNA -‬בתמיסה מוכפל‪.‬‬
‫בגרף‪:‬‬
‫בטמפ' של ‪ 80‬מעלות חלק מהגדילים מתחילים להיפתח‪.‬‬
‫מ‪ 80‬עד ‪ 90‬מעלות ‪ -‬מצב ביניים‪ ,‬חלק מהמולקולות הן סינגל וחלק דאבל‪,‬‬
‫כלומר רק חלק מהדנ"א עבר התרה‪.‬‬
‫‪ - Tm‬נקודת התכה‪ ,‬מסומן בעיגול בגרף‪ .‬כאשר ‪ 50‬אחוז מהמולקולות נפתחו‪,‬‬
‫עברו דנטורציה‪.‬‬
‫ב‪ 90‬מעלות כבר כל הדנא עבר התרה‪.‬‬
‫הבליעה‪:‬‬
‫מתחילים עם דנ"א דו גדילי‪ .‬כשהוא עובר דנטורציה מקבלים שתי מולקולות‬
‫של דנא חד גדילי ‪ -‬מעלה את רמת הבליעה‪ .‬רמת הבליעה תמשיך לעלות‬
‫בצורה לינארית מאחר והדנ"א החד גדילי מתקפל ויוצר מבנים שניוניים בינו‬
‫לבין עצמו‪.‬‬
‫מה משפיע על ה‪?Tm -‬‬
‫‪ .1‬ריכוז הדנ"א‪.‬‬
‫‪ .2‬ריכוז היונים בתמיסה ‪ -‬המלח מפריע להיווצרות קשרי מימן‪ .‬במלח יש‬
‫קשרים אלקטרוסטטיים‪ .‬קשרי מימן הם סוג של דיפול דיפול‪ ,‬ויונים הם‬
‫חומרים טעונים‪.‬‬
‫‪ .3‬רצף הדנ"א ‪ -‬ככל שיש יותר קשי ‪ C=G‬ה‪ Tm -‬עולה (יותר קשרי מימן)‪.‬‬
‫‪ .4‬אורך הדנ"א ‪ -‬במקטע קצר יהיו פחות קשרי מימן לעומת מקטע ארוך‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA Replication in prokaryotes‬‬

‫מורכב משלושה שלבים‪:‬‬
‫‪Initiation .1‬‬
‫‪Elongation .2‬‬
‫‪Termination .3‬‬

‫‪:Initiation‬‬
‫הרפליקציה מתחילה מה ‪ ,Origin of replication‬זה האתר בו הדנא נפתח‪.‬‬
‫לחיידקים יש כרומוזום מעגלי עם ‪ Origin of Replication‬אחד בלבד‪ ,‬אליו נקשרים חלבונים שאחראיים לרפליקציה‪.‬‬
‫לעומת זאת באאוקריוטים יש מספר ‪ ORI‬ומספר כרומוזומים‪.‬‬
‫ה‪ ORI‬של חיידק ‪ E.coli‬נפתח ומתחיל שכפול סמי קונסרבטיבי‪ .‬מקבלים ‪ 2‬מולקולות חדשות שכל אחת בנויה מגדיל‬
‫אחד חדש וגדיל אחד ישן‪.‬‬

‫מודל רפליקציה ‪:Theta‬‬

‫בחיידקים יש כרומוזום אחד של דנ"א המעוגן לממברנת התא כדי שתהיה סגרגציה של‬
‫הכרומוזום ל‪ 2-‬תאי הבת‪.‬‬
‫כל כרומוזום בנוי מגדיל ישן וגדיל חדש‪.‬‬

‫‪Replication fork‬‬
‫‪ Uni Directional‬או ‪?Bi Directional‬‬
‫האם הרפליקציה מתקדמת בכיוון אחד‪ ,‬או בשני כיוונים מנוגדים?‬
‫כיצד ניתן לבדוק את זה?‬
‫‪ .1‬ניתן לבדוק את זמן הרפליקציה ‪ -‬אם מדובר ב‪ Bi -‬מדובר בחצי‬
‫מהזמן‪.‬‬
‫‪ .2‬בעזרת סימון של נוקלאוטידים רדיואקטיביים‪ ,‬אם זה היה‬
‫‪ UniDirectional‬רק צד אחד היה מסומן רדיואקטיבית‪.‬‬

‫‪Origin of Replication in E.coli- oriC‬‬

‫מכיל כ‪.245 Base pairs -‬‬ ‫•‬
‫ישנם רצפים שמורים (‪ .)Consensus sequence‬מדובר ברצפים חשובים שאם יהיה בהם שינוי זה יגרום לשיבוש‬ ‫•‬
‫הרפליקציה‪.‬‬
‫ישנם ‪ 2‬סוגים של רצפים שמורים‪:‬‬
‫‪ -Tandem array of three 13 bp sequence o‬רצף של ‪ 13‬נוקלאוטידים שחוזר על עצמו ‪ 3‬פעמים‪ .‬כל‬
‫אחד מהם נקרא‪ dnaB box :‬והוא עשיר ב‪ .A=T‬רציפים ובאותו הכיון‪.‬‬
‫‪ .dnaA boxes o‬כל אחד מהם בנוי מ‪ 9-‬נוקלאוטידים‪ .‬הם אינם רציפים ואינם באותו הכיוון (נגיד אחד‬
‫יהיה ‪ TTAG‬ואז הרצף אחרי יכול להיות ‪.)GATT‬‬
‫לסיכום‪ :‬ההבדל בין ה‪ boxes -‬הוא באורך‪ ,‬ברצף ובסידור שלהם‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:dnaA boxes‬‬
‫אזורים שקושרים חלבונים הנקראים‪dnaA :‬‬
‫‪ .protein‬כאשר החלבונים נקשרים לאזורים‬
‫האלו של ה‪ 9-‬נוקלאוטידים‪ ,‬הם גם נקשרים‬
‫אחד לשני ויוצרים מעין ‪ loop‬של הדנ"א‪.‬‬
‫כתוצאה מכך נוצר מתח בדנ"א שנקרא‪:‬‬
‫‪.Negatively Supercoil‬‬
‫הלחץ שנוצר מספיק גדול בשביל לגרום‬
‫לאזור של ‪ ,dnaB boxes‬שעשיר ב‪,T=A‬‬
‫להיפתח‪.‬‬
‫הערה‪ :‬ה‪ Super coil -‬מבטא סיבוב של ה‪-‬‬
‫‪ Double helix‬ולא מדובר ב‪.A/B/Z form -‬‬
‫ה‪ DNA‬במקור הוא ‪.super negatively coil‬‬

‫השלבים‪:‬‬
‫‪ dnaA‬מגייס ‪ ,Helicase‬חלבון ‪ ,dnaB‬שפותח את הדנ"א ויוצר את שני מזלגות ההכפלה (דורש ‪ ATP‬לשם כך)‪.‬‬
‫‪ dnaC‬דואג להביא את ההליקאז אותו לאזור הנכון‪ ,‬הוא מזהה את הרצפים של ה‪ dnaB boxes‬שנפתחו ונקשר‬
‫אליהם‪.‬‬
‫ההליקאז עובד כהקסמאר ‪ 6 -‬תת יחידות של ‪.dnaB‬‬
‫לכל ‪ dnaB‬צריך ‪ ,dnaC‬כלומר יש צורך ב‪ 6‬יחידות של ‪ dnaC‬שיביאו ‪ 6‬יחידות של ‪.dnaB‬‬
‫צריך ‪ 2‬הליקאזות שיתקדמו לכיוונים הפוכים וייצרו את שני מזגלות ההכפלה ‪ ‬צריך ‪ dnaC 12‬שיביאו ‪ 2‬הקסמרים‬
‫של ‪.dnaB‬‬
‫הערה‪ :‬בחיידקים יש ‪ 6‬סוגים שונים של הליקאזות‪ dnaB .‬הוא העיקרי‪.‬‬

‫כדי ש ‪ dnaA‬יעבוד יש צורך באנזים נוסף ‪( HU‬דורש ‪ )ATP‬שהינו בסיסי‪ ,‬כלומר חיובי ולכן יכול להיקשר לדנ"א שהינו‬
‫שלילי בגלל הפוספטים‪.‬‬
‫החלבון ‪ - HU‬עוזר להיטען על ה‪ DNA -‬ולבצע את ה‪ .loop -‬לא בטוחה שדיברנו על החלבון הזה בכלל‪.‬‬

‫חלבון קטן‪ ,‬בסיסי ויציב שקשור לנוקלאוטיד‪.‬‬ ‫•‬

‫התפקיד העיקרי שלו הינו לעכב את ה‪ DNA Supercoiling -‬במצב שאין צורך בו על מנת למנוע שברים בדנ"א‬ ‫•‬
‫ולבקר את תהליך רפלקציית ה‪.DNA -‬‬
‫מסייע לפעולת ‪ dnaA protein‬באיניציאציה של ההתחלה של הרפליקציה‪ .‬משתתף בתהליך הרפליקציה‪.‬‬ ‫•‬

‫סיכום השלבים‪:‬‬
‫‪ dnaA proteins .1‬נקשרים לרצף של ה‪ 9-‬נוקלאוטידים‪.‬‬
‫‪ Negative Super coil .2‬נוצר‪.‬‬
‫‪ dnaB boxes .3‬עוברים "התכה"‪.‬‬
‫‪ 12 .4‬יחידות של ‪ dnaC‬מביאים ‪ 2‬הליקאזות (הקסמריות‪ ,‬בעלות ‪ 6‬תתי‬
‫יחידות) של ‪.dnaB‬‬
‫‪ dnaB .5‬הליקאז נקשר לדנא הפתוח‪ .‬הוא נקשר ל‪.single strand DNA‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Super coil‬‬
‫כאשר לוקחים חבל מלופף שבנוי ממספר גדילים ומסובבים‬
‫אותו גורמים לו להיות ‪ .Super coil‬כלומר הדנא יכול להתקפל‬
‫על עצמו‪.‬‬
‫המבנה הזה נמצא גם בלינארים (אצל אאוקרטיוטים) וגם‬
‫במעגלים (חיידקים‪-‬פרוקריוטים)‪.‬‬
‫• ‪ - Negative supercoil‬סיבוב לצד ימין‪.‬‬
‫• ‪ - Positive supercoil‬סיבוב לצד שמאל‪.‬‬
‫‪ - Linking number‬כמה פיתולים יש במולקולה‪ .‬בדוגמא יש לינקינג נאמבר ‪.1‬‬

‫ה‪ DNA -‬הוא דאבל הליקס‪ .‬הליקאז יכול לפתוח את שני גדילי‬
‫הדנא עד גבול מסוים ‪ -‬נוצר מתח גדול מידי שתוקע את הפתיחה‬
‫ומעצים את הליפוף של הדנא הסגור על עצמו‪.‬‬
‫בתמונה‪:‬‬
‫משמאל ‪ -‬דנא מעגלי שהינו ‪ Relaxed‬ולא ‪.Super coiled‬‬
‫מימין ‪ -‬שני מזלגות ההכפלה גורמים ליצירת מבנה של טטא ‪.θ‬‬
‫ברגע שהגדילים נפתחים זה גורם ל‪ Positive supercoils‬בהמשך‬
‫הדנא שעדיין מלופף‪.‬‬
‫לכן יש צורך באנזימים שישחררו את הלחץ בהמשך הדנא ‪-‬‬
‫אנזימים אלו נקראים ‪.Topoisomerases‬‬

‫‪Topoisomerases‬‬
‫אלו הם האנזימים שמשחררים את הלחץ במורד הדנא ומשנים את טופולוגית ה‪.DNA-‬‬
‫נתמקד בשני סוגים של טופואיוזמראזות שנמצאים תמיד בפרונט של מזלג ההכפלה‪:‬‬
‫‪:Topoisomerase type 1‬‬
‫עושה ‪ Single strand break‬וכתוצאה מכך משחרר את הדנא‪ .‬הוא גורם לניק בדנא‪.‬‬
‫שובר דנא חד גדילי ופותח את הפלונט ומאפשר את המשך התהליך‪.‬‬
‫‪:Topoisomerase type 2‬‬
‫עושה ‪ Double strand breakg‬ובכך משחרר את הלחץ‪ .‬שובר את שני הגדילים של הדנא‪.‬‬

‫‪:Topoisomerase I‬‬
‫טופואיזומראז ‪ 1‬מבצע ‪ nick‬בגדיל אחד (פותח קשר פוספודיאסטרי) ואז מסובב את הגדיל‬
‫היחיד מסביב לגדיל השני ומשנה את האוריינטציה של הדנא‪.‬‬
‫הוא יוצר ‪( Positive supercoil‬פותח ‪ - )Negative supercoil‬מגדיל את הלינקינג נאמבר ב‪.1+‬‬
‫לא דורש ‪ ATP‬לפעילותו‪.‬‬
‫אינו עובד ברפליקציה של הדנא כי הוא לא יודע לפתוח ‪.Positive Supercoil‬‬
‫עובד במקרים אחרים של תיקוני נזקי ‪ ,DNA‬אריזת כרומוזום ועוד‪.‬‬

‫)‪:Topoisomerase type II (Gyrase‬‬

‫טופואיזומראז ‪ 2‬יוצר ‪ .Negative super coiled‬הוא עובד במהלך השכפול‪ ,‬עושה‬
‫‪ nicking( double break‬לשני הגדילים)‪ ,‬מעביר גדיל אחד מעבר לגדיל השני ובכך‬
‫מכניס ‪.negative super coiled‬‬
‫רק הוא משתתף ברפליקציה מאחר ורק הוא יודע לפתוח ‪ Positive Supercoil‬שנוצר‬
‫כתוצאה מפתיחת הדנא ע"י הליקאז‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA polymerase‬‬
‫האנזים שמבצע את הרפליקציה של ה‪ DNA -‬הינו ‪.DNA Polymerase‬‬
‫תכונות בסיסיות‪:‬‬
‫▪ ‪ DNA‬פולימראז צריך ‪ ,Template‬כלומר צריך גדיל מקור כדי להעתיק לפי‬
‫התבנית שלו את הגדיל הקומפלימנטרי‪ .‬הוא יודע להעתיק ‪.DNA‬‬
‫▪ לא יודע להתחיל שרשרת מאפס ולכן הוא זקוק ל‪.Primer‬‬
‫▪ הסובסטרים שלו הם ‪ -dNTPs‬נוקליאוטידים של דנא בלבד‪.‬‬
‫לסיכום‪ :‬יודע להוסיף נוקליאוטידים רק לקצה ‪ '3‬של גדיל קיים‪.‬‬

‫פעילות‪:‬‬
‫▪ ‪ - Polymerase activity‬פולימריזציה (הוספת נוקלאוטידים) מכיוון ‪ 5‬ל‪ 3‬בלבד‪.‬‬
‫▪ ‪ - Exonuclease activity‬תיקון מכיוון ‪ 3‬ל‪.5‬‬

‫‪Primer‬‬
‫מולקולה קטנה שממנה תתחיל הרפליקציה של ה‪ ,DNA‬דנא פולימראז יאריך את הפריימר וייצור גדיל קומפלימנטרי‬
‫ל‪ .Template‬הפריימר למעשה נותן לדנא פולימראז קבוצת ‪.OH‬‬
‫הפריימר הכי נפוץ זה ‪ RNA‬והאנזים המייצר את הפריימר נקרא ‪.Primase‬‬

‫‪Primase‬‬
‫‪ - DNA dependent RNA polymerase‬אנזים תלוי ‪ DNA‬שמייצר ‪.RNA‬‬ ‫▪‬
‫מסנתז פריימר קצר של ‪ 10-12‬נוקלאוטידים שהינו ‪.RNA‬‬ ‫▪‬
‫הפריימר הינו קומפלימנטרי ל‪.Template -‬‬ ‫▪‬
‫מסנתז מכיוון ‪ 5‬ל‪ ,3‬לכן ה‪ Template-‬חייב להיות ‪ 3‬ל‪ 5-‬כדי‬ ‫▪‬
‫שהרפליקציה תהיה מ‪ 5-‬ל‪.3-‬‬
‫בעל פרוססיביות נמוכה (פרוססיביות‪ -‬כמה הוא יכול לסנתז לפני‬ ‫▪‬
‫הנפילה מה‪.)DNA -‬‬
‫‪ Primase‬פעיל רק בקומפלקס של ה‪ Primosome -‬אשר מכיל‪:‬‬ ‫▪‬
‫‪Helicase - DNaB, Helicase assistan- DNaC, Primase - DNaG,‬‬
‫‪Replication factor‬‬
‫פעיל רק במהלך השכפול‪.‬‬ ‫▪‬

‫‪:SSB Protein‬‬
‫בעלי שלושה תפקידים‪:‬‬
‫• מניעה של ‪ - reassociation‬היקשרות מחדש של גדילי ה‪.DNA-‬‬
‫• הגנה מפני ‪ - degradation‬ברגע שחיידק או התאים שלנו מזהים‬
‫‪ Single DNA strand‬בתוך התא מיד פועלים עליו נוקלאזות‬
‫שמפרקות אותו מאחר ויש חשד שמדובר בוירוס‪ .‬החלבונים הללו‬
‫מגנים על ה‪ DNA -‬מפני אותם נוקלאזות בזמן השכפול‪.‬‬
‫• מניעה מפני היווצרות מבניים שניוניים בדנא החד גדילי‪.‬‬
‫החלבונים הבאים דרושים עד להשלמת השכפול ע"י דנא פולימראז‪:‬‬
‫• הליקאז (‪ )DNAB‬פותח את שני הגדילים‪.‬‬
‫• ‪ SSBP‬מונעים מהגדילים שנפתחו שוב להיסגר‪.‬‬
‫• פרימאז מסנטז פריימר ‪ -‬רצף קצר של רנא‪.‬‬
‫• גיראז (טופואיזומראז ‪ )2‬נמצא מקדימה‪ ,‬לפני הקומפלקס‪,‬‬
‫ומשחרר את הלחץ שנוצר מקדימה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Model of replication in E.coli‬‬

‫‪ dnaA .1‬מתיישב על הדנא‪ ,‬עושה ‪loop‬‬
‫וכך יוצר מתח‪.‬‬
‫‪ .2‬כתוצאה מכך יש פתיחה של הגדילים‬
‫באזור ה‪.dnaB box‬‬
‫‪ dnaC‬מטעין את ‪ dnaB‬על הדנא ‪-‬‬ ‫‪.3‬‬
‫נוצרה בועית הכפלה‪.‬‬
‫הליקאז ופרימאז יוצרים קומפלקס על‬ ‫‪.4‬‬
‫הדנא ‪.primosome -‬‬
‫‪ Topoisomerase‬יושב מקדימה‬ ‫‪.5‬‬
‫ומשחרר את הלחץ הנוצר מפתיחת‬
‫הדנא‪.‬‬
‫פרימאז מייצר פריימר ודנ"א‬ ‫‪.6‬‬
‫פולימראז משכפל ועושה פולימרציה‪.‬‬

‫סוגי ‪ DNA Polymeras‬בפרוקיוטיים‪:‬‬

‫▪ ‪ - DNA Polymeras III‬מבצע את הרפליקציה‪.‬‬
‫▪ ‪ - DNA Polymeras II‬מבצע בעיקר תיקון של נזקי‬
‫‪.DNA‬‬
‫▪ ‪ - DNA Polymeras I‬מבצע בעיקר תיקון נזקי ‪DNA‬‬
‫ודרוש גם לרפליקציה הרגילה ‪ -‬מקטעי אוקזקי‪ .‬רק‬
‫לסוג הזה יש יכולת תיקון תוך כדי הסינתזה ‪ -‬מ‪ 5‬ל‪.3‬‬
‫בכולם הסנתוז הוא תמיד מ‪ 5‬ל‪ 3‬ופרופרידינג תמיד מ‪ 3‬ל‪.5‬‬

‫‪Polymerase III Holoenzyme‬‬

‫פולימראז ‪ 3‬מכיל הרבה תתי יחידה ולכן הוא נקרא‬
‫‪ .Holoenzyme‬המבנה‪:‬‬
‫‪ ,Core‬הליבה‪:‬‬
‫מכילה את תתי היחידה הבאים אשר מהווים את הפעילות‬
‫האנזימתית של הפולימראז ‪ -‬אחראיים על סנתוז ה‪ DNA‬ועל‬
‫ה‪:Proofreading‬‬
‫אלפא ‪ -‬פעילות של פולימראז ‪ 5‬ל‪.3-‬‬ ‫•‬
‫אפסילון ‪ -‬פעילות של אקסו נוקלאז ‪ 3‬ל‪.5-‬‬ ‫•‬
‫טטא ‪ -‬מקשרת בין אפסילון לאלפא‪.‬‬ ‫•‬

‫הערה‪ :‬דנ"א פולימאז ‪ 3‬מסנתז את שני הגדילים ולכן קיימות‬

‫‪ 2‬יחידות מכל חלק בקומפלקס (‪ 2‬אלפא‪ 2 ,‬אפסילון ו‪2‬‬
‫טטא)‪ ,‬אחד לכל מזלג הכפלה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:Sliding clamp‬‬
‫בטא ‪ -‬חלבונים אשר גורמים לדנ"א פולימראז להחליק על הדנ"א‪ ,‬כלומר הם מגדילים את הפרוססיבות של‬ ‫•‬
‫הדנ"א‪ .‬הם קושרים את הדנ"א פולימראז ל‪ DNA-‬על מנת שלא ייפול‪ .‬האינטראקציות בין ה‪ Sliding clamp -‬ל‪-‬‬
‫‪ DNA‬חזקות יותר מאשר האינטראקציות בין הדנ"א פולימראז ל‪ .DNA-‬בכל צד יש ‪ 2‬תתי יחידה של בטא‪ ,‬סך הכל‬
‫‪ 4‬תתי יחידה ב‪.Holoenzyme -‬‬
‫‪:Clamp loader‬‬
‫גמא קומפלקס ‪ -‬שם כולל לדלתא והגמא‪ .‬קיימת אי סימטריה‪ .‬זהו ה‪ Clamp loader-‬אשר מעמיס את תתי‬ ‫•‬
‫היחידה של בטא על ה‪ .DNA-‬קיים רק קומפלקס אחד שכזה‪ .‬פועל פעם אחת ‪ -‬בטעינה של הדנא‪.‬‬
‫טאו ‪ -‬מחבר את כל הקומפלקס יחד‪ .‬יש ‪ 2‬תתי יחידה טאו ב‪.Holoenzyme -‬‬

‫‪Elongation‬‬
‫קיים ‪ Template‬שהינו ‪ 3‬ל‪ .5-‬יש פריימר שנוצר על ידי ‪Primase‬‬
‫שהינו מ‪ 5-‬ל‪ .3-‬ל‪ Primer-‬יש קצה ‪ 3‬עם ‪ OH‬חופשי‪ .‬דנ"א‬
‫פולימראז יביא נוקלאוטיד חדש שהוא טרי פוספט‪ ,‬אך למעשה‬
‫הוא קושר רק פוספט אחד מהשלושה ומשחרר פירופוספט (‪2‬‬
‫פוספטים)‪.‬‬
‫תהליך זה נקרא‪ - Elongation :‬הארכת הגדיל‪.‬‬

‫מימין ‪ -‬תיקון הטעויות של הדנא פולימראז‪:‬‬

‫נעשה ע"י פעילות ‪ 3 Exonuclease‬ל‪( 5‬על מנת לתקן פולימריזציה‬
‫שהינה מ‪ 5‬ל‪ 3‬צריך פעילות אקסונוקליאז מ‪ 3‬ל‪.)5‬‬
‫דנ"א פולימראז יודע לתקן רק את הנוקלאוטיד האחרון שהוא הוסיף‪ ,‬אם‬
‫הוא עבר אותו אין לו דרך לתקן‪.‬‬
‫הערה‪ :‬קיימים ‪ 2‬סוגים של ‪:Nuclease‬‬
‫‪ - Endonuclease‬חותך ‪ DNA‬באמצע ללא קצוות חופשיים‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫‪ - Exonuclease‬חותך ‪ DNA‬מהקצה‪ ,‬צריך קצה חופשי‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫דנ"א פולימראז הוא אנזים מאוד מדויק‪:‬‬

‫עושה טעות אחת כל ‪ 104‬נוקלאוטידים‪ .‬אך זה עדיין לא מספיק‬ ‫▪‬
‫כאשר הדנ"א שלנו הינו בסדר גודל של ‪.109‬‬
‫ה‪ Proofreading‬של הדנ"א פולימראז מגדיל את יכול הדיוק ל‪-‬‬ ‫▪‬
‫‪ .107‬כלומר פי ‪.1000‬‬
‫‪ - DNA mismatch repair system‬קיימת מערכת נוספת‬ ‫▪‬
‫שמגיעה לאחר הדנ"א פולימראז ומתקנת את מה שלא תוקן‪.‬‬
‫המערכת הזו מספקת דיוק של ‪ .9^10 :1‬מעלה את הדיוק פי‬
‫‪.100‬‬
‫הערה‪ :‬קיימות גם מוטציות שאינן קשורות לרפליקציה‪ ,‬כמו‬
‫בקרינה‪ .‬המוטציות הללו אינן מתוקנות על ידי ‪DNA mismatch‬‬
‫‪ repair system‬מאחר והמערכת עובדת רק במהלך‬
‫הרפליקציה‪ .‬קיימים בתא מנגנוני תיקון אחרים‪.‬‬

‫טעויות בדנא‪:‬‬

‫בדוגמא הבאה קיים ‪( Mismatch‬חוסר התאמה)‪ ,‬יש ‪ A‬מול ‪.G‬‬

‫אופציה ‪:A‬‬
‫המוטציה איננה מזוהה‪.‬‬
‫ברפליקציה הבאה הגדילים יפרדו‪ ,‬כל גדיל ישמש כטמפלייט לגדיל קומפלימנטרי‪ ,‬והמוטציה תתקבע באחד‬
‫מהגדילים‪ .‬כלומר אחד מתאי הבת יהיה עם מוטציה‪.‬‬
‫במידה והמוטציה זוהתה ‪ -‬ישנן ‪ 2‬אופציות מאחר והמערכת לא בהכרח יודעת מי הגדיל עם המוטציה‪:‬‬
‫אופציה ‪:B‬‬
‫התיקון יהיה לפי הגדיל החדש ‪ -‬במקרה הזה נקבל שני תאי בת עם מוטציה‪.‬‬
‫אופציה ‪:C‬‬
‫התיקון הינו לפי הגדיל הישן ‪ -‬במקרה הזה אין תאי בת עם מוטציה‪ .‬נקבל ‪ 2‬תאי בת תקינים‪.‬‬

‫‪ ‬כלומר אם מתקנים לפי הגדיל החדש זה יותר גרוע מאשר שלא מתקנים בכלל!‬
‫אבל אל דאגה‪ ,‬המערכת יודעת לזהות מי הגדיל החדש ומי הגדיל הישן‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫כיצד ה‪ DNA mismatch repair -‬יודע להבדיל בין הגדיל הישן והגדיל החדש?‬

‫בפרוקריוטים‪:‬‬
‫דנ"א של חיידקים בדרך כלל ממותל ‪ -‬ישנו קישור של קבוצה מתילית (בעיקר לצורך הגנה)‪.‬‬
‫‪ - Dam methylase‬אנזים שעושה מתילציה ל‪ A‬ברצף '‪ .'GATC‬כך ניתן לזהות מי הגדיל החדש ומי הישן ‪ -‬הגדיל‬
‫החדש לא יהיה ממותל (לכן מערכת התיקון הזאת חייבת לעבוד ישר אחרי הרפליקציה)‪.‬‬
‫המיממותל ‪ -‬כאשר גדיל אחד ממותל ואחד לא ממותל‪.‬‬
‫גם בבני אדם יש מתילציה ‪ -‬לצורך השתקה וביטוי של גנים‪.‬‬
‫הערה‪ :‬המתילציה הינה יותר משמעותית מאשר הימצאות הניקים‪.‬‬
‫באאקוקריוטים‪:‬‬
‫לפי ה‪ .Nick‬בגדיל החדש יש הרבה ניקים בגלל מקטעי האוקזאקי‪.‬‬
‫בדרך כלל הדנ"א שיש בו ‪ mismatch‬מתוקן על ידי ‪ - Excision‬הוצאה החוצה לא רק של הנוקלאוטיד הלא תקין‪ ,‬אלא‬
‫קטע ארוך של דנ"א‪.‬‬

‫תהליך התיקון בפרוקריוטים‪:‬‬

‫נעשה בעזרת מספר חלבונים‪:‬‬
‫• ‪ - Mut S‬מזהה את ה‪ mismatch -‬ומתיישב עליו‪.‬‬
‫• ‪ - Mut H‬מזהה את האזור ההמי‪-‬ממותל שהכי קרוב לאזור ה‪mismatch -‬‬
‫ומתיישב עליו (יכול להיות גם רחוק)‪ ,‬אנדונוקליאז‪.‬‬
‫• ‪ - Mut L‬מחבר בינהם‪ .‬נקשר ל‪ Mut S -‬ול‪ .Mut H -‬כיצד זה ייתכן אם הם‬
‫רחוקים אחד מהשני? עושים ‪ loop‬של הדנ"א‪.‬‬
‫‪ Mut H‬הופך לפעיל רק כאשר ‪ Mut L‬נקשר אליו‪ .‬הוא יעשה ‪ - nick‬חותך קשר‬
‫פוספודיאסטרי בגדיל החדש (שאינו ממותל) ‪ Urv D helicase ‬מפריד את‬
‫הגדילים ‪( Exonuclease ‬פעילות ‪ 3‬ל‪ )5‬יאכל את כל הגדיל החדש ‪ -‬קצת אחרי‬
‫הטעות ‪ ‬נשאר ‪ gap‬שדנ"א פולימראז יגיע וישלים ‪ ‬הליגאז יחבר את הניק‬
‫שנוצר‪.‬‬

‫תהליך התיקון באאוקריוטים‪:‬‬

‫הזיהוי יהיה על פי הניק ולא על פי המתילציה‪.‬‬
‫משתתפים בתהליך ‪ 2‬חלבונים (הומולוגים לחלבונים בפרוקריוטים) ולא ‪:3‬‬
‫• ‪ - Mut S‬מזהה את ה‪ mismatch -‬ומתיישב עליו‪.‬‬
‫• ‪ - Mut L‬נקשר ל‪ Mut S -‬ואז מחפש ניק קרוב‪ .‬כשהוא מוצא הוא משפעל דגרדציה (פירוק) מהניק עד אחרי‬
‫‪ mismatch‬בעזרת אקסונוקליאז‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Replication direction‬‬
‫דנא פולימראז יכול לשכפל רק מ‪ 5‬ל‪ 3‬ולכן ה‪ Template‬צריך‬
‫להיות מ‪ 3‬ל‪.5‬‬
‫במהלך הרפליקציה נוצר מזלג הכפלה ושם יושבים ה‪-‬‬
‫‪ Helicase‬וה‪ Primase -‬ובהמשך הדנא (באזור הסגור) יש‬
‫‪ Gyrase‬שמוריד את המתח ב ‪ DNA‬המלופף‪.‬‬
‫יש בעיה במזלג ההכפלה מאחר ועבור גדיל אחד ההכפלה‬
‫נעשית בכיוון התקדמות המזלג ואילו בגדיל השני ההכפלה‬
‫נעשית בכיוון ההופכי להתקדמות המזלג (שכן זה אנטי פרללי)‪.‬‬
‫הגדיל שהולך עם כיוון פתיחת המזלג נקרא ‪Leading strand‬‬
‫ואילו השני נקרא ‪ Lagging strand‬והמקטעים שמרכיבים אותו נקראים ‪.okazaky fragments‬‬
‫בגלל זה צריך רק ‪ clamp louder‬אחד ‪ -‬הוא צריך להטעין את ה‪ lagging‬כל פעם מחדש‪.‬‬
‫נראה שיש הרבה ‪ nicks‬בגדיל שהולך בכיוון ההופכי‪ ,‬זאת משום שהשכפול הוא לא רציף‪ .‬ב‪ lagging‬כל פעם צריך‬
‫להוסיף פריימר כדי שדנא פולימראז יוכל לבוא ולסנתז‪.‬‬
‫עוד נקודה לגבי מזלג ההכפלה‪:‬‬
‫בפתיחת מזלג ההכפלה יש ‪ 2‬כיוונים‪ ,‬ימינה ושמאלה‪ ,‬כלומר רפליקציה דו כיוונית‪:‬‬
‫מהצד השני של מזלג ההכפלה כיוון הרפליקציה לא משתנה מאחר וזה אותו גדיל‪ .‬מה שהשתנה זה הלידינג סטרנד‬
‫והלגינד סטרנד ‪ -‬הם מתהפכים‪.‬‬
‫כיוון הרפליקציה של הגדיל העליון הוא תמיד שמאלה וכיוון הרלפליקציה של הגדיל התחתון‬
‫הוא תמיד ימינה‪ .‬מה שהתהפך זה כיוון התקדמות מזלג ההכפלה‪.‬‬
‫כאשר כיוון הרפליקציה הוא כמו כיוון התקמדות מזלג ההכפלה זה יהיה ‪,Leading strand‬‬
‫לעומת זאת כשכיוון הרפליקציה מנוגד למזלג ההכפלה זה ‪.Lagging strand‬‬
‫למעשה ה‪ mismatch -‬מפרק מקטע ‪ .Okazaki‬הוא מזהה את ה‪ nick-‬כך שיוצא שהוא חותך‬
‫אזור ‪ Okazaki‬מסוים‪ .‬אם זה באזור ה‪ ,leading-‬הוא יחתוך מעט יותר‪.‬‬
‫‪ ‬מי מסנתז את הדנא?‬
‫דנא פולימראז ‪ - 3‬יש לו ‪ 2‬פולימראזות‪ 2 ,‬אקסונוקליאזות‪ 2 ,‬סליידינג קלאמפ ו‪ 1‬קומפלקס‬
‫קלאמפ לאודר‪.‬‬
‫‪ ‬כיצד ייתכן שיש קומפלקס אחד שמתקדם תמיד בכיוון אחד‪ ,‬וגדיל אחד מסונתז עם כיוון‬
‫התקדמות הקומפלקס והגדיל השני מסונתז בניגוד לכיון התקדמות הקומפלקס?‬
‫הרי בלגינג הוא כל פעם יצטרך לרדת ממנו ולהקשר ובלידינג הוא רציף‪.‬‬
‫כדי לרדת ולהקשר מחדש ‪-‬‬
‫שניהים צריכים סליידינג קלאמפ‪ ,‬אבל מבחינת קלאמפ לאודר צריך רק אחד! ככה יש תת יחידה שתאפשר כל הזמן‬
‫לרדת ולהקשר ללגינג סטרנד (כי רק אותו צריך כל פעם להטעין מחדש בדנא פולימראז בעוד שבלידינג סטרנד הדנא‬
‫פולימראז לא מתנתק ממנו כל פעם אלא פועל עליו באופן רציף)‪.‬‬
‫‪ ‬בקומפלקס יש ‪ 2‬אנזימים הפועלים יחד באותו כיון של מזלג ההכפלה‪:‬‬
‫בלידינג ‪ -‬הליקאז בא‪ ,‬פותח‪ ,‬ודנא פולימראז מסנתז בכיון מזלג ההכפלה‪.‬‬
‫בלגינג ‪ -‬דנא פולימראז רץ בכיוון פתיחת ההליקאז וכל פעם מסנתז בכיון ההפוך של מזלג ההכפלה‪ .‬כלומר הדנא‬
‫עצמו זז ככה שעדין בלידינג סטרנד יש סינתוז בכיון הנכון של מזלג ההכפלה‪ ,‬ובלגינג ה‪ Template -‬שלו עושה מעין‬
‫‪ loop‬כדי שהסינתזה תהיה באותו כיוון‪ ,‬כלומר הלופ מאפשר את הסינתזה בכיוון ההפוך אך זה לא משנה את כיוון‬
‫התקדמות הרפליקציה‪.‬‬
‫לסיכום‪ :‬דנא פולימארז מתקדם עם כיוון פתיחת המזלג‪ .‬הוא מסנתז את הלגינג ע"י כך שהלגינג רץ אחורה‪.‬‬
‫‪ ‬ה‪ Single strand binding proteins -‬נחוצים יותר בגדיל ה‪ Lagging -‬כי קודם צריך לפתוח את כל ה‪-‬‬
‫‪ Okazaki‬ורק אז צריך ‪ Polymerase‬כדי להתחיל לסנתז‪ ,‬ולכן יש לשמור עליו מפני נוקלאזות‪ .‬שכן לא ייתכן‬
‫שיהיו ניקים או ‪.single strand‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Sliding clamp and clamp loader‬‬

‫אלו הם חלבונים שמהווים חלק אינטגרלי מ ‪.DNA Polymerase 3‬‬
‫הם מחזיקים את הפולימראז על ה‪ ,DNA-‬כמו כן הם מאפשרים לפולימראז להיות על‬
‫ה‪ DNA -‬למשך כל מחזור השכפול ואם הוא ייפול הם יעמיסו אותו חזרה‪.‬‬
‫• ה‪ Sliding clamp -‬מחזיק את הפולימראז על הדנ"א ועוזר לו להישאר קשור אליו‪.‬‬
‫הוא בצורת טבעת ‪ -‬כאשר הטבעת פתוחה היא יכול ליפול מהדנ"א וכאשר סגורה‬
‫היא רצה על הדנ"א בלי ליפול‪.‬‬
‫• ה‪ Clamp loader -‬מטעין את ה‪ Sliding clamp -‬עם הדנ"א פולימראז על הדנ"א‪.‬‬
‫ה‪ Clamp loader -‬חשוב ב‪ lagging-‬לכן יש רק אחד‪ .‬ברגע שאנו מטעינים פעם אחת‬
‫על ה‪ leading-‬הוא רץ ואילו ה‪ loader-‬מטעין את ה‪ lagging-‬כל הזמן מחדש משום‬
‫שזה לא רציף וכל הזמן צריך לשים ‪ primer‬חדש כדי שהרפליקציה תמשיך לרוץ‪.‬‬
‫ה‪ Clamp loader-‬דורש ‪!ATP‬‬
‫‪ Clamp loader‬עם ‪ ATP‬נקשר ל‪ Sliding clamp-‬ופותח אותו כדי שיוכל להיקשר ל‪-‬‬
‫‪ .DNA‬כעת הקומפלקס של ה‪ sliding+loader-‬פתוח ומועמס על ה‪ DNA-‬ע"י ה‪.loader-‬‬
‫ברגע שזה קורה‪ ,‬אנחנו לא צריכים את ה‪ Clamp loader -‬יותר (בגדיל הלגינג כן‬
‫צריך!)‪ .‬ה‪ DNA -‬פולימראז נכנס לתמונה‪ ,‬ה‪ Sliding-‬תופס את ה ‪ DNA‬פולימראז‬
‫והסינתזה של הגדיל המשלים מתחילה‪ .‬כל עוד הפולימראז לא סיים את הרפליקציה‬
‫או כל עוד הוא לא פגש את האוקאזקי שלפניו הוא לא ייפול‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫"פינישים" בדנא‪:‬‬
‫בדנ"א ישנם הרבה פריימרים שהם ‪ RNA‬ולא של ‪.DNA‬‬
‫ה‪ RNA -‬שונה מה‪ DNA -‬במספר גורמים‪:‬‬
‫• דאוקסי ריבוז לעומת ריבוז‪.‬‬
‫• נוקלאוטידים‪.‬‬
‫לכן נוקלאוטידים של ‪ RNA‬לא יכולים להיות ב‪ DNA -‬ויש להוריד אותם‪.‬‬
‫ב‪ Leading -‬לא קיימת בעיה כי על כל מזלג הכפלה יש פריימר אחד‪.‬‬
‫לעומת זאת ב‪ Lagging‬שנבנה כמקטעי ‪ Okazaki‬יש כל פעם הטענה של פריימר נוסף‪ ,‬ולכן ישנם הרבה פריימרים של‬
‫‪ RNA‬בגדיל החדש וגם הרבה ניקים‪.‬‬
‫כיצד ה‪ nicks‬נוצרים?‬
‫דנ"א פולימראז יכול לחבר נוקלאוטיד לנוקלאוטיד קודם ולא לנוקלאוטיד הבא! ולכן תמיד ישנם ניקים בין מקטעי‬
‫האוקזאקי‪ ,‬הניקים הינם מסוכנים כי יכולים להגיע נוקלאזות אשר יעכלו את ה‪.DNA -‬‬
‫הגנום הזה לא יציב ולכן צריך‪:‬‬
‫▪ להוריד את מקטעי הרנא (הפריימרים)‪.‬‬
‫▪ להשלים את ה‪ gap-‬במקום הפריימר בדנא‪.‬‬
‫▪ לחבר את ה‪ nicks -‬על ידי דנ"א פולימראז‪.‬‬

‫תזכורת ‪ -‬ההבדל בין ‪ Endonuclease‬לבין ‪:Exonuclease‬‬

‫• ‪ - Endonuclease‬חותך באמצע‪ ,‬עושה בדרך כלל רק ‪.nick‬‬
‫• ‪" - Exonuclease‬אוכל" מהקצה (לדנ"א מעגלי של חיידקים אין‬
‫קצוות) או מהניק‪ .‬קיימים ‪ 2‬סוגים‪:‬‬
‫▪ ‪ 5‬ל‪.3‬‬
‫▪ ‪ 3‬ל‪ .5‬קיים גם בדנא פולימראז ‪ -‬פעילות של ‪.Proofreading‬‬
‫איך נורידים פריימרים?‬
‫ע"י אקסנונוקליאז בכיוון ‪ 5‬ל‪ 3-‬שיאכל את הפריימר‪.‬‬
‫אם נשתמש באקסונוקליאז ‪ 3‬ל‪ 5-‬נעכל את כל מי שכבר סונתז ותוקן‪.‬‬

‫עד כה דיברנו על דנ"א פולימראז ‪ Holoenzyme - 3‬שהוא זה שמסנתז את הדנ"א מכיוון ‪ 5‬ל‪.3-‬‬
‫אחרי הסרת הפריימרים צריך להחליף את הרנא שהסרנו בדנא‪.‬‬

‫‪DNA Polymerase I‬‬

‫תת יחידה אחת בעלת ‪ 3‬דומיינס (‪ 3‬אתרים קטליטים)‪:‬‬

‫‪ ,68kD - Klenow fragment‬תת יחידה גדולה‪:‬‬
‫▪ ‪ 3  5 Polymerase‬פעילות פולימראז רגילה של‬
‫פולימריזציה מ‪ 5‬ל‪.3‬‬
‫▪ ‪.Proofreading 5  3 Exonuclease‬‬
‫עד כה זהה לדנא פולימראז ‪.3‬‬
‫‪ ,35kD - Small subunit‬תת יחידה קטנה‪:‬‬
‫▪ ‪:3  5 Exonuclease‬‬
‫‪.Primer digesting, Nick translation activity‬‬
‫מבין ‪ 3‬דנא פולימראז רק לו יש את הפעילות הזאת!‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫פעילות‪:‬‬
‫מתיישב בקצה ההתחלתי של מקטע אוקזאקי ‪ -‬על ‪ 3‬פריים‪.‬‬
‫ואז הוא מתקדם קדימה (‪ 5‬ל‪ - )3‬מוציא נוקלאוטיד רנא‪ ,‬מחליף אותו‬
‫בנוקלאוטיד דנא ואז הולך אחורה ובודק שעשה נכון (‪ .)proofriding‬כלומר‬
‫מעכל את הפריימר ומוסיף במקום דנא ‪ -‬פעילות זו מייחדת את דנ"א פולימראז‬
‫‪ 1‬מ‪ -‬דנ"א פולימראז ‪ 2‬ו‪ .3-‬אין לו ‪ - Slinding clamp‬בעל פרוססבויות נמוכה‪.‬‬
‫אוכל ‪ 200‬ומשלים ‪.200‬‬
‫הערה‪ :‬יכול לעבוד רק על שרשרת עם קצה חופשי‪ .‬כמו כן צריך לזכור שהוא‬
‫‪ DNA‬פולימראז ומכאן שהוא צריך פריימר בשביל תחילת הפעילות שלו‪.‬‬
‫הפריימר שלו הוא קצה ‪ 3‬חופשי (יש ניקים בין ה‪.)Okazaki -‬‬
‫ה‪ Lygase -‬בסופו של דבר מחבר את הניק בסוף‪.‬‬

‫מאפיינים‪:‬‬
‫איך דנא פולימראז ‪ 1‬יודע מתי לעצור באכילה שלו כך שלא ימשיך לעכל גם את ה‪ Okazaki-‬שנוצרו ע"י פול' ‪?3‬‬
‫מדוע פול' ‪ 3‬מסנתז בגדיל ה‪ Lagging‬אם פול' ‪ 1‬עושה את אותה הפעולה בדיוק?‬
‫‪ ‬לפול' ‪ 1‬יש פרוססיביות נמוכה‪ ,‬לכן הוא מעכל את הפריימר ואולי קצת מהדנא ואז נופל‪ .‬כך מונעים ממנו להמשיך‬
‫לעכל עוד ועוד נוקלאוטידים ובסופו של דבר את כל ה‪( Okazaki -‬שנעשו על ידי פולימראז ‪.)3‬‬

‫השוואה בין סוגי הדנ"א פולימראז‪:‬‬

‫‪DNA Ligase‬‬
‫הוא זה שמחבר את הקשר הפוספודיאסטרי בניקים שבין פרגמנטי האוקזאקי ולשם כך הוא זקוק ל‪ .ATP-‬הוא‬
‫משתמש ב‪ ATP -‬לקשירה של ‪ OH‬קיים לקצה פוספט קיים‪ .‬מחבר ‪ 3‬ל‪ 5-‬הבא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫סיכום ‪ -‬תהליך‪:‬‬
‫הגדיל שלמטה הינו ה‪ Leading -‬ולמטה ה‪.Lagging -‬‬
‫פולימראז ‪ 1‬יאכל שחור וקצת אדום וגם ישלים במקומו‬
‫דנא‪ .‬בסוף ייווצר ניק שיחובר ע"י ליגאז‪.‬‬

‫סיכום ‪ -‬חלבונים‪:‬‬
‫הראשון שמתיישב על הדנא הוא ‪dnaA‬‬
‫(‪ )HU protein+‬ויוצר ‪ loop‬ו ‪negative‬‬
‫‪  super coil‬הדנא מתחיל להיפתח‬
‫‪ ‬הליקאז (‪ )dnaB‬מובא על ידי ‪dnaC‬‬
‫ומתיישב על הדנא ‪ ‬טופואיזומראז ‪2‬‬
‫(‪ (gyrase‬יושב בפרונט כי להוריד לחץ‬
‫שנוצר כתוצאה מפתיחת סליל הדנא‬
‫‪ ‬חלבוני ‪ SSB‬נקשרים לסליל החד‬
‫גדילי שנפתח ועדיין לא שוכפל בעיקר‬
‫על מנת להגן עליו מפני מפירוק ולמנוע‬
‫מבנים שניונים ‪ ‬פרימאז (אנזים‬
‫המייצר פריימר) נקשר לדנא ‪ ‬נוצר‬
‫קומפלקס בשם ‪ primosome‬הכולל‬
‫הליקאז ופרימאז ‪ ‬מתחיל שכפול על‬
‫ידי פולימראזות‪.‬‬

‫הערה חשובה‪ :‬מקטעי האוקזאקי שהכי רחוקים‬

‫ממזלג ההכפלה הם הראשונים שהפולימראז ‪3‬‬
‫שיכפל!‬
‫הערה נוספת‪ :‬ניתן לזהות את גדיל ה‪ Lagging -‬על‬
‫ידי כך שהוא מכיל יותר חלבוני ‪.SSB‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫טבלת סיכום של כל החלבונים שמשתתפים בתהליך השכפול של ה ‪ DNA‬בפרוקריוטים‪:‬‬

‫‪Termination of Replication in E.coli‬‬

‫בחיידקים הדנ"א מעגלי‪ .‬טרמינציה ‪ -‬פגישה של ‪ 2‬מזלגות ההכפלה וסיום של כרומוזומי הבת‪.‬‬
‫יש בעיה ‪ -‬אם מגיע קומפלקס ענק הנקשר ל‪ 2‬הצדדים יש סכנה שהאזור בסוף לא ישוכפל מאחר והסנתזה נעשת‬
‫מאחורי הקומפלקס‪ .‬בנוסף יש סכנה שששני הקומפלקסים יצליחו לעבור אחד את השני‪ ,‬ימשיכו לסנתז ויעשו סיבוב‬
‫נוסף של שכפול‪.‬‬
‫לכן יש בקרה על כך‪:‬‬
‫צריך רצפים שיאמרו לקומפלקסים להפסיק עם השכפול‪.‬‬
‫רצפים אלו נקראים רצפי טרמינציה ‪ -‬זאת בקרה בציס (בקרה של רצף)‪.‬‬
‫אבל זה לא מספיק‪ ,‬צריך גם בקרות בטרנס ‪ -‬מדובר בחלבוני טרמינציה שנקשרים‬
‫לרצפי הטרמינציה שב‪.DNA-‬‬
‫• ‪ - Ter sites‬רצפי הטרמינציה‪ ,‬בקרה בציס ‪ -‬זוהי בדרכ בקרה ברמת הרצף‬
‫עצמו‪ .‬בקרה שלא ניתן להחליף מבחוץ‪.‬‬
‫• ‪ .Tus=Terminator Utilization Substance - Tus proteins‬בקרה בטרנס ‪-‬‬
‫בקרה ברמת החלבון‪ .‬אם החלבון לא תקין נוכל להכניס חלבון מבחוץ ולתקן‬
‫ברמת החלבון‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:Ter sites‬‬
‫רצפים אלו לוכדים את מזלגות ההכפלה‪.‬‬ ‫•‬
‫מכילים רצפים שגורמים לדה קאטנציה של כרומוזומי הבת (הסבר למטה)‪.‬‬ ‫•‬
‫באורך של ‪.300bp‬‬ ‫•‬
‫דורשים חלבוני ‪ - Tus‬חלבונים אשר מונעים מהדנא לעבור הכפלה‪.‬‬ ‫•‬
‫דורשים טופואיזומראז ‪( 4‬סוג ‪ - )2‬חותך את הדנא כדי שהכרומוזומים ייפרדו‪.‬‬ ‫•‬

‫הרצפים תופסים את מזלגות ההכפלה כדי שלא ימשיכו הלאה‪.‬‬

‫בנוסף‪ ,‬הם מכילים רצפים שיאפשרו את ההיפרדות של הכרומוזומים‪ ,‬תהליך‬
‫שנקרא ‪:De catenation‬‬
‫כאשר הכרומוזום משוכפל נוצרים ממנו שני כרומוזומים אולם הם שזורים אחד‬
‫בשני‪.‬‬
‫על מנת להפריד ביניהם יש לחתוך ולחבר ‪ Topoisomerase4 -‬שיודע לחתוך‬
‫‪ Double strand‬עושה זאת‪.‬‬
‫הערה‪ :‬הבעיה הזאת קיימת רק בכרומוזום מעגלי‪.‬‬

‫היכן נמצאים ה‪ 180 ?TER sites‬מעלות מה‪( ORI‬שני מזלגות ההכפלה נפגשים ‪ 180‬מעלות מה‪.)ORI‬‬
‫ב‪ TER sites -‬יש קובץ של שלושה רצפים בכיוון מסוים ועוד שלושה‬
‫רצפים בכיוון אחר‪ .‬סט אחד מונע ממזלג ההכפלה להתקדם בכיוון‬
‫השעון והסט השני מונע ממזלג ההכפלה להמשיך בכיוון שנגד‬
‫השעון ‪ -‬כאשר מגיע מזלג הכפלה רוצים שהוא יעבור סט אחד ולא‬
‫יעבור את השני ‪ -‬כך גורמים לזה שהחלק הסופי ישוכפל ושלא יהיה‬
‫סיבוב נוסף של הכפלה‪.‬‬
‫בפרונט של מזלג ההכפלה נמצא ההליקאז כי הוא כל הזמן פותח‬
‫את הדנא הדו גדילי‪ ,‬יש לגרום לכך שההליקאז לא יתקדם לכויון ה‪-‬‬
‫‪ Ter site‬הבא‪.‬‬

‫מימין‪ :‬קיימת התקדמות עם כיוון השעון ונגד כיוון‬

‫השעון‪.‬‬
‫מזלג הכפלה שנע עם כיוון השעון ייעצר בסגול‬
‫והמזלג השני ייעצר באדום‪.‬‬
‫זה גם אומר שכל האזור עד האדום ישוכפל וכל‬
‫האזור עד הסגול משוכפל‪.‬‬
‫לא מדובר בשכפול כפול!‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:Tus proteins‬‬
‫אינם סימטריים ולכן יושבים בצורה לא סימטרית על ה‪,Ter site-‬‬
‫‪ -‬צד אחד של החלבון מאפשר מעבר של ‪( dnaB‬ושאר‬
‫הקומפלקס) והצד השני אינו מאפשר את המעבר‪.‬‬
‫זה לא הרצף עצמו שעוצר את מזלג ההכפלה מלהתקדם אלא‬
‫החלבון שנקשר לרצף!‬

‫צד שמאל‪:‬‬
‫‪ dnaB‬מגיע מהצד המאפשר מעבר (‪ .)permissive‬במקרה הזה‬
‫ברגע ש‪ dnaB‬נתקל ב‪ Tus‬הוא "מעיף" אותו מהדנא וממשיך‬
‫להתקדם הלאה‪ .‬לאחר מכן ‪ Tus‬חוזר לאזור שלו על מנת לעצור‬
‫את ‪ dnaB‬שמגיע מהצד הנגדי‪.‬‬
‫צד ימין‪:‬‬
‫‪ dnaB‬מגיע מהצד שלא מאפשר מעבר (‪.)non-permissive‬‬
‫במקרה הזה ברגע ש‪ dnaB‬נתקל ב‪ Tus‬כל הקומפלקס יורד‬
‫מהדנא‪.‬‬
‫הערה‪ :‬חלבוני ה ‪ Tus‬יושבים על שני הגדילים‪ ,‬לא רק על גדיל‬
‫אחד‪ ,‬אחרת לא היה מפגש בין החלבון לסליל המשוכפל אותו‬
‫צריך לעצור‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA Replication in Eukaryotes‬‬

‫‪ - Cell cycle‬מחזור התא‪:‬‬

‫‪ - Division .1‬שלב החלוקה‪ ,‬שלב ‪ ,M‬מכיל ‪ 2‬שלבים‪ :‬חלוקה וציטוקינזה‪.‬‬

‫‪ - Interphase .2‬שלב ביניים שמחולק לשלושה חלקים‪.G1, S, G2 :‬‬
‫‪:G1‬‬
‫כאשר שני תאי בת נוצרים האברונים לא מחולקים בניהם באופן שווה (אין בקרה‬
‫לכמה יעברו לכל צד‪ ,‬רק הדנא מתחלק שווה בשווה) ולכן עם סיום החלוקה התא גדל‬
‫ומשלים את האברונים שלו וכך הוא מתקיים‪.‬‬
‫ישנם תאים שיקבלו סיגנל לחלוקה נוספת ואז יכנסו לשלב ‪.S‬‬
‫אולם צריך לזכור שמרבית התאים בגוף שלנו לא מתחלקים‪ ,‬תא שנמצא זמן רב‬
‫בשלב ‪ G1‬ייחשב שהוא נמצא בשלב ‪.G0‬‬
‫‪:S‬‬
‫ברגע שתא מקבל סיגנל לחלוקה והוא יכול להתחייב לזה מתחיל שלב הסנתזה ‪-‬‬
‫הכפלה של הדנא‪ ,‬התא מכין את עצמו לחלוקה שווה של הדנא‪.‬‬
‫‪:G2‬‬
‫התא ממשיך להכין את עצמו לחלוקה‪ .‬בין היתר ממשיך לגדול ולייצר עוד אברונים‪.‬‬
‫מיטוזה‬
‫דיפלואיד ‪ -‬תא שמכיל שני כרומוזמים (אחד מהאמא ואחד מהאבא)‪.‬‬
‫לפני שנכנסים לשלב ‪ M‬יש את שלב ‪ S‬בו יש הכפלה של הדנ"א‪ .‬בשלב החלוקה נפרדות‬
‫הכרומטידות האחיות‪ .‬זוהי חלוקה של תאים סומטיים ‪ -‬תאי הגוף אינם יוצרים את הגמטות‪.‬‬
‫מקבלים שני תאים זהים לתא האם‪.‬‬

‫שיטות למעקב אחרי חלוקת התא‪:‬‬

‫‪:FACS‬‬
‫מכשיר שיכול לבדוק חלבונים שנמצאים על פני התא ובתוך התא (יודע לזהות בין תא המבטא‬
‫חלבון איקס לתא המבטח חלבון וואי)‪ .‬תהיה על המכשיר שאלה במבחן!!‬
‫בעזרת השיטה הזאת ניתן לבדוק את כמות הדנא בתאים‪ ,‬גודל תאים ומידת המורכבות של‬
‫תאים (על פי כמות גרנולות שיש בתוך התא)‪.‬‬
‫כיצד ‪ FACS‬עובד‪:‬‬
‫שמים תאים במבחנה‪ .‬המכשיר שואב מהמבחנה את התאים ומעביר אותם בזרם של נוזל ‪ -‬בכל נקודת זמן רק תא‬
‫בודד עובר בזרם‪ .‬מקרינים על הנוזל לייזר‪ .‬כשהלייזר פוגע בתא‪ ,‬התא שובר את הקרנים לכל עבר‪ ,‬ואז יש כמה‬
‫חיישנים שקולטים את הלייזר‪:‬‬
‫• ‪ - FSC‬חיישנים ‪ forward‬שנמצאים מול הלייזר ובודקים את גודל‬
‫התא‪ ,‬ככל שהתא יותר גדול האור שפוגע בתא יתפזר קדימה‬
‫בצורה רחבה יותר‪.‬‬
‫• ‪ - SSC‬חיישנים ‪ side‬שנמצאים ‪ 90‬מעלות ללייזר ובודקים את‬
‫המורכבות‪ ,‬ככל שהתא יותר צפוף האור ישבר יותר לצדדים ולא‬
‫ימשיך קדימה‪.‬‬
‫• חיישנים נוספים בודקים פלוריסנציה (צריך לצבוע לפני את‬
‫התאים)‪ .‬המכשיר יספור לכמה תאים יש את הסימון‪ .‬אפשר גם‬
‫לסמן חלבון מסוים ‪ -‬במהלך ההתפתחות חלבונים שונים באים לידי‬
‫ביטוי‪ .‬בנוסף הוא יכול להפריד את התאים המסומנים מכלל התאים‬
‫שאינם מסומנים על ידי מטענים חשמליים (שלילי‪ ,‬חיובי ונטרלי)‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫בתמונה משמאל‪:‬‬
‫אם נרצה לבודד לימפוציטים ‪ -‬כל תא מבטא רצפטורים שונים וניתן‬
‫לסמן כל סוג רצפטור עם חומר פלורסנטי אחר‪ .‬נעשה ‪ - Sorting‬אם‬
‫מדובר בחומר אדום הוא יסומן במטען חשמלי חיובי‪ ,‬ואילו מטען‬
‫ירוק יסומן במטען חשמלי שלילי‪ .‬אם הוא לא אדום ולא ירוק הוא לא‬
‫יסומן כלל‪.‬‬

‫עוד דוגמא‪:‬‬
‫רוצים שהמכשיר יבדוק ‪) SSC‬מורכבות) כפונקציה של ‪( FSC‬גודל)‪.‬‬
‫ציר ‪ ,FSC - X‬גודל‪ .‬ציר ‪ ,SSC - Y‬מורכבות‪.‬‬
‫בדקו תאי דם וקיבלו ‪ 3‬אוכלוסיות‪:‬‬
‫אוכלוסיה תחתונה ‪ -‬התאים הכי קטנים והכי פחות מורכבים ‪‬‬
‫לימפוציטים‪.‬‬
‫אוכלוסיה אמצעית ‪ -‬תאים יותר מורכבים ויותר גדולים ‪ ‬מונוציטים‪.‬‬
‫אוכלוסיה עליונה ‪ -‬התאים הכי מורכבים ובגודל זהה לתאים‬
‫האמצעיים ‪ ‬ניוטרופילים‪.‬‬
‫אז המכשיר מסוגל לקרוא סוג מסוים של תאים‪ ,‬לבודד אותם‬
‫ולהראות עוד אינפורמציה עליהם מבלי להשתמש בפלוריסנציה ‪ -‬רק‬
‫לפי גודל ומורכבות!‬

‫דוגמא אחרונה‪:‬‬
‫אפשר גם לסמן על הממברנה של התא רצפטור מסוים (נגיד בעזרת נוגדן)‪ .‬נקח‬
‫תאים עם שני סוגי רצפטורים אפשרים‪ .‬אז המכשיר יספור‪ :‬תאים בלי שני‬
‫הרצפטורים‪ .‬תאים עם רצפטור א'‪ .‬תאים עם רצפטור ב'‪ .‬תאים עם שני הסוגים‪.‬‬

‫המכשיר נותן שני סוגי גרפים‪:‬‬

‫‪ .1‬דוט‪-‬פלוט‪ :‬במקרה של שני פרמטרים‪ .‬נגיד גודל מול מורכבות‪.‬‬
‫‪ .2‬היסטוגרמה‪ :‬פרמטר מול מספר תאים‪.‬‬

‫זיהוי השלבים במחזור התא‪:‬‬

‫פאקס יכול למדוד כמות של דנא ‪ -‬נסמן את הדנא בחומר פלורוסנטי וכך‬
‫אפשר לעקוב אחר מחזור התא‪:‬‬
‫• תא שנמצא בשלב ‪ G1‬הינו בעל ‪ X‬דנא‪.‬‬
‫• תא שנמצא בשלב ‪ S‬הינו בעל ‪ X+m‬דנא‪.‬‬
‫• בשלבים ‪ M‬ו‪ G2‬יש ‪ 2X‬דנא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫ניתן לקחת תאים בתרבית באופן לא סינכרוני (שלא כולם בואתו שלב של מחזור התא)‪.‬‬
‫בעזרת ‪ FACS‬אפשר לספור לכמה תאים יש כמות רגילה של דנא‪ ,‬לכמה יש כמות כפולה‬
‫וכמה נמצאים בשלב ביניים‪ .‬נבדק לפי כמות הפלוריסנציה ‪ -‬צובעים את הדנא‪ .‬מקבלים‬
‫במקרה הזה גרף של היסטוגרמה (פרמטר מול מספר תאים)‪.‬‬
‫בגרף‪:‬‬
‫ציר ‪ - X‬כמות פלוריסנציה‪ ,‬כמות הדנא‪.‬‬
‫ציר ‪ - Y‬כמות התאים‪.‬‬
‫מסקנות‪:‬‬
‫▪ כמות התאים שנמצאת בשלב מסוים מעידה על משך הזמן של אותו שלב ‪.‬אם משך‬
‫הזמן הינו ארוך הסיכוי שנפגוש את אותם התאים הינו גדול יותר (‪ G1‬הוא השלב הכי‬
‫ארוך‪ ,‬אחר כך ‪ S‬ואז ‪ G2‬ו‪.)M‬‬
‫▪ למרבית התאים יש ‪ X‬דנא והם נמצאים בשלב ‪.G1‬‬
‫▪ בשלב ‪ S‬מתרחשת הרפליקציה ולכן התאים בשלב הזה לא מסונכרנים ‪ -‬הדנא לא‬
‫מוכפל בבת אחת אלא זה לוקח זמן ולכן התאים בשלב ‪ S‬לא בהכרח יהיו בעלי אותה‬
‫כמות דנא ‪ -‬לכן שלב ‪ S‬לא גבוה אלא רחב‪.‬‬

‫מה מבקר את מחזור התא ?‬

‫▪ נוטריינטים ‪ -‬חומרי מזון‪.‬‬
‫▪ פקטורי גדילה ‪ -‬דרושים לסיגנל המורה על כניסה לחלוקה‪ .‬בנוסף זקוקים לשרידות של תאים‪ ,‬נקראים פקטורי‬
‫הישרדות‪.‬‬
‫▪ הורמונים‪.‬‬
‫▪ סיגנלים מתאים אחרים‪ .‬לתאים נורמליים בתרבית יש אפקט שנקרא‪ - Contact inhibition :‬הם שולחים סיגנלים‬
‫אחד לשני להפסיק לגדול‪ .‬לעומת זאת כאשר יש תאים סרטניים בתרבית תהליך זה אינו קיים‪ .‬לא דיברנו על זה‬
‫בהרצאה‪.‬‬
‫▪ נזק לדנא‪.‬‬

‫‪:Checkpoints‬‬
‫ישנם ‪ 3‬נקודות ביקורת עיקריות‪:‬‬
‫‪:G1 checkpoint .1‬‬
‫זהו הצ'ק פויינט החשוב ביותר‪ .‬בודקים האם התא מספיק גדול והאם‬
‫הוא מסוגל להתחייב לחלוקה לפני שנכנסים לשלב ‪ S‬מאחר ואם הוא‬
‫עובר את הנקודה הזאת הוא מחויב לסיים את מחזור התא‪.‬‬
‫הבדיקות‪:‬‬
‫• האם התא מספיק גדול (‪ G1‬הוא אחרי שלב ‪ M‬בו הייתה חלוקה‬
‫של תא בת לשניים‪ .‬אם התא קיבל סיגנל להתחלק אך הוא עדיין‬
‫קטן מידי צריך לעצור אותו)‪.‬‬
‫• האם ישנם מספיק נוטריינטים‪ ,‬חמצן וכו' כדי להתחייב לסיים את‬
‫כל מחזור התא‪ .‬לבדוק שאין יותר מידי פסולת‪.‬‬
‫• האם יש נזק ל‪ .DNA-‬אם יש נזק ל‪ DNA -‬התא יפעיל מנגנוני‬
‫תיקון‪ ,‬במידה והכל תוקן התא ימשיך הלאה‪ ,‬במידה ולא התא‬
‫יעבור אפופטוזיס‪.‬‬
‫לפני שעוברים את הצ'ק פוינט הזה התא יכול להשתהות‪ .‬נגיד אם התא‬
‫קטן מידי אז אפשר לחכות עד שייגדל‪ .‬לכן זה השלב הכי ארוך‪.‬‬
‫בשלבים הבאים אין זמן להשתהות כמו שכאן ניתן‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:G2 checkpoint .2‬‬

‫ב‪ G2‬לפני שנכנסים לשלב ‪.M‬‬
‫הבדיקות‪:‬‬
‫• האם ה‪ DNA-‬שוכפל במלואו‪ .‬כפי שהזכרנו‪ ,‬בשלב ‪ S‬לא כל ה‪ DNA-‬משוכפל בו זמנית‪ .‬לכן יש גנים‬
‫שמשוכפלים בתחילת שלב ‪ ,S‬חלק באמצע וחלק בסוף ‪ -‬צריך לוודא שכולם שוכפלו‪.‬‬
‫• האם התא מספיק גדול (התא עדיין צריך להמשיך ולגדול כך שיהיה בסף מספיק גבוה כדי להגיע לשלב ‪.)M‬‬
‫• האם תנאי הסביבה מאפשרים המשך חלוקה‪.‬‬
‫• האם יש נזק ל‪ .DNA-‬למה שוב שואלים? כי בשלב ‪ S‬הייתה רפליקציה ‪ -‬יכול להיות שנוצרו טעויות בדנא‪.‬‬

‫‪:M checkpoint .3‬‬

‫באמצע שלב ‪ .M‬בודקים האם הדנא התחלק שווה בשווה בין שני תאי הבת‪.‬‬
‫הבדיקות‪:‬‬
‫• האם יש ‪( alignment‬סידור בשורה) של הכרומוזומים על קו המשווה‪ .‬כדי להתחלק שווה בשווה כל‬
‫הכרומוזומים צריכים להסתדר על קו המשווה (כך ששתי כרומוטידות אחיות יהיה משני צידי הקו)‪ .‬זה קורה‬
‫בשלב ‪ M‬בסוף שלב המטאפאזה‪ .‬התא יכול להשתהות קצת עד שיסתדרו‪ ,‬אם הן לא יצליחו התא ימות‪.‬‬
‫במידה ואליימנט לא תקין ייווצר ‪ - Non disjunction‬מצב שבו שתי הכרומטידות של הכרומוזום הולכות לתא‬
‫בת אחד ‪ ‬נקבל טריזומיה‪ .‬בודקים האם כל הכרומוזומים קשורים לכישור‪.‬‬

‫כיצד יראה הגרף במצב של הרעבה?‬

‫במצב של הרעבה לא יהיו נוטריינטים‪ ,‬לכן התאים לא יעברו את ה‪ Check point -‬של‬
‫‪ G1‬ויישארו בשלב הזה‪.‬‬
‫לכן אחת השיטות לעשות אוכלוסייה הומוגנית הינה מצב של הרעבה‪.‬‬
‫דרך נוספת היא פגיעה ביצירת הכישור ואז כל התאים יהיו תקועים בין שלב ‪ G2‬לשלב‬
‫‪.M‬‬

‫‪:cyclins & cyclin dependent kinases‬‬

‫חלבוני ‪ cyclin‬ביחד עם אנזימי ‪ CKD‬הם אלו שמבקרים את מחזור התא‪.‬‬
‫‪ - CDK‬קינאזות שעושות פוספורילציה ופעילותם תלויה בציקלינים‪ .‬הרמה שלהם‬
‫קבועה ‪ -‬הם פשוט לא פעילים‪.‬‬
‫‪ - cyclins‬בעלי צורה ציקלית‪ .‬נוצרים ומתפרקים‪ ,‬כלומר רמתם משתנה‪.‬‬

‫לכל אחד מהשלבים של מחזור התא קיים ‪ CDK‬משלו‪ .‬יש להם פעילות של‬
‫‪ Off/On‬בהתאם לשלב אותו הם מבקרים‪ ,‬הפעילות תלויה בריכוזי ציקלין שנוצרים‬
‫ומתפרקים במהלך מחזור התא‪ .‬לכל ‪ CDK‬יש ציקלין משלו שמסונתז רק בשלב‬
‫מסוים של מחזור התא‪.‬‬
‫לדוגמא‪:‬‬
‫ה‪ MCDK -‬נמצא בריכוז קבוע בתא‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬הציקלין שלו (‪ M‬ציקלין) מסונתז במהלך ‪ G2‬כך שבסוף ‪ G2‬הוא‬
‫נמצא בריכוז מספיק גבוה כדי להקשר ל‪ MCDK‬ולהפוך אותו לפעיל‪ .‬התא ייכנס לשלב ‪ M‬והציקלין יעבור דגרדציה‪.‬‬
‫אם רוצים להיכנס לשלב ‪ S‬יש ‪ ,SCDK‬ברגע שעוברים את ה‪ Checkpoint -‬של ‪ ,G1‬ה‪ S -‬ציקלין מסונתז ונקשר ל‪-‬‬
‫‪.SCDK‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫ישנם ‪ 4‬סוגים של ‪:CDK‬‬

‫• ‪G1-CDK‬‬
‫• ‪G1/S-CDK‬‬
‫• ‪S-CDK‬‬
‫• ‪M-CDK‬‬

‫‪ G1/S Cyclin‬הוא זה שמתחיל את כל‬

‫התהליך (נקשר ל‪ G1/S-CDK‬בסוף שלב ‪G1‬‬
‫ומכניס את התא להתחייבות לחלוקה)‪.‬‬
‫הוא יוצר את ‪ S-Cyclin‬וברגע שהוא נוצר אז‬
‫‪ S-CDK‬נהפך לפעיל ונכנסים לשלב ‪- S‬‬
‫מתחיל שכפול הדנא‪.‬‬
‫ברגע שרוצים להיכנס לשלב ‪ M‬מסונתז‬
‫‪ M-Cyclin‬שמשפעל את ‪ M-CDK‬ומכניס‬
‫את התא למיטוזה‪.‬‬
‫הבקרה תמיד מתבססת על תהליך קודם‪.‬‬
‫כלומר‪ ,‬אם רוצים להיכנס לשלב ‪ S‬יש‬
‫לעבור את ה‪ Checkpoint -‬כאשר מי שמסונתז ב‪ Checkpoint -‬הינו ‪ G1/S-CDK‬יחד עם הציקלין שלו‪ ,‬ורק אם עוברים‬
‫את ה‪ Checkpoint-‬נוצר ה‪ S-Cyclin -‬ורק אז ‪ CDK-S‬פעיל ורק אז הוא מעביר אותנו לשלב ‪.S‬‬

‫משמאל ניתן לראות שכל ציקלין מסונתז בדיוק בשלב‬

‫שבו הוא נחוץ‪.‬‬
‫כל עוד התא לא קיבל סיגנל להתחלק הוא נמצא בשלב‬
‫‪ G1‬ואין לו ציקלין‪.‬‬
‫ברגע שהוא מקבל את הסיגנל יש יצירה של ‪G1-Cyclin‬‬
‫)‪ (cyclinD1‬שמפעיל את ‪ G1-CDK‬והוא מפעיל את‬
‫)‪ G1/S-Cyclin (cyclinE‬שמפעיל את ‪ G1/S-CDK‬וכך‬
‫הלאה‪.‬‬

‫החלבון ‪ E2F1‬הוא פקטור שעתוק‪ ,‬נכנס לגרעין וגורם לביטוי של גנים‬

‫מסוימים‪ .‬על החלבון יושב רפרסור (רפרסור ‪ -‬חלבון שהקשירה שלו‬
‫לאופרטור מעכבת את הביטוי של הגן) שנקרא ‪ RB .RB‬נמצא בכל‬
‫התאים שלנו באופן נורמאלי (גילו אותו לראשונה בסרטן הרשתית‬
‫ומכאן שמו)‪.‬‬

‫מתקבל סיגנל להתחלקות התא‪.‬‬

‫נוצר בתא ‪ cyclinD1‬שמשפעל ‪ G1-CDK‬והוא גורם ליצירת כמות‬
‫קטנה של ‪ cyclinE‬שמשפעל ‪.G1/S-CDK‬‬
‫שני סוגי ה‪ CDK‬שנוצרו עושים פוספורילציה לרפרסור ‪ RB‬וכתוצאה‬
‫‪ RB‬משנה קונפורמציה‪ ,‬יורד מחלבון ‪ ,E2F1‬ועובר פולייוביקוויטינציה‬
‫(הסבר המושג בעמוד הבא) ודגרדרציה בפרוטאוזום‪.‬‬
‫בעקבות הניתוק חלבון ‪ E1F2‬הופך לפעיל ‪ -‬הוא נכנס לגרעין וגורם‬
‫לביטוי של שני גנים‪:‬‬
‫• עוד ‪ cyclinE‬שמשפעל עוד ‪.G1/S-CDK‬‬
‫• ‪ S-cyclin‬שמשפעל ‪ S-CDK‬ומכניס את התא לשלב ‪ - S‬לרפליקציה‪.‬‬
‫כלומר ‪ G1/S‬הוא זה שמתחיל את התהליך‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫פולייוביקוויטינציה ‪ -‬חלבונים שפג תוקפם‪/‬סונטזו עם פגם‪/‬לא נחוצים יותר מיועדים לפירוק בפרוטאוזום‪ .‬מסמנים‬
‫אותם עם סימון לדגרגציה ע"י קישור לחלבון יוביקוויטין ואז הפרוטאוזום בציטוזול מזהה אותם על פי היוביקוויטין‬
‫ומפרק אותם‪.‬‬
‫כשיש נזק בדנא‪:‬‬
‫בשלב ‪ G1‬יש ‪ Checkpoint‬שאומר שאם יש נזק לתא‪ ,‬אנחנו לא רוצים שתהיה‬
‫כניסה לשלב ‪.S‬‬
‫כשיש נזק ל‪ ,DNA-‬משופעל ‪ P53‬שיש לו כמה פונקציות‪:‬‬
‫▪ הוא ‪ - Repressor gene‬פקטור שעתוק שגורם לביטוי הגן ‪ P21‬שעושה‬
‫אינהיביציה ל‪.CDK‬‬
‫▪ יכול לגרום לאפופטוזיס‪.‬‬
‫‪ P53‬מסונתז בלי הפסקה אבל יש את ‪( MDM2‬סוג של ‪ - E3-ligase‬אנזים‬
‫שעושה פולייוביקוויטינציה) שגורם לפירוק שלו כל הזמן ולכן אם נבדוק את רמתו בתאים היא תהיה אפסית כי הוא כל‬
‫הזמן עובר דגרגציה‪.‬‬
‫התהליך‪:‬‬
‫יש נזק לדנא ‪ ‬מופעלות קינאזות שעושות פוספורילציות ‪‬‬
‫‪ MDM2‬מעוכב ולא עושה פולייוביקוויטינציה ל‪ P53‬‬
‫יש הצטברות של ‪  P53‬גורם ליצירת ‪ P21  P21‬מעכב את כל ה‪CDKs‬‬
‫‪ ‬אין זרחון של ‪ RB  RB‬לא מתנתק מ‪  E1F2‬אין שפעול של פקטור‬
‫השעתוק ‪ S-cyclin  E1F2‬לא מיוצר‪ ,‬התא לא נכנס לשלב ‪.S‬‬
‫הערה‪ :‬אם הרפליקציה כבר התחילה ‪ P21‬יפיל את הפולימראז מהדנא ע"י‬
‫עיכוב של ‪( PCNA‬סליידינג כלאמפ)‪.‬‬
‫מלבד עצירת מחזור התא‪ P53 ,‬גם מפעיל מנגנוני תיקון של דנא‪ .‬אם‬
‫מנגנוני התיקון הצליחו מחזור החלוקה ימשיך‪ .‬אולם אם לא ‪ P53‬יכניס את‬
‫התא לאפופטוזיס (ע"י הפעלה של חלבון בשם ‪.)BAX‬‬
‫עובדת בונוס‪ :‬מצאו שלפילים‪ ,‬שאין להם סרטן‪ ,‬יש המון עותקים של ‪,P53‬‬
‫ואם יש נזק תאי הם ישר עושים אפופטוזיס לתאים‪.‬‬

‫נקרוזיס הינו מוות פאסיבי‪ .‬התא מתפוצץ וה‪ DNA -‬מתפרק‬

‫בספונטניות ‪-‬נוצרים גדלים שונים של ‪.DNA‬‬
‫אפופטוזיס לעומת זאת הינו מוות תאי מתוכנן וזהו תהליך‬
‫אקטיבי שדורש אנרגיה‪ .‬כאשר התא עובר אפופטוזיס‪ ,‬הוא הופך‬
‫לקומפקטי והכרומטין שלו נהיה דחוס‪.‬‬
‫מופעלים כל מיני ‪( DNAase‬מפרקי דנא) כך שהדנא נחתך בצורה‬
‫מבוקרת ומתקבלים קטעים בגדלים שווים‪ .‬התא מתחיל ליצור‬
‫מעין תאים קטנים שמכילים חלק מהדנא של התא ‪ -‬תאים קטנים‬
‫שמכילים כמות קטנה יותר מאשר ‪ 2N‬כרומוזומים‪.‬‬

‫דרכים לראות אפופטוזיס‪:‬‬

‫‪ .1‬סולם אפופטוטי‪ -‬כפולות של ‪.200‬‬
‫‪ - Sub G1 - FACS .2‬תאים שיש להם פחות מ‪ X‬דנא‪.‬‬

‫פירוט על כל אחד מהדרכים בעמוד הבא‪.‬‬

‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫סולם אפופטוטי‪:‬‬
‫תא שעבר נקרוזיס ‪ -‬נקבל מריחה שלמה‪.‬‬
‫באפופטוזיס ‪ -‬יש חלוקה וסדר‪ .‬הדנא ארוז במבנה של נוקלאוזומים‪ ,‬וה‪-‬‬
‫‪ DNAase‬יכול לחתוך רק במקטעים מסוימים (כל ‪ 200‬נוקלאוטידים) ולכן‬
‫מקבלים סולם אפופטוטי‪.Apoptotic ladder -‬‬

‫פאקס‪:‬‬
‫במצב נורמאלי אנחנו לא רואים תאים שיש להם כמות הקטנה מ‪ X‬דנא‬
‫(ובהכפלה יגיע ל‪.)2X‬‬
‫במצב של אפופוטוזיס ‪ -‬לא רואים תאים בשלב ‪ G1‬אלא בשלב שנקרא‬
‫סאב ‪ - G1‬יש להם פחות מ‪ X‬דנא‪ .‬כמות התאים מצד שני גדלה כי כל‬
‫תא מתפצל לכמה תאים‪.‬‬
‫‪ FACS‬סופר ממברנה של ‪ ,DNA‬ולכן יוכל לספור את כמות ה‪DNA -‬‬
‫בחלקים הללו‪ ,‬אשר נבלעים על ידי תאי מערכת החיסון ‪-‬‬
‫המקרופאגים‪ .‬הם מזהים אותם על ידי היפוך ויציאה החוצה על פני‬
‫התא של הפוספטידיל סרין‪.‬‬
‫בנקרוזיס לא נקבל כלום ב‪ FACS‬מאחר ולא רואים תאים מתים‪ .‬הממברנה שלהם מתפוצצת‪.‬‬
‫ציר ‪ - X‬כמות פלוריסנציה‪ ,‬כמות דנא‪.‬‬
‫ציר ‪ - Y‬כמות תאים‪.‬‬

‫כל עוד ‪ RB‬לא עובר פוספורילציה התא לא ישוכפל ‪ -‬מעכב‬

‫את התא באופן נורמאלי עד שיקבל סיגנל להפסיק את‬
‫העיכוב‪.‬‬
‫‪ P53‬מעכב את התא כשיש משהו לא נורמאלי (ע"י עיכוב‬
‫של מסלול ‪.)RB‬‬
‫הגנים האלה מעכבים חלוקה של תא ולכן הם נחשבים‬
‫ל‪.Tumor suppressor genes‬‬
‫כאשר יהיה ‪ Loss of function‬של אחד הגנים תהיה‬
‫חלוקה בלתי מבוקרת ‪ -‬גידול‪ .‬זוהי מוטציה רצסיבית‬
‫שעוברת בתורשה‪ ,‬כדי שיהיה סרטן שני האללים צריכים‬
‫להיות פגומים‪.‬‬
‫מעל ‪ 50%‬ממקרי סרטן באדם נגרמים כתוצאה מ‪Loss of -‬‬
‫‪ function‬ב‪.P53-‬‬
‫‪ Onco genes‬מעודדים את התאים להתחלק‪ .‬הפופולארי ביותר הוא ‪ 30% - RAS‬ממקרי סרטן באדם נגרמים כתוצאה‬
‫ממוטציה ב‪ .RAS-‬זוהי מוטציה דומיננטיית שאינה עוברת בתורשה כי הילד בכלל לא ייוולד‪ ,‬כבר בזיגוטה יהיו חלוקות‬
‫בלתי מבוקרות ‪ -‬יווצר גוש סרטן‪.‬‬
‫הערה‪ :‬פרוטו‪-‬אונקו היו פעם גנים שמעודדים חלוקה תאית כשהם קיבלו סיגנל לכך‪ .‬נהייתה להם מוטציה שגרמה ל‬
‫‪ - gain of function‬נהיים פעילים כל הזמן‪.‬‬
‫‪ – BRACA‬מוטציה של ‪( Loss of function‬לבדוק את זה)‪ ,‬יש אלל אחד תקין ואחד לא ‪ -‬לכן הסיכוי שהבת תפתח‬
‫סרטן שד מאוד גבוה‪ .‬נשים שיודעות שהן נשאיות של הגן עוברות כריתת שד על מנת להימנע מהופעה של סרטן‬
‫השד בעתיד‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫השוואה בין פרוקריוטים לאאוקריוטים‪:‬‬

‫פרוקריוטים ‪ -‬כרומוזום אחד‪ ,‬דנא מעגלי‪,‬‬
‫הכרומוזום קטן (מליונים) ולכן יש אזור ‪ORI‬‬
‫אחד‪ ,‬טרמינציה ‪ -‬יש טר וטוס‪ ,‬דנא פולימראז‬
‫של חיידקים מסנתז ‪ 1000‬נוקלאוטידים‬
‫בשניה‪.‬‬

‫אאוקריוטים ‪ -‬הרבה כרומוזומים‪ ,‬דנא לינארי‪,‬‬

‫מאוד ארוך‪ ,‬יש כמה נק התחלת ‪,ORI‬‬
‫מבחינת טרמינציה ‪ -‬יש את הטלמורים‪ ,‬הדנא‬
‫ארוז בצורה של כרומטין‪ ,‬דנא פולימראז הרבה‬
‫יותר איטי ‪ -‬מוסיף ‪ 50‬נוקלאוטידים לשניה לכן‬
‫שלב ‪ S‬הוא יותר ארוך‪.‬‬

‫‪:Origin of replication‬‬

‫יש צורך בהרבה ‪ ORI‬באאוקריוטים מהסיבות הבאות‪:‬‬

‫• הדנ"א פולימראז שלנו הרבה יותר איטי מאשר בפרוקריוטיים‪.‬‬
‫• כמות גדולה יותר של ‪ DNA‬שצריך לשכפל‪.‬‬
‫באאוקריוטים אין רצף ספציפי מסוים ל‪ .ORI‬לכן קשה לבדוק כמה ‪ORI‬‬
‫באמת יש‪.‬‬
‫אם היה ‪ ORI‬אחד היינו צריכים ‪ 20‬יום רק להכפיל את הדנא‪ ,‬בזכות‬
‫הרבה ‪ ORI‬ההכפלה מצטמצמת ל‪ 7‬שעות‪.‬‬

‫כל ה‪ ORI -‬אינם נפתחים בו זמנית ולא כולם בהכרח נפתחים (נגיד‬
‫בעובר יש יותר ‪ ORI‬ולכן ההכפלה היא יותר מהירה)‪ .‬כלומר יש גנים‬
‫שמוכפלים בתחילת שלב ‪ ,S‬חלק באמצע וחלק רק בסוף ולכן יש‬
‫צורך בבקרה ב‪ G2-‬שאכן הכל שוכפל כהלכה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫גודל הגנום ומהירות הרפליקציה‪:‬‬

‫הגנום של אי קולי הוא הכי קטן ‪ 4.6 -‬מיליון בסיסים‪,‬‬
‫מהירות השכפול היא ‪ 50Kb‬לדקה‪ ,‬פאזת אס היא ‪40‬‬
‫דקות‪ ,‬יש לו סט אחד של כרומוזומים (לנו יש ‪ 2‬סטים אחד‬
‫מאמא ואחד מאבא) ויש אוריגין אחד‪.‬‬
‫בשמרים (‪ )yeast‬הגנום הוא ‪ 14‬מיליון בסיסים‪ ,‬המהירות‬
‫יותר איטית ‪ 3Kb -‬לדקה‪ ,‬פאזת אס לוקחת ‪ 20‬דקות‬
‫(גודלו פי ‪ 3‬מאי קולי ועושה זאת בפחות זמן למרות‬
‫שמהירותו נמוכה כי יש לו פי ‪ ,)ORI 330‬יש לו גם רבייה‬
‫מינית כלומר יש לו ‪ 16/32‬כרומוזומים‪.‬‬
‫בבני אדם‪ 2.3 -‬ביליארד נוקלאוטידים‪ ,‬במהירות ‪2Kb‬‬
‫לדקה‪ ,‬שלב אס לוקח ‪ 7‬שעות‪ ,‬יש לנו ‪ 23‬כרומוזומים ויותר מעשרת אלפיים ‪.ORI‬‬
‫גודל הגנום של ‪ E.coli‬הינו מאוד קטן ויש לו ‪ ORI‬אחד‪ ,‬בתאים אאוקריוטים ככל שהגנום מורכב יותר כך יש יותר ‪.ORI‬‬

‫‪Eukaryotic DNA Replication‬‬

‫איניציאציה‪:‬‬
‫הרפליקציה מתחילה מה ‪ Pre replication complex‬שהוא זה שמגייס את ההליקאז‪ .‬חלק מהקומפלקס הזה‬
‫באאוקריוטים יושב כל הזמן על ה‪.ORI -‬‬
‫בשלב ‪ G1‬יושב על ה‪ ORI‬קומפלקס ‪( ORC‬מורכב‬
‫מ‪ 6‬תת יחידות המסומנים כ ‪ 1‬עד ‪.)6‬‬
‫לאחר מכן יש גיוס של שני חלבונים‪:‬‬
‫‪( CDT1+CDC6‬הם נמצאים בגרעין בריכוז גבוה‬
‫בזמן ‪ )G1‬שמתיישבים על ה‪ .ORC‬כל הקומפלקס‬
‫הזה מגייס את ה‪ MCM -‬שהינו ההליקאז‬
‫(הקסאמר ‪ -‬בעל ‪ 6‬תתי יחידה שיוצרות טבעת‬
‫המסומנים כ ‪ 2‬עד ‪.)7‬‬
‫החלבונים מגייסים את ההליקאז ובו זמנית‬
‫מעכבים את פעילותו‪ .‬כל עוד הם יושבים כולם‬
‫כקומפלקס אחד (פרה רפליקיישן קומפלקס) הוא‬
‫לא פעיל!‬
‫הערה‪ :‬ההליקאז דרוש גם לאניציאציה וגם‬
‫לאלונגציה‪.‬‬
‫במעבר בין ‪ G1‬ל‪ S -‬מגויס ה‪ .SCDK -‬הוא‬
‫משופעל ואז עושה פוספורילציה (הרי הוא קינאז) לחלבון‪ CDC6 :‬ולתת היחידה ‪ .ORC1‬כתוצאה מכך הם מתנתקים‬
‫מהקומפלקס‪ ,‬יוצאים מהגרעין ועוברים דגרדציה‪ .‬בעקבותם גם החלבון ‪ CDT1‬מתנתק ומעוכב בגרעין על ידי החלבון‬
‫ג'מינין שנוצר בשלב ‪ .S‬כלומר ‪ CDT1‬לא עובר פוספורילציה‪.‬‬
‫כתוצאה מכך‪ ,‬אין עיכוב של ההליקאז ‪( MCM‬גם הוא עובר פוספורילציה)‪ MCM .‬נהפך לפעיל ופותח את הדאבל‬
‫סטרנד של הדנא‪ .‬כמו כן יש גיוס של פקטורים נוספים ו‪ DNA-‬פולימראז ואז מתחילה הרפליקציה‪.‬‬
‫הערה‪ :‬תתי היחידות ‪ 2-6‬של ‪ ORC‬נשארות על ה‪ ORI‬כל הזמן‪ ,‬לאורך כל הרפליקציה‪ .‬רק ‪ ORC1‬יורד‪.‬‬
‫כאשר עוברים מ‪( Pre replication complex -‬מורכב מ‪ :‬קומפלקס ‪ )MCM ,CDT1 ,CDC6 ,ORC‬ל‪Pre initiation -‬‬
‫‪ complex‬תתחיל הרפליקציה מהנקודה של ה‪ ORI -‬לשני הכיוונים‪ .‬כלומר ה ‪ Pre initiation complex‬נוצר במעבר‬
‫מ‪ G1‬ל‪ S‬בעקבות יצירת ‪.SCDK‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫הערה‪ :‬כל חלבון שנמצא בגרעין סונטז במקור בציטוזול ולכן יוכל להיכנס אליו‪ .‬לגבי יציאה מהגרעין ‪ -‬רק ברגע שעובר‬
‫פוספורילציה יכול לצאת (ב ‪ ER‬מסונטזים רק חומר שנשארים ב‪/ER‬עוברים לממברנה‪/‬לגולג'י‪/‬החוצה)‪.‬‬

‫לצורך הרפליקציה נחוצים חלבונים נוספים‪:‬‬

‫‪.Sliding clamps and clamp loader‬‬

‫‪Clamp loader - RFC - Replication‬‬

‫‪Factor C.‬‬
‫‪Sliding clamp - PCNA - Proliferating‬‬
‫‪Cell Nuclear Antigen.‬‬

‫ה‪ RFC -‬עושה ‪ Loading‬של ה‪ PCNA -‬שהוא זה‬

‫שקושר את הדנ"א פולימראז כדי שתהיה לו‬
‫פרוססיביות גבוהה‪.‬‬
‫ההבדל בין הקלאמפ והסליידינג זה שהקלאמפ‬
‫מטעין את הדנא פולימראז על הגדיל‪ .‬בלגינג צריך אותו כל הזמן‪ ,‬בלידינג צריך אותו רק פעם אחת בהתחלה‪ .‬לעומת‬
‫זאת הסליידינג הוא זה שעוזר להחלקה על גבי הגדיל‪.‬‬
‫הערה‪ PCNA :‬מעוכב ע"י חלבון ‪( P21‬הוא עוצר את המחזור התא ע"י עיכוב ‪ ,S-CDK‬וגם מעכב את ‪  PCNA‬כך יש‬
‫עצירה מוחלטת של מחזור התא)‪.‬‬

‫יש בעייתיות מסוימת ‪ -‬למה שאוריגין לא ייפתח ואז האוריגין שכבר נוצר שוב יעבור הכפלה? כלומר למה בכל סייקל‬
‫יש רק רפליקציה אחת של הגנום ואין שכפול על שכפול? איך יש על כך בקרה?‬
‫יש הרבה מנגנונים שמבקרים את התהליך הזה‪:‬‬
‫‪ CDC6 .1‬עובר פוספורילציה‪ ,‬יוצא מהגרעין ועובר דגרגציה‪ ,‬בלעדיו לא תתחיל רפליקציה‪.‬‬
‫‪ CDT1 .2‬מעוכב עי ג'ימינין‪ .‬ללא ‪ CDT1‬ההליקאז (‪ )MCM‬לא יגויס‪.‬‬
‫‪ ORC1 .3‬מתנתק מהקומפלקס בשלב ‪ ,S‬יוצא מהגרעין ומתפרק‪.‬‬
‫‪ MCM .4‬עובר פוספורילציה (מפוספר) ע"י ‪ MCDK‬וכתוצאה מתנתק מהגדיל‪.‬‬
‫בתחילת שלב ‪ G2‬יש צ'קפוינט‪ -‬בדיקה אם כל הדנא שוכפל במלואו‪ ,‬אם לא נותן עוד זמן לשכפול‪ .‬ברגע שנכנסים‬
‫לשלב ‪ M‬כבר לא ניתן לשכפל ‪ -‬הרפליקציה נעצרת לחלוטין ולכן הצ'קפוינט חשוב‪.‬‬
‫הערה‪ SCDK :‬עושה ל‪ MCM‬פוספורילציה כדי לאקטב אותו לעומת ‪ MCDK‬שמפספר אותו במקום אחר וגורם לשחרור‬
‫שלו מהגדיל‪.‬‬
‫הערה נוספת‪ SCDK :‬מעוכב על ידי ‪ P21‬אם יש פגם בדנ"א (בודקים את זה בצ'קפוינט של ‪.)G1‬‬
‫סיכום הבקרות שיש כדי לוודא שלא יהיה הכפלה כפולה‪:‬‬
‫‪ ORC1‬מצטבר בשלב ‪ G1‬ומפורק בשלב ‪.S‬‬
‫‪ ORC2-6‬נשארים על הדנא במשך כל מחזור התא‪ .‬יוצרים קומפלקס עם ‪ ORC1‬בשלב ‪.G1‬‬
‫‪ CDC6‬מצטבר בשלב ‪ G1‬ומפורק בשלב ‪.S‬‬
‫‪ CDT1‬מצטבר בשלב ‪ G1‬ומפורק בשלב ‪ S‬ו‪ M‬ע"י ‪( SCF‬לא דיברנו על הפירוק בהרצאה)‪ .‬בשלב ‪ S‬מעוכב ע"י ג'מינין‪.‬‬
‫ג'ימינין מצטבר בשלב ‪ S‬ומפורק בשלב ‪( M‬ע"י ‪.)APC‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫הבדל בין פרוקריוטים לאאוקריוטים‪:‬‬

‫פרוקריוטים‪:‬‬
‫בהתחלה ‪ DNA A‬עושה ‪ loop‬שיוצר מתח‬
‫בדנא‪ DNA C .‬מגייס את ‪ ,DNA B‬שהוא‬
‫ההליקאז ואז מתחילה הרפליקציה‪ .‬מהמתח‬
‫שה‪ DNA A -‬יצר יש כבר פתיחה של‬
‫הגדילים ו‪ DNA B -‬ממשיך את הפתיחה של‬
‫הגדילים כי הוא ההליקאז‪.‬‬
‫אאוקריוטים‪:‬‬
‫קומפלקס ‪ ORC‬מתיישב על ה‪ ORI‬ואז‬
‫מגוייסים החלבונים‪ CDT1+CDC6 :‬שמגייסים‬
‫את ההליקאז‪ .‬בשלב ‪ S-CDK S‬הופך לפעיל‬
‫ומוריד את‪ ,ORC1+CDT1+CDC6 :‬ואז‬
‫הליקאז (‪ )MCM‬יכול להתחיל לפעול‪ .‬יש‬
‫גיוס של ה‪ Clamp loader‬ושל ה ‪Sliding‬‬
‫‪ clamp‬שרצים על ה‪ DNA‬בשתי מזלגות‬
‫ההכפלה‪.‬‬

‫סוגי פולימראזות באאוקריוטים‪:‬‬

‫• דנא פולימראז אלפא ‪ -‬נמצא בגרעין‪ ,‬משתתף ברפליקציית‬
‫ה‪ ,DNA‬אין לו ‪.proofreading‬‬
‫• דנא פולימראז בטא ‪ -‬נמצא בגרעין ואחראי על התיקון‪ .‬אין לו‬
‫‪.proofreading‬‬
‫• דנא פולימראז גמא ‪ -‬נמצא במיטוכונדריה (יש שם דנא מעגלי)‪.‬‬
‫יש לו ‪.proofreading‬‬
‫• דנ"א פולימראז דלתא ‪ -‬אחראי לרפליקציית הדנא‪ .‬יש לו‬
‫‪.proofreading‬‬
‫• דנ"א פולימראז אפסילון ‪ -‬נמצא בגרעין ויש לו ‪ .proofreading‬לא לגמרי ברור מה התפקיד שלו‪.‬‬
‫קצב הרפליקציה באאוקריוטים הינו הרבה יותר איטי מאשר בפרוקריוטיים‪.‬‬

‫דנ"א פולימראז אלפא‪:‬‬

‫בנוי מ‪ 4‬תתי יחידה שאחת מהן הינה פרימאז (רנא‬
‫פולימראז‪ ,‬הטמפלייט שלו הוא דנא ומה שהוא‬
‫מסנתז זה רנא)‪ .‬משמע הוא דנא פולימראז אבל‬
‫יש לו גם פעילות קטליטית של רנא פולימראז‪.‬‬
‫הערה‪ :‬אף דנא פולימראז לא יודע להתחיל סנטוז‬
‫מאפס! רק רנא פולימראז יודע להתחיל מאפס‪,‬‬
‫הוא יסנטז רנא ואז הדנא פולימראז ימשיך אותו‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫▪ יש לו פרוססיביות נמוכה ‪ -‬לכן הוא מספיק לייצר רק פריימר (מרנא)‪ ,‬מקטע קטן של דנא ואז הוא נופל‪ .‬דנא‬
‫פולימראז דלתא ימשיך להאריך את הדנא‪.‬‬
‫▪ אין לו פעילות של ‪ ,Proofreading‬חסר לו אקסונוקלאז ‪ 3‬ל‪ .5‬לכן זה טוב שיש לו פרוססיביות נמוכה ‪ -‬עדיף שלא‬
‫יישכפל לנו את הגנום מאחר ואם ייצר טעויות הוא לא יכול לתקן אותם‪.‬‬
‫▪ בשביל ה‪ Leading strand -‬הוא נחוץ רק פעם אחת‪ ,‬אך בשביל ה‪ Lagging strand -‬יש צורך ליצור פריימר וליפול‪.‬‬
‫▪ סביר להניח שכל מה שהדנ"א פולימראז אלפא מסנתז לא יישאר על הדנ"א כי אין לו פרופרידיניג ויכול‬
‫להיות שיש שם טעויות (סיכוי נמוך ‪ -‬לדנ"א פולימראזות וגם לרנ"א פולימראזות יש אחוז טעות של ‪ 1‬ל‪10 -‬‬
‫בחזקת ‪ ,4‬אם מסנתזים משהו של ‪ 30‬נוקלאוטידים הסיכוי שתהיה טעות נמוך מאוד ובכל זאת לא לוקחים‬
‫סיכון)‪.‬‬

‫סיכומון‪:‬‬
‫דנא פולימראז אלפא יוצר פריימר (רנא) בעזרת תת היחידה של הפרימאז‪ .‬לאחר מכן הוא מאריך את הפריימר (עם‬
‫דנא)‪ .‬עקב הפרוססיביות הנמוכה הוא נופל ואז מגיע דלתא שממשיך להאריך את הדנא (לא נוצר ניק בכלל כאן)‪.‬‬
‫‪ ‬דנ"א פולימראז דלתא הוא זה שמבצע את הרפליקציה‪.‬‬

‫הערה‪ :‬באאוקריוטים על כל גדיל יש דנא פולימראז משלו (בפרוקריוטים יש אחד על כל מזלג רפליקציה)‪.‬‬

‫הבעיתיות‪:‬‬
‫יש הרבה מקטעים של רנא (הפריימרים) שצריך להוציא‪.‬‬
‫צריך להוציא את הדנא שדנא פולימראז אלפא יצר‪.‬‬
‫צריך לחבר את הניקים במקטעי האוקזאקי‪.‬‬

‫פתרונות‪:‬‬
‫כדי לחבר את הניקים קיים הליגאז‪.‬‬
‫כדי להוריד את הפריימר ואת מה שדנא פול' אלפא יצר ‪ -‬בפרוקריוטיים הוריד אותו דנ"א פולימראז ‪ 1‬שיש לו פעילות‬
‫של ‪( Nick translation‬מעכל ‪ 5‬ל‪ 3-‬את הפריימר‪ ,‬משכפל ‪ 5‬ל‪ 3-‬ומתקן ‪ 3‬ל‪.)5‬‬
‫באאוקריוטים הוא לא קיים ולכן התהליך שונה‪:‬‬
‫מי שמוריד את הפריימר זה האנזים ‪( RNAase H1‬בעל פעילות של‬
‫אקסונוקליאז)‪ .‬הוא יכול לעכל ‪ RNA‬רק כשהוא בצורת ‪RNA-DNA‬‬
‫‪ .hybrid‬לאחר מכן יבוא דנא פולימראז דלתא שישלים את ה‪.Gap‬‬
‫קיימות שתי אופציות‪:‬‬
‫‪ .1‬האדום בציור זה הפריימר‪ RNAase H1 .‬מעכל את כל הפריימר חוץ‬
‫מהנוקלאוטיד האחרון‪ .‬דנ"א פול' דלתא מגיע והוא מאריך את‬
‫השרשרת (האוקזאקי הקודם משמש לו כפריימר)‪ .‬כשהוא מגיע‬
‫לנוקלאוטיד של הפריימר הוא עושה ‪ Displacement‬של הגדיל ‪-‬‬
‫מוסיף נוקלאוטידים תוך כדי דחיקת המקטע של הגדיל הקודם‬
‫שסונטז‪ .‬לבסוף מגיע אנדונוקלאז שנקרא ‪ FEN1‬שחותך את‬
‫המקטע המיותר (המקטע הזה מכיל גם נוקלאוטידים של דנא‬
‫שסונטזו ע"י פול' אלפא שאין לו ‪ proofreading‬ככה שזה עוד‬
‫יתרון)‪ .‬את הניק שנוצר בסוף ליגאז מחבר‪.‬‬
‫‪ RNAaseH .2‬לא חותך את הפריימר‪ .‬דנ"א פול' דלתא עושה‬
‫‪ Displacement‬של הכל (של הפריימר ושל מקטע קטן של דנא כדי‬
‫להוריד את מה שדנא פול' אלפא עשה)‪ ,‬ואז ‪ FEN1‬חותך את‬
‫המקטע המיותר וליגאז סוגר את הניק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫השוואה בין פרוקריוטים לאאוקריוטים‬

‫צריך לדעת את ההבדלים ואת הטבלה‪.‬‬
‫הערות‪:‬‬
‫• ‪ = Gyrase‬טופואיזומראז מסוג ‪.2‬‬
‫• באאוקריוטים ה‪ Sliding clamp-‬וה‪ Clamp loader-‬אינם‬
‫חלק מדנ"א פולימראז‪ .‬לעומת זאת בפרוקריוטים ה‬
‫‪ Sliding clamp‬זה תת יחידה בטא של הפולימראז וה‬
‫‪ Camp loader‬זה תת יחידה גמא‪.‬‬
‫• דנ"א פולימראז באאוקריוטים אינו עובד כדימר כמו‬
‫בפרוקריוטים (שיש להם את הקטע של ה‪ loop‬על‬
‫ה‪ legging‬בשביל שקומפלקס אחד יוכל לסנטז את שני‬
‫הגדילים)‪ ,‬אלא לכל גדיל יש אחד משלו‪.‬‬

‫בעיית הסיום‪:‬‬
‫דנא פולימראז לא יודע לסנטז מאפס‪ ,‬לכן הוא חייב פריימר‪.‬‬
‫כשהוא משלים את הגאפ שנוצר כתוצאה מהורדת פריימר‬
‫הרנא הוא משתמש במקטע האוקזאקי הקודם כפריימר שלו‪.‬‬
‫בקצה נוצרת בעיה ‪ -‬אין מקטע אוקזאקי שישמש כפריימר‬
‫ולכן החלק האחרון לא יסנותז‪ .‬יווצר מצב של סינגל סטרנד‬
‫בקצה שנוקליאז יכול לבוא ולעכל ‪ -‬יגרום לדנא להתקצר‪.‬‬
‫הבהרה‪ :‬בגדיל ה‪ leading‬אין בעיה כזאת כי צריך פריימר‬
‫רק בהתחלה‪ .‬רק בגדיל ה‪ lagging‬זה בעייתי‪ .‬אבל בכל‬
‫מזלג הכפלה יש אחד משני הגדילים ככה שהדנא יתקצר‬
‫משני הצדדים‪.‬‬
‫איך מתגברים על זה?‬
‫בקצוות יש טלומרים ‪ -‬אלו רצפים חוזרים שלא מקודדים‬
‫לגנים ולכן לא נורא אם יתקצרו‪.‬‬

‫בנוסף קיים אנזים בשם ‪ telomerase‬שהוא ‪RNA‬‬

‫‪ .dependent DNA polymerase‬יש עליו ‪ tamplate‬של‬
‫רנא שלפיו הוא מסנתז דנא‪.‬‬
‫הוא סוג של ‪ Reverse transcriptase‬אבל לא בדיוק מכיוון‬
‫שהוא יודע להשתמש רק ברנא שלו‪ .‬אם נביא לו רנא אחר‬
‫הוא לא ידע מה לעשות איתו‪.‬‬
‫האנזים הזה מאריך את הכרומוזומים ברצף קבוע וחסר‬
‫משמעות‪( TTGGGG :‬הטמפלט שלו זה ‪.)AACCCC‬‬
‫טלומרז מוטנטי ‪ -‬בכל חלוקה הכרומוזום יתקצר‪.‬‬
‫פעילות האנזים‪:‬‬
‫טלומראז הוא סוג של דנא פולימראז ולכן גם הוא מסנתז‬
‫מ‪ 5‬ל‪ 3‬וחייב טמפלט‪.‬‬
‫הגדיל החדש הסתיים ב‪ ,'5‬כלומר אין לו קצה ‪ OH‬חופשי‬
‫כך שאין אפשרות להאריך אותו‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫לכן האנזים מאריך את הגדיל הישן ‪ -‬הוא מזהה את הקצה‬

‫שלו ונקשר אליו ואז הוא מסנתז לפי טמפלט הרנא שלו‪,‬‬
‫נופל ושוב חוזר ועושה עוד סינתזה‪ .‬לבסוף דנא פולימראז‬
‫אלפא משלים את הגדיל החדש‪.‬‬
‫לאחר הארכת הגדיל הישן ‪ -‬הגדיל החדש יסונתז כרגיל‪.‬‬
‫רק שעכשיו אין בעיית סיום ‪ -‬לא אכפת לנו שהחלק האחרון‬
‫לא יסנותז ושהדנא יתקצר כי הרגע הארכנו אותו‪.‬‬
‫קצה הטלומר שנשאר חד גדילי מתקפל על עצמו וכך מגן‬
‫על הדנא‪:‬‬

‫בקרה על התהליך‪:‬‬
‫חלבונים שמבקרים את התהליך‪ TRF1 :‬ו‪.TRF2‬‬
‫הערה‪TRF=Telomeric Repeat binding Factor :‬‬
‫‪ :TRF1‬מבקר שלילית את הארכת הטלומרים‪ ,‬הרי לא רוצים שהארכה תהיה לנצח‪.‬‬
‫‪ :TRF2‬יושב על הטלומרים ומגן עליהם מפני פירוק (יש מלא אקסונוקלאזות ולכן כשיש קצוות חופשיים צריך להגן‬
‫עליהם)‪ .‬בנוסף מגן מפני איחוי של שני כרומוזומים אחד עם השני (ואז תהיה בעיה בחלוקת התא)‪.‬‬
‫אם לא היו טלומרים הכרומוזומים היו עוברים איחוי‪.‬‬
‫הערת אגב‪:‬‬
‫כשכרומוזום נשבר יש שתי אופציות‪:‬‬
‫‪ .1‬יעבור עיכול על ידי אקסונוק'‪.‬‬
‫‪ .2‬יעבור איחוי‪.‬‬
‫פעילות טלומראז‪:‬‬
‫ברוב התאים פעילות הטלמוראז נעצרת לאחר שהתא עבר דיפרציניאציה‪ .‬כלומר הטלומראז פעיל בעיקר בשלב‬
‫העוברי‪( .‬י שנם תאים כמו הגמטות הזכריות שבהן הטלומראז פעיל‪ ,‬כי ברגע שגבר מגיע לבגרות מינית כמעט עד מותו‬
‫הוא מייצר עוד תאי זרע מתאי גזע)‪.‬‬
‫ברגע שהטלומראז מספיק את פעילותו הכרומוזומים מתחילים להתקצר‪ .‬כשהם מגיעים לאורך מסוים התא כבר אינו‬
‫יכול להמשיך להתחלק והוא מתחיל להזדקן (לכן אובדן הטלומראז מאוד קשור להזדקנות)‪.‬‬
‫רוב התאים הסרטניים מבטאים טלומרז בעודף כדי לאפשר חלוקה אינסופית‪.‬‬
‫הכבשה דולי‪:‬‬
‫לקחו גרעין מעטין (תא סומטי) של כבשה בוגרת והשתילו אותו בתוך ביצית של כבשה אחרת‪ .‬נוצרה דולי‪.‬‬
‫בעטין של כבשה אין טלומראז ולכן מראש הגרעין הזה היה עם טלומרים קצרים‪ .‬ההתחלקויות הרבות בשלב העוברי‬
‫קיצרו את הטלומרים עוד יותר‪.‬‬
‫בסופו של דבר הכבשה מתה אחרי זמן קצר בגלל מחלות גיל‪ ,‬היא "נולדה זקנה"‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Senescence‬‬
‫כשהטלומרים מגיעים לאורך מינימלי מסוים יש הפעלה של ‪P53‬‬
‫שגורם לתא להפסיק להתחלק ולהכנס למצב של הזדקנות ‪-‬‬
‫‪.senescenece‬‬
‫עובדת בונוס‪:‬‬
‫לא דיברה על זה בהרצאה אבל זה מעניין אז השארתי ‪ -‬במוצרי אנטי‬
‫אייג'ינג ישנם חומרים אנטי אוקסידנטים‪ .‬כאשר תא לא מתחלק הוא‬
‫נתון יותר לנזקים של רדיקלים חופשיים ולכן החומרים האלו יוכלו‬
‫להוריד את הנזק שייגרם לתאים‪ ,‬אך הם לא יגרמו להארכה של‬
‫הטלומרים‪.‬‬

‫אורך הטלומרים כתלות בגיל‪:‬‬

‫ככל שמתבגרים אורך הטלומרים מתקצר‪.‬‬

‫בירוק ‪ -‬מצב נורמאלי בתאי הגוף הסומטיים‪ .‬הטלומרים‬
‫הולכים ומתקצרים עד שבסופו של דבר מגיעים למצב של‬
‫מחלה‪.‬‬
‫באדום ‪ -‬התקצרות מהירה בגלל מחלה גנטית כלשהי‪.‬‬
‫לדוגמא‪ - Progeria :‬הילדים נולדים מקומטים ונראים זקנים‪.‬‬
‫בסגול ‪ -‬הטלומרים אינם מתקצרים ושומרים על האורך‬
‫שלהם‪ .‬זה קורה בתאי ‪ germ line‬שיוצרים את הגמטות‪ .‬יש‬
‫להם טלומרז ולכן לא מתקצרים‪.‬‬
‫לנשים זה פחות בעייתי מאחר והגמטות נוצרות בעובר‪.‬‬
‫לגברים זה ממש חשוב‪ ,‬הם מתחילים ליצור גמטות רק בגיל ההתבגרות‪.‬‬
‫‪ - Hayflick limit‬מספר הפעמים שתא מסוגל מתחלק עד שהוא מגיע לאורך המינימלי של הטלומרים ומפסיק‪.‬‬

‫כמות התאים כתלות בזמן‪:‬‬

‫אמרה שהיא מאוד אוהבת את הגרף הזה ‪ -‬אולי רמז שיהיה במבחן‪.‬‬
‫כשהאורך של הטלומרים מגיע לאורך מינימאלי‬
‫מסוים זה לא אומר שאין יותר טלומרים זה רק‬
‫אומר שהתא מקבל הוראה להפסיק להתחלק‪.‬‬
‫בכחול ‪ -‬התאים מתחלקים כתלות בזמן עד שהם‬
‫מגיעים לגבול (‪.)Hayflick limit‬‬
‫בירוק ‪ -‬אם יש לתאים טלומרז הטלומרים שלהם‬
‫לא יתקצרו ולכן הם יכולים להמשיך להתחלק לנצח‪.‬‬
‫בכתום ‪ -‬אם אין טלומרז וגם אין ‪ P53‬או ‪ RB‬שיעצרו‬
‫את מחזור התא ‪ -‬התא ימשיך להתחלק (מספר‬
‫התאים יעלה) והטלומרים יתקצרו למינימום‪.‬‬
‫בורוד ‪ -‬אם התא ימשיך להתחלק אחרי‬
‫שהטלומרים הגיעו למינימום (נגיד בגלל חוסר‬
‫ב‪ )p53‬יהיה קרייסס ‪ -‬אין טלומרים שיגנו על הדנא‬
‫ולכן הוא יפורק או יעבור איחוי עם כרומוזומים‬
‫אחרים ‪ -‬הגנום לא יהיה יציב‪.‬‬
‫בצהוב ‪ -‬אם יוסיפו טלומרז לתאים שהטלומרים שלהם התקצרו למינימום התאים יוכלו להמשיך להתחלק ויהיו יציבים‪.‬‬
‫באדום ‪ -‬אם יוסיפו טלומרז לתאים שהטלומרים שלהם התקצרו מתחת למינימום התאים יוכלו להמשיך להתחלק אבל‬
‫הגנום יהיה מאוד לא יציב ‪ -‬כנראה יתפתח סרטן וכאלה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫טלומרים וסרטן‪:‬‬
‫התאים הסרטניים מתחמקים מה‪.Hayflick limit‬‬
‫כ‪ 85‬אחוז מהם מבטאים טלומרז ‪ -‬אפשר לנסות לעכב‬
‫אותם על ידי מעכבים של טלומרז‪.‬‬
‫אולם יש תאים סרטניים שהם לא תלויי טלומרז ‪ -‬הטלומרים‬
‫שלהם לא בהכרח מתקצרים‪ .‬עושים זאת ע"י ‪ - ALT‬שומרים‬
‫על האורך של הטלומרים ע"י רקומבינציה הומולוגית (לא‬
‫נכנכסה לזה אבל בכל מקרה זה אומר שהם מחליפים‬
‫מקטעים בינהם)‪ .‬בכל מקרה אלא שלא תלויים בטלומרז לא‬
‫יגיבו לטיפול עם מעכבים בטלומרז‪.‬‬

‫זהה לגרף בעמוד הקודם של אורך הטלומרים כתלות בגיל‪ ,‬רק‬

‫שפה יש תוספת ‪ -‬החלק האדום‪:‬‬
‫רואים שפתאום הטלומרים מתארכים ‪ -‬התאים הפכו להיות‬
‫סרטניים‪ .‬יכול להיות שיש להם פעילות של טלומרז או שיש להם‬
‫‪.ALT‬‬

‫סוף הרפליקציה‪:‬‬
‫בסוף הרפליקציה הדנ"א נמצא במבנה כרומטיני‬
‫(ארוז על ידי חלבונים ‪ -‬היסטונים)‪.‬‬
‫כשפותחים את הדנ"א לרפליקציה חלק‬
‫מההיסטונים יורדים לגמרי‪ ,‬חלק נשארים על גדיל‬
‫א' וחלק נשארים על גדיל ב' (מתחלקים בין הגדילים‬
‫באופן אקראי)‪.‬‬
‫לכן בסוף יש לסנתז כמות עצומה של היסטונים כדי‬
‫ללפף על שני הגדילים ‪ -‬החדש והישן וצריך להטעין‬
‫את ההיסטונים מחדש ‪ ‬בשלב ‪ S‬בנוסף לשכפול‬
‫הדנא יש סינטזה מוגברת של היסטונים (יש הרבה‬
‫גנים שלהם כדי לאפשר זאת)‪.‬‬
‫כדי להטעין את ההיסטונים על הדנא נעזרים‬
‫בצ'פרונים שזה תפקידם‪.‬‬
‫בנוסף ישנו פקטור בשם ‪ CAF1‬שתופס את‬
‫ההיסטונים החדשים ומלפף עליהם את הדנא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫טבלה מסכמת‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Chromatin structure & modifications‬‬

‫בפרוקריוטים הדנא מעגלי ולא ארוז בצורה כלשהי‪.‬‬
‫לעומת זאת באאוקרקיוטים הדנא לינארי וארוז במבנה של כרומטין‬
‫(דנא‪+‬חלבונים)‪.‬‬
‫למה צריך חלבונים לאריזת הדנא?‬
‫אורך ה‪ DNA-‬הוא כ‪ 2-‬מטר‪ .‬יש להכניסו לא רק לתוך תא שגודלו מיקרונים‪ ,‬אלא‬
‫לתוך הגרעין‪ .‬לשם כך דרגת האריזה צריכה להיות ברמה מאוד גבוהה‪ .‬יש לזכור‬
‫שה‪ DNA-‬טעון שלילית וקשה לדחוס את הדנ"א לנפח קטן בגלל כוחות דחייה‬
‫חזקים‪ .‬כדי להתגבר על כוחות הדחייה צריך חלבונים שיאזנו את המטען‪.‬‬

‫ניתן לראות כרומוזומים במיקרוסקופ אור רק כשהתא‬

‫נמצא בשלב חלוקה‪ ,‬בשלב ‪ .M‬בשלב הזה הכרומוזומים‬
‫יהיו עבים וקצרים וכל כרומוזום יהיה בנוי מ‪ 2-‬כרומטידות‬
‫אחיות (הכרומוזומים עברו הכפלה בשלב ‪.)S‬‬

‫ההוכחה הראשונה לכך שהדנא ארוז בצורה מסוימת הייתה בשימוש של אנדונוקלאז (‪)DNase‬‬
‫שחותך במקומות שבו הדנא חשוף‪.‬‬
‫אם הוא היה חותך את הדנא במקומות רנדומליים היינו מקביל סמיר ‪ -‬מריחה‪ .‬אולם קיבלנו‬
‫סולם עם קפיצות של ‪ 200‬ולכן זה סימן שהדנא ארוז בצורה שאיננה אקראית‪.‬‬

‫רמת הארגון של הדנא‪:‬‬

‫‪.2nm .Double Helix .1‬‬
‫‪ .2‬נוקלאוזום‪.11nm :‬‬
‫הדנא מתלופף פעמיים על שמונה היסטונים (אוקטמר)‪.‬‬
‫היסטונים ‪ -‬חלבונים מאוד קטנים בעלי מבנה של אלפא הליקס‪ .‬הם‬
‫עשירים בחומצות אמינו בסיסיות (ליזין וארגנין) על מנת לנטרל את‬
‫המטען השלילי של הדנא ‪ -‬כך שנוכל לארוז אותו‪ .‬נקודה מאוד חשובה‪:‬‬
‫יש להם קצוות לינארים (נלמד בהמשך למה הקצוות משמשים)‪.‬‬
‫ההסיטונים מאורגנים באוקטט‪ :‬יש ‪ 4‬סוגי היסטונים‪ ,‬שמכל סוג יש ‪:2‬‬

‫מסוף נוקלאוזום אחד לשני יש בערך ‪ 200‬נוקלאוטידים (זה מסביר‬

‫את הסולם שקיבלנו קודם)‪.‬‬
‫יש ליפוף כפול של הדנא על ההיסטונים (‪ 146-7‬נוקלאו') ואז‬
‫‪ 40-50( linker‬נוקלאו') בין ליפופים‪.‬‬
‫בעזרת המבנה הזה הנדא מתקצר ונהיה עבה יותר‪.‬‬
‫עובי הנוקלאוזום הינו ‪ 11‬ננומטר‪.‬‬
‫הדנא מתקצר ומתרחב (‪ 11‬ננוטמר לעומת ‪ 2‬ננומטר של דנא דו‬
‫גדילי)‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪.30nm :Solenoid .3‬‬

‫בנוסף לארבעת ההיסטונים הקודמים יש‬
‫היסטון נוסף‪ H1 :‬שאורז את‬
‫הנוקלאוזומים אחד על השני ויוצר מבנה‬
‫אפילו יותר צפוף של ‪ 30‬ננומטר‪.‬‬
‫בציור היסטון ‪ H1‬מסומן בצהוב‪.‬‬

‫‪.300nm :scaffold .4‬‬

‫מדובר בקיפולים של הסלנואיד על חלבון‬
‫שנקרא ‪( Scaffold‬האדום בציור‪ ,‬גם המבנה‬
‫נקרא ‪.)scaffold‬‬
‫שוב הדנא מתקצר ומתרחב‪.‬‬
‫לאחר מכן ישנה דרגת אריזה נוספת שאין‬
‫לה שם ומדובר בקיפולים של ה‪Scaffold -‬‬
‫על עצמו ‪ -‬מקבלים את דרגת האריזה‬
‫הדחוסה ביותר בקוטר של ‪ 700‬ננומטר‪.‬‬
‫הערה‪ :‬דחיסה של ‪ 1400‬ננומטר מתייחסת‬
‫לשתי הכרומוטידות (בשלב החלוקה)‪ ,‬לכן‬
‫רק בשלב החלוקה ניתן לראות את‬
‫הכרומוזומים בעזרת מיקרוסקופ אור‪.‬‬

‫לא דיברה על השקף הזה אבל נראה חשוב‬

‫אז שיהיה‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫סיכום דרגות האריזה‪:‬‬

‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫רמת דחיסה‪:‬‬

‫לוקחים שני סוגי תאים ומסתכלים על אותו הגן‪:‬‬

‫הגן לגלובין (יוצר את ההמוגלובין)‪.‬‬
‫בתא מסוים כמו אריתרוציט הגלובין בא לידי‬
‫ביטוי ובתא אחר כמו מזובלסט הוא אינו בא לידי‬
‫ביטוי‪.‬‬
‫לקחו את ה ‪ DNA‬של כל תא (הם מאותו בן‬
‫אדם‪ ,‬לכן מדובר באותו דנא ‪ -‬רצף זהה) וחתכו‬
‫אותו עם אנזים אנדונוקלאז שיודע לזהות רצף‬
‫ספציפי (‪.)BamH1‬‬
‫התקבל מקטע באורך של ‪ 6.4Kb‬בשני סוגי‬
‫התאים‪ .‬זה הגיוני כי מדובר בזיהוי של רצף‪.‬‬
‫לאחר מכן הוסיפו ‪ - DNAase‬אנזים שמפרק דנא‬
‫באופן לא ספציפי‪.‬‬
‫הממצאים‪ :‬האריתרוציט פורק לנוקלאוזומים‬
‫ואילו המזובלט נשאר שלם‪.‬‬
‫מכך הסיקו שרמת הדחיסה בתאים שונים היא שונה‪ .‬כשהדנא דחוס הוא מוגן מפני ‪ ,DNAase‬כשהוא פחות דחוס הוא‬
‫לא מוגן ומעוכל‪ .‬בדוגמא הזאת ‪ -‬באריתרוציטים הגן לגלובין בא לידי ביטוי ולכן דרגת האריזה נמוכה יותר והוא רגיש‬
‫ל‪ . DNAase -‬לעומת זאת במזובלסטים בטא גלובין לא בא לידי ביטוי‪ ,‬הוא ארוז בדרגת אריזה מאוד גבוהה ולכן ל‪-‬‬
‫‪ DNAase‬אין גישה‪.‬‬

‫הוסיפו ‪ DNAase‬בהדרגה וכל פעם הריצו את שני הגדילים בג'ל שבו ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬רץ לפי הגודל‪ .‬חתיכות קטנות של דנא ינועו מהר וחתיכות גדולות‬
‫ינועו לאט‪ ,‬היכן שהדנא ייעצר נקבל פס‪.‬‬
‫באריתרוציטים‪ :‬בריכוז נמוך של ‪ DNAase‬הדנא לא ייחתך וישאר בגודל‬
‫של ‪ .4.6 kb‬אולם ברגע שמתחילים להעלות את הריכוז הדנא מתפרק‪.‬‬
‫במזובלסטים ‪ -‬גם כששמים ריכוז גבוה של ‪ DNAase‬הדנא לא מפורק‬
‫ונשאר במקטע של ‪.4.6 kb‬‬
‫‪ ‬למרות שהרצף של הגלובין זהה ‪ DNAase‬באריתרוציטים עיכל את‬
‫הדנא ואילו במזובלסטים הוא השאיר אותו כ‪.4.6 kb-‬‬
‫גנים פעילים הם בדרגת אריזה נמוכה יותר‪.‬‬

‫ניתן לראות משמאל מספר דרגות אריזה‪ .‬דרגת‬

‫אריזה יכולה לקבוע האם הגן יבוא לידי ביטוי או לא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪ 2‬מצבים לכרומטין‪:‬‬
‫במהלך האינטרפאז (מחולק ל‪ )2G ,S ,1G‬יש לכרומטין שני מצבים‪:‬‬
‫כרומטין פעיל ‪ -‬פתוח‪ .‬נקרא אאוכרומטין‪.‬‬
‫כרומטים לא פעיל ‪ -‬סגור‪ .‬נקרא הטרוכרומטין‪.‬‬
‫זאת דרך לבקר ביטוי של גנים‪.‬‬
‫הערה‪ :‬לא מתייחסים לשלב ‪ - M‬מאחר ובשלב הזה כל הדנא‬
‫דחוס על מנת להתחלק‪.‬‬

‫כשמסתכלים על כרומוזום שלם אפשר לראות כמה אזורים‪:‬‬

‫• הטרוכרומטינים טוטאליים‪ ,‬קונסטיטוטיביים‪ :‬אזור של הטרוכומטין שנמצא בכל כרומוזום‪ .‬לדוגמא‪ :‬הטלומרים ‪ -‬הם‬
‫לא גנים ולכן לא צריכים לבוא לידי ביטוי ולעבור שעתוק כך שאין בעיה שהם תמיד יהיה סגורים‪ .‬בנוסף זה טוב גם‬
‫להגנה על הדנא‪ .‬כנ"ל לגבי האזור של הצנטרומר (גם שם אין גנים)‪.‬‬
‫• ‪ - HouseKeeping Genes‬גנים הנחוצים לתחזוקה בסיסית של התא‪ .‬יהיו תמיד במצב פתוח בכל התאים‪.‬‬
‫• שאר הגנים יהיו פתוחים\סגורים כתלות בפונקציה של התא‪ .‬לדוגמא‪ :‬הגן לגלובין ‪ -‬במזובלסט הבטא גלובין יהיה‬
‫הטרוכרומטין‪ ,‬ובאריתרובלסט הוא יהיה אאוכרומטין ‪.‬‬

‫כאשר מסתכלים על הגרעין במיקרוסקופ אלקטרונים יש אזורים בהירים ‪ -‬אאוכרומטין וכהים ‪-‬‬
‫הטרוכרומטין‪ .‬הצביעה היא לפי הצפיפות ‪ -‬ככל שיותר צפוף כל האזור נראה יותר כהה‪.‬‬
‫בהיקף ‪ -‬ההטרוכרומטין קשור ל‪( Nuclear lamina‬ממברנת הגרעין הפנימית)‪ ,‬כלומר הוא נמצא‬
‫בצידי הגרעין והאאוכרומטין יהיה באמצע ‪ ‬סידור הדנ"א בגרעין לא אקראי‪.‬‬

‫מאפיינים‪:‬‬
‫הטרוכרומטין‬ ‫אאוכרומטין‬
‫לא פעיל מבחינת שעתוק‬ ‫פעיל מבחינת שעתוק‬
‫מאוד דחוס‬ ‫פחות דחוס‬
‫בא לידי ביטוי בסוף שלב ‪,S‬‬ ‫בא לידי ביטוי בתחילת שלב ‪,S‬‬
‫משוכפל לקראת הסוף‬ ‫משוכפל בהתחלה‬

‫‪ ORI‬שנמצא במקום פתוח‪ ,‬אאכורומטין‪ ,‬ישוכפל בתחילת שלב ‪ S‬כי הוא‬

‫זמין יותר לפקטורי הרפליקציה‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ORI ,‬שמצא במקום סגור ישוכפל לקראת הסוף‪ .‬יש תלות‬
‫בפונקציה של התא (לדוגמא‪ :‬בלבלב הגן לאינסולין ישוכפל בתחילת‬
‫שלב ‪ S‬ואילו בתא ריאה הוא ישוכפל בסוף שלב ‪.)S‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫הטרוכרומטין ‪ - constitutive‬צנטרומרים וטלומרים‪ ,‬הרחבו עליו קודם‪.‬‬ ‫▪‬

‫הטרוכרומטין ‪ Transposons ,rRNA - facultative‬ו‪ .Inactive X chromosome-‬בתאים שונים יהיו במצב שונה‬ ‫▪‬
‫(יכול להיות הטרוכומטין ויכול להיות אאוכרומטין)‪.‬‬
‫‪ - rRNA‬הגנים של הריבוזומל ‪ RNA‬אינם באים לידי ביטוי בבת אחת ומשתיקים חלק מהם‪.‬‬
‫‪ - Inactive X chromosome‬אצל נשים אחד מכרומוזומי ‪ X‬מושתק‪.‬‬

‫ניתן לסמן נוקלאוטידים בתחילת‪/‬אמצע‪/‬סוף שלב ‪ S‬ולראות מתי גנים‬

‫מסוימים משוכפלים‪.‬‬
‫רואים שגנים שונים משתכפלים בזמנים שונים‪.‬‬
‫אזור בהיר ‪ -‬הגן משוכפל‪.‬‬

‫‪Replication timing‬‬

‫בתמונה ‪ -‬שיטת ‪ .FISH‬כל נקודה מסמנת גן כלשהו‪ .‬רואים שתי‬

‫נקודות בתא אחד מאחר ויש שני כרומוזומים הומולוגים (אחד‬
‫מאמא ואחד מאבא)‪.‬‬

‫‪ :SS‬שתי נקודות בודדות‪ .‬את השלב הזה אפשר לראות עד אמצע‬

‫שלב ‪( S‬בסוף שלב ‪ S‬הגן כבר יהיה חייב לעבור הכפלה)‪.‬‬

‫‪ :SD‬נקודה אחת עברה הכפלה והשנייה לא‪ .‬איך זה ייתכן?‬

‫יכול להיות שמדובר בגן שנמצא בכרומוזום ‪ .X‬אחד מכרומוזומי ‪X‬‬
‫מאוקטב והשני מושתק‪ .‬כל הגנים שנמצאים ב‪ X‬האקטיבי‬
‫ישוכפלו בתחילת ‪ S‬ואילו הגנים שנמצאים ב‪ X‬המושתק ישוכפלו‬
‫בסוף שלב ‪ .S‬הערה‪ :‬בדרכ יש שני עותקים של הגן ובחלק‬
‫מהמקרים יש אפילו יותר‪ .‬לא כל העותקים פתוחים כל הזמן‪.‬‬

‫‪ :DD‬יכול להיות לאורך כל שלב ‪ .S‬תלוי מתי הגן משוכפל ‪ -‬בהתחלה‪ ,‬באמצע או בסוף‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Epigenetics‬‬

‫שינויים על הכרומטין שאינם מגיעים מרצף והם‬

‫קובעים אם גנים יבואו לידי ביטוי או לא‪.‬‬
‫מספר הפרסומים בנושא הזה הולך ועולה עם השנים ‪-‬‬
‫זהו תחום ממש "חם" היום‪.‬‬

‫האפי גנטיקה קובעת את‪:‬‬

‫הארגון של הכרומטין‪ .‬צריך לארגן את הדנא‬ ‫▪‬
‫בצורה מסודרת ‪ -‬חלק מהגנים צריכים לבוא לידי‬
‫ביטוי וחלק צריכים להיות מושתקים‪.‬‬
‫‪ - Genomic imprinting‬הכתמה‪ .‬נדבר בהמשך‪.‬‬ ‫▪‬
‫השתקת אלמנטים שחוזרים על עצמם‪ :‬טלומרים‪ ,‬צנטרומרים‪.‬‬ ‫▪‬
‫‪.X chromosome inactivation‬‬ ‫▪‬

‫הקוד האפיגנטי מוכתב על ידי‪:‬‬

‫▪ ‪ - DNA Methylation‬מתילציה של הדנ"א‪.‬‬
‫▪ ‪ - Histone modification‬מודיפיקציה של ההיסטונים‪.‬‬
‫▪ מבנה הכרומטין ‪ -‬נגזר משני הנ"ל‪.‬‬
‫שלושת אלה יבקרו ביטוי של גנים‪.‬‬

‫‪:Histone modification‬‬
‫תזכורת‪ :‬נוקלאוזום בנוי מ‪ 8‬היסטונים (‪ 4‬סוגים שונים‪ 2 ,‬מכל סוג)‪.‬‬
‫לכל היסטון יש זנב חופשי לינארי‪ .‬כל המודיפיקציות נעשות על הזנבות של‬
‫ההיסטונים‪.‬‬
‫לכל מודיפיקציה יש מאפיינים משלה‪:‬‬
‫▪ המיקום ‪ -‬על איזה היסטון‪ ,‬באיזו עמדה בהיסטון ועל איזו חומצה‬
‫אמינית‪.‬‬
‫▪ האנזימים שמשתתפים‪.‬‬
‫▪ מה המשמעות של המודיפיקציה ‪ -‬לאיזה פעילות תגרום‪.‬‬

‫זנבות ההיסטונים עוברים אינטראקציה אחד עם השני כדי לייצר‬

‫אריזה טובה יותר‪ ,‬כלומר הזנבות גם חשובים לדרגת האריזה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫המודיפיקציות על ההיסטונים‪:‬‬

‫‪ - Acetylation‬קישור קבוצת אצטיל לזנב‪.‬‬ ‫•‬

‫‪ - Methylation‬קישור ‪ CH3‬לזנב‪.‬‬ ‫•‬
‫‪ - Ubiquination‬קישור חלבון קטן שנקרא יוביקוויטין להיסטון עצמו‪ .‬בדרך כלל פולי‪-‬יוביקוויטינציה מובילה‬ ‫•‬
‫לפרוטאוזום לפירוק‪ .‬הוספת יוביקוויטין להיסטון משנה את דרגת האריזה‪.‬‬
‫‪ - Sumoylation‬קישור חלבון קטן להיסטון עצמו‪.‬‬ ‫•‬
‫‪ - ADP Ribosylation‬קישור מולקולת ‪.ATP‬‬ ‫•‬
‫‪ - Phosphorylation‬קישור מולקולת פוספט‪.‬‬ ‫•‬
‫אנחנו נתמקד במה שמסומן בסגול‪.‬‬

‫הקבוצות האלו נקשרות באופן קוולנטי לזנבות ההיסטונים ‪ -‬תמיד על שייר של‪ :‬ליזין (העיקרי)‪ ,‬ארגנין או סרין‪/‬טריונין‪.‬‬
‫לכל מודיפיקציה יש פעילות ביולוגית שונה והיא הפיכה ודינמית ‪ -‬אפשר גם להוריד אותה‪ ,‬יש אנזימים שעושים כל אחד‬
‫מהדברים‪ .‬מתבצע ע"י סיגנלים‪.‬‬
‫איך המודיפיקציה משנה את פעילות הגן או מבנה הכרומטין?‬
‫‪ .1‬ע"י שינוי המטען על ההיסטונים (הם חיוביים)‪.‬‬
‫לדוגמא‪ :‬אצטילציה מורידה את המטען החיובי של ההיסטון‪ ,‬יהיה יותר דחייה בין ההיסטון לדנא ‪ ‬הדנא יפתח‪.‬‬
‫דוגמא נוספות‪ :‬פוספורילציה מוסיפה מטען שלילי‪ ,‬מחלישה את הקשר בין ההיסטון לדנא ‪ ‬גם תגרום לפתיחה‪.‬‬
‫‪ .2‬ע"י שינוי סטרי של הכרומטין ‪ -‬שינוי הקיפול שלו שיגרום לשינוי במבנה המרחבי‪ .‬משנה את האינטרקציה עם‬
‫הדנא ‪ -‬יכול לפתוח או לסגור את הדנא‪.‬‬
‫‪ .3‬ע"י גיוס חלבונים או פקטורים‪ .‬מודיפקציה אחת יכולה לגייס אקטיבטור ואחרת תגייס רפרסור‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫לכל מודיפיקציה יש‪:‬‬

‫‪ - Writers .1‬אנזים שעושה את המודיפיקציה ‪ -‬מוסיף את‬
‫הקבוצה‪.‬‬
‫‪ - Readers .2‬חלבונים שיודעים לזהות את המודיפיקציה ולעשות‬
‫פעילות כלשהי ‪ -‬נגיד לשנות את מבנה הכרומטין או לגייס‬
‫פקטור שעתוק‪.‬‬
‫‪ - Erasers .3‬אנזים שמוריד את המודיפיקציה‪.‬‬

‫הערות לגבי הטבלה‪:‬‬

‫האנזים שעושה לליזין מתילציה לפעמים‬ ‫▪‬
‫נקרא ‪ KMT‬והאנזים שמוריד את‬
‫המתיצליה ‪ K( KDM‬מסמנת ליזין)‪.‬‬
‫רק ח‪ .‬האמינו סרין‪ ,‬טראונין וטירוזין‬ ‫▪‬
‫יכולות לעבור פוספורילציה (יש להן‬
‫קבוצת ‪ OH‬בשייר ‪ .)R‬בהקשר של‬
‫מודיפיקציה ‪ -‬רק בסרין ובטראונין‪.‬‬
‫מתילציה של ארגינין פחות שכיחה‪.‬‬ ‫▪‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫המודיפיקציות העיקריות‪:‬‬
‫(נרחיב על כל אחת מהן בהמשך)‬
‫אצטילציה ‪ -‬יכולה להיות באתרים שונים‬ ‫▪‬
‫על גבי ההיסטונים‪ ,‬תמיד מתרחשת בליזין‬
‫ובלי קשר לעמדה תמיד גורמת לכך‬
‫שהכרומטין יהיה פתוח (מורידה את‬
‫המטען החיובי של ההיסטונים)‪.‬‬
‫מתילציה ‪ -‬יכול להיות פתוח ויכול להיות‬ ‫▪‬
‫דחוס‪ .‬תלוי היכן מתבצעת (לא על איזה‬
‫חומצה אמינית אלא באיזה עמדה‪ .‬תמיד‬
‫יקשר לליזין)‪.‬‬
‫פוספורילציה ‪ -‬פוספורילציה תמיד תפתח‬ ‫▪‬
‫את הכרומטין כי זה מכניס מטען שלילי‪.‬‬

‫‪:Acetylation‬‬
‫יש הרבה שיירים של ליזין שיכולים לעבור אצטילציה‪.‬‬
‫האנזים שעושה (‪ )Writer‬את האצטילציה‪HAT - Histone Acetyl :‬‬
‫‪.Transferase‬‬
‫האנזים שמוריד (‪ )Eraser‬את האצטילציה‪.HDAC - Histone Deacetylase :‬‬

‫חלבוני ‪ - Readers‬יש כמה סוגי חלבונים‪ .‬המשותף לכולם הוא‬

‫זיהוי ליזין שעבר אצטילציה‪ ,‬לשם כך יש להם דומיין שנקרא‬
‫‪.bromodomain‬‬
‫אצטילציה תמיד מורידה את המטען החיובי בליזין ולכן תגרום‬
‫לכרומטין להיות יותר פתוח ופחות דחוס‪.‬‬
‫בגלל שזה תמיד פותח יש לזה קורולוציה מאוד גבוהה עם‬
‫אקטיבציה של גנים‪.‬‬
‫הערה‪ :‬האנזים שמוריד את האצטילציה גורם להשתקה של‬
‫גנים‪.‬‬
‫הערה חשובה‪ :‬בגנים מה שצריך להיות פתוח (מבחינת‬
‫המבנה הכרומטיני) על מנת שיוכלו לעבור שעתוק זה מקומות‬
‫הבקרה‪ .‬למשל‪( enhancers ,promoters :‬רצפי בקרה שאינם‬
‫נמצאים בצמוד לגן אלא מרוחקים) ‪ -‬לכן כשאומרים פתוח\סגור‬
‫זה באזורים האלה‪.‬‬

‫‪:Bromodomain-Containing Proteins‬‬
‫החלבונים נקשרים לזנב של היסטונים שעברו אטצילציה‪.‬‬
‫הקישור שלהם מוריד את המטען החיובי של ההיסטונים ‪-‬‬
‫המבנה נפתח עוד יותר‪.‬‬
‫מכילים אזור באורך של ‪ 70‬ח‪ .‬אמינו שמזהות את המבנה‬
‫שעבר אצטילציה (זה מה שאמרה בהרצאה)‬
‫הם גורמים לשפעול של גנים ע"י קשירה של כל מיני‬
‫אקטיבטורים‪ ,‬נגיד פקטורי שעתוק (‪ TFIID‬למשל)‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Lysine Methylation‬‬
‫לליזין אפשר לעשות עד שלוש מתילציות‪:‬‬
‫יכול להיות ‪mono/di/tri methyl‬‬
‫לכן כאשר אנו דנים במתילציה יש לשאול ‪ 2‬שאלות‪:‬‬
‫‪ .1‬באיזו עמדה מתרחשת המתילציה?‬
‫‪ .2‬בכמה מתילים מדובר?‬
‫הערה‪ :‬מתילציה לא מורידה את המטען של ההיסטון לכן‬
‫לא יודעים אם המבנה יפתח או ייסגר‪.‬‬
‫ליזין שעבר מתילציה יגרום לגיוס של חלבונים אחרים‬
‫שיכולים לגרום כרומטין פתוח או לכרומטין סגור‪ ,‬תלוי‬
‫במיקום הליזין בהיסטון‪.‬‬
‫אם החלבונים הם רפרסורים הם יגרמו לסגירה של‬
‫הכרומטין ולהשתקה של הגן‪ ,‬ואילו אם הם אקטיבטורים‬
‫הם יגרמו לגן להיות אקטיבי‪.‬‬
‫כלומר יש תלות בהיכן התרחשה המתילציה ובאילו‬
‫חלבונים מגויסים‪.‬‬
‫ליזין שעבר מתילציה יכול לגייס חלבוני ‪ Readers‬שלכולם‬
‫יש דומיין דומה שנקרא ‪.Chromodomain‬‬
‫למתילציה יש תפקידים נוספים‪:‬‬
‫‪ .1‬יכול להשפיע על מבנה הכרומטין גם בהמשך‬
‫השעתוק ולא רק בהתחלה‪.‬‬
‫‪ .2‬מתילציה בליזין יכולה לגרום לכך שיהיה‬
‫הטרוכרומטין‪ .‬באזור הצנטרומר יש הטרוכומטין‬
‫קונסטיטוטיבי‪.‬‬
‫‪ .3‬אינאקטיבציה של כרומוזום ‪.X‬‬

‫‪KMTs‬‬
‫‪.Lysine Methyltransferases = KMTs‬‬
‫מדובר באנזימי ‪ - Writers‬אלו שעושים את המתילציה‪.‬‬
‫הם מאוד ספציפים ‪ -‬כולם עושים מתיצליה על ליזין אבל‬
‫כל אחד עושה על עמדה מסוימת בהיסטון מסוים‪.‬‬
‫האנזימים יכולים לעשות לליזין מתיצליה אחת (‪,)me‬‬
‫שתיים (‪ )me2‬או שלוש (‪.)me3‬‬
‫בציור‪:‬‬
‫בשחור ‪ -‬מה האנזים עושה‪ .‬למשל‪:‬‬
‫‪ = H3K27me‬מתילציה בליזין בעמדה ‪ 27‬בהיסטון ‪.3‬‬
‫באדום ‪ -‬השם הפרטי של האנזים‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫בעמדות‪ H3K36 ,H3K4 :‬מתילציה תמיד תגרום לאקטיבציה‪ .‬כלומר לפתיחת הדנא‪.‬‬
‫הערה‪ :‬יש שלוש רמות מתילציה‪ ,‬משתנה‬
‫כתלות באזור‪.‬‬
‫לדוגמא‪ :‬באזור של ה‪ Promoters‬יהיה ‪tri-‬‬
‫‪ me‬ואילו באזור של ה‪enhancers‬‬
‫יהיה ‪ mono-me‬למרות ששניהם מבוצעים‬
‫על אותו היסטון (‪ )H3‬ואותה עמדה (‪.)K4‬‬
‫הבהרה‪ :‬לא מדובר באותו היסטון בדיוק‪,‬‬
‫הרי פרומוטורים ואינהנסרים נמצאים‬
‫במקומות שונים בדנא‪ ,‬אלא מתכוונים‬
‫באותה עמדה בקומפלקס של ההיסטונים‪.‬‬
‫עוד דוגמא‪ :‬בשלב ה‪ Elongation‬ההיסטונים‬
‫בתוך הגן עצמו בעמדה ‪ H3K36‬ממותלים ‪3‬‬
‫פעמים‪.‬‬

‫לסיכום‪,H3K4me3 ,H3K4me1 :‬‬

‫‪ - H3K36me3‬תמיד יגרמו לפתיחה של הדנא ולאקטיבציה של הגן‪.‬‬

‫בעמדות‪ H3K27 ,H3K9 :‬מתילציה תמיד תגרום לדיכוי שעתוק‪ .‬כלומר לסגירת הדנא‪.‬‬
‫‪:H3K9me‬‬
‫מבוצע ע"י האנזימים ‪ 69A‬ו‪.Suv39H1‬‬
‫בעמדה הזאת בדר"כ יהיה טרי מתיל‪ ,‬אבל לא בהכרח‪ .‬יש למתילציה הזאת שני תפקידים‪:‬‬
‫‪ .1‬נמצא בפרומוטרים של גנים מסוג ‪ tissue specific genes‬וסוגר אותם‪ .‬אלו גנים שבאים לידי ביטוי רק ברקמות‬
‫בהם הם נחוצים‪ .‬לדוגמא‪ :‬הגן לאינסולין‪.‬‬
‫בלבלב‪ :‬הוא צריך להתבטא ולכן המתיצליה תהיה בעמדה ‪ K4‬ולא בעמדה ‪.K9‬‬
‫לעומת זאת בכבד‪ :‬הגן לא צריך להתבטא ולכן‬
‫המתיצליה תהיה היה בעמדה ‪ - K9‬תשתיק אותו‪.‬‬
‫‪ ‬זה תלוי בסוג התא‪.‬‬
‫‪ .2‬באזורים נרחבים יותר ‪ -‬יוצר הטרוכומטין‬
‫קונסטיטוטיבי‪ ,‬נגיד בטלומרים‪.‬‬
‫‪ ‬כלומר בכל התאים אותו דבר‪.‬‬
‫‪:H3K27me‬‬
‫מבוצע ע"י האנזים‪.EZH2 :‬‬
‫יש למתילציה הזאת שני תפקידים‪:‬‬
‫‪ .1‬רפרסיה של טרנסקריפציה (דיכוי שעתוק)‪.‬‬
‫‪ .2‬המתיצליה גורמת לגיוס חלבוני ‪ - readers‬קומפלקס‬
‫חלבונים שנקרא ‪Polycomb group silencing‬‬
‫והקומפלקס משתיק את הגנים‪.‬‬

‫לסיכום‪ - H3K27me ,H3K9me :‬תמיד יגרמו לסגירה של הדנא ולהשתקת הגן‪.‬‬

‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:Chromodomain-Containing Proteins‬‬
‫נקשרים להיסטון שעבר מתילציה‪.‬‬
‫יש להם אזור שמור של ‪ 60‬חומצות אמינו‪.‬‬
‫משתתפים ברפרסיה של גנים (דיכוי שעתוק) ויצירת‬
‫הטרוכרומטין קונסטיטוטיבי‪.‬‬
‫לדוגמא ‪ -‬שני החלבונים בתמונה מעידים על השתקה‪:‬‬

‫‪ - )Polycomb group silencing) PcG‬ידכא שעתוק‪.‬‬ ‫•‬

‫‪ - (Heterochromatin 1) HP1‬יקשר לדוגמא ל‪ H3K9‬ויגרום‬ ‫•‬
‫לכרומטין להיות ממש דחוס‪ ,‬יהפוך אותו להטרוכרומטין‪.‬‬

‫‪Serine/Threonine phosphorylation‬‬
‫קינאז‪ -‬מבצע פוספורילציה‪.‬‬
‫פוספטאז ‪ -‬מוריד פוספורילציה‪.‬‬
‫עד כה דיברנו על המודיפיקציות ככאלו שגורמות‬
‫לפתיחה\לסגירה של גנים‪.‬‬
‫פוספורילציה משפיעה על דברים נוספים‪.‬‬
‫לדוגמא‪:‬‬
‫• היסטון ‪ - H2A.X‬תת סוג של ‪ .H2A‬עובר פוספורילציה‬
‫בתגובה לנזקי דנא ‪ -‬יופעלו מנגנוני תיקון או שהתא ייכנס‬
‫לאפופטוזיס‪.‬‬
‫• כאשר יש פוספורילציה ב‪ H3‬בעמדה ‪ S10‬זה גורם למיטוזה‬
‫‪ -‬ישנה קורלציה עם חלוקת התא‪.‬‬
‫ניסיוי ‪ -‬מסמנים בפלוריסנציה ‪ 2‬חלבונים‪:‬‬
‫• ‪ MCA1- Mitotic Chromosomal Antigen‬באדום‪ .‬כשתא נכנס‬
‫למיטוזה הוא מבטא את החלבון הזה‪.‬‬
‫• נוגדנים פלורסנטים כנגד ‪ H3S10‬שעבר פוספורילציה‪ .‬בירוק‪.‬‬
‫ב‪ Interphase-‬אין אדום או ירוק‪ ,‬אין פוספורילציה ב‪ S10‬ולא חלבון שבא‬
‫לידי ביטוי במיטוזה‪.‬‬
‫ב‪ Prophase -‬יש אדום ‪ -‬כלומר נמצאים בשלב המיטוזה וכל הכרומטין‬
‫ירוק כי הוא עובר פוספורילציה בסרין בעמדה ‪.10‬‬
‫ב‪ Metaphase -‬עדיין רואים את הצבעים‪.‬‬
‫ב‪ Telophase -‬כבר לא רואים אף אחד מהם‪.‬‬
‫כלומר מלבד בקרה על ביטוי גנים המודיפיקציות מבקרות חלק מהשלבים במיטוזה‪.‬‬
‫במקרה הזה את התהליך שהדנא עובר ב‪.Prophase‬‬

‫ניסוי ‪ - 2‬צובעים את הדנא ב‪( DAP1‬צבע כחול)‪.‬‬

‫‪ H2AX‬שעבר פוספורילציה מסומן בירוק (עובר פוספורילציה בתגובה לנזקי דנא)‪.‬‬
‫קרינת ‪ UV‬לא שוברת את הדנא באזור ספציפי ולכן רואים הכל מפוזר ‪ H2AX -‬שעברו‬
‫פוספורילציה כתגובה לנזק נראים כמו נקודות‪.‬‬
‫עם לייזר לעומת זאת אפשר למקד את הקרינה לאזור מסוים ואז נקבל פס של ‪ H2AX‬שעברו פוספורילציה כתגובה‬
‫לנזק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA damage response networks‬‬

‫בשלב ‪ G1‬יש את הבדיקה הכי קפדנית של נזק בדנא ‪ -‬יש‬
‫חיישנים שעוברים על הדנא ובודקים אותו‪ .‬ברגע שיש נזק הם‬
‫משפעלים קינאז שעושה פוספורילציה להיסטון ‪ A2X‬באתר‬
‫של השבר‪/‬נזק‪.‬‬
‫‪ HA2X‬שעבר פוספורילציה ‪ -‬בהכרח יש נזק‪ ,‬מעין דגל אדום‬
‫שמסמן למנגנוני תיקון שיבואו ויתקנו את הנזק‪ ,‬בנוסף צריך‬
‫לעצור את מחזור התא‪.‬‬

‫התהליך‪:‬‬
‫יש שבר בדנא‪.‬‬
‫חלבונים שמחפשים נזקים בדנא מוצאים את השבר‪.‬‬
‫הם עושים פוספורילציה לקינאז ‪ ATM‬ומאקטבים אותו‪.‬‬
‫‪ ATM‬עושה פוספורילציה ל‪ H2AX‬והופך אותו לגמא ‪ - H2AX‬מרקר ל ‪DNA‬‬
‫‪.damage‬‬
‫בנוסף ‪ ATM‬עושה פוספורילציה ל‪ P53‬ול‪ mdm2‬כתוצאה‪:‬‬
‫‪ P53‬מצטבר‪ ,‬גורם לביטוי ‪ P21‬שעוצר את מחזור התא ומפעיל מנגונוני תיקון‪.‬‬
‫אם הדנא יתוקן מחזור התא ימשיך והכל יחזור לשגרה‪ ,‬ואם לא ‪ -‬אפופטוזיס‪.‬‬

‫סיכום המודיפיקציות‪:‬‬
‫הערות‪:‬‬

‫• לשים לב שפוספורילציה על ‪ S10‬קשורה‬

‫למיטוזה‪.‬‬
‫• יש שתי מתילצות שגורמות לכרומטין להיות‬
‫סגור ‪ -‬ב‪ K27‬וב‪ .K9‬אם כך מה ההבדל בינהם?‬
‫מדובר בגנים שונים‪ .‬הגנים שנסגרים ב‪K27‬‬
‫נקראים‪ HOX genes :‬והם אחראיים‬
‫להתפתחות‪ .‬ב‪ K9‬יש גנים אחרים‪.‬‬
‫• הערה‪ K4 :‬יכול להיות רק ממותל‪ .‬לא יעבור‬
‫אצטילציה (כי גם היא תפתח אותו אז מה‬
‫עשינו בזה?)‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מודיפיקציות בהתמיינות העובר‪:‬‬

‫תא תותיפוטנטני ‪ -‬יכול ליצור כל תא בעובר ומחוצה לו (שלייה)‪.‬‬
‫תא פלוריפוטנטי ‪ -‬תא גזע שיכול להתמיין לכל תא מלבד רקמות חוץ עובריות‪.‬‬
‫תא מולטיפוטנטי ‪ -‬יכול להתמיין למשפחה של תאים‪.‬‬
‫‪ OCT4‬הוא גן פלוריפוטנטי ‪ -‬שומר על‬
‫הפלוריפוטנטיות של התא‪.‬‬
‫כשהתא מתחיל להתמיין ‪ OCT4‬מושתק‪.‬‬

‫הסבר הסכמה‪:‬‬
‫בעובר ‪ -‬יש מתילציה על ‪ K4‬ואצטילציה על ‪K27‬‬
‫ו‪ .K9‬כל אלה שומרים על הגן פתוח‪.‬‬
‫כשהתאים מתחילים להתמיין כבר לא צריך‬
‫לשעתק את הגן ולכן צריך להוריד את‬
‫המתיצליה מ‪ K4‬ואת האצטילציה על‪ K27‬ו‪.K9‬‬
‫כדי לסגור את הגן צריך לעשות מתילציה על‬
‫‪ K27‬ו‪.K9‬‬
‫בסוף חלבוני ‪ HP1‬ו‪ PcG‬נקשרים לליזין‬
‫הממותל וסוגרים לגמרי את הגן‪.‬‬

‫עובדת בונוס‪ IPS :‬לקחו תאים ממוינים והכניסו מספר גנים שאחראיים לפלוריפוטנטיות‪ .‬כך הם הצליחו להחזיר את‬
‫התאים אחורה ולעשות דה‪-‬דיפרנציאציה‪ .‬קיבלו על כך פרס נובל‪.‬‬

‫סיכום סופי‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA Methylation & Development‬‬

‫עד עכשיו דיברנו על מודיפיקציות של היסטונים‪ ,‬אולם גם הדנא יכול‬
‫לעבור מודיפיקציות‪.‬‬
‫מבין המודיפיקציות של ההיסטונים‪ ,‬דנא יכול לעבור רק מתילציה‪.‬‬
‫המתיצליה יכולה להיות רק על ציטוזין (‪ )C‬ורק בתנאי שהוא‬
‫סמוך לגואנין (‪ ,)G‬מפני שכך מתקבלת סימטריה בגדיל‬
‫הקומפלימנטרי‪ .‬אין מצב שבגדיל אחד תהיה מתילציה ובשני לא ‪ -‬הגדילים‬
‫תמיד יהיו סימטריים מהבחינה הזאת‪.‬‬
‫המתילציה נעשית על עמדה ‪ 5‬של הבסיס עצמו ‪ -‬ציטוזין (ולא על עמדה ‪ 5‬פריים של הסוכר)‪.‬‬

‫הערת כתיבה‪ CpG :‬מציין שמדברים על ‪ C‬שנמצא ליד ‪( G‬ולא על הקשר בין שני הבסיסים ‪.)G-C‬‬

‫השפעת המתיצליה על ביטוי גנים‪:‬‬

‫אם יש מתילציה באזורי הבקרה הגן סגור‪.‬‬
‫אם אין מתיצליה באזורי הבקרה הגן פתוח‪.‬‬
‫זה אומר שאם נסתכל על דגם מתילציה בשני תאים‬
‫שונים‪ :‬בכבד ובלבלב הוא יהיה שונה כי בכל תא יש‬
‫גנים ייחודיים שבאים לידי ביטוי‪.‬‬

‫אם נסתכל על כל הגנום ‪ 85%‬מכל ה‪ CpG -‬הינו‬

‫ממותל ורק ‪ 15%‬אינו ממותל‪.‬‬
‫מדוע הרוב ממותל?‬

‫יש אזורים בגנום שיש להם תדירות גבוהה של ‪.CpG‬‬

‫אזורים שעשירים ב‪ CpG‬נקראים ‪.CpG island‬‬
‫מרביתם לא ממותלים‪ ,‬הם *מוגנים* ממתיצליה‪.‬‬

‫נרצה לבדוק את מידת הפיזור של ה‪ CpG -‬בגנום‪.‬‬

‫מידת הפיזור אומרת כמה ‪ CpG‬יש על כל מקטע‬
‫של ‪:DNA‬‬
‫ב‪ 98‬אחוז מהגנום התדירות של רצף ‪ CpG‬נמוכה‬
‫(אחד לכל ‪ 100‬נוקלאוטידים)‪ .‬למרות התדירות‬
‫הנמוכה הרוב ממותל‪.‬‬
‫אזור זה נקרא ‪.Non CpG Island‬‬
‫ואילו ב‪ 2‬אחוז הנותרים של הגנום התדירות של‬
‫רצף ‪ CpG‬גבוהה (אחד לכל ‪ 10‬נוקלאוטידים)‪.‬‬
‫למרות התדירות הגבוהה הרוב לא ממותל‪.‬‬
‫אזור זה נקרא ‪ CpG Island‬ובו יושבים‬
‫‪.housekeeping genes‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מה ההבדל בין האזורים?‬

‫בגנים לא אקטיבים‪ :‬אזורי הבקרה שלהם ממותלים‪ .‬כשיש מתיצליה יש גיוס‬
‫של חלבונים הנקראים ‪.Methyl binding domain proteins - MBD‬‬
‫החלבונים האלו לא מאפשרים לפקטור שעתוק (‪ )TF‬להיקשר לדנא‪ .‬בנוסף‬
‫הם מגייסים רפרסורים‪ .‬לכן הגן לא יוכל לבוא לידי ביטוי‪.‬‬
‫בגנים אקטיבים‪ :‬אזורי הבקרה לא ממותלים‪ .‬פקטור שעתוק יכול להקשר‬
‫לדנא ולגייס רנא פולימראז‪ .‬הגן יכול לבוא לידי ביטוי‪.‬‬

‫יש שילוב בין מודיפיקציות היסטוניות לבין מתיצליה של הדנא‪:‬‬

‫גן לא אקטיבי ‪ -‬מתילציה של אזור הבקרה הולכת עם מתיצליה על ‪H3K9‬‬
‫(ולא עם אצטילציה‪/‬מתילציה על ‪.)H3K4‬‬
‫גן אקטיבי ‪ -‬אזור הבקרה אינו ממותל‪ ,‬הולך עם מתיצליה על ‪H3K4‬‬
‫ואצטיליציה‪.‬‬

‫קביעת הפנוטיפ‪:‬‬
‫בתהליך ההפריה תא זרע מפרה תא ביצית ונוצרת זיגוטה שמתחילה‬
‫להתחלק עוד ועוד עד שנוצר עובר‪ .‬בעובר יש תאים בצורות שונות ‪ -‬מעל‬
‫‪ 1000‬סוגים שונים של תאים‪.‬‬
‫לכל התאים יש את אותה אינפורמציה גנטית ‪ -‬רצף הדנא בכל התאים זהה אז כיצד הם נראים ומתפקדים שונה?‬
‫מה שמכתיב פנוטיפ זה הגנטיקה והאפיגנטיקה‪:‬‬
‫• מודיפיקציות של ההיסטונים‪.‬‬
‫• מתילציה של הדנא ‪ -‬לכל תא יש דגם מתילציה ספציפי לו‪.‬‬

‫דגם המתיצליה לאורך ההתפתחות‪:‬‬

‫לזרע ולביצית יש דגם מתיצליה משלהם (לא זהה)‪ .‬בזרע‬
‫לדוגמא יש הרבה פחות ביטוי של גנים מאשר בביצית‪ ,‬לכן‬
‫הוא יהיה הרבה יותר ממותל‪.‬‬
‫כשיש הפרייה ונוצרת הזיגוטה ‪ -‬גם לה יש דגם מתיצליה‬
‫משלה‪ .‬הזיגוטה מתחילה להתחלק ונוצר בלאסטוציט‬
‫(תרום השרשה) שבו יש היפומתילציה‪ :‬יש דה‪-‬מתילציה‬
‫כמעט טוטאלית‪ ,‬מוחקים כמעט את כל המתילציות‪ ,‬את‬
‫ה"תכנות" שהיה לתא הקודם‪.‬‬
‫הבלאסטוציט ממשיך להתחלק ועובר השרשה‪.‬‬
‫לאחר מחיקת כל המתילציה עושים מתילציה‪-‬דה‪-‬נובו‪,‬‬
‫כלומר מתילציה כמעט טוטאלית (מלבד האזורים של ‪CPG‬‬
‫איילנד ‪ -‬יש חלבונים שמגנים עליו‪ .‬בנוסף ‪germ cells‬‬
‫שיוצרים את תאי המין נשארים לא ממותלים)‪.‬‬
‫השלב הבא זה התמיינות ‪ -‬כל תא צריך את המתילציה שלו‪ ,‬לכן השלב הבא יהיה דה‪-‬מתילציה ספציפית לכל סוג של‬
‫תא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫גרף ‪ -‬שינוי מתילציה בהתפתחות‪:‬‬

‫גרף נוסף‪:‬‬
‫עוקבים אחרי שני הגנומים (מהזרע ומהביצית) במהלך ההיריון‪.‬‬
‫כלומר מסתכלים על הזיגוטה מרגע ההפריה‪.‬‬
‫לפני ההשרשה יש דה‪-‬מתילציה‪.‬‬
‫לאחר ההשרשה יש מתילציה‪-‬דה‪-‬נובו‪.‬‬

‫‪Imprinted genes‬‬
‫יש שני סוגים של הורשה‪:‬‬
‫‪ - biallelic‬אלל אחד מהאם ואלל אחד מהאב ושניהם באים לידי ביטוי‪,‬‬
‫בהתאם לאלל הדומיננטי נראה פנוטיפ מסוים‪.‬‬
‫‪ - monoallelic‬אלל שרק האם יכולה להוריש אותו‪ ,‬אצל האב הגן הזה‬
‫מושתק‪ .‬האב מוריש את הגן אבל הוא לא יבוא לידי ביטוי‪ .‬זה גם יכול‬
‫להיות הפוך ‪ -‬האב יוריש ושל האם יהיה מושתק‪ .‬זה נקרא החתמה‪:‬‬
‫החתמה אימהית ‪ -‬רק האמא מורישה‪ .‬החתמה אבהית ‪ -‬רק האבא‬
‫מוריש‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Imprinting in nature‬‬
‫אם מזווגים בין חמור לסוסה נוצר ‪ Mule‬שנראה כמו חמור‪.‬‬
‫אם מזווגים בין סוס לאתון נוצר ‪ Hinny‬שנראה כמו סוס‪.‬‬
‫כלומר הצאצא תמיד יוצא דומה יותר לאבא‪ ,‬ישנה חשיבות לאיזה הורה מוריש מה‪.‬‬
‫עובדת בונוס ‪ -‬פרד לא יכול להביא צאצאים כי הכרומוזומים שלו לא הומולוגיים‪.‬‬

‫הסבר הסכמה‪:‬‬
‫גמטה זכרית (זרע) ונקבית (ביצית) שכל אחת מכילה את‬
‫הגנים ‪ A‬ו‪ .B‬כאשר הגן מסומן בכוכב זה אומר שהוא פעיל‪.‬‬
‫בזרע הכתמה אבהית ‪ -‬הגן ‪ B‬פעיל‪ .‬בביצית הוא מושתק‪.‬‬
‫בביצית הכתמה אמהית ‪ -‬הגן ‪ A‬פעיל‪ .‬בזרע הוא מושתק‪.‬‬
‫כך נוצר מצב שבביצית המופרת יש רק עותק אחד מכל גן ‪-‬‬
‫מאוזן לגמרי‪.‬‬
‫ב‪ germ cells‬המתיצליה נמחקת ונוצרת מחדש‪:‬‬
‫אם מדובר בזכר‪ :‬כשהוא ייצור את הגמטות שלו הוא יצטרך‬
‫להשתיק את ‪ A‬ולהפעיל את ‪ B‬בכרומוזום שירש מהאם ‪-‬‬
‫הכתמה אבהית‪.‬‬
‫אם מדובר בנקבה‪ :‬כשהיא תיצור את הגמטות שלה היא‬
‫תצטרך להשתיק את ‪ B‬ולהפעיל את ‪ A‬בכרומוזום שירשה מהאב ‪ -‬הכתמה אמהית‪.‬‬
‫זה מסביר את העקומה השחורה בגרף בעמוד הקודם ‪ -‬במהלך ההתמיינות ‪ B‬ו‪ A‬ישארו אותו דבר מבחינת מתיצליה‪.‬‬
‫איך שהעובר קיבל את זה ככה זה ישאר אצלו כל החיים‪ ,‬כשהוא ייצר את הזרע אז הוא כן ישנה את המתילציה‪.‬‬
‫זה גם מסביר למה זה לא אפשרי בתנאי מעבדה לקחת ביצית ‪ +‬ביצית ולהפרות בינהן ‪ -‬למרות שבשתיהן יש ‪n‬‬
‫כרומוזומים הביצית לא תתפתח מאחר וחסרה החתמה אבהית‪.‬‬

‫‪X Inactivation‬‬
‫ידוע שלנשים יש ‪ 2‬כרומוזומי ‪.X‬‬
‫כרומוזום ‪ X‬הינו מאוד גדול ויש בו הרבה גנים‬
‫שאינם קשורים למין‪ .‬הוא מכיל לדוגמא פקטור ‪-8‬‬
‫שאחראי על קרישה‪.‬‬
‫כדי שיהיה איזון בין הביטוי בנקבות ובזכרים יש‬
‫בנשים אינאקטיבציה של אחד מכרומוזומי ה‪.X‬‬
‫האינאקטיבציה היא רנדומלית ומתרחשת בשלבים‬
‫מוקדמים של ההתפתחות בעזרת מתילציה של‬
‫הכרומוזום‪.‬‬
‫ברגע שהכרומוזום עבר השתקה כך הוא יישאר‬
‫לנצח ‪ -‬בכל התאים שיוצרו ממנו דגם המתילציה‬
‫ישמר‪.‬‬
‫זה אומר שבממוצע ב‪ 50%‬מהתאים ה‪ X‬האימהי‬
‫מושתק וב‪ 50%-‬מהתאים ה‪ X‬האבהי מושתק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫המופיליה ‪ -‬מחלה שבה יש בעיה בקרישת הדם‪ .‬האם המחלה תופיע כאשר רק אלל אחד פגום?‬
‫אשה שהיא הטרוזיגוטית למוטציה בדר"כ לא תהיה חולה כי זה מספיק ש‪ 50‬אחוז מהתאים ייצרו פקטורי קרישה‬
‫בעוד ש‪ 50‬האחוז הנותרים לא יעבדו‪ .‬זה נקרא ‪.Mosaic‬‬
‫לעומת זאת גבר עם מוטציה בכרומוזם ‪ X‬בהכרח יהיה חולה מאחר ויש לו רק כרומוזום ‪ X‬אחד ‪ -‬אין דבר כזה‬
‫הטרוזיגוט כשמדובר על כרומוזום ‪.X‬‬

‫כיצד מתרחשת אינאקטיבציה של ‪?X‬‬

‫על ידי ‪.Xist - X inactive specific transcript‬‬
‫זהו ‪ RNA‬שמתיישב על כרומוזום ‪ X‬שממנו הוא נוצר‬
‫וכאשר הוא מתיישב עליו הוא מגייס את כל‬
‫הפקטורים שיגרמו לכרומוזום להיות בצורת‬
‫הטרוכרומטין‪ .‬הראשון שייצר ‪ Xist‬הוא זה שיעבור‬
‫אינאקטיבציה‪.‬‬

‫הערה‪ :‬לא כל הכרומוזום מושתק‪ ,‬בערך ‪ 99‬אחוז‬

‫ממנו‪ .‬איך יודעים את זה?‬
‫בתסמונת טרנר ‪ -‬יש לנשים רק כרומוזום ‪ X‬אחד‬
‫(‪ 45‬כרומוזומים)‪ .‬הנשים בריאות באופן כללי אולם‬
‫הן עקרות ויש להן עוד כל מיני פגמים‪.‬‬

‫‪Methylation during development‬‬

‫בשקופית ‪ -‬שוב סכמה שמתארת את השינוי במתילציה‪.‬‬
‫▪ לביצית ולזרע יש דגם מתילציה מסוים‪.‬‬
‫▪ בזיגוטה יש דגם מתילציה שהייתה בביצית ובזרע‪.‬‬
‫▪ ב‪ Pre implantation-‬אין שום מתילציה כי עשינו דה‬
‫מתילציה כללית‪.‬‬
‫▪ ב‪ Post implantation-‬עושים מתילציה דה נובו‬
‫גלובלית‪ .‬מי שעושה זאת הוא האנזים ‪- DNMT3‬‬
‫דנ"א מתיל טרנספראז‪ .‬הוא ממתל את הכל חוץ‬
‫ממה שמוגן מפני מתילציה ‪Housekeeping genes -‬‬
‫‪.CPG island -‬‬
‫▪ במהלך ההתמיינות לכל סוג תא יש דגם מתילציה‬
‫משלו‪ .‬ברגע שתא מקבל דגם מתילציה ספציפי הוא‬
‫ישמור עליה כאשר הוא יתחלק‪ .‬זה נקרא‪:‬‬
‫‪ Maintenance‬שלכך אחראי האנזים ‪.DNMT1‬‬
‫האנזים עושה מתילציה לגדיל החדש ע"י כך שהוא‬
‫מעתיק את דגם המתילציה שעל הגדיל הישן‪.‬‬
‫הערה‪ DNMT3 :‬מתבטא במהלך ההתפתחות העוברית לאחר ההשרשה לעומת זאת ‪ DNMT1‬מתבטא כל הזמן כי כל‬
‫הזמן יש תאים שמתחלקים‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Pre imprinting‬‬
‫משמאל ניתן לראות שלושה סוגי תאים‪ :‬תא שומן‪ ,‬תא‬
‫עור ותא היפופיזה‪.‬‬
‫ב‪ Pre imprinting‬כל הגנים לא ממותלים‪.‬‬
‫ב‪ Post imprinting‬תהיה מתילציה טוטאלית וכל הגנים‬
‫יהיו ממותלים מלבד ה‪ GpC islands‬שהם‬
‫‪ .Housekeeping genes‬לכן בטא אקטין לדוגמא לא‬
‫יהיה ממותל ‪ -‬הוא חשוב לבניית הציטוסקלטון שדרוש‬
‫בכל תא‪.‬‬
‫בתהליך ההתמיינות נפתחים הגנים הספציפיים‬
‫לרקמה‪ .‬מה שמוקף בכתום ‪ -‬עושים להם דה מתילציה‬
‫ספציפית לפי הרקמה אליה הם שייכים‪.‬‬

‫לא דיברה על זה אבל מעניין ‪ -‬כאשר העובר נוצר הוא‬

‫לא סימטרי ‪ -‬אין אחידות מבחינת החלבונים‪ .‬יש תלות‬
‫בחלבונים ובריכוזם והם יקבעו האם התא יתמיין לנוירון‪ ,‬תא שריר‪ ,‬עור וכו'‪.‬‬
‫יש אזורים מסוימים בגוף העובר שכל התאים שנמצאים בהם יתמיינו לאותו סוג תאים‪ .‬לדוגמא‪ :‬חלק יותר פנימי לתאי‬
‫עור‪ ,‬יותר חיצוני לנוירונים וכך הלאה לפי מיקומם בגוף העובר‪.‬‬

‫כשתא עובר מתילציה הוא הופך להיות סטבילי (יציב) ובעל דגם ביטוי קבוע לאורך כל הדורות של התא‪.‬‬
‫דוגמא לשם הבהרה‪ :‬פרולקטין הוא הורמון שגורם ליצירת החלב ובא לידי ביטוי בהיפופיזה‪.‬‬
‫אצל גברים הוא יהיה ממותל‪ .‬אבל מה לגבי אישה שאינה בהריון ולא מניקה‪ ,‬האם גם אצלה הוא ממותל?‬
‫התשובה היא שלא‪ .‬זה לא אומר שהוא מתבטא כל הזמן‪ ,‬אלא שיש לו את האופציה לבוא לידי ביטוי‪.‬‬
‫הרי מתי נקבע דגם המתילציה? בתקופה העוברית‪ .‬רק כשיש צורך גנים באים לידי ביטוי אך אם צריכה להיות להם‬
‫בכלל אופציה להיות מבוטאים הם חייבים להיות פתוחים‪ .‬לכן פרולקטין באישה תמיד יהיה פתוח אבל פקטורי השעוק‬
‫שיגרמו לו לבוא לידי ביטוי יווצרו רק בהריון‪.‬‬

‫רמת מתילציה‪:‬‬
‫כל פס מציין גן (ספציפי לרקמות מסוימות‪ .‬לא ‪ )CpG islands‬וכל טור מציין תא ‪.‬‬
‫▪ כחול ‪ -‬לא ממותל ‪ -‬לא מושתק‪.‬‬
‫▪ צהוב ‪ -‬ממותל מאוד ‪ -‬מושתק‪.‬‬
‫בביצית ‪ :‬ישנם גנים מושתקים וגנים שאינם מושתקים‪.‬‬
‫תא זרע‪ :‬יש לו דגם מתילציה משלו‪ .‬הוא יותר ממותל‬
‫מתא ביצית‪.‬‬
‫כאשר מגיעים לטור כחול כולו ישנה דה מתילציה‬
‫גלובלית ולאחר מכן הכל נהיה צהוב כי הכל ממותל‬
‫מלבד גנים ספציפיים‪.‬‬
‫הצהוב די שולט‪ ,‬אך מידי פעם יש כחולים ששונים בין‬
‫הטורים ‪ -‬תלוי בסוג התא‪ ,‬לדוגמא במוח יש יותר ביטוי‬
‫של גן מסוים מאשר בלב‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫סיכום המודיפיקציות‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Molecular Biology Methods‬‬

‫שיטות לזיהוי חלבון‬ ‫שיטות לזיהוי רנא‬ ‫שיטות לזיהוי דנא‬

‫‪Western Blot‬‬ ‫‪Northern Blot‬‬ ‫‪Southern Blot‬‬
‫‪PCR‬‬ ‫‪FISH‬‬
‫‪Microarray‬‬
‫‪PCR‬‬

‫‪Hybridization‬‬

‫השיטות מבוססות על שיטת היברידיזציה‪.‬‬

‫פותחים את הגדילים ע"י דנטורציה ‪ -‬מחממים אותם לטמפ' גבוהה ומתקבלים חד‪-‬גדילים‪.‬‬
‫ברגע שמקררים אותם מחדש כל מולקולה יודעת לזהות את הגדיל הקומפלמנטרי שלה ולהתחבר אליה ‪ -‬זה נקרא‬
‫היברידיזציה‪.‬‬

‫‪Southern/ Northern Blot‬‬

‫רוצים לדוגמא לראות האם יש חוסר בגן לאינסולין‪.‬‬
‫‪ ‬מפיקים דנא מהחולה‪.‬‬
‫‪ ‬חותכים אותו עם אנזים רסטריקציה ‪ -‬אנזים שיודע‬
‫לזהות רצף מסוים של ‪ 4-8‬נוקלאוטידים ולחתוך אותו‬
‫ספציפית‪ .‬נקבל סמיר (‪ - )Smear‬שברים של הדנ"א‬
‫בגדלים שונים‪.‬‬
‫‪ ‬נעשה דנטורציה ‪ -‬נפרק את הדנ"א לגדילים בודדים‬
‫(גם לרנ"א צריך לעשות דנטורציה מאחר והוא יוצר‬
‫מבניים פנימיים)‪.‬‬
‫‪ ‬נריץ את השברים על ג'ל (הדנ"א שלילי‪ ,‬מפעילים‬
‫מתח מצד חיובי לשלילי‪ ,‬הדנ"א ירוץ לחיובי כך‬
‫שמולקולות קטנות ירוצו יותר מהר מאשר הגדולות)‪.‬‬
‫‪ ‬נעביר את מה שהרצנו על הג'ל לממברנה מיוחדת‬
‫שנקראת מיקרוצלולוז (התהליך נקרא ‪.)blotting‬‬
‫‪ ‬היברידיזציה עם גלאי מסומן שספציפי למה שאנחנו מחפשים (הגלאי נקרא ‪ .)PROBE‬משתמשים בשני המקרים‬
‫בגדיל קומפלמנטרי של דנ"א‪.‬‬
‫הערה‪ :‬יש בעיה קטנה ‪ -‬בג'ל אי אפשר ליצור היברידיזציה‪ ,‬הגדילים לא יתחברו‪ .‬לכן צריך להעביר את הדנ"א שבג'ל‬
‫לממברנה מיוחדת ששם אפשר לעשות את ההיברידיזציה‪.‬‬
‫הערה נוספת ‪ :‬התהליך כמעט זהה ברנ"א‪ ,‬ההבדל היחיד הוא שאת הרנא לא צריך לחתוך למקטעים מאחר והוא גם‬
‫ככה לא גדול‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫התהליך‪:‬‬

‫תוצאות הבדיקה‪:‬‬
‫עוצמת הבנד מעידה על כמות הדנ"א‪/‬רנ"א (בפועל רואים את האדום בתמונה‪ .‬הירוק סתם להמחשה)‪.‬‬
‫• חוסר של הגן ‪ -‬לא נראה בכלל ‪ RNA‬וגם לא ‪.DNA‬‬
‫• מוטציה נקודתית ‪ -‬החלבון לא יהיה פונקציונאלי אבל מבחינת הבדיקה הדנ"א והרנ"א יראו תקינים‪.‬‬
‫• מוטציה שגורמת ליצירת סטופ קודון ‪ -‬דנ"א ורנ"א יראו תקינים (קודונים משפיעים על תרגום! החלבון לא יהיה‬
‫פונקציונאלי אבל מבחינת הדנ"א והרנ"א לא תהיה בעיה)‪.‬‬

‫‪FISH - Fluorescence In situ Hybridization‬‬

‫כשרוצים לעשות את הבדיקה בתא עצמו‪.‬‬
‫עושים קיבוע לתאים‪.‬‬
‫עושים דנטורציה לדנ"א (אבל הוא נשאר בגרעין)‪.‬‬
‫מכניסים גלאי ‪ -‬גן מסומן לגרעין והוא יתחבר לקטע המתאים‬
‫בדנא‪ .‬נצטרך גלאי גדול יחסית כי הכרומוזום גדול‪.‬‬
‫בעזרת השיטה הזאת ניתן‪:‬‬
‫לראות קטע בכרומוזום או אפילו מקטע שלם בעיניים‪.‬‬ ‫▪‬
‫לזהות הפרעות בכרומוזום‪.‬‬ ‫▪‬
‫למפות גנים ולפענח את המבנה‪.‬‬ ‫▪‬
‫כבר נתקלו בשיטה הזאת‪ ,‬תזכורת‪:‬‬

‫שתי נקודות בסכ"ה ‪ -‬שני האללים של הגן‪.‬‬

‫ארבע נקודות בסכ"ה ‪ -‬שני האללים של הגן שעברו הכפלה‪.‬‬
‫שלוש נקודות בסכ"ה ‪ -‬אלל אחד עבר הכפלה לפני האלל השני‪.‬יכול‬
‫לקרות בשני מצבים‪ :‬גן על כרומוזום איקס (אחד מושתק) או החתמה‬
‫של הגן (‪.)imprinting‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪DNA MICROARRAY‬‬
‫קונים צ'יפים מוכנים עם חורים‪ .‬מראש יש בכל‬
‫חור גנים שונים (אנחנו בוחרים איזה גנים אנחנו‬
‫רוצים)‪.‬‬
‫רוצים לדוגמא לבדוק מה השתנה בביטוי הגנים‬
‫בתא סרטני לעומת תא רגיל‪.‬‬
‫מפיקים משני סוגי התאים רנ"א‪ ,‬הופכים אותו‬
‫לדנ"א ומסמנים אותו בחומר פלוריסנצי‪:‬‬
‫תא נורמאלי ‪ -‬נסמן בירוק‪.‬‬
‫תא סרטני ‪ -‬נסמן באדום‪.‬‬
‫זורקים את כל הדנ"א על הצ'יפ ולפי הצבע נוכל‬
‫לדעת איזה גן מתבטא באיזה תא‪:‬‬
‫ירוק ‪ -‬מתבטא בעיקר בתאים נורמאליים‪.‬‬
‫אדום ‪ -‬מתבטא בעיקר בתאים סרטניים‪.‬‬
‫צהוב ‪ -‬מתבטא בשני התאים‪.‬‬
‫שחור ‪ -‬לא מתבטא באף תא‪.‬‬

‫‪Western Blot‬‬
‫שיטה לזיהוי חלבונים‪.‬‬
‫בניגוד לחלבונים‪ ,‬דנ"א ורנ"א תמיד טעונים שלילית‪ .‬בנוסף יש יחס ישיר בין המטען לגודל שלהם ‪ -‬ככל שהמולקולה‬
‫יותר גדולה המטען יותר שלילי ולכן כשנריץ בג'ל עם אלקטרודות המולקולות ירוצו לפי הגודל‪.‬‬
‫בחלבונים זה לא ככה‪ .‬לחומצות אמינו שונות יש מטענים שונים והחלבון יכול להיות נטרלי‪ ,‬טעון שלילית או טעון‬
‫חיובית‪ .‬בנוסף המבנה המרחבי משתנה מחלבון לחלבון והוא לא בהכרח מעיד על גודל החלבון (=מספר חומצות‬
‫האמינו)‪ .‬לפיכך התנהגות החלבונים על הג'ל תהיה בלתי צפויה‪.‬‬
‫על מנת לוודא שההרצה שלהם תהיה על פי הגודל עושים עליהם כמה מניפולציות‪:‬‬
‫▪ דנטורציה‪ .‬נעשה על ידי הרתחה‪ ,‬חומר מחזר בשם ‪ β-ME‬הפותח קשרים די סולפידיים וחומר נוסף הנקרא ‪- SDS‬‬
‫בעל זנב הידרופובי ארוך בקצה אחד ומלח בקצה האחר‪ .‬פותח קשרים יונים במולקולה‪ .‬בסופו של דבר החלבונים‬
‫יתפרקו למבנה הראשוני שלהם‪.‬‬
‫▪ הטענת החלבון במטען שלילי‪ SDS .‬אחראי גם על החלק הזה ‪ -‬מטעין את המולקולה במטען שלילי מאוד חזק‪.‬‬
‫הזנב ייקשר לחלבון בקשרי ואן‪-‬דר‪-‬ואלס‪ .‬הוא ייקשר פרופורציונאלית לגודל של החלבון ‪ -‬ככה שהחלבון יותר גדול‪,‬‬
‫יש לו יותר חומצות אמינו ויותר ‪ SDS‬ייקשר אליו‪( .‬המטען הטבעי של החלבון הופך להיות זניח)‪.‬‬
‫לאחר הדנטורציה וההטענה במטען שלילי‬
‫חזק החלבונים ירוצו על הג'ל לפי הגודל‪.‬‬
‫חלבונים קטנים ירוצו מהר‪ ,‬לאחר מכן‬
‫בינוניים ואז גדולים‪.‬‬
‫ואז כמו בדנ"א ורנ"א נעשה ‪blotting‬‬
‫(נעביר לממברנה מיוחדת)‪.‬‬
‫גודל החלבון ייתן לנו מושג כלשהו לגבי‬
‫זהות החלבון אולם זה לא מספיק ולכן‬
‫נשתמש בנוגדנים מסומנים כגלאי‪.‬‬
‫הערה‪ :‬הנוגדן מזהה רצף מאוד קטן בחלבון ולכן הוא יוכל לזהות את החלבון למרות שעבר דנטורציה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫סיכומון‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪PCR - Polymerase Chain Reaction‬‬

‫בעזרת השיטה הזאת ניתן להכין מיליארדי עותקים של גן מסוים שבחרנו (צריך לדעת מהו הרצף ההתחלתי של הגן)‪.‬‬
‫מה דרוש לשכפול הדנ"א במעבדה?‬
‫תבנית של דנ"א‪.‬‬ ‫▪‬
‫אמצעי לפתיחת הדנ"א ‪ -‬דנטורציה על ידי חימום (בתחילת כל מחזור צריך לחמם כדי לפתוח את הקשרים שנוצרו‬ ‫▪‬
‫ואז להוריד את הטמפ' כדי שהפריימרים יוכלו להיקשר)‪.‬‬
‫‪ 2‬פריימרים באורך של ‪ 16-26‬בסיסים‪ .‬ככל שהפריימר יותר ארוך כך הוא יותר ספציפי (ויותר יקר)‪.‬‬ ‫▪‬
‫נוקלאוטידים של דנ"א ‪.dNTP's -‬‬ ‫▪‬
‫‪ 2‬דנ"א פולימראז‪ .‬משתמשים בסוג מיוחד שנקרא ‪ .Taq‬אלו פולימראזות שהטמפ' האופטימלית עבורם היא ‪72‬‬ ‫▪‬
‫מעלות‪ ,‬לכן כאשר מחממים את הדנ"א כדי לפתוח אותו לא צריך לדאוג מהרס האנזים (הוא לא יעבוד בטמפ' של‬
‫‪ 95‬מעלות אבל גם לא יעבור דנטורציה ולכן לא נצטרך להוסיף רנ"א פולימראז חדש)‪.‬‬
‫בופר לפעילות האנזים וקו פקטור של מגנזיום‪.‬‬ ‫▪‬
‫התהליך‪:‬‬
‫‪ .1‬שלב ראשון ‪:Denature DNA -‬‬
‫פותחים את הדנ"א בעזרת חימום בטמפ' של ‪ 95‬מעלות‪.‬‬
‫‪ .2‬שלב שני ‪:Primers Anneal -‬‬
‫מוסיפים שני פריימרים (לשני הגדילים)‪ ,‬שני פולימראזות ואת כל הנוקלאוטידים הדרושים‪.‬‬
‫מורידים את הטמפ' ל‪ 40-65‬מעלות על מנת לאפשר לפריימרים להיקשר לדנ"א‪.‬‬
‫‪ .3‬שלב שלישי ‪:Extension -‬‬
‫מעלים מעט את הטמפ' ל‪ 72‬מעלות (הזכרנו שזאת הטמפ' המיטבית עבור האנזים) והדנ"א פולימראז מסנתז‬
‫דנ"א חדש‪ .‬הערה‪ :‬לא מוסיפים סליידינג כלאמפ ולכן אין לו פרוססיביות גבוהה והוא יסנתז מקטעים קצרים יחסית‬
‫(נקבל גדילים מספיק ארוכים המכילים את הגן הרצוי)‪.‬‬
‫וכך חוזרים על הפעולה שוב ושוב‪ ,‬בדר"כ כ‪ 30-40‬מחזורים‪ .‬בכל מחזור מספר התבניות שנוצרות גדל בצורה‬
‫מעריכית‪ .‬מספר ה‪ 2 = templates‬בחזקת מספר המחזורים שעשינו‪.‬‬
‫הערה חשובה‪ :‬החל מהמחזור השלישי מקבלים את מה שאנחנו רוצים ‪ -‬מקטע דו גדילי של הגן‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫הרחבה על הפריימרים‪:‬‬

‫בגוף יש פריימרים של רנ"א‪ ,‬אולם במעבדה אפשר להשתמש בפריימרים של דנ"א‪.‬‬

‫הפריימרים צריכים להיות בגודל של ‪ 16-26‬נוקליאוטידים‪.‬‬
‫הסיבות לכך הם‪:‬‬
‫▪ עלות ‪ -‬קונים את הפריימרים מחברות מסוימות‪ .‬ככל שהפריימר יותר ארוך כך המחיר שלו יותר גבוה‪.‬‬
‫▪ ספציפיות ‪ -‬גודל של ‪ 16‬נוקליאוטידים עד ‪ 26‬נוקליאוטידים מאפשר לנו את הספציפיות הנדרשת כדי שהפריימר‬
‫יקשר לרצף שאנו צריכים‪ .‬ככל שהפריימר ארוך יותר כך הוא ספציפי יותר‪.‬‬

‫‪:Amplification‬‬

‫כמות המולקולות בכל מחזור גדלה פי ‪ - 2‬כלומר מדובר בגידול מעריכי‪.‬‬

‫לדוגמא‪ :‬עבור מולקולת דנ"א אחת שתעבור ‪ 5‬מחזורים נקבל ‪ 25‬מולקולות דנ"א ‪ -‬כלומר פי ‪.32‬‬
‫אם התחלנו עם ‪ 10‬מולקולות דנ"א אחרי ‪ 5‬מחזורים יהיו לנו ‪.320‬‬
‫מספר המולקולות הארוכות שנוצרות בכל מחזור אינו גדל בצורה מעריכית מאחר והמקור נשאר מולקולה אחת‪ .‬לכן‬
‫המספר יגדל בצורה לינארית ‪ -‬בכל מחזור מוסיפים ‪ .2‬אז לדוגמא לאחר ‪ 5‬מחזורים יהיו ‪ 10‬מולקולות ארוכות (‪.)2*5‬‬
‫לכן מספר המולקולות שאנחנו רוצים בתכלס יהיה ‪ 25‬פחות ‪ 10‬עבור הדוגמא הנ"ל‪.‬‬
‫ככל שמספר המחזורים עולה כמות מולקולות הדנ"א הארוכות נהיה זניח לעומת כמות המקטעים הרצויים‪.‬‬

‫סרטון שממחיש את התהליך‪ :‬תלחצו עלי‬

‫בדיקת תוצר ה‪:PCR‬‬

‫מריצים את תוצרי ה‪ PCR -‬על ג'ל של ‪ DNA‬שבנוי‬
‫מאגרוז‪ .‬בצד אחד שמים אלקטרודה שלילית‬
‫ובשני אלקטרודה חיובית‪.‬‬
‫הדנ"א טעון שלילית ולכן ירוץ לכיוון האלקטרודה‬
‫החיובית‪ .‬היות ויש מעין רשת בג'ל הדנ"א ירוץ לפי‬
‫הגודל ‪ -‬המולקולות הקטנות ירוצו מהר יותר‪.‬‬
‫לאחר שמסיימים להריץ את הג'ל שמים את הג'ל‬
‫תחת אור ‪ UV‬ומוסיפים חומר פלורסנטי בשם‬
‫‪ Ethidium Bromide‬שנכנס בין הגדילים של‬
‫הדנ"א וזוהר בתגובה ל‪.UV‬‬
‫לאחר מכן נוכל לראות פסים זוהרים ‪ -‬ככל שהבנד‬
‫יותד חזק ככה ריכוז התוצר שהתקבל יותר גבוה‪.‬‬
‫לפעמים נוכל לראות גם בנד של הגדיל המקורי‬
‫(אם הוא בריכוז מספיק גבוה)‪.‬‬
‫אם רואים מספר בנדים כנראה שהפריימרים נקשרו לדנ"א באופן לא ספציפי‪ .‬במצב כזה נצטרך לשנות את טמפ' ה‪-‬‬
‫‪.Annealing‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫רגישות השיטה‬
‫אפשר להשתמש ב‪ PCR‬לצורך כימות הדנ"א ההתחלתי‬
‫‪ -‬נוכל לראות מה עוצמת הבנד שהתקבל‪.‬‬
‫אולם יש חסרון לשיטה ‪ -‬היא לא מאוד רגישה‪:‬‬
‫עבור כמות קטנה מידי ‪ .Undetectable -‬לא נוכל‬
‫להבחין בבנד‪ ,‬לא נראה כלום‪.‬‬
‫עבור כמות גדולה מידי ‪ .Plateau -‬לא נצליח להבחין‬
‫האם בשתי דגימות יש כמות שונה‪ ,‬שני הבנדים יראו‬
‫אותו הדבר‪.‬‬
‫כלומר אפשר להבחין בהבדל בכמויות בריכוזים בינונים‪,‬‬
‫עבור האזור הלינארי‪.‬‬
‫אנחנו לא יכולים לדעת בוודאות כמה מחזורים של ‪ PCR‬דרושים כדי להגיע לאזור הלינארי‪ .‬הסיבה לכך היא שאנחנו‬
‫לא יודעים מה היא כמות הדנ"א ההתחלתית‪.‬‬
‫הפתרון לכך הוא עבודה בשיטת ניסוי וטעייה ‪ -‬מתחילים במספר מחזורים קטן עד שמגיעים לאזור שניתן לראות‪.‬‬

‫‪Real Time PCR = qPCR‬‬

‫שיטה לכימות התוצר שהתקבל (שממנו ניתן להסיק את‬
‫כמות הדנ"א ההתחלתית)‪ .‬לא נשתמש בשיטה זו כדי לדעת‬
‫אם יש או אין תוצר ‪ -‬אפשר לבדוק את זה ב‪ PCR‬רגיל‪.‬‬
‫בשיטה הזאת נעזרים במחשב ‪ -‬לאחר כל מחזור המערכת‬
‫בודקת מה ריכוז הדנ"א במבחנה‪ .‬עושים זאת ע"י הוספת‬
‫ריאגנט פלורסנטי למבחנה ולאחר כל מחזור המחשב מצלם‬
‫את כמות הפלורסנציה‪.‬‬

‫חומרים פלורסנטים שאיתם עובדים‪:‬‬

‫‪ - SYBR green‬חומר שזוהר רק כאשר עובר אינטרקלציה לדנ"א דו גדילי‬ ‫▪‬
‫(נקשר אליו)‪ .‬ככל שיש יותר דנ"א ‪ ‬יותר חומר ייקשר אליו ‪ ‬הפלורסנציה‬
‫תהיה יותר גדולה‪ .‬הערה‪ :‬החומר הזה אינו ספסציפי! נקשר לכל דנ"א דו‬
‫גדילי‪.‬‬
‫‪ - Taqman Probe‬גלאי ספציפי לדנ"א שאותו אנחנו רוצים להרבות‪ .‬בגלל‬ ‫▪‬
‫שהוא ספציפי הוא הרבה יותר יקר מה‪ .SYBR‬מולקולות דנ"א קצרה שלשני‬
‫הקצוות שלה מצומדים חומרים‪:‬‬
‫בקצה ‪ ,)Reporter fluorophore( R - '5‬חומר פלורסנטי שכשמקרינים אותו‬
‫באורך גל מסוים האלקטרונים שלו עולים רמה‪ .‬בסופו של דבר האלקטרונים‬
‫יורדים ברמה (מאבד אנרגיה) אבל לא חזרה להתחלה‪ .‬לכן הוא יפלוט אור‬
‫באורך גל ארוך יותר (ככל שאורך הגל יותר קצר כך האנרגיה יותר גדולה)‪.‬‬
‫לכן אם לדוגמא הקרנו אותו באורך גל של ‪ 430‬הוא יחזיר אורך גל ארוך יותר ממה שהקרנו‬
‫‪ -‬נגיד ‪.510‬‬
‫בקצה ‪ ,)Quencher fluorophore( Q - '3‬חומר שבולע את אורך הגל ש‪ R‬הקרין ולכן לא‬
‫נראה כלום‪ .‬הוא מבטל את הפלורסנציה של ‪ .R‬הוא עובד רק כאשר ‪ R‬נמצא בסמוך אליו‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫התהליך‪:‬‬
‫הגלאי יושב על הגן‪ .‬לא נראה פלורסנציה‪ Q .‬ו‪ R‬יושבים אחד ליד השני‬
‫כך ש‪ Q‬מבטל את הפלורסנציה של ‪.R‬‬
‫כאשר ‪ Taq‬עושה ‪ Extension‬תוך כדי הוספת נוקלאוטידים לגדיל החדש‬
‫הוא חותך את הגלאי הזה (יש ל‪ Taq‬תכונות של ‪ Exonuclease‬מ‪ 5‬ל‪.)3‬‬
‫ע"י החיתוך הוא בעצם משחרר את ‪ R‬ומרחיק אותו מ‪ .Q‬לכן תהיה‬
‫פלורסנציה רק כאשר רנ"א פולימראז יסנתז את הדנא הספציפי שאנחנו‬
‫רוצים‪ .‬ככל שיותר ‪ Taqman Probe‬נחתכים ככה הפלורסנציה תהיה‬
‫חזקה יותר‪.‬‬

‫הערות‪:‬‬
‫ב‪ PCR-‬רגיל ניתן לזהות אם ישנה חוסר ספציפיות על ידי כך שנקבל‬ ‫▪‬
‫יותר משני ‪ .Bands‬לעומת זאת ב‪ qPCR-‬אין ‪ ,bands‬רואים רק רמת‬
‫פלורסנציה ולכן לא נוכל להבחין בחוסר ספציפיות )‪Taqman Probe‬‬
‫הוא מאוד ספציפי ונקשר רק לגן שנבדק ולא למקטע אחר אז כך‬
‫ניתן לדוגמא להגדיל את הספציפיות)‬
‫‪ PCR‬רגיל נעשה כדי להשתמש בתוצר של ה‪ .PCR‬נגיד אם אנחנו רוצים לייצר מלא גנים של אינסולין כדי להכניס‬ ‫▪‬
‫אותו לחיידקים‪ .‬לעומת זאת ‪ PCR real time‬נעשה רק כשנרצה לכמת דנא‪.‬‬
‫ההשוואה היא לאותו הגן ולא לגנים שונים‪.‬‬ ‫▪‬

‫פענוח התוצאות‪:‬‬
‫משמאל זה הגרף שמתקבל לאחר ‪ 40‬מחזורים ‪ -‬המחשב בודק‬
‫את כמות הפלורסנציה לאחר כל מחזור‪.‬‬
‫ציר ‪ - X‬כמות מחזורים‪.‬‬
‫ציר ‪ - Y‬כמות פלורסנציה‪.‬‬
‫ניתן לראות שמתחת ל‪ 20‬מחזורים המכשיר לא מספיק רגיש ‪-‬‬
‫טווח ה‪ .Undetectable -‬בנוסף החל ממחזור ‪ 30‬בערך זהו שלב‬
‫ה‪ - Plateau‬המחשב כבר לא מסוגל לזהות שינוי בפלורסנציה‪.‬‬

‫נעשה ‪ qPCR‬לשלוש דוגמאות שבכל אחת כמות הדנ"א‬

‫התחלתית שונה‪ .‬נרצה לדעת מה היחס בין הכמויות‪.‬‬
‫בגרף רואים ‪ 3‬עקומות ‪ -‬כל אחת מתארת דוגמא‪.‬‬
‫נבחר רמת פלורסנציה כלשהי (מסומן בריבוע)‪ .‬נשים לב‬
‫שהבחירה שרירותית אולם היא צריכה להיות באזור הלינארי‪.‬‬
‫כאשר רמת הפלורסנציה זהה בכל המבחנות זה אומר שגם‬
‫כמות הדנ"א זהה (כי רמת הפלורסנציה מעידה על כמות הדנ"א‬
‫באותו הרגע)‪.‬‬
‫בודקים כמה מחזורים הייתה צריכה לעבור כל דוגמא כדי להגיע‬
‫אל רמת הפלור' הזאת ‪ -‬לפי זה נוכל לדעת באיזה מבחנה היה‬
‫יותר דנ"א התחלתי‪.‬‬
‫‪ ‬אז בגרף ניתן לראות שהדוגמא הירוקה עברה הכי פחות מחזורים כדי להגיע לרמה הזאת ולכן בה היה הכי הרבה‬
‫דנ"א התחלתי‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מדידת כמות דנ"א לפי הגרף‪:‬‬

‫המדידה נעשת ע"י מדד שנקרא ‪.Ct Value‬‬
‫המדד הזה מתאר באיזה מחזור הגיעו לסף שהוחלט‬
‫(‪ .(threshold line‬כמו שאמרנו בעמוד קודם ‪ -‬מדובר בסף‬
‫שרירותי‪ ,‬העיקר שיהיה באזור הלינארי‪.‬‬
‫כמה דנ"א יש אחרי ‪ Ct‬מחזורים? ‪ 2Ct‬כפול הכמות‬
‫ההתחלתית של הדנ"א במבחנה‪.‬‬
‫אולם אנחנו לא ידועים מה הייתה הכמות ההתחלתית ולכן‬
‫לא נוכל לדעת כמה דנ"א יש‪.‬‬
‫מה שכן נוכל לדעת זה היחס בין הכמויות ‪ -‬ככל שה‪ Ct‬נמוך‬
‫יותר יש יותר ‪ DNA‬התחלתי‪.‬‬

‫נחזור לדוגמא מהעמוד הקודם‪:‬‬

‫ניסיון להסביר את החישוב‪:‬‬

‫נגיד אנחנו רוצים לדעת מה היחס בין הדגימה הירוקה לדגימה הכחולה‪ .‬אז באופן רגיל היינו צריכים לעשות‪:‬‬
‫ירוק‬ ‫‪223‬‬
‫=‬ ‫=‬ ‫‪223-28 = 2-5‬‬
‫כחול‬ ‫‪228‬‬

‫אבל! בגלל שהיחס פה הפוך‪ ,‬כלומר ככל שמספר המחזורים יותר גבוה כך כמות הדנ"א ההתחלתי נמוכה ‪ -‬צריך לשים‬
‫מינוס לפני החישוב‪.‬‬
‫כלומר‪:‬‬
‫‪2-(23-28) = 25‬‬
‫ועכשיו זה מסתדר‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Reversed transcription PCR = RT-PCR‬‬

‫לפעמים רוצים לעשות כימות של הרנ"א בתוך התאים‪ .‬לדוגמא כאשר רוצים לבדוק את רמת‬
‫הביטוי של גן מסוים בתא סרטני לעומת תא נורמאלי‪.‬‬
‫אי אפשר לכמת את מולקולות הרנ"א ‪ -‬צריך להפוך אותם לדנ"א‪ .‬לשם כך משתמשים באנזים‬
‫‪ Reverse Transcriptas‬שיהפוך ‪ mRNA‬ל‪( cDNA‬דנ"א קומפלימנטרי‪ .‬צריך לזכור שהוא אינו‬
‫דומה לדנ"א שיש בגנום‪ ,‬אין לו אינטרונים ואזורי בקרה ‪ -‬מכיל רק אקסונים)‪ .‬ל‪ cDNA‬נעשה‬
‫‪ qPCR‬כרגיל‪.‬‬
‫התהליך‪:‬‬
‫‪ .1‬שלב ראשון ‪ :Reverse Transcription -‬לשלב הזה נחוץ אנזים ‪ .DNA polymerase RNA dependent‬אמרנו שכל‬
‫דנ"א פולימראז חייב פריימר כדי להתחיל לסנתז‪ .‬יש כמה סוגי פריימרים שאיתם עובדים‪:‬‬
‫▪ פריימר רנדומלי ‪ -‬זהו פריימר קצר שיכול להיקשר לכל מקום‪ ,‬כלומר הוא ממש לא ספציפי‪.‬‬
‫▪ פריימר ספציפי ‪ -‬פריימר שייקשר בדיוק לגן שאותו אנחנו מחפשים‪ .‬נגיד אם נרצה לדעת כמה אינסולין בא‬
‫לידי ביטוי בתאים‪.‬‬
‫▪ פריימר של פולי ‪ - T‬גם הוא פריימר לא ספציפי ‪ -‬ייקשר לזנב הפולי ‪ A‬שנמצא בקצה ‪ '3‬של ה‪.mRNA‬‬
‫בדר" נעדיף פריימר לא ספציפי ‪ -‬נעביר את כל מולקולות ה‪ mRNA‬שיש לנו ל‪ cDNA‬כדי שנוכל להשתמש בהם‬
‫במקרה הצורך במקום שוב לחזור על התהליך‪ .‬את הסלקציה נעשה ממולקולות ה‪ - cDNA‬נשים רק פריימרים‬
‫למה שאנחנו רוצים‪.‬‬
‫‪ .2‬שלב שני ‪:PCR -‬‬
‫‪ qPCR‬רגיל כמו שראינו קודם רק שהפעם מתחילים מדנ"א חד גדילי‪ ,‬לכן במחזור הראשון יווצר דנ"א דו גדילי‬
‫ומהסיבוב השני תהיה אמפליפיקציה (אז נגיד אחרי ‪ 30‬מחזורים כמות הדנ"א תהיה ‪.)229‬‬
‫בשלב הזה צריך להוסיף פריימרים ספציפים לגן שאנחנו מחפשים (צריך להוסיף פריימרים של שני הגדילים‬
‫למרות שהתחלנו רק עם גדיל אחד)‪.‬‬
‫הערה‪ :‬יכול להיות מצב שהדגימה שלנו "מזוהמת" בדנ"א גנומי‪ .‬כלומר יש נוכחות של דנ"א מהגנום שגם הוא‬
‫ישתכפל ולכן זה ישבש לנו את הנתונים‪ .‬כדי להתגבר על זה צריך לשים פריימרים על שני אקסונים רחוקים או על‬
‫נקודת חיבור בין שני אקסונים‪ .‬שימו לב שמה שכתוב במצגת זה טעות ‪ -‬נקודת חיבור בין אקסון לאינטרון תתן רק‬
‫תוצאה של דנ"א ולא של רנ"א‪ .‬מה עוד לא נעשה? לא נשים את הפריימרים על אותו האקסון ‪ -‬מאחר ואז ישתכפל‬
‫גם ה‪ cDNA‬וגם הדנ"א הגנומי‪.‬‬
‫דוגמא לזיהום דנ"א‪:‬‬
‫אנו רוצים לבדוק פי כמה גן מסוים בא לידי ביטוי במוח לעומת הכבד‪.‬‬
‫הנתונים שהתקבלו‪:‬‬
‫‪)2‬‬ ‫לפי החישוב שלמדנו גן ‪ X‬בא לידי ביטוי במוח פי ‪( 2‬‬
‫)‪-(18-23‬‬ ‫‪5‬‬

‫אולם יש בעיה ‪ -‬יכול להיות שלקחנו בכל דגימה כמות שונה של תאים מכל אחד מהאיברים‪ ,‬או שבאחד מהם היה‬
‫זיהום של דנ"א שלא ידענו עליו‪ .‬כלומר קיים סיכוי רב שהתוצאה שקיבלנו שגויה‪.‬‬
‫כדי להתגבר על חוסר הוודאות צריך לבדוק רפרנס נוסף שאליו נוכל להשוות את התוצאות שקיבלו‪ .‬אפשר להשתמש‬
‫לדוגמא ב‪ HKG - Housekeeping gene‬שהביטוי שלו לא משתנה מתא לתא‪.‬‬
‫הנתונים שהתקבלו‪:‬‬
‫‪.)2‬‬ ‫לפי החישוב הפעם גן של ‪ HKG‬בא לידי ביטוי במוח פי ‪( 2‬‬
‫)‪-(20-24‬‬ ‫‪4‬‬

‫כלומר אכן הייתה בעיה בבדיקה ‪ -‬הכמות של הגן הייתה צריכה להיות זהה‬
‫במקרה הזה בשני התאים‪ ,‬לכן ניתן להסיק שלקחנו פי ‪ 24‬יותר תאים מהמוח מאשר מהכבד‪.‬‬
‫לכן כל מה שנדרש לעשות כעת כדי לקבל את התוצאה האמיתית זה לחלק את התוצאה שקיבלנו עבור גן ‪ X‬ביחס‬
‫עבור מספר התאים ההתחלתי‪:‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪( From DNA to protein‬מרצה חדש)‬

‫כיצד תאים קוראים את הגנום? כיצד התא קורא את הגנום על מנת שיוכל ממנו ליצור את החלבונים?‬
‫▪ שעתוק‪/‬תעתוק‪ :‬זהו התהליך בו נוצרת מולקולת ה‪ RNA-‬על סמך ה‪.DNA-‬‬
‫▪ תרגום‪ :‬מעבר מ‪ RNA‬לחלבון‪.‬‬
‫▪ שליטה בביטוי גנים ‪ -‬מספר שלבי בקרה לאורך המעבר מ‪ DNA‬ל‪ RNA‬ולחלבון‪.‬‬

‫‪The central dogma‬‬

‫הדוגמה של מעבר אינפורמציה בתוך התא‪.‬‬
‫הדנ"א עובר שכפול או עובר שעתוק ויוצר את הרנ"א‪.‬‬
‫המחשבה הייתה שכל הרנ"א עובר תרגום ויוצר חלבון‪ ,‬היום יודעים‬
‫שחלק נכבד מהרנ"א אינו עובר תהליך של תרגום‪ ,‬אלא מבצע את‬
‫פעילותו כמולקולת רנ"א‪.‬‬

‫מולקולת הדנ"א מורכבת מסליל כפול ובעל כיווניות ‪ -‬גדיל אחד‬

‫מכיוון ‪ 5‬ל‪ 3-‬והגדיל השני בכיוון ההפוך‪.‬‬
‫תהליך השעתוק הוא יצירת מולקולת ‪ RNA‬על בסיס גדיל‬
‫ה‪ .DNA‬מולקולת ה‪ RNA‬היא חד גדילית והיא מהווה את‬
‫התבנית ליצירת חומצות האמינו‪.‬‬
‫‪ ‬למה צריך את ה‪ RNA‬ומדוע לא ניתן לעבור ישירות מ‪DNA‬‬
‫לחלבון?‬
‫זהו שלב שמאפשר בקרה‪ :‬הגברה‪ - Splicing ,‬ניתן לחתוך את‬
‫הרנ"א שכך שמאותו הגן ייווצרו הרבה חלבונים שונים‪ ,‬הרנ"א‬
‫מאפשר לקחת את האינפורמציה מהגרעין החוצה‬
‫לציטופלסמה לתהליך התרגום‪.‬‬

‫יכול להיות גן מסוים שהשעתוק שלו יהיה מהיר וזה יאפשר‬

‫לתרגם אותו מהר יותר ולקבל הרבה יותר מהחלבון‪ .‬ויכול להיות‬
‫מצב הפוך ‪ -‬גן שהוא בעל שעתוק איטי‪ ,‬יתקבלו פחות תוצרי‬
‫‪ RNA‬ולכן פחות חלבון‪ .‬כלומר זה מאפשר בקרה נוספת על ביטוי‬
‫הגנים‪.‬‬
‫הבקרה יכולה להיות בכל שלב בתהליך‪ :‬בשעתוק (איטי\מהיר‬
‫נגיד כתלות בפרומוטור ‪ -‬אם הוא עובד חזק או לא)‪ ,‬בתהליך‬
‫התרגום (יכול להיות יעיל\ לא יעיל)‪ ,‬בשלב היציאה מהגרעין‪,‬‬
‫בפירוק החלבונים שנוצרו‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מולקולות ה‪:RNA‬‬
‫בדומה לדנ"א‪:‬‬
‫רנ"א הינו פולימר שמורכב מנוקלאוטידים‪.‬‬
‫הנוקלאוטיד מורכב מ‪ :‬בסיס‪ ,‬סוכר (ריבוז)‪ ,‬פוספט‪.‬‬
‫הבסיס נקשר לפחמן מספר ‪ 1‬בסוכר והפוספט נקשר לפחמן מספר ‪.5‬‬
‫החיבור בין שני נוקלאוטידים הינו בקשר פוספודיאסטרי‪.‬‬
‫בשונה מדנ"א‪:‬‬
‫ברנ"א בעמדה מס ‪ 2‬יש קבוצת ‪ OH‬ואילו בדנ"א יש ‪.H‬‬
‫ברנ"א יש בסיס אורציל ‪ U‬במקום טימין ‪.T‬‬

‫‪ RNA‬היא מולקולה פחות יציבה מה‪ .DNA -‬ה‪ OH‬בעמדה ‪ 2‬משפיע על הקיפול של הריבוז ‪ -‬הוא‬
‫מוסיף נפח וגורם למולקולת ה‪ RNA -‬להיות פחות יציבה‪ .‬היציבות ברנ"א פחות קריטית מאשר‬
‫בדנ"א‪ ,‬הדנ"א צריך להיות יציב יותר במעבר המידע התורשתי‪.‬‬

‫בגדיל כפול רואים את ה‪ DNA‬בצורת ‪ B form‬ואילו ב ‪ RNA‬יש רק צורת ‪ A form‬שהינה פחות‬

‫יציבה למבנה של דו גדיל‪ ,‬כי ההידרוקסיל יוצר הפרעה סטרית‪.‬‬
‫כלומר ה‪ OH-‬ב‪:RNA-‬‬
‫▪ פוגע ביציבות‪.‬‬
‫▪ לא מאפשר יצירת מבנה ‪.B form‬‬

‫הריבוז הינה טבעת מחומשת אך היא לא פלנרית‪ .‬כאשר ההידרוקסיד‬

‫בפחמן מספר ‪ 2‬זה מביא לכך שפחמן מס ‪ 3‬הוא מעל המישור‪ ,‬ואילו בצורת‬
‫‪ B‬פחמן ‪ 2‬הינו מעל המישור‪ .‬לכן לא ניתן לקבל את צורת ה‪ B form‬ברנ"א‪.‬‬

‫ב‪ DNA -‬ישנם פורינים (‪ )A, G‬ופירימידינים (‪ .)C, T‬ב‪ RNA -‬יש ‪ U‬במקום ‪ .T‬בין הפורינים לפירימידינים נוצרים קשרי‬
‫מימן (‪ T-A‬ו‪.)G-C‬‬

‫מדוע אין טימין ב‪ ?RNA‬ומדוע לא ניתן היה להסתדר עם ‪ 4‬הבסיסים ב‪?DNA‬‬

‫בהתפתחות האבולוציונית ההנחה היא ש‪ RNA‬קדם ל‪ - DNA‬כלומר קודם‬
‫היה ‪.U‬‬
‫בתא יש אנזימים שיכולים לעשות דה‪-‬אמינציה לציטוזין ולהפוך אותו‬
‫לאורציל‪ .‬אם בדנ"א היה ‪ U‬במקום ‪ T‬והייתה מתרחשת דה‪-‬אמינציה של‬
‫ציטוזין‪ ,‬אז ציטוזין היה הופך לאורציל והתא לא היה יכול לתקן את זה כי לא‬
‫הייתה לו דרך לזהות שהאורציל הזה לא אמור להיות בדנ"א‪.‬‬
‫העובדה שיש טימין בדנ"א ולא אורציל‪ ,‬מאפשרת לזהות שהתרחשה דה‪-‬‬
‫אמינציה על ציטוזין ולתקן זאת‪ .‬ברנ"א זה פחות קריטי כי מקסימום יצא‬
‫חלבון פגום שיתפרק‪ .‬בדנא זה כבר מוטציה שתתקע אצלנו וזה כבר פחות‬
‫רצוי‪.‬‬
‫לסיכום‪ :‬הטימין נוצר בתהליך אבולוציוני שנועד להתגבר על הבעיה שיכולה‬
‫להיווצר מבלבול בין ‪ C‬ל‪.U-‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מבנים שניוניים של ה‪: RNA‬‬

‫‪ RNA‬יכול ליצור קשרי מימן ‪ -‬אינטראקציות ווטסון‪-‬קריר בתוך המולקולה‪.‬‬
‫כלומר הוא יוצר מגוון רחב של מבנים שניוניים‪ .‬המולקולה מתקפלת על‬
‫עצמה‪.‬‬
‫כאשר למולקולה יש אפשרות למגוון רחב של צורות זה אומר שיש לה‬
‫הרבה פעילויות בתא‪ .‬ואכן כיום מבינים שהרנ"א לא מהווה רק תבנית‬
‫לבניית חלבון אלא משתתף במגוון תהליכים‪.‬‬

‫סוגים שונים של ‪:RNA‬‬

‫▪ ‪ - mRNA‬תוצר שעתוק‪ ,‬ושלב ביניים בדרך לתרגום וליצירת‬
‫חלבון‪ .‬יהווה את ה‪ Template‬שעל בסיסו ייווצר חלבון‪.‬‬
‫▪ ‪ - rRNA‬ריבוזום‪ .‬בית חרושת ליצירת חלבונים‪ .‬קומפלקס ענק‬
‫שמורכב מחלבונים ומ‪.rRNA-‬‬
‫▪ ‪ - tRNA‬המפתח שיודע לעבור משפת הנוקלאוטידים לשפת‬
‫החלבונים‪ .‬יודע להביא את החומצה האמינית הנכונה אל הקודון‬
‫הנכון‪.‬‬
‫▪ ‪ - snRNA‬קשור ל‪ ,Splicing-‬לשחבור‪.‬‬
‫▪ ‪ - snoRNA‬קשורים למודיפיקציות של ‪.RNA‬‬
‫▪ ‪ - miRNA, siRNA‬עוסקים בבקרה על ביטוי של גנים‪.‬‬
‫▪ ‪ - Other non-coding RNAs‬כאשר ריצפו את הגנום ראו שיש‬
‫הרבה אזורים שעוברים שעתוק‪ ,‬אבל הם לא מגיעים לכדי חלבון‪.‬‬
‫לסיכום‪ :‬לרנ"א יש מגוון תפקידים בתא‪ ,‬אנו נתמקד בתרומתו ליצירת חלבונים‪.‬‬

‫‪DNA Transcription‬‬
‫שעתוק ‪ -‬סינתזה של מולקולת רנא על סמך תבנית של דנא‪.‬‬
‫(הכפלה ‪ -‬סינתזה של מולקולת דנא על סמך תבנית של דנא)‪.‬‬
‫תהליך השעתוק‪:‬‬
‫▪ הדנ"א הוא סליל כפול‪ .‬בתהליך השעתוק הדנ"א יפתח‬
‫וסליל אחד של הדנ"א יהווה את התבנית ליצירת הרנא‪.‬‬
‫▪ רנ"א‪ ,‬בדומה לדנ"א‪ ,‬נבנה מקצה ‪ 5‬ל‪ .3‬לכן התבנית‬
‫תהיה מ‪ 3‬ל‪.5‬‬
‫▪ הרנ"א שייווצר יהיה קומפלמנטרי‪ ,‬משלים‪ ,‬לתבנית‪.‬‬
‫▪ כל פעם יכנס נוקלאוטיד רנ"א בהתאם לרצף של התבנית והוא ייצור קשר‬
‫פוספודיאסטרי עם הנוקלאוטיד הקודם של הרנ"א‪.‬‬
‫▪ אם הרנ"א משלים לגדיל של התבנית אז הרצף שלו זהה לדנ"א המשלים‬
‫(‪ )coding‬מלבד ההבדל בין ‪.U\T‬‬
‫כלומר‪ :‬לפי מולקולת רנ"א ניתן לדעת את גדיל ה‪ template‬וגדיל ה‪ coding‬של‬
‫הדנ"א‪.‬‬

‫כיצד הגנים מסודרים ב‪?DNA -‬‬

‫גנים שונים משועתקים בכיוונים שונים‪ .‬כלומר לחלק מהגנים‬
‫המולקולה התחתונה תהווה את התבנית ולחלק המולקולה‬
‫העליונה תהווה את התבנית‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫יצירת מולקולת הרנ"א‪:‬‬

‫בתהליך יצירת מולקולת הרנ"א נוצר קשר בין‬
‫הפוספט של הנוקלאוטיד שמצטרף לבין קצה ‪3‬‬
‫על הסוכר של הנוקלאוטיד הקיים‪,‬‬
‫מדובר בקשר פוספודיאסטרי‪ .‬בתהליך‬
‫משתחררת מולקולת מים‪.‬‬
‫הערה‪ :‬גם ביצירת חלבון ויצירת קשר פפטידי יש‬
‫יציאה של מולקולת מים‪.‬‬
‫האנזים שמבצע זאת הינו ‪.RNA Polymerase‬‬
‫התאמת הבסיס נעשית על ידי ווטסון קריר‪.‬‬
‫בציור מימין‪ :‬מסתכלים על הנוקלאוטיד הרביעי שנכנס‪ ,‬במקרה הזה אדנין‪:‬‬
‫הנוקלאוטיד מגיע עם שלושה פוספטים (אדינוזין טרי פוספט)‪.‬‬
‫החמצן בעמדה שלוש של הנוקלאוטיד הקודם (השלישי) תוקף את פוספט אלפא‪ ,‬כתוצאה מכך בטא וגמא‬
‫משתחררים (פירופוספט) ונוצר הקשר הפוספודיאסטרי‪.‬‬
‫הערה‪ :‬לנוקלאוטיד הראשון שמוסיפים יש ‪ 3‬פוספטים (ספוילר‪ :‬הם ירדו בהמשך)‪.‬‬
‫באנזים יש יוני מגנזיום שעוזרים למקם את המולקולות ולזרז את הריאקציה הכימית ביצירת קשר פוספודיאסטרי‪.‬‬

‫‪RNA polymerase‬‬
‫רנ"א פולימראז הוא קומפלקס חלבוני גדול (‪ 400‬קילו דלתון) שמורכב מ‪ 5‬תתי יחידה‪:‬‬
‫• ‪ 2‬יחידות אלפא זהות‪ .‬היחידה בעלת שני דומיינים‪ C :‬טרמינל ו‪ N‬טרמינל‪.‬‬
‫• ‪ 2‬יחידות בטא ובטא' ‪ -‬דומות אבל עם הבדל קטן‪.‬‬
‫• יחידה אחת של אומגה‪.‬‬
‫המבנה הזה נכון ליצורים פרוקריוטים‪ ,‬ביצורים אאוקריוטים המבנה‬
‫קצת שונה ‪ -‬המבנה הכללי נשמר אבל הוא יותר מורכב ‪ -‬משתתפים‬
‫עוד חלבונים‪.‬‬

‫סוגים של רנ"א פולימראז‪:‬‬

‫בפרוקריוטים יש רק סוג אחד של רנ"א פולימראז‪.‬‬
‫באאוקריוטים יש שלושה סוגים‪:‬‬
‫רנ"א פולימראז ‪ - 1‬אחראי לרנ"א ריבוזומלי‪.‬‬
‫רנ"א פולימראז ‪ - 2‬מייצר את המסנגר רנ"א‪.‬‬
‫רנ"א פולימראז ‪ - 3‬אחראי ליצירת ‪ ,tRAN‬רנ"א ריבוזומלי ורנ"א‬
‫שאחראי לשחבור‪.‬‬
‫בצמחים יש חמישה סוגים כלומר עוד שניים נוספים‪.‬‬

‫יחידת שעתוק‪:‬‬
‫לכל גן יש יחידת שעתוק‪ .‬היחידה מוגדרת ע"י אזור של‬
‫תחילת שעתוק (‪ ,)promoter‬אזור של סיום שעתוק‬
‫(‪ )terminator‬וכל מה שנמצא ביניהם‪.‬‬
‫הנקודה בה מתחילים את השעתוק מוגדרת כ‪.+1‬‬
‫הפרומוטר נמצא ב"מעלה הזרם" של האזור שעובר שעתוק‪,‬‬
‫מהצד של ה‪ 5‬פריים ואליו הדנ"א פולימראז צריך להגיע‬
‫(הפרומוטר עצמו אינו עובר שעתוק)‪ .‬השעתוק ימשיך עד‬
‫לאזור שנקרא טרמינטור שנמצא ב"מורד הזרם" ומסמן את‬
‫הפסקת השעתוק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫את תהליך השעתוק ניתן לחלק לשלושה שלבים‪:‬‬

‫‪ -Initiation .1‬התחלת השעתוק‪ .‬הדנ"א הוא רצף ענק‪ ,‬כיצד יודעים היכן להתחיל‬
‫את השעתוק? זה חשוב כי ייתכן שנחסיר חלק או נמשיך מעבר לרצף הרצוי‪,‬‬
‫ואז נקבל חלבון שונה‪ .‬בשלב הזה רנ"א פולימראז מזהה את הפרומוטור‬
‫ומתיישב על הדנ"א‪.‬‬
‫‪ -Elongation .2‬מולקולת הרנ"א מסונתזת וישנה הארכה של המולקולה‪.‬‬
‫‪ -Termination .3‬הפסקת תהליך השעתוק‪ .‬מתקבלת מולקולת רנ"א‪.‬‬

‫בעיה‪:‬‬
‫‪ RNA polymerase core enzyme‬יודע לסנתז רנ"א על סמך דנ"א אבל הוא לא יודע‬
‫לזהות איפה נמצא תחילת השעתוק ‪ -‬הפרומוטור‪.‬‬
‫הפתרון‪:‬‬
‫ישנם חלבונים נוספים שעוזרים לרנ"א פולימראז להגיע אל הפרומוטור‪.‬‬
‫הרעיון זהה בפרוקריוטים (חלבון אחד) ובאאוקריוטים (מספר חלבונים)‪.‬‬

‫פרומוטורים ביצורים פרוקריוטים‬

‫תחילת השעתוק מסומנת ב‪.+1‬‬
‫כל מה שנמצא ‪ upstream‬מנקודה זאת יסומן‬
‫במינוס ומה שנמצא ‪ downstream‬יסומן בפלוס‪.‬‬
‫בתמונה פרומוטור של חיידקים באי קולי‪.‬‬
‫בצהוב‪ -‬אזור תחילת השעתוק ומשמאל‬
‫)‪ upstream‬לאזור תחילת השעתוק) יש את‬
‫הפרומוטור שמסומן בסגול ובכחול‪.‬‬
‫מבנה הפרומוטור‪:‬‬
‫יש בו שני אזורים של רצפים שמורים שמשותפים לכל הפרומוטורים ‪ .-35 Region ,-10 Region :‬אלו רצפים שעשירים‬
‫יחסית ב‪ A‬ו‪ .T‬ביניהם‪ ,‬בכחול‪ ,‬יש רצפים לא שמורים (משתנים)‪ .‬ישנם פרומוטורים שיש להם רצף נוסף בשם ‪Up‬‬
‫‪ element‬שהינו רחוק עוד יותר מאזור תחילת השעתוק‪ .‬פרומוטורים שיכילו אזור זה יהיו יותר פעילים‪ ,‬ויהיה סנתוז‬
‫גבוה יותר של ‪( RNA‬מגביר את מספר הרנ"א פולימראזות שיזהו אותם)‪.‬‬
‫הערה‪ :‬המרחק בין שני האזורים (‪ )-35 Region ,-10 Region‬נע בין ‪ 15‬ל‪ 19‬בסיסים וקשור לאופן שבו הרנ"א יזהה‬
‫את הפרומוטור‪ .‬ברוב המקרים המרחק הינו באורך של ‪ 17‬בסיסים‪.‬‬
‫הערה חשובה‪ :‬כשמתייחסים לגן ולמיקומים ‪ -‬מדברים על גדיל ה‪ coding‬ולא על התבנית‪ .‬כלומר הפרומוטור לא נמצא‬
‫בתבנית אלא בגדיל השני‪.‬‬
‫החוזק של הפרומוטור נקבע ע"פ‪:‬‬
‫• ‪.-10 Region‬‬
‫• ‪.-35 Region‬‬
‫• המרחק ביניהם‪.‬‬
‫• ‪.Up element‬‬

‫‪Sigma factors‬‬
‫ה‪ Core RNA Polymerase -‬פותר את הבעיה של זיהוי מיקום הפרומוטור‬
‫בעזרת חלבון בשם ‪ .Sigma factor‬כשהחלבון נקשר ל‪ Core‬מתקבל האנזים השלם‪:‬‬
‫𝒆𝒎𝒚𝒛𝒏𝒆𝒐𝒍𝒐𝑯 𝑨𝑵𝑹 = 𝒓𝒐𝒕𝒂𝑭 𝒂𝒎𝒈𝒊𝑺 ‪𝑪𝒐𝒓𝒆 𝑹𝑵𝑨 𝑷𝒐𝒍𝒚𝒎𝒆𝒓𝒂𝒔𝒆 +‬‬
‫הקומפלקס שלהם מאפשר לזהות את הפרומוטור‪.‬‬
‫ה‪ Sigma factor -‬מזהה את האזורים של ‪ -10‬ו‪ ,-35‬יש לו אפיניות גבוהה אליהם ועל ידי‬
‫כך הוא מכווין את ה‪ core‬לפרומוטור‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫הזכרנו שישנם הבדלים בין פרומוטורים‬

‫שונים‪ .‬ב‪ E.coli -‬יש ‪ 7‬סוגים שונים של‬
‫‪ .Sigma factor‬ההבדל ביניהם הוא‬
‫באפיניות לפרומוטורים שונים ‪ -‬בהתאם‬
‫לסיגמא אפשר להביא את רנ"א פולימראז‬
‫לפרומוטור מסוים‪.‬‬
‫לדוגמא‪ :‬סיגמא ‪( 70‬נפוץ בתא) מזהה‬
‫פרומוטורים של ‪.Housekeeping genes‬‬
‫לפי עמודת ה‪ Ratio -‬בטבלה ניתן לראות שהפיזור של ה‪ Sigma factors -‬אינו אחיד‪ .‬ישנן סיגמות יותר נפוצות (בדר"כ‬
‫עבור גנים שמבוטאים כל הזמן) וסיגמות שמבוטאות בכמות נמוכה (יהיו עבור גנים ספציפיים)‪.‬‬
‫כלומר בהרבה מקרים הבקרה על ביטוי הגן יכולה להיות ברמת הסיגמא‪ .‬אם תא נמצא במצב של סטרס ועקת חום‪,‬‬
‫הוא יבטא סיגמא שמזהה פרומוטורים שנחוצים להתמודדות עם עקת חום‪.‬‬
‫ה‪ Sigma factor -‬הינו חלבון‪ ,‬כלומר יש לו קצה אמיני‬
‫וקצה קרבוקסילי‪ .‬בעל ‪ 4‬אזורים מבנים‪:‬‬
‫אזור ‪ 2‬אזור הליקלי (הליקס) מזהה את אזור ‪-10‬‬
‫בפרומוטור‪.‬‬
‫אזור ‪ 4‬מזהה את אזור ‪ -35‬בפרומוטור‪.‬‬
‫סיגמות שונות מזהות רצפים שונים (לא מדובר רק ברצף‪ ,‬אלא גם המרחק בין הרצפים)‪.‬‬

‫בקרה על פעילות הסיגמא‪:‬‬

‫‪ .1‬רמת הסיגמא בגרעין‪:‬‬
‫הסיגמא הוא חלבון וניתן לשלוט בכמות שלו‪ .‬לדוגמא‪ :‬אם התא נקלע למצב של חום קיצוני ועליו לבטא גנים עם‬
‫פרומוטור מסוים‪ ,‬הוא ייצר את הסיגמא שמתאים לפרומוטורים‪ ,‬כמות הסיגמא תעלה והוא יפעיל רנ"א פולימראז‪.‬‬
‫‪:Pro-Sigma factor .2‬‬
‫הסיגמא כבר קיים‪ ,‬אבל הוא במצב לא פעיל‪ .‬צריך לעבור חיתוך או מודיפיקציה שתפעיל אותו ורק אז הוא יוכל‬
‫להיקשר לרנ"א פולימראז‪ .‬זה טוב לבקרה מהירה‪ .‬יש מאגר של פרו‪-‬סיגמא שצריך רק למטרה מסוימת (נגיד‬
‫במצב של עקת חום ‪ -‬הוא יחתך‪ ,‬יהפוך לפעיל ויהיה זמין לקישור לרנ"א פולימראז)‪.‬‬
‫‪:Anti-sigma factors .3‬‬
‫מולקולות קטנות שנקשרות לסיגמא ומונעים ממנו להיקשר לחלבון מטרה‪.‬‬

‫דוגמא לבקרה של ‪:Anti-sigma factor‬‬

‫בבניית השוטון בתא זרע יש צורך בביטוי של גנים‬
‫מסוימים בשלב הראשון ובביטוי גנים אחרים בשלב‬
‫השני‪.‬‬
‫אז בשלב הראשון משתמשים בסוג מסוים של סיגמא‬
‫בעוד שהסוג השני של סיגמא חסום ( ‪Anti-sigma‬‬
‫‪.)factors‬‬
‫כאשר השוטון עובר את הממברנה ‪ -‬הסיגמא החסומה‬
‫משוחררת והגנים הנחוצים יכולים לבוא לידי ביטוי‪.‬‬
‫הרעיון הוא שלמרות שיש רנ"א פולימראז באזור ניתן‬
‫לבקר את ביטוי הגנים גם ע"י רמת הסיגמא‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מעגל השעתוק‬
‫סיגמא פקטור ורנ"א פולימראז מתחברים ויוצרים קומפלקס אשר נע על‬
‫הדנ"א באינטראקציה חלשה‪ .‬כשהקומפלקס מגיע לאזור הפרומוטור‬
‫הוא נקשר באפיניות טובה לאזורים של מינוס ‪ 10‬ומינוס ‪ ,35‬ואז הרנ"א‬
‫פולימראז ננעל על הפרומוטור‪.‬‬
‫בשלב הבא יש פתיחה של הסליל הכפול כדי לחשוף את גדיל התבנית‬
‫והתחלת יצירת הרנ"א (זה דורש כמה ניסיונות עד שמצליחים להתחיל‬
‫לבנות את מולקולת הרנ"א כראוי)‪.‬‬
‫לאחר מכן הסיגמא עוזב את הרנ"א פולימראז אשר כבר התחיל את‬
‫סינתזת הרנ"א‪ .‬ללא הסיגמא הוא יכול לנוע על הדנ"א ולסנתז רנ"א עד‬
‫שהוא מגיע לאזור הטרמינטור ונופל מהדנ"א ומולקות הרנ"א‬
‫משתחררת‪.‬‬

‫‪Abortive initiation‬‬

‫רנ"א פולימראז יחד עם סיגמא נמצאים בפרומוטור‪.‬‬

‫מתחיל השעתוק ‪-‬‬
‫בשלב ה‪ Initiation‬הקומפלקס זיהה את הפרומוטור‪ ,‬התיישב עליו והתחיל את‬
‫תהליך השעתוק ‪ -‬היווצרות מולקולת הרנ"א‪ .‬לא תמיד ההתחלה מובילה לרנ"א‬
‫שלם‪ .‬נוצרים ‪ 7-10‬בסיסים‪ ,‬אולם נוכחות הסיגמא מונעת מהרנ"א שסונתז לצאת‬
‫החוצה ‪ -‬אין לו מקום להמשיך לגדול והוא נופל‪ .‬התהליך הזה חוזר על עצמו כמה‬
‫פעמים עד שחלבון הסיגמא משתחרר ואפשר להתחיל את שלב ה‪.elongation‬‬

‫הרחבה על התהליך‪:‬‬
‫בצורה שהסיגמא תופס את רנ"א פולימראז נוצר ‪ loop‬שחוסם את‬
‫הפתח ממנו הרנ"א שסונתז אמור לצאת‪ .‬הרנ"א מתחיל לגדול‪,‬‬
‫לא מצליח לצאת ועובר פירוק‪.‬‬
‫הצורה הזו שהסיגמא מחזיק את הרנ"א פולימראז חשובה כדי‬
‫לייצב את כל הקומפלקס על הפרומוטור‪.‬‬
‫באיזשהו שלב הרנ"א שמסונתז מצליח להזיז ולשנות את‬
‫הקונפורמציה של ה‪ loop‬ואז קורים שני דברים‪:‬‬
‫‪ .1‬הרנ"א שצומח יכול להמשיך לגדול כי אין משהו שחוסם אותו‪.‬‬
‫‪ .2‬חוזק הקישור של הסיגמא לרנ"א פולימראז קטן והסיגמא‬
‫עוזב את הרנ"א פולימראז‪.‬‬
‫שלב זה נקרא ‪ .Promotor clearance‬מתקבל קומפלקס של דנ"א‬
‫ורנ"א פולימראז ללא הסיגמא שיכול לרוץ על הדנ"א ולשעתק את‬
‫הדנ"א‪ .‬ככה מסתיים תהליך תחילת השעתוק ומתחיל שלב‬
‫ה‪.elongation‬‬
‫הערה‪ :‬לאחר שהסיגמא השתחרר הוא יכול לקשור עוד רנ"א‬
‫פולימראז ולהתחיל שעתוק נוסף‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Termination‬‬
‫בשלב זה אנו מעוניינים להפסיק את סינתזת ה‪ .RNA -‬בפרוקריוטים זה‬
‫נעשה ע"י כך שבדנ"א יש רצף שיוצר מבנה של ‪loop/Hairpin and Stem‬‬
‫(קשרי ווטסון קריק) רצף הבסיסים קומפלמנטרי וכאשר הרנ"א נוצר הוא‬
‫נסגר על עצמו‪ .‬אחרי הרצף יש אזור של בסיסי ‪ .U-A‬זה גורם לרנ"א להיות‬
‫לא יציב ולהתנתק מרנ"א פולימראז‪ .‬הריאקציה מפסיקה ‪ -‬סיום תהליך‬
‫השעתוק‪.‬‬

‫הערה‪ :‬בעמוד ‪ 45‬במצגת יש סיכום של מעגל השעתוק‪.‬‬

‫תמונה במיקרוסקופ אלקטרוני של שעתוק גנים‪.‬‬

‫הערות‪:‬‬
‫▪ קצה ‪ 5‬נוצר בהתחלה לכן הוא יהיה הכי רחוק‬
‫מהקו האמצעי‪.‬‬
‫▪ תהליך השעתוק במקרה הזה מתחיל משמאל כי‬
‫התוצרים קטנים יותר וככל שמתקדמים לצד ימין‬
‫התוצרים נהיים יותר ארוכים‪.‬‬
‫▪ הנקודות השחורות בקצוות (למטה ולמעלה) הם‬
‫על קצה ‪ '5‬והן שחורות בגלל שמדובר ברנ"א‬
‫ריבוזומלי אשר יוצר קומפלקס עם ריבוזומים‬
‫וחלבונים‪.‬‬

‫‪Transcription in Eukaryotes‬‬
‫גם ביצורים אאוקריוטים הרנ"א פולימראז אינו יודע לזהות את הפרומוטור בעצמו ולכן ישנם שחקנים נוספים שעוזרים‬
‫לו (בפרוקריוטים היה רק את חלבון סיגמא‪ ,‬כאן מדובר במספר חלבונים)‪.‬‬
‫מדובר בקומפלקס חלבונים שנקרא ‪ - TF‬פקטור שעתוק‪.‬‬
‫בדומה לסיגמא הם עוזרים בשלב הראשון לרנ"א פולימראז למצוא את הפרומוטר ולאחר מכן עוזבים‪ .‬יש פקטורי‬
‫שעתוק אחרים שעוזרים להארכת הרנ"א‪.‬‬

‫הפרומוטור באאוקריוטים‪:‬‬
‫תחילת השעתוק מסומנת בקיצור ‪.INR‬‬
‫‪ Upstream‬לתחילת השעתוק נמצאים שני רצפים שמורים‪:‬‬
‫ב‪ -35‬אזור בשם ‪ BRE‬וב‪ -30‬אזור בשם ‪.TATA box‬‬
‫יש גם רצף ‪ Downstream‬לתחילת השעתוק ב‪ +30‬וגם הוא‬
‫מזוהה על ידי חלק מהחלבונים שמביאים את רנ"א פולימראז‬
‫(יש חלבונים שמזהים את הרצף של כל אזור)‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫תהליך הזיהוי‬
‫בשלב הראשון נקשר פקטור השעתוק ‪ TFIID‬אל ה‪ TATA box‬שנמצא בפרומוטור (אחת‬
‫היחידות שלו היא ה‪ TBP - TATA Binding protein -‬אשר קושרת את רצף ה‪.(TATA‬‬
‫הקישור גורם לקיפול של הדנ"א ‪ -‬שינוי קונפורמציה וזה מסמן את הפרומוטור‪ ,‬מגייס‬
‫פקטורי שעתוק נוספים ואת הרנ"א פולימראז‪.‬‬
‫לפקטור השעתוק ‪ TFIIH‬יש פעילות של הליקאז ‪ -‬פותח את הסליל הכפול‪.‬‬
‫לקראת הסוף יש זרחון של הקצה ה‪ C‬טרמינלי של רנ"א פולימראז (הזרחון חיוני להעברה‬
‫של הקומפלקס מהתהליך שהוא זיהה את הפרומוטור לתהליך של שעתוק הרנ"א ‪-‬‬
‫אלונגציה)‪ .‬בנוסף לזרחון רוב פקטורי השעתוק מתנתקים‪.‬‬
‫הערה‪ :‬גם כאן‪ ,‬כמו בפרוקריוטים‪ ,‬יש שלב של חוסר הצלחה עד שמצליחים לרוץ קדימה‪.‬‬

‫חלבונים מאקטבים‪:‬‬
‫המורכבות באאוקריוטים באה לידי ביטוי‬
‫גם בכך שלעיתים רצפים שנמצאים‬
‫מאוד רחוק מהגן יכולים להשפיע על‬
‫גיוס הרנ"א פולימראז ויצירת‬
‫הקומפלקס שמאפשר את תחילת‬
‫שעתוק‪ .‬הם נקראים ‪ Enhancer‬והם‬
‫מגבירים את היעילות של השעתוק‪.‬‬

‫כאשר רנ"א פולימראז מתחיל את תהליך השעתוק‪ ,‬פקטורי השעתוק מתחלפים‬

‫ל‪ - elongation factors‬לחלבונים שיעזרו בתהליך האלונגציה‪ .‬אלו הם חלבונים שייצבו‬
‫את האינטראקציה עם הדנ"א (רוצים שהפלוימראז יגיע עד לאזור הטרמינציה בלי ליפול) וישנם גם חלבונים שעוזרים‬
‫לו לעבור אזורים דחוסים בדנ"א ומפנים לו את הדרך על מנת שיוכל לעבור בצורה חלקה יותר‪.‬‬

‫‪Elongation‬‬
‫כאשר משעתקים את הדנ"א ליצירת רנ"א‪ ,‬בגלל שהדנ"א תפוס משני הצדדים נוצר איזשהו‬
‫מתח (‪ .)supercoil‬ישנם אנזימים בשם ‪ Topoisomerase‬אשר משחררים את הלחץ שנוצר‪.‬‬
‫מסדרים את המבנים שנוצרים בדנ"א כתוצאה מתהליך השעתוק‪.‬‬

‫השוואה בין פרוקריוטים לאאוקריוטים‪:‬‬

‫באאוקריוטים השעתוק מלווה בתהליכים נוספים שאינם מצויים בפרוקריוטים ‪:‬‬
‫▪ בפרוקריוטים אין גרעין והכל קורה באותה‬
‫הסביבה (שעתוק‪ ,‬תרגום וכו')‪.‬‬
‫באאוקריוטים יש שלב נוסף של יציאת‬
‫הרנ"א מהגרעין לציטופלסמה (שם יתרחש‬
‫התרגום) ולכן יש שלב נוסף של בקרות ‪-‬‬
‫הרנ"א יצא לציטופלזמה רק כשהוא תקין‬
‫ומוכן לתהליך התרגום‪.‬‬
‫▪ באאוקריוטים התהליך הרבה יותר מורכב‪:‬‬
‫הרנ"א שנוצר עובר מודיפיקציות‪ :‬חיתוך‪,‬‬
‫‪ capping‬של ה‪ polyadenylation ,'5‬ב‪ .'3‬זה‬
‫מאפשר מגוון יותר גדול של רצפים ומגן על‬
‫הרנ"א מפני פירוק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫תהליך השעתוק מצומד לעוד שני תהליכים‪:‬‬

‫‪ .1‬עיבוד של הרנא ‪ -‬מודיפיקציות של הקצוות‪.‬‬
‫‪ - Splicing .2‬שחבור הרנ"א‪ :‬הוצאת אינטרונים וקבלת רנ"א בוגר עם אקסונים בלבד‪.‬‬
‫לפני יציאת הרנא מהגרעין בודקים אותו‪.‬‬

‫‪The 5 cap of eukaryotic mRNAs .1‬‬

‫קצה ‪ 5‬של רנ"א סונתז ראשון‪ .‬הזכרנו כבר שעל הנוקלאוטיד הראשון יהיו ‪ 3‬פוספטים‬
‫(הוא הראשון שהתווסף‪ ,‬מכל הנוקלאוטידים הבאים ישתחררו ‪ 2‬פוספטים)‪ .‬במודיפיקציה‬
‫הזאת מוסיפים לקצה ‪ 7 5‬מתיל גואנוזין והיא מתרחשת ברגע שקצה ‪ 5‬נוצר‪ ,‬ולפני‬
‫שתהליך השעתוק הסתיים‪.‬‬
‫▪ בשלב הראשון יש פוספטאז שמוריד פוספט אחד כך שנשארים עם שני פוספטים‪.‬‬
‫▪ בשלב הבא יש אנזים שנקרא גואנין טרנספראז שעושה הידרוליזה של ‪ GTP‬ומצמיד‬
‫‪ - GMP‬פוספט‪ ,‬סוכר ובסיס לעמדה ‪.5‬‬
‫▪ חזרנו ל‪ 3-‬פוספטים‪ .‬מתקבל גואנוזין‪ .‬בין פחמן ‪ 5‬ל‪ 5‬פריים יש גשר של שלושה‬
‫פוספטים‪ .‬זהו הקשר היחיד בין ‪ 5‬פריים לבין פחמן בעמדה ‪.5‬‬
‫▪ בשלב הבא יש מתילציה על הבסיס (על החנקן) וזה יוצר מטען חיובי כי נוצרו ‪4‬‬
‫קשרים על החנקן ‪.‬‬

‫‪3' polyadenylation of mRNAs .2‬‬

‫בקצה ‪ 3‬מה שקורה זה שחל תהליך השעתוק עד שרנ"א פולימראז מגיע‬
‫לרצף מסוים של בסיסים (מוצג בציור)‪ .‬כשהוא מגיע לרצף הזה חל חיתוך‬
‫של הרנ"א באזור הרצף של ה‪( CA‬בציור)‪ .‬לאחר החיתוך יש אנזים שמוסיף‬
‫רצף של אדנינים (‪ .)AAA‬הערה‪ :‬הרצף הזה לא נוצר כתוצאה של התבנית‬
‫בדנ"א‪ ,‬זה פשוט אנזים שמוסיף ‪ A‬לא על סמך תבנית כלשהי‪.‬‬
‫חיתוך והוספת הזנב מאוד חשובים‪.‬‬
‫יש אפשרות לבקר באיזה מקום יכול החיתוך של הרנ"א‪ ,‬וכך הוספת הרצף יכולה‬
‫להיות באזורים שונים כפועל יוצא למקום בו נעשה החיתוך של הרנ"א‪ .‬יכול‬
‫להיות של ‪ 2‬רנא עם אותה מסגרת קריאה יהיה אורך זנב ‪ A‬שונה וזה ישפיע על‬
‫יציבות הרנא הזה‪.‬‬
‫התהליך הזה מתבצע במהלך השעתוק לפני שרנ"א פולימראז עוזב‪.‬‬
‫הערה‪ :‬הוספת הזנב גם מגנה על הרנ"א מפני ‪ RNAase‬שיכולים לפרק אותו‪.‬‬

‫‪Alternative polyadenylation‬‬
‫לפעמים יותר מאזור אחד בגן יכול לעבור‬
‫חיתוך והוספה של ‪.Poly A‬‬
‫למרות שבשניהם בכחול יש אותו רצף לקבלת‬
‫החלבון‪ ,‬בכל פעם אתרים אחרים מזוהים‬
‫כאתרי חיתוך‪.‬‬
‫ב‪ (a) -‬ישנם אלמנטים נוספים ‪ -‬אתרים למיקרו‬
‫‪ RNA‬שיכולים לחסום את תהליך התרגום של‬
‫הרנ"א והיציבות שלו‪ .‬במקרה של )‪ (b‬הם לא‬
‫יהיו כי תוצר השעתוק הוא קצר יותר וה‪Poly a‬‬
‫נוסף בשלב מוקדם יותר‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪CTD- C Terminal domain of RNA polymerase II‬‬

‫ה‪ CTD -‬ארוך מאוד והפוספורילציה עליו יכולה להיות באתרים שונים ‪ -‬בהתאם למיקום יגויסו חלבונים שונים‪.‬‬
‫הפוספורילציה מביאה לגיוס של‪:‬‬
‫• האנזימים שיצרו את ה‪ .'5 capping‬זה קורה תוך כדי השעתוק וקריטי לתהליך השחבור והתרגום‪,‬‬
‫מהווה מנגנון בקרה לתהליך שעתוק תקין‪.‬‬
‫• ‪ - Splicing machinery‬הקומפלקס שעושה את השחבור‪.‬‬
‫• ‪ - End processing complex‬הקומפלקס שעושה חיתוך של הרנ"א בקצה ‪ 3‬והוספה של ‪- Poly A‬‬
‫מתבצע בסוף‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪:RNA Splicing‬‬

‫בעברית התהליך נקרא שחבור‪ .‬זהו תהליך בו מולקולת הרנ"א עוברת עיבוד‪.‬‬
‫כאשר המולקולה נוצרת היא מכילה שני אזורים‪:‬‬
‫• אינטרונים ‪ -‬אזורים בגנים שעוברים שעתוק אבל לא קיימים ברנ"א הבוגר (ימחקו במהלך העיבוד)‪.‬‬
‫• אקסונים ‪ -‬רצפים של רנ"א שנשארים ברנ"א הבוגר ויקודדו בהמשך לחלבונים‪.‬‬
‫היחס בין האזורים‪:‬‬
‫בציור משמאל ‪ -‬האקסונים באדום והאינטרונים בכתום‪.‬‬
‫למעלה גן קצר שמכיל כמות שווה של אינטרונים ואקסונים‪ .‬לעומת זאת הגן‬
‫למטה הרבה יותר ארוך אבל מכיל בעיקר אינטרונים‪  .‬האינטרונים יכולים‬
‫לנוע בטווח של מספר בודד של בסיסים ועד מאות ואלפי בסיסים‪ .‬בסופו של‬
‫דבר כולם ימחקו במהלך השחבור‪.‬‬

‫תהליך השחבור מבחינה כימית‪:‬‬

‫זוהי ריאקציית טרנסאסטריפיקציה‪ .‬מדובר בשבירת קשר פוספודיאסטרי ויצירה של הקשר פוספודיאסטרי בחזרה‪.‬‬
‫מבחינה אנרגטית אין בזבוז אנרגיה ‪ -‬שוברים ובונים את אותו הקשר‪.‬‬
‫תהליך השחבור מתרחש גם בפרוקריוטים וגם באאוקריוטים‪ ,‬אולם בפרוקריוטים התהליך נעשה על ידי הרנ"א עצמו‬
‫ללא מעורבות של חלבונים‪ .‬שחבור ע"י חלבונים הוא רק באאוקריוטים‪.‬‬

‫שחבור בפרוקריוטים ‪ -‬שחבור עצמי‪:‬‬

‫בבקטריות‪ ,‬בווירוסים ובצמחים יש תהליך של ‪ - Self-Splicing‬לאינטרון עצמו יש‬
‫יכולת לבצע את תהליך השחבור ללא צורך בחלבונים‪ ,‬נקרא רנ"א קטליטי‪.‬‬
‫ישנם ‪ 2‬קבוצות של אינטרונים שיכולים לבצע ‪:Self-Splicing‬‬
‫‪:Group 1 introns .1‬‬
‫התהליך דורש גואנוזין חופשי (אינו חלק מהרנ"א)‪.‬‬
‫בשלב הראשון ה‪ OH -‬בעמדה ‪ 3‬בריבוז תוקף את נקודת החיבור בין האקסון‬
‫הראשון לבין קצה ‪ '5‬של האינטרון (קשר פוספודיאסטרי‪ ,‬הגואנוזין יודע איפה‬
‫לתקוף לפי המבנה המרחבי של האינטרון)‪ .‬כתוצאה מכך הגואנוזין מתחבר‬
‫לקצה ‪ '5‬של האינטרון ומשתחרר מהאקסון הראשון ‪ -‬יש לו קצה ‪ '3‬חופשי‪.‬‬
‫בשלב הבא האקסון שהשתחרר תוקף עם ה‪ OH‬החופשי (בעמדה ‪ )3‬את‬
‫הקשר הפוספודיאסטרי בין האינטרון לאקסון הבא ואז נוצר חיבור בין שני‬
‫האקסונים והאינטרון שהיה בין שניהם משתחרר‪.‬‬

‫‪:Group 2 introns .2‬‬

‫התהליך הזה אינו דורש נוקלאוטיד חיצוני‪ .‬בתוך האינטרון יש אדנוזין‬
‫שה‪ OH‬שלו תוקף את נקודת החיבור (זה ה‪ OH‬בעמדה ‪ ,2‬הרי ה‪OH‬‬
‫בעמדה ‪ 3‬תפוס) בין אקסון ‪ 1‬לאינטרון‪ .‬האדנוזין מחובר כעת לשלוש‬
‫נוקלאוטידים (דרך ‪ 3 ,2‬ו‪ )5‬ונוצרת מעין לולאה‪ .‬כתוצאה אקסון ‪1‬‬
‫משתחרר והוא יכול לתקוף עם ה‪ OH‬שיש לו בעמדה ‪.3‬‬
‫בשתי הקבוצות שהזכרנו התהליך הינו דו שלבי‪:‬‬
‫בשלב ‪ :1‬שחרור אקסון אחד מהאינטרון‪.‬‬
‫בשלב ‪ :2‬האקסון שהשתחרר תוקף את האקסון השני‪.‬‬
‫‪ ‬תהליך השחבור מורכב משבירה של ‪ 2‬קשרים ויצירה של ‪ 2‬קשרים‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫שחבור באאוקריוטים‪:‬‬
‫באאוקריוטים רוב האינטרונים אינם עוברים שחבור עצמי‪ .‬התהליך יותר מורכב ומצריך מעורבות של חלבונים נוספים‪.‬‬
‫אותו קומפלקס של חלבונים ורנ"א שמבצע את השחבור נקרא ‪.Spliceosome‬‬
‫ה‪ Spliceosome‬מורכב ממספר יחידות של ‪ snRNPs‬ומחלבונים נוספים שמתחלפים במהלך השחבור‪.‬‬
‫‪ - (small nuclear ribonucleoproteins) snRNPs‬קומפלקס של חלבון ורנ"א יחד‪ .‬הרנ"א שיוצר את הקומפלקס הזה‬
‫נקרא ‪ snRNA‬ויש חמישה סוגים שלו‪ .U1, U2, U4,U5,U6 :‬כל ‪ U‬יוצר קומפלקס עם חלבון ליצירת ה‪.snRNP‬‬
‫הראקציה של ה‪ Spliceosome‬דומה למנגנון של ‪.Group 2 introns‬‬

‫זיהוי האינטרונים‪:‬‬
‫בפרוקריוטים המבנה המרחבי של הרנ"א מאפשר את זיהוי‬
‫מיקום האינטרונים והאקסונים‪ .‬באאוקריוטים הזיהוי נעשה על‬
‫סמך הרצף‪:‬‬
‫רצף שמאפיין את קצה ‪ '5‬של האינטרון‪.‬‬ ‫▪‬
‫רצף סביב האדנוזין שה‪ OH‬בעמדה ‪ 2‬שלו יתקוף‪.‬‬ ‫▪‬
‫רצף שמאפיין את קצה ‪ '3‬של האינטרון‪ .‬מאופיין על ידי‬ ‫▪‬
‫רצף עשיר של פירימידינים‪ ,Y=( .‬פורינים = ‪.)R‬‬

‫המנגנון‪:‬‬
‫התהליך יותר מורכב מהתהליך ב‪ Group 2 introns‬אבל דומה במהות הכימית‪.‬‬
‫משמאל ‪ -‬סכמה של המנגנון‪.‬‬
‫‪ .1‬בשלב הראשון יש זיהוי של הרצפים החשובים‪:‬‬
‫‪ U1‬מזהה את הקצה ה‪ 5‬פריים של האינטרון‪ ,‬חלבונים נוספים מזהים את‬
‫האדנוזין שיתקוף עם ה‪ OH‬בעמדה ‪ 2‬שלו ואת הקצה ה‪ 3‬פריים של האינטרון‪.‬‬
‫‪ .2‬החלבונים מתחלפים‪ .‬החלבון שזיהה את האדנוזין משתחרר ובמקומו נכנס ‪.U2‬‬
‫‪ .3‬בהמשך מצטרפים ‪ U4, U5, U6‬שנקשרים באזור של האדנוזין‪.‬‬
‫הערת ביניים‪ :‬השמות של החלבונים לא חשובים‪ .‬צריך להבין את הרעיון ‪ -‬כאשר‬
‫החלבונים מתחלפים הם משנים את הקונפורמציה של הרנ"א‪ .‬שינוי‬
‫הקונפורמציה מאפשר ל‪ OH‬של האדנוזין לתקוף את ה‪ 5‬פריים של האינטרון‬
‫(נוצרת בו לולאה לאחר התקיפה) ולשחרר את האקסון הראשון‪.‬‬
‫‪ .4‬האקסון שהשתחרר יתקוף את הקשר בין האינטרון לאקסון השני ‪ -‬נקבל שני‬
‫אקסונים מחוברים יחד‪.‬‬
‫לסיכום‪ :‬באאוקריוטים הזיהוי נעשה על פי הרצף‪ .‬מי שאחראי על הזיהוי אלו חלבונים‬
‫חיצוניים שגורמים גם לשינוי קונפורמציה של הרנ"א‪.‬‬

‫זיהוי הקצה ה‪ 5‬פריים של האינטרון נעשה על ידי רצף‬

‫רנ"א קומפלמנטרי ב‪.U1‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫תהליכים נוספים באאוקריוטים‪:‬‬

‫בנוסף לחלבונים שמזהים את הרצפים שהזכרנו קודם יש חלבונים נוספים שנועדו לבקר‬
‫את התהליך‪:‬‬
‫▪ ‪ - SR proteins‬נקראים כך כי הם עשירים בסרין וארגינין‪ .‬נקשרים לאקסונים ועוזרים‬
‫לתחם את האזור של האינטרון‪.‬‬
‫▪ ‪ - hnRNPs‬תפקידם למסך אזורים שיכולים לבלבל את המערכת ולגרום למצב של‬
‫חיתוך במקום הלא נכון‪ .‬ממסכים אזורים שיכולים להיות דומים לקצוות ‪ 5‬ו‪ 3-‬של‬
‫האינטרון‪.‬‬
‫אותם חלבונים שמגדירים איפה נמצא האינטרון‪/‬האקסון לא זהים בכל סוגי התאים וכך אפשר לקבוע ספלייסינג שונה‪.‬‬
‫טעות בתהליך השחבור עלול לגרום לשינוי מסגרת הקריאה של החלבון או לרצף חומצות אמינו שלא צריך בחלבון\רצף‬
‫חומצות אמינו שחסר בחלבון‪.‬‬

‫‪Alternative splicing‬‬
‫רנ"א יכול לעבור שחבור שונה ברקמות‬
‫שונות ‪ -‬כתוצאה מכך מקבלים מולקולות‬
‫‪ mRNA‬באורך שונה שיתורגמו לחלבונים‬
‫שונים‪.‬‬
‫שחבור חלופי מאפשר להעשיר את‬
‫רפרטואר החלבונים‪ ,‬כי מאותו הגן ניתן‬
‫יהיה לייצר רנ"א בוגר עם אקסונים שונים‬
‫= חלבון עם רצף חומצות אמינו שונה‪.‬‬
‫הבהרה‪ :‬ה‪ mRNA‬לפני תהליך השחבור‬
‫יהיה זהה בכל הרקמות‪ ,‬ההבדל חל לאחר‬
‫השחבור‪.‬‬

‫טעויות בשחבור‪:‬‬
‫שתי טעויות שיכולות לקרות‪:‬‬
‫‪ - Exon skipping .1‬יש אקסון שבמהלך השחבור מאבדים‬
‫אותו‪ .‬אין זיהוי שזה אקסון‪ ,‬נכנס לאינטרון ויורד‪.‬‬
‫הדבר הזה ישפיע על החלבון שייווצר ‪ -‬כנראה לא יהיה‬
‫פעיל ויצטרך ללכת לפירוק‪.‬‬
‫‪ - Cryptic splice site selection .2‬אתר ספלייסינג חבוי ‪-‬‬
‫מבלבל את המערכת וחלק מהאקסון נחתך‪ .‬לכן ברנ"א‬
‫הבוגר יהיה חסר חלק מהאקסון‪.‬‬

‫תהליך השחבור קורה במקביל לתהליך השעתוק‪.‬‬

‫בתמונה רואים את הרנ"א פולימראז שעבר פוספורילציה על הזנב שלו שחשובה‪ ,‬בין‬
‫היתר‪ ,‬לגיוס מערכת הספלייסינג‪.‬‬
‫ישנם חלבונים שנקראים ‪ )exon junction complex( EJC‬שמסמנים אתרים שעברו‬
‫שחבור‪ .‬הסימון הזה מהווה בקרה נוספת ‪ -‬כך ניתן לזהות שהרנ"א אכן עבר את‬
‫התהליך והוא מוכן לצאת לציטוזול כדי לעבור תרגום‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Translation‬‬
‫בעברית‪ :‬תרגום‪ .‬תהליך יצירת חלבון על בסיס תבנית של ‪.mRNA‬‬
‫בתהליך התרגום עוברים משפה של נוקלאוטידים לשפה של חומצות אמינו‪.‬‬
‫בעוד שב‪ RNA -‬וב‪ DNA -‬דיברנו על קצוות '‪ 5‬ו‪ ,3'-‬בחלבון מדברים על קצה אמיני‬
‫וקצה קרבוקסילי ובהמשך נראה כיצד הקצוות מתייחסים אחד ביחס לשני‪.‬‬
‫אבני הבניין של החלבונים הרבה יותר מורכבים מאשר אבני הבניין של נוקלאוטידים‪.‬‬
‫ישנן כ‪ 20 -‬חומצות אמינו שאותן ניתן לחלק לקבוצות שונות על בסיס שייר ה‪ R‬שלהן‪.‬‬
‫כלומר משפה של ‪ 4‬אותיות עוברים לשפה של ‪ 20‬אותיות‪ .‬המעבר בין השפות נעשה ע"י שימוש בקודונים‪.‬‬
‫כל קודון מכיל ‪ 3‬בסיסים שנותנים ‪ 64‬אפשרויות לקודונים שונים‪ .‬כלומר יש חומצות אמינו שיש להן יותר מקודון אחד‪.‬‬
‫‪ 61‬קודונים מקודדים לחומצת אמינו‪ 3 ,‬קודונים מעודדים הפסקת תרגום (אין ‪ tRNA‬שמתאים להם)‪.‬‬

‫בד"כ ‪ 2‬הבסיסים הראשונים זהים בקודונים של אותה חומצה אמינית ‪ -‬נותנים את הספציפיות והבסיס השלישי‬
‫משתנה‪.‬‬

‫‪:tRNA‬‬
‫המתווך בין הרנ"א לבין חומצות האמינו הינו ה‪.tRNA-‬‬
‫זוהי מולקולת רנ"א באורך של ‪ 75-79‬נוקלאוטידים‪.‬‬
‫בקצה ה‪ '3‬מחוברת אליה חומצה אמינית בקשר אסטרי‪,‬‬
‫ובלולאת האנטי‪-‬קודון ישנו רצף של ‪ 3‬בסיסים שאמור להיות‬
‫משלים לרצף של הקודון ‪ -‬בעזרת רצף זה הוא מזהה את‬
‫הקודון ב‪.mRNA‬‬
‫מבנה ‪:tRNA‬‬
‫זאת מולקולה אחת שיוצרת אינטראקציות ווטסון קריק במולקולה עצמה ליצירת המבנה‬
‫המרחבי שלה ‪ -‬לולאת ‪ D‬יוצרת אינטראקציה עם לולאת ‪ T‬ומקבלים את האות ‪.L‬‬
‫כל המולקולות מסתיימות בקצה ה‪ '3‬ברצף שמור‪.CCA :‬‬
‫‪ 10‬אחוז מהבסיסים עוברים מודיפיקציות (בציור מסומן ב‪ D‬או פסאי) ‪ -‬השינויים הם ב‪ D‬וב‪T‬‬
‫‪ .loop‬המודיפיקציות האלו חשובות על מנת שה ‪ tRNA‬יוכל לבצע את הפעילות שלו‪.‬‬

‫כיצד נעשה זיהוי הקודון?‬

‫בציור‪ :‬באפור ‪ mRNA‬ובכחול ‪ .tRNA‬ל‪ mRNA‬יש כיווניות הפוכה מאשר ל‪.tRNA‬‬
‫שני הנוקלאוטידים הראשונים של ה‪( mRNA‬בדוגמא הזאת‪ )U-U :‬תמיד עוברים‬
‫אינטראקציה של ווטסון קריק עם הנוקלאוטידים ב‪( tRNA‬כלומר‪ U-A :‬ו‪ ,)G-C‬אולם‬
‫הנוקלאוטיד השלישי יותר מתירני ‪ -‬לא בהכרח עובר את האינטראקציה הזאת‪ ,‬יכול‬
‫להיות גם יותר חלש‪ .‬התופעה נקראת‪.Wobble pairing :‬‬
‫בטבלה ניתן לראות מהן האינטראקציות (לא צריך לזכור)‪.‬‬
‫בגלל המתירנות בעמדה ‪ 3‬לא צריכים ‪ tRNA 61‬שונים ‪ -‬בגופנו יש ‪ 40‬שמכסים את‬
‫כל ‪ 61‬הקודונים (‪ 3‬קודוני ‪ stop‬ולכן ‪ 61‬ולא ‪.)64‬‬
‫הערה‪ :‬לא כל ה‪ tRNA‬נמצאים בכמות זהה בתא‪ .‬יש כאלה שיותר נפוצים ויש כאלה שפחות‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫תפקיד ה‪:tRNA‬‬
‫לזהות את הקודון ולהביא את חומצת האמינו המתאימה‪.‬‬

‫בתהליך התרגום יש ‪ tRNA‬שמחוברות אליו מספר חומצות אמינו שהתווספו קודם‪ .‬מגיע ‪ tRNA‬חדש עם חומצה‬
‫אמינית בהתאם לקודון‪ .‬נוצר קשר פפטידי בין הח‪ .‬האמינית החדשה לבין הפוליפפטיד הקיים ‪ -‬הפפטיד מתארך‬
‫בחומצה אמינית אחת וכך הלאה עד שמגיעים ל‪ STOP -‬קודון‪.‬‬

‫‪Amino acyl tRNA Synthetase‬‬

‫האנזים מלביש על ה‪ tRNA -‬את החומצה האמינית הנכונה‪.‬‬
‫ההטענה נעשית בשני שלבים‪:‬‬
‫‪ .1‬בשלב הראשון עושים אקטיבציה לחומצה האמינית ‪ -‬אדנילציה‪.‬‬
‫לוקחים מולקולת ‪ ATP‬כדי להוסיף לחומצה האמינית ‪AMP‬‬
‫לקצה ה‪ C -‬טרמינלי‪ .‬זהו שלב שדורש אנרגיה‪.‬‬
‫‪ .2‬חומצת האמינו נקשרת לקצה ה‪ '3‬של ה‪ .tRNA‬הקישור הזה‬
‫משחרר את מולקולת ה‪.AMP‬‬
‫האנזים הוא בעל ‪ 2‬סובסטרטים‪:‬‬
‫• חומצה אמינית‪.‬‬
‫• ‪.tRNA‬‬

‫איך האנזים מזהה את סוג ה‪ tRNA‬הנכון?‬

‫הזיהוי נעשה על ידי שני אזורים עיקריים‪:‬‬
‫▪ ‪ - Anticodon loop‬ה‪ loop‬של האנטי קודון שיתאים עבור‬
‫חומצת אמינו מסוימת‪.‬‬
‫▪ ‪ - Acceptor stem‬אזור בחלק שקרוב לקצה ‪.3‬‬
‫ניתן לראות את האזורים בתמונה של המבנה בעמוד הקודם‪.‬‬
‫צורת ה‪ L -‬והמודיפיקציות השונות של ה‪ tRNA-‬עוזרות לזיהוי של‬
‫ה‪ tRNA-‬על ידי האנזים‪.‬‬

‫איך האנזים מזהה את חומצת האמינו הנכונה?‬

‫יש כ‪ Amino acyl tRNA Synthetase 20‬שונים‪ ,‬כלומר לכל כחומצה אמינית יש אנזים אחר‪.‬‬
‫ב‪ Catalytic site -‬של האנזים מתרחשת הראקציה של חיבור החומצה האמינית ל‪.tRNA-‬‬
‫בנוסף יש באנזים אתר שנקרא ‪.Editing site‬‬
‫שני האתרים מאפשרים לאנזים לבחור את חומצת האמינו הנכונה‪:‬‬
‫‪ - Size exclusion .1‬הסינון הראשון נעשה על פי גדול המולקולה‪ .‬אם חומצת האמינו גדולה מידי כדי להיכנס לאתר‬
‫הפעיל של האנזים אז מן הסתם זאת לא חומצת האמינו הנכונה‪ .‬כלומר זאת סלקציה לחומצות אמינו גדולות‪.‬‬
‫‪ - Editing pre-transfer .2‬אם חומצת האמינו הצליחה להיכנס לאתר הפעיל ‪ -‬זה לא אומר שהיא הנכונה‪ .‬צריך‬
‫לעשות עוד בדיקה‪ .‬בודקים האם היא גם מתאימה לאתר העריכה ‪ -‬אם כן אז זאת לא חומצת האמינו הנכונה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪ - Editing post-transfer .3‬התהליך הזה יכול לקרות גם לאחר שנוצר קישור בין החומצה האמינית ל‪ ,tRNA -‬אך‬
‫עדיין זה לא מאוחר לעלות על הטעות כי החומצה האמינית עדיין יכולה להיכנס לאתר העריכה‪ .‬אם זה קורה‬
‫הקשר בין החומצה האמינית ל‪ tRNA -‬יפורק‪.‬‬
‫‪ - Correct amino acid .4‬במצב שהחומצה האמינית אכן מתאימה לאתר הקליטי ולא מתאימה לאתר העריכה‪ ,‬נוצר‬
‫הקשר בין החומצה האמינית ל‪.tRNA -‬‬

‫‪The ribosome‬‬
‫תהליך התרגום נעשה על ידי קומפלקס חלבונים ו‪ RNA-‬שנקרא‬
‫ריבוזום‪.‬‬
‫הקומפלקס מתווך את האינטראקציה בין ה‪ tRNA‬לבין ה‪mRNA‬‬
‫ויצירת הקשר הפפטידי בין ח‪ .‬האמינו לפי הרצף שנקבע ברנ"א‪.‬‬
‫הריבוזום מורכב מ‪ 2-‬יחידות‪:‬‬
‫קטנה ‪ -‬אחראית לקישור ‪ mRNA‬והתאמה של ‪.tRNA‬‬
‫גדולה ‪ -‬אחראית ליצירת הקשר הפפטידי בין ח‪ .‬האמינו‪.‬‬
‫כל יחידה מורכבת ממספר מולקולת רנ"א וחלבונים‪.‬‬
‫בנקודת המגע בין שתי היחידות (‪ )interface‬יש בעיקר רנ"א‪,‬‬
‫כלפי החוץ המבנה הוא בעיקר חלבוני‪.‬‬
‫ההנחה היא שהריבוזום התפתח מרנ"א וחלבונים התווספו עם‬
‫התקדמות האבולוציה‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫בריבוזום ישנם ‪ 3‬אתרי קישור עבור ה‪:tRNA -‬‬

‫▪ ‪A - Aminoacyl site‬‬
‫▪ ‪P - Peptidyl site‬‬
‫▪ ‪E- Exit site‬‬
‫‪ A‬ו‪ P-‬אלו אתרים שיכולים לקשור ‪ .tRNA‬כאשר ‪ tRNA‬מגיע לאתר ‪ E‬הוא יכול‬
‫להשתחרר‪.‬‬

‫ניתן לחלק את תהליך התרגום למספר שלבים‪:‬‬

‫▪ ‪ - Initiation‬איפה מתחיל החלבון‪.‬‬
‫▪ ‪ - Elongation‬הארכת ובניית החלבון‪.‬‬
‫▪ ‪ - Termination‬זיהוי ה‪ stop‬קודון ‪ -‬סיום יצירת החלבון‪.‬‬
‫▪ ‪ - Recycling‬שלב המחזור שמאפשר לריבוזום להיות מוכן לפעולה הבאה שלו‪.‬‬
‫יש סכמה בעמוד ‪ 52‬במצגת ‪ 2‬שמתארת את התהליך‪.‬‬
‫הרחבה על השלבים‪:‬‬
‫‪ tRNA - Initiation‬עם ח‪ .‬אמינית מתיונן מתיישב באתר ‪ P‬בריבוזום‪ .‬מקבלים את הריבוזום השלם עם תת יחידה‬ ‫▪‬
‫גדולה ותת יחידה קטנה‪.‬‬
‫‪ tRNA - Elongation‬נוסף מגיע לעמדה ‪ ,A‬נוצר קשר פפטידי בין החומצה האמינית שנמצאת בעמדה ‪ A‬לבין‬ ‫▪‬
‫החומצה האמינית שנמצאת בעמדה ‪ ,P‬ובעצם יש מעבר של הפוליפפטיד מעמדה ‪ P‬לעמדה ‪ .A‬בשלב הבא יש‬
‫מעבר של אותו ‪ tRNA‬שנמצא בעמדה ‪ A‬לעמדה ‪ .P‬ה‪ tRNA -‬הקודם עובר לעמדה ‪ E‬ומשתחרר‪.‬‬
‫‪ - Termination‬מגיע ‪ STOP‬קודון‪ .‬במקרה הזה לא נכנס ‪ tRNA‬אלא חלבון שמזהה את קודון ה‪ .STOP -‬יש שחרור‬ ‫▪‬
‫של השרשרת הפוליפפטידית ומופסק תהליך התרגום‪.‬‬
‫‪ - Recycling‬יש שחרור של הריבוזם ושחרור מה‪.mRNA -‬‬ ‫▪‬
‫בכל שלב בתהליך התרגום יש שימוש רב בהרבה פקטורים חלבוניים שמשחקים תפקיד חשוב‪ .‬לדוגמא‪:‬‬
‫• חלבונים עם פעילות של ‪ - GTPase‬מפרקים ‪ GTP‬ל‪ .GDP‬כאשר חלבון קושר ‪ GTP‬הוא יכול להיקשר‬
‫לרנ"א‪ ,‬אולם ברגע שהוא עובר הידרוליזה הוא משנה את הקונפורמציה שלו ומאבד את יכולת הקישור‪.‬‬
‫נגיד ‪ Elongation factor‬שכאשר קשור ל‪ GTP‬הוא קושר ‪ tRNA‬וכאשר קשור ל‪ GDP‬הוא לא קושר‪.‬‬
‫• חלבונים שמחקים את המבנה של ה‪ tRNA‬ואז הם יכולת להתחרות איתו על האתרים בריבוזום‪.‬‬

‫‪Translation initiation‬‬
‫יש שלושה שלבים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬היחידה הקטנה של הריבוזום צריכה לזהות את אזור תחילת התרגום‪ .‬כלומר את הקודון הראשון של מסגרת‬
‫הקריאה‪ .‬קודון ההתחלה יגדיר את ה‪ .(Open Reading Frame( ORF‬החומצה האמינית הראשונה תמיד תהיה‬
‫מתיונין‪.‬‬
‫‪ tRNA .2‬שטעון במתיונין צריך להיכנס לאתר ‪ P‬שנמצא בתת היחידה הקטנה של הריבוזום ואז נוצרת אינטראקציה‬
‫עם הקודון של המתיונין‪ .‬הקודון הראשון במסגרת הקריאה תמיד יהיה של מתיונין ‪.AUG -‬‬
‫בסוף שלב זה באתר ‪ P‬של תת היחידה הקטנה יושב ‪ tRNA‬עם מתיונין‪.‬‬
‫‪ .3‬היחידה הגדולה מצטרפת וסוגרת על תת היחידה הקטנה‪ .‬בסוף השלב יש ריבוזום שלם עם ‪Methionyl tRNA‬‬
‫באתר ‪.P‬‬

‫ניתן לחלק את ה‪ mRNA‬למספר אזורים‪:‬‬

‫• ‪ - Open reading frame‬הקטע שיעבור תרגום‪.‬‬
‫• ‪ - 5' UTR‬לפני המתיונין‪ .‬לא עובר תרגום‪.‬‬
‫• ‪ - 3' UTR‬אחרי ה‪ stop‬קודון‪ .‬לא עובר תרגום‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫בחיידקים התהליך יותר מורכב‪:‬‬

‫בעוד שבאאוקריוטים לכל ‪ mRNA‬יש רק מסגרת קריאה אחת‪ ,‬בחיידקים‬
‫ובפרוקריוטים ייתכן ש‪ mRNA -‬אחד ייתן יותר מחלבון אחד‪ ,‬כלומר יהיו‬
‫מספר מסגרות קריאה ‪ -‬נקרא ‪ mRNA‬פוליציסטרוני‪.‬‬
‫בדוגמא יש ‪ 3‬מסגרות קריאה‪ ,‬כאשר כל מסגרת קריאה מתחילה ב‪AUG -‬‬
‫ונגמרת ב‪  STOP-‬יכולים להיווצר שלושה חלבונים שונים‪.‬‬

‫בפרוקריוטים לפני תחילת מסגרת הקריאה יש רצף שנקרא ‪Shine-( SD‬‬

‫‪ .)Dalgarno‬הרצף הזה מתאים לרנ"א שנמצא ביחידה הקטנה של הריבוזום‬
‫ועל ידי כך דואג להביא את היחידה קרוב לקודון ההתחלה ‪.AUG -‬‬
‫הערה‪ :‬יש וריאציות שונות של הרצפים האלו ‪ -‬יש כאלה שחזקים יותר ויש כאלה שחלשה יותר‪.‬‬
‫באאוקריוטים בתהליך האיניציאציה מדובר בתהליך של סריקה‪ .‬תת היחידה הקטנה מתחילה לסרוק מהקצה '‪ 5‬של‬
‫ה‪ mRNA -‬עד למפגש עם ה‪ AUG-‬הראשון‪.‬‬
‫ישנו רצף לפני ה‪ AUG-‬שמגדיר אותו טוב יותר כנקודת התחלת התרגום ‪ .Kozak sequence -‬אם ‪ 3‬בסיסים לפי ה‪-‬‬
‫‪ AUG‬יהיה ‪ A/GXXAUG : A/G‬ישנה הגדרה טובה יותר של קודון ההתחלה‪ .‬הרצף הזה לא הכרחי לתחילת התרגום‪.‬‬
‫בנוסף צריך לזכור שב‪ RNA‬של אאוקריוטים יש בקצה ה‪ 5‬פריים את ה‪ capping‬ובקצה ה‪ 3‬פריים זנב ‪.poly A‬‬

‫התהליך בפרוקריוטים‪:‬‬
‫▪ ‪ Shine-Dalgarno‬מביא את תת היחידה הקטנה של הריבוזום לאזור ה‪.AUG‬‬
‫▪ ‪ IF2‬שהוא חלבון בעל פעילות ‪ GTPase‬וה‪ tRNA‬של המתיונין נקשרים לתת היחידה‬
‫הקטנה של הריבוזום‪ .‬אתר ‪ A‬ואתר ‪ E‬חסומים על ידי ‪ IF1‬ו‪ IF3‬ולכן‬
‫ה‪ tRNA‬נקשר לאתר ‪.P‬‬
‫▪ בשלב הבא יש הידרוליזה של ה‪ GTP-‬והקומפלקס מתפרק ‪ -‬החלבונים משתחררים ותת‬
‫היחידה הגדולה נקשרת לתת היחידה הקטנה וסוגרת על ה‪ tRNA‬שבעמדה ‪.P‬‬
‫הערה‪ IF1, IF2, IF3 :‬נועדו לוודא שה‪ tRNA‬ייקשר לאתר ‪ P‬וגם למנוע את סגירת הריבוזום ע"י‬
‫תת היחידה הגדולה לפני הזמן‪.‬‬
‫כלומר ‪ 3‬השלבים בתהליך ה‪ Initiation -‬בפרוקריוטים הינם‪:‬‬
‫זיהוי של ה‪ ,AUG -‬הכנסת המתיונין לעמדה ‪ ,P‬סגירה של תת היחידה הגדולה‪.‬‬
‫כאשר מגיעים לקומפלקס הזה הסתיים תהליך ה‪.Initiation-‬‬

‫התהליך באאוקריוטים‪:‬‬
‫באאוקריוטים המנגנון מעט שונה מבפרוקריוטים‪.‬‬
‫▪ הזכרנו שהמודיפיקציות על הרנ"א (קאפינג וזנב פולי ‪ )A‬חשובות גם‬
‫להמשך התרגום ‪ -‬כדי שהתהליך יתחיל צריכה להיות אינטראקציה‬
‫בין קצה ‪ 3‬לקצה ‪ .5‬כתוצאה מכך נוצר מבנה מיוחד של מעין לולאה‪.‬‬
‫▪ בשלב הבא היחידה הקטנה של הריבוזום יוצרת אינטרקציה עם‬
‫הקצה ה‪ 5‬פריים של הרנ"א‪ .‬בשונה מפרוקריוטים היחידה מתחילה‬
‫לנוע על הרנ"א בכיוון השלוש פריים עד שהיא מוצאת את קודון‬
‫ה‪ .AUG‬הערה‪ :‬היחידה מלווה במספר חלבוני ‪ IF‬שעוזרים ליחידה‬
‫ליצור את האינטראקציה עם הרנ"א‪ .‬בנוסף ‪ tRNA‬עם מתיון קשור‬
‫לעמדה ‪.P‬‬
‫▪ בשלב הבא יש הידרוליזה של ‪ GTP‬ע"י שחקן נוסף וכל הפקטורים‬
‫משתחררים‪ .‬היחידה הגדולה מגיעה וסוגרת על הקומפלקס‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫התוצר הסופי בפרוקריוטים ובאאוקריוטים הוא אותו הדבר‪:‬‬

‫המנגנון שונה‪ :‬בפרוקריוטים זיהוי ה‪ AUG-‬נעשה בעזרת רצף ה‪ SD-‬שמכוון את תת היחידה הקטנה של הריבוזום‪.‬‬
‫באאוקריוטים הקומפלקס מתחיל לנוע עד שהוא מגיע ל‪.AUG-‬‬

‫‪Translation Elongation‬‬
‫שלב הארכת השרשרת הפוליפפטידית‪.‬‬
‫שלב זה גם כן מחולק לשלושה שלבים‪:‬‬
‫‪ - Decoding .1‬מציאת ה‪ tRNA-‬הנכון שאמור להגיע לאתר ‪.A‬‬
‫‪ - Peptide bond formation .2‬יצירת הקשר הפפטידי בין חומצה אמינית שנמצאת באתר ‪ P‬לבין חומצה אמינית‬
‫שנמצאת באתר ‪.A‬‬
‫‪ - Translocation .3‬תזוזה של הריבוזום‪ ,‬מעבר בין האתרים‪.‬‬

‫‪:Decoding‬‬
‫בתמונה נסתכל על התהליך שקורה מהחומצה‬
‫האמינית ה‪ 9‬שמתווספת‪:‬‬
‫באתר ‪ P‬יש ‪ tRNA‬שאליו מחוברת חומצה‬
‫אמינית (מתיונין אם מדובר בראשון)‪.‬‬
‫ה‪ tRNA‬עם החומצה האמינית הבאה צריך‬
‫להגיע לאתר ‪ .A‬זהו תהליך תרמודינמי ‪ -‬צריכה‬
‫להיות התאמה בין הקודון לאנטי קודון‪ .‬אם אין‬
‫התאמה הקשר יהיה חלש וה‪ tRNA‬יצא‪.‬‬
‫אם יש התאמה ה‪ tRNA‬ייקשר חזק יותר‪.‬‬
‫לאחר מכן יש הידרוליזה של חלבון בשם ‪ .)Elongation Factor - EF( EFTu‬בשלב הזה אם ה‪ tRNA‬לא נכון הוא עדיין יכול‬
‫לצאת החוצה‪ .‬כלומר לחלבון יש שני תפקידים‪ :‬עוזר ל‪ tRNA‬להגיע לאתר ‪ ,P‬מאפשר בקרה נוספת על זיהוי החומצה‬
‫האמינית הנכונה‪.‬‬
‫‪:Peptide bone formation‬‬
‫אם ה‪ tRNA‬שנכנס הוא הנכון‪ ,‬תהיה ריאקציה וייווצר קשר פפטידי‪.‬‬
‫הקצה האמיני של הח‪ .‬האמינית באתר ‪ A‬חופשי (הקצה הקרבוקסילי הוא זה שקשור‬
‫ל‪ )tRNA‬ולכן תוקף את הקצה הקרבוקסילי של הח‪ .‬האמינית שנמצאת בעמדה ‪.P‬‬
‫הסינתזה תמיד מקצה ‪ N‬טרמינלי לקצה ‪ C‬טרמינלי‪.‬‬
‫כלומר לאחר יצירת הקשר הפפטידי‪ ,‬הפפטיד עובר מעמדה ‪ P‬לעמדה ‪.A‬‬
‫הערה‪ :‬יש בריבוזום לולאות (‪ A loop‬ו‪ )P loop -‬שמורכבות מרנ"א ועוזרות לממקם את שני‬
‫ה‪ tRNA-‬בצורה כזאת שיוכל להיווצר הקשר הפפטידי‪.‬‬
‫‪:Translocation‬‬
‫לאחר שנוצר הקשר הפפטידי ישנה טרנסלוקציה‪:‬‬
‫חלבון ‪, EFG‬הדומה בצורתו ל‪ ,tRNA‬דוחף את ה‪ tRNA‬מעמדה ‪ A‬לעמדה ‪( P‬עושה זאת ע"י‬
‫פעילות של ‪ .)GTPase‬כך למעשה משחררים את אתר ‪ A‬לכניסה של חומצה אמינית‬
‫נוספת‪ .‬בנוסף ה‪ tRNA‬הריק שהיה בעמדה ‪ P‬נדחף לעמדה ‪ E‬ומשתחרר‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫‪Translation Termination‬‬
‫הסיום מתבצע כאשר אחד משלושת קודוני ה‪ stop‬מגיע לאתר ‪ .A‬תזכורת‪ :‬לסטופ קודון אין ‪ tRNA‬שמתאים לו‪.‬‬
‫חלבונים שנקראים ‪ )class 1 Release Factor( RF‬נקשרים לאתר ‪ ,A‬מפרקים את השרשרת הפפטידית מה‪tRNA‬‬
‫שנמצא בעמדה ‪ P‬וכך משחררים אותה מהריבוזום‪.‬‬
‫בפרוקריוטים ישנם ‪ 2‬סוגים של ‪ Release factors‬בהתאם לסוג ה‪.STOP codon-‬‬
‫באאוקריוטים יש סוג אחד של ‪ Release factors‬שמזהה את כל ‪ 3‬ה‪.STOP codon-‬‬
‫בפרוקריוטים ובאאוקריוטים לאחר שפקטור השחרור הראשון נקשר יש משפחה נוספת שנקשרת ‪.Release factor 2 -‬‬

‫קיים דימיון מבני שמאפשר לפקטור השחרור להיראות כמו ‪ ,tRNA‬להיכנס לאתר ‪ A‬ולבצע את‬
‫הראקציה של שחרור החלבון מאתר ‪.P‬‬
‫בתמונה‪ :‬באפור ‪ tRNA‬ובכחול ‪.RF‬‬

‫כיצד מתרחש התהליך?‬

‫פרוקריוטים‪:‬‬
‫ה‪ RF‬נקשר לאתר ‪ A‬וגורם לשחרור של‬
‫הפפטיד מה‪ .tRNA‬מזכיר בפעילות שלו את‬
‫חלבון ‪ EFG‬שעושה טרנסלוקציה‪.‬‬
‫בשלב הבא מגיע ‪ RF3‬שהוא ‪- GTPase‬‬
‫גורם לפפטיד לעזוב את הריבוזום‪.‬‬
‫לאחר מכן יש הידרוליזה של ‪ GTP‬לקבלת‬
‫הקומפלקס של הריבוזום השלם עם ‪tRNA‬‬
‫בעמדה ‪ P‬ו‪.mRNA‬‬
‫אאוקריוטים‪:‬‬
‫‪ RF‬מלווה בחלבון ‪ eRF3‬שעוזר לו להגיע לעמדה‬
‫‪ .A‬זה חלבון דומה למה שיש בפרוקריוטים רק‬
‫שכאן הוא גם מלווה את ‪.RF‬‬
‫החלבון ‪ eRF3‬מבצע הידרוליזה של ‪ GTP‬שמשנה‬
‫את המבנה שלו והוא משתחרר (הפפטיד עדיין‬
‫קשור לאתר ‪.)A‬‬
‫מגיע עוד חלבון עם פעילות ‪ ATPase‬שנקשר ל‪ RF‬והוא זה שגורם לשחרור של הפפטיד‪.‬‬
‫בסיום התהליך בשני המקרים נשארים עם אותו המבנה‪ :‬ריבוזום שלם‪.mRNA ,tRNA ,‬‬
‫הערה‪ :‬באאוקריוטים עדיין יש חלבון שקשור באתר ‪.A‬‬

‫‪Ribosomal recycling‬‬
‫פרוקריוטים‪:‬‬
‫מגיע פקטור מיחזור בעל פעילות של ‪.GTPase‬‬
‫הוא דוחף את ה‪ tRNA‬שנמצא בעמדה ‪.P‬‬
‫הריבוזום נפתח‪ ,‬ה‪ mRNA‬וה‪ tRNA‬משתחררים‪.‬‬
‫ליחידה הקטנה של הריבוזום נקשר ‪ IF3‬לאתר ‪ E‬כדי‬
‫למנוע סגירה של הריבוזום השלם‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫אאוקריוטים‪:‬‬
‫מלבד ה‪ tRNA‬בעמדה ‪ P‬יש בנוסף ‪ RF‬שאליו קשור חלבון עם פעילות‬
‫‪( ATPase‬נשארו בריבוזום משלב הטרמינציה)‪.‬‬
‫החלבון עובר הידרוליזה וכל הקומפלקס מתפרק‪.‬‬
‫גם כאן יש גם פקטורים שחוסמים את היחידה הקטנה כדי שהיחידות לא‬
‫יתחברו‪.‬‬

‫טעויות בתרגום‪:‬‬
‫‪ - Nonsense suppression .1‬כאשר קודון סטופ מזוהה על ידי ‪ tRNA‬והתרגום ימשיך‪.‬‬
‫תוצאה‪ :‬חלבון יותר ארוך במספר חומצות אמינו ‪ -‬יתווסף לו חלק‪.‬‬
‫‪ - Frameshifting .2‬כאשר ‪ tRNA‬לא מזהה את הקודון שלו נכון‪.‬‬
‫תוצאה‪ :‬שינוי מסגרת הקריאה‪ ,‬מאותה נקודה החלבון לא יהיה תקין‪ .‬הרבה יותר הרסני מאשר החלפה של חומצה‬
‫אמינית אחת בשנייה במקום מסוים‪.‬‬

‫‪:Gene expression regulation‬‬

‫הבקרה על ביטוי הגנים יכולה לעשות במספר נקודות לאורך התהליך‪:‬‬

‫אנחנו נתמקד בבקרה על שעתוק גנים‪.‬‬

‫מושגים‪:‬‬
‫פקטורי שעתוק ‪ -‬חלבונים שקושרים דנ"א ומשפיעים על הבקרה של פעילות הגנים‪.‬‬ ‫•‬
‫רצפים רגולטורים ‪ -‬הרצפים בדנ"א שאליהם נקשרים פקטורי השעתוק‪ .‬בדר"כ‬ ‫•‬
‫הרצפים נמצאים במעלה הזרם לפרומוטור‪.‬‬
‫אופרטורים ‪ -‬כך נקראים הרצפים הרגולטוריים בבקטריות ‪ -‬אלו אותם רצפים‬ ‫•‬
‫שמזוהים על ידי חלבונים ‪.TF‬‬

‫סוגי פקטורי שעתוק‪:‬‬

‫‪ .1‬אקטיבטור ‪ -‬מעודד את השעתוק‪.‬‬
‫‪ .2‬רפרסור ‪ -‬מעכב את השעתוק‪ .‬לדוגמא‪ :‬כאשר יש חפיפה בין הפרומוטור לרפסור‪,‬‬
‫חלבון שיקשר לרפרסור ימנע מרנ"א פולימראז להיקשר לפרומוטור‪.‬‬
‫‪ .3‬חלבונים שנקשרים ומשנים את המבנה של הדנא‪ .‬כתוצאה מכך הם מביאים‬
‫אופרטורים לאזורים המסוימים במרחב ביחס לפרומוטור‪ ,‬יכול להפעיל\לעכב את‬
‫תהליך השעתוק‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫בדר"כ החלבונים שנקשרים לאופרטורים לא משפיעים באופן ישיר על השעתוק‪.‬‬

‫לרצפים הרגולטוריים של הדנ"א נקשרים חלבוני ‪ TF‬ואליהם ייקשרו עוד חלבונים‬
‫שהם אלה שיבצעו את הפעילות המסוימת‪.‬‬
‫החלבונים שמבצעים את הפעולה נקראים ‪ co-activator‬או ‪.co-suppressor‬‬
‫כלומר זה רב שלבי‪.‬‬

‫חלבונים שנקשרים לדנ"א‪:‬‬

‫חלבון בעל מבנה מאוד‬ ‫‪.1‬‬
‫פלקסבילי‪ .‬כאשר הוא פוגש את‬
‫הדנ"א הוא מתייצב למבנה של‬
‫שני הליקסים (באדום ובכחול)‬
‫ו"מתלבש" על הדנ"א‪.‬‬
‫חלבון בעל דומיין שקושר אבץ‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫חלבון בעל דומיין בצורת הליקס‬ ‫‪.3‬‬
‫שנקשר לדנ"א ‪" -‬הומודומיין"‪.‬‬
‫חלבון עם דומיין של שני‬ ‫‪.4‬‬
‫הליקסים (אדום וכחול)‪ ,‬בינהם‬
‫יש זווית מוגדרת שמאפשרת‬
‫להם להיכנס ל‪ major groove‬של הדנ"א‪.‬‬

‫דוגמאות לבקרה על השעתוק‪:‬‬

‫טריפטופן וחיידקים‪:‬‬
‫חיידקים יכולים לסנתז את חומצת האמינו טריפטופן‪ ,‬לצורך הסנתוז‬
‫הם צריכים לייצר מספר אנזימים‪.‬‬
‫במידה וחיידק גדל בסביבה עם טריפטופן‪ ,‬הוא לא צריך לייצר את‬
‫הטריפטופן בעצמו ולכן אין טעם לסנתז את האנזימים המעורבים‬
‫בסינתזה‪.‬‬
‫לכן יש רפרסור‪ .‬הוא נקשר לאופרטור רק כאשר הוא קשור‬
‫לטריפטופן ומונע מדנ"א פולימראז להיקשר לפרומוטור‪.‬‬
‫בחיידקים תהליך השעתוק והתרגום מצומדים כי שניהם קורים‬
‫בציטופלזמה‪ .‬לכן יש מנגנון נוסף לעצירת התהליך‪:‬‬
‫בתחילת ה‪ mRNA‬ישנו רצף שעשיר בקודונים לטריפטופן‪.‬‬
‫▪ כאשר יש מחסור בטריפטופן‪ :‬הריבוזום ינוע לאט כי הוא‬
‫יתקע על כל קודון כזה ‪ -‬ייקח לו זמן למצוא ‪ tRNA‬עם‬
‫טריפטופן בגלל שאין הרבה בתא‪.‬‬
‫במקרה שהתרגום איטי‪ ,‬אזורים ‪ 2‬ו‪ 3‬בציור מספיקים ליצור‬
‫מבנה של ‪( stem loop‬הם קומפלימנטרים)‪ .‬המבנה הזה לא‬
‫גורם לטרמינציה והשעתוק יכול להמשיך‪.‬‬
‫▪ כאשר יש מספיק טריפטופן בתא‪ :‬הריבוזום יוכל לנוע מהר‬
‫מאחר והוא מוצא בקלות למצוא ‪ tRNA‬עם טריפטופן‪.‬‬
‫התרגום המהיר מונע מאזור ‪ 2‬ליצור קומפלימנטציה עם ‪.3‬‬
‫כתוצאה מכך אזור ‪ 3‬עובר קומפלימנטציה עם אזור ‪ - 4‬אחרי‬
‫המבנה הזה יש ‪ UUU‬וזה מוביל לטרמינציה של השעתוק‪.‬‬
‫הערה‪ :‬המנגנון הזה לא יעבוד באאוקריוטים כי אין צימוד!‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫לקטוז וחיידקים‪:‬‬
‫חיידקים יכולים לייצר אנרגיה מלקטוז ע"י‬
‫פירוקו לגלוקוז וגלקטוז‪ .‬הדבר מצריך השקעת‬
‫אנרגיה ולכן במידה ויש מספיק גלוקוז בתא אין‬
‫סיבה לפרק לקטוז‪ .‬לכן יש בקרה על האנזימים‬
‫שמפרקים אותו‪.‬‬
‫כדי שהאנזימים האלו ייוצרו יש צורך בשני‬
‫תנאים‪ :‬שלא יהיה גלוקוז בתא ושיהיה לקטוז‪.‬‬
‫הערה‪ :‬כאשר ריכוז הגלוקוז נמוך יש עליה‬
‫בכמות ה‪ cAMP‬בתא‪.‬‬
‫לפני הגנים של האנזימים האלו יש אופרטור‬
‫בשם ‪ - CAP‬אליו נקשר אקטיבטור שמופעל על‬
‫ידי ‪( cAMP‬לא בטוחה שככה זה עובד) ולכן‬
‫יופעל כאשר רמת הגלוקוז בתא נמוכה‪.‬‬
‫בנוסף לאקטיבטור יש את ‪ - LAC‬רפרסור לגנים‪.‬‬
‫כאשר הרפסור נקשר ללקטוז הוא מתנתק‬
‫מהאופרטור של הגן ומאפשר את השעתוק‪.‬‬

‫פתיחת פרומוטור‪:‬‬
‫למדנו שבפרומוטורים יש אזורים קבועים‪ :‬אחד באזור ‪ -10‬ואחד באזור ‪.-35‬‬
‫הזכרנו שיש בינהם מרחק שנע בין ‪ 17‬ל‪ 19‬נוקלאוטידים‪.‬‬
‫אקטיבטורים יכולים לשחק עם המרחק הזה‪ .‬לדוגמא אקטיבטור יכול להיקשר לפרומוטור עם מרווח של ‪19‬‬
‫נוקלאוטידים ולשנות את המבנה כך שזה יהיה יותר דומה למרווח של ‪ 17‬נוקלאוטידים‪.‬‬

‫מבנה הכרומטין‪:‬‬
‫ההשפעה על מבנה הכרומטין יכולה לגרום לשינוי בהתבטאות הגן‪.‬‬
‫דוגמאות‪ :‬החלפה‪/‬הסרה של היסטונים‪ ,‬מודיפיקציה להיסטונים‪ ,‬גיוס חלבונים שמזהים מודיפיקציות שיגרמו לשינוי‬
‫מבנה הכרומטין וכך יחשפו את הפרמוטור ויאפשרו את תחילת השעתוק‪.‬‬

‫‪Transcriptional synergy‬‬
‫חיבור של שני אלמנטים יגרמו לתגובה חזקה יותר מאשר חיבור רגיל‬
‫של שניהם‪.‬‬
‫הם ישתפו פעולה ויגבירו את היעילות אחד של השני‪.‬‬
‫כלומר במקרה הזה ‪ 1+1‬לא שווה ‪ 2‬אלא שווה ‪.100‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫מנגנון רפרסורים באאוקריוטים‪:‬‬

‫‪ .1‬בעזרת עיכוב תחרותי ‪ -‬האקטיבטור והרפסור מתחרים על אותו אזור בדנ"א‪.‬‬
‫כלומר אפשר לשחק ביחס בין כמות הרפרסור לכמות האקטיבטור‪.‬‬
‫‪ .2‬במידה והרפרסור והאקטיבטור נקשרים לאזורים קרובים בדנ"א‪ ,‬הרפרסור יכול‬
‫ליצור אינטרקציה עם האקטיבטור ובכך יפריע לו להיקשר לחלבונים נוספים‪.‬‬
‫‪ .3‬הרפרסור נקשר בצורה שבה האקטיבטור לא יכול להגיע לאזור השעתוק‬
‫ולהגביר את שעתוק הגן‪.‬‬
‫הערה‪ :‬יש גם שיטות שמערבות היסטונים שכבר הזכרנו אותם בהרצאות של‬
‫עמליה‪ .‬אם בכל זאת רוצים לרענן את הזיכרון‪ :‬מצגת ‪ 4‬עמודים ‪( 24-26‬המצגת של‬
‫ראובן)‪.‬‬

‫בידוד רצף‪:‬‬
‫חלק מהאזורים הרגולטוריים נמצאים בין שני גנים‪ ,‬אולם הם משפיעים רק על ביטוי גן אחד‪.‬‬
‫בדנ"א יש אלמנטים מבודדים‪ ,‬אליהם נקשרים חלבונים שגורמים לקיפול הדנ"א בצורה כזאת שהאזור הרגלוטורי יהיה‬
‫קרוב לגן שעליו הוא אחראי ולא לגן הקרוב השני‪.‬‬
‫בתמונה‪:‬‬
‫בדוגמא משמאל רואים ששני הגנים במרחק זהה מהאזור הרגולטורי ולכן הוא יכול להשפיע על שניהם‪.‬‬
‫בדוגמא מימין המבנה המרחבי השתנה וכעת האזור הרגולטורי יוכל להשפיע רק על הגן שקרוב אליו בעוד הגן השני‬
‫מבודדץ‬

‫‪Regulation of translation‬‬
‫מחסור בחומצות אמינו‪:‬‬
‫במצב תקין כאשר ‪ tRNA‬משתחרר מהריבוזום הוא ישר נטען בחומצת אמינו חדשה‪.‬‬
‫נוכחות של ‪ tRNAs‬לא טעונים בתא מעידים על מחסור בחומצות אמינו‪ ,‬במקרה כזה צריך להפסיק את סינטזת‬
‫החלבון‪.‬‬
‫זיהוי המחסור בפרוקריוטים‪:‬‬
‫כאשר לעמדה ‪ A‬נקשר ‪ tRNA‬ללא חומצת אמינו זה מסמן‬
‫שיש בעיה בתא ‪ -‬אין מספיק חומצות אמינו‪.‬‬
‫הדבר גורם לחלבון שנקרא ‪ RelA‬להיקשר לריבוזום ובעזרת‬
‫‪ ATP‬ליצור מולקולה בשם ‪ - PPGPP‬גואנוזין פנטפוספט‬
‫(גואנין עם חמישה פוספטים)‪ .‬המולקולה גורמת לעצירה של‬
‫תהליכי שעתוק וכיוון השעתוק רק לגנים מאוד ספציפים‬
‫שיכולים לעזור בסינתזה של חומצות אמינו‪.‬‬
‫ביולוגיה מולקולרית ‪2018‬‬ ‫יסמין אדר (בעזרת סיכום של יהב בן דוד כפיר)‬

‫זיהוי המחסור באאוקריוטים‪:‬‬

‫‪ tRNA‬לא טעון יזוהה על ידי חלבון שנקרא ‪.Gcn2‬‬
‫כתוצאה החלבון מזרחן את ‪Initiation ( eIF2‬‬
‫‪ )factor‬והוא נקשר לחלבון בשם ‪.eIF2B‬‬
‫הקומפלקס המזורחן גורם לו לאבד את הזמינות‬
‫שלו לעבוד בתור פקטור שמלווה את ה‪ tRNA‬אל‬
‫הריבוזום והתרגום נפסק‪.‬‬
‫המנגנון‪:‬‬
‫כאשר הקומפלקס לא מזורחן ‪ eIF2B‬עוזר להחליף‬
‫את מולקולת ה‪ GDP‬ב‪.GTP‬‬
‫אולם פוספורילציה גורמת לקומפלקס הזה להתקע‪,‬‬
‫כך שלא מקבלים מולקולת ‪ eIF2‬עם ‪.GTP‬‬

‫שינוי בטמפרטורה‪:‬‬
‫המבנה של הרנ"א משתנה כפונקציה של הטמפרטורה‪.‬‬
‫השינוי במבנה המרחבי מאפשר עוד סוג של בקרה על התרגום‪.‬‬
‫לדוגמא‪:‬‬
‫בטמפ' של ‪ 30‬מעלות אזור ה‪ SD‬שחשוב לתחילת תהליך התרגום חסום ולכן לא‬
‫נגיש לריבוזום ‪ -‬לא יהיה תרגום‪.‬‬
‫בטמפ' של ‪ 37‬מעלות האזור נגיש ולכן הריבוזום יוכל להיקשר לרנ"א ולבצע את‬
‫התרגום‪.‬‬

‫אינטרקציה עם ויטמינים‪:‬‬
‫לדוגמא אינטרקציה של רנ"א עם תיאמין (ויטמין ‪ ,)B1‬כתוצאה מכך‬
‫הרנ"א משנה את המבנה המרחבי שלו‪ ,‬האזור ‪ SD‬לא זמין לריבוזום‬
‫ולכן לא יהיה תרגום‪.‬‬

‫תחרות בעקבות מבנה מרחבי זהה‪:‬‬

‫לדוגמא‪:‬‬
‫‪ .Threonyl-tRNA Synthetase - ThrRS‬זהו האנזים שמצמיד ל‪ tRNA‬של תראונין את החומצה האמינית תראונין‪.‬‬
‫ל‪ mRNA‬של הגן ליצירת האנזים יש מבנה דומה למבנה של ה‪ tRNA‬של תראונין ולכן האנזים יכול לקשור את שניהם‪.‬‬
‫כאשר יש מספיק ‪ tRNA‬טעונים לא צריך את האנזים‪ ,‬ולכן מה שיקרה ‪ -‬האנזים יקשר ל‪ mRNA‬שלו במקום ל‪tRNA‬‬
‫שלו ועל ידי כך יעכב את התרגום שלו עצמו‪.‬‬

‫עיכוב על ידי חלבונים‪:‬‬

‫שקף חדש שאין במצגת‪ ,‬פספסתי מה בדיוק אמר עליו‪ ,‬בגדול‪:‬‬
‫קיים חלבון שמונע מ‪ E4‬להתחבר ל‪ G4‬כך לא ניתן ליצור את המבנה הלולאתי שדרוש‬
‫לשלב הראשון של תהליך התרגום‪.‬‬
‫פוספורילציה של ‪ E4‬תגביר את תהליך התרגום כי היא תאפשר את הסגירה של‬
‫הלולאה‪.‬‬