ЕЛИСА МЕТОД

Елиса е кратенка за Enzyma Lined Immunosorbent Assay ,таа служи за одредување на количество на
антитела или на антигени кои ни се од интерес.Пример во даден раствор сакаме да видиме дали
имаме некои антитела и ако имаме колку имаме,освен што можеме квалитативно да одредиме дека
има може и колку има квантитаивно.И генерално за квантитаивни анализи се користи,бидејки а
квалитативна анализа постојат и други техники кои се релативно поефтини .Има ралзични елиса
техники.

Индиректна ЕЛИСА :се земаат претходно подготвени бунарчиња на кои има вметнато на
површината слој врз кој се ставени некои антигени кои ни се од интерес и поентата е со тие
антигени кои така ги купуваме можеме да видиме дали во некој раствор да речеме серум од некој
пациент и сакаме да видиме дали во серумот има антитела комплементарни на антигени на
површината од садот ,кои ако би имало би требало да се врзат со антигените од површината на
садот.Серумот го ставаме во бунарчето и бројни антитела од серум за кои нема соодветни антигени
на површина на сад ке си плутаат во раствор нема да се врзат нема за што додека соодветните за
кои има антигени ке се врзат со антигените од површина на садот на бунарчето и прво вишокот ке го
декантираме потоа го испираме бунарчето со пуфер со цел да се тргнат сите антитела кои не се
врзале за антигени.Бидејки оние кои се врзале ке останат укотвени на површина од бунарче а оние
кои не се врзале се декантираат сакаме да ги одстраниме.Откога тоа ке го направиме добиваме
бунарче на кое ги има антигени соодветни со антитела врани за нив.Потоа додаваме друг раствор од
антитела кои се специфични за Fc регионот на антителата кои се веќе врзани(портокалови) и кога ке
ги ставиме овие кои се специфични(жолти) тие ке се залепат за Fc регионот на портокалово антитело
и се наречени секундарни антитела овие жолтите.Додека протокаловите кои ги ставивме уште на
почеток се примарни антитела.Е сега зошто ги ставивме скеундарните антитела тие не се најобични
туку на врвот имаат прикачено еден ензим кои се биокатализатори што забрзуваат одредени
хемиски реакции,и откога ке го направиме тоа оставаме да постои некое време и пак го правиме
истото декантираме и пак испираме со пуфер некој за да ги испереме сите секундарни антитела кои
не се врзале бидејки ние ставаме во вишок секундарни(жолти) антитела,и тоа што ке ни остане
всушност по испирање се антигените со антитела од пациентот и за нивен Fc регион врзани
секундарни антитела кои на врв имаат ензим.Земаме раствор сега кој на почеток е безбоен и го
ставаме внатре во бунарче со примарните и секундарните антитела и ензимот кој е на секундарните
антитела ке почне да реагира со сивите молекули кои беа безбојно соединение и ке ги конвертира
во одреден обоен продукт=виолетово пример. Но ова нема да се случи веднаш бидејки ензимот
зема молекула по молекула и го прави сето тоа и ако оставиме доволно долго време сите безбојни
молекули ке станат обоени но ние не оставаме да трае процесот во бесконечност едноставно го
прекинуваме после дадена стандардизирана временска рамка пример 5 минути. И ке се прекине
реакцијата ,на почетокото значи кога ке ја ставиме безбојната супстанца какко поминува време
бојата ке е розевкаста па ке оди накај виолетова се поинтензивно виолетова,но ние не го оставаме
да трае туку одредуваме една стандардна временска граница со цел сите проби исто време да ги
држиме и за 5 мин да завршиме.По 5 минути ензимот го деактивираме со додавање сулфурна
киселина или ја зголемуваме температура или додаваме некои други хемиски супстанци кои ке ја
прекинат реакцијата и таа на 5 мин ке запре.Врз база на тоа колку е силно обојувањето тоа ни
укажува колкава е количината на антителата и примарните и секундарните.Ако имаме 3 бунарчиња
и во #1 имаме серум од човек во негов серум имало само 1 антитело кое ке се врзе за антигенот
примарен и на него секундарно антитело со ензим кај второ бунарче имаме серум од втор пациент
#2 и во негов серум имало 2 антитела со 2 секундарни и ензими и во бунарче #3 имало серум од
трет пациент со 3 антигени и на нив 3 примарни антитела и 3 секундарни со езним.Поентата е во
исто време во сите овие бунарчиња да ставиме безбоен раствор и во сите во исто време ке го
ставиме и чекаме 5 мин тече време поминуваат и во сите ставаме одма сулфурна киселина или
хлороводородна и прекинува реакцијата.Е сега во #1 бидејки има само 1 ензим обојување за 5 мин
нема да биде некое си многу силно зашто само 1 ензим треба да постигне сите овие молекули кои се
безбојни да ги направи обоени.Кај број #2 всушност бидејки имаме 2 ензима реакцијата е 2х
подалеку и ке имаме поинтензивно обојување,во број #3 пак имаме најинтензивно обојување
бидејки имаме 3 ензими и врз база на тоа ако направиме ваков експеримент каде ке ни биде
познато колку примарни антитела сме ставиле и колку секундарни сме ставиле и ако измериме
апсорбанца на сите 3 може да конструираме стандардна крива каде на х оска ке ставиме конц на
антитела а на y оска апсорбанца ке ставиме и сите анализи за 5 мин се прават,па графикот ке
изледа вака:колку повеќе антитела имаме толку апсорбанца ке е поголема ке имаме поинтензивно
обојување на раствор.Стандардната крива ке се направи кога ке знаеме од кое колку сме ставиле и
кога ке се направи може да земеме едно бунарче во кое ке ставиме се како треба ке го ставиме
безбојниот раствор и ке чекаме некое време да помине ке се обои до некој степен ке отчитаме
апсорбанца на непознатиот ке рече пример дека е 0,2 и на крива одиме гледаме каде се пресекува и
ке најдеме број на антитела.И така може да одредиме колку всушност антитела има во некој
непознат раствор.

Освен преку индиректна ЕЛИСА ние може да

користиме и т.н СЕНДВИЧ ЕЛИСА каде што не се
одредува количество на концентрација на
антитела туку се одредува количество на
концентрација на антигени.Имаме бунарче
фабрички обработено така што на негова
површина се залепени антитела(црвени) и се
примарни и е поврзуваат само со црвен антиген
ние имаме серум каде има различни антигени
порокалови виолетови сини и црвени е сега
како ке одредиме колкаво количество и дали
воопшто имаме некој антиген во дадениот
серум.Ке го ситуриме серумот во бунарче и ке
дојдат во контакт виолетово портокалово жолто
и црвено антиген и да речеме имаме 2 црвени ке се врзат за црвените антитела и откога тоа ке се
случи декантираме промиваме со пуфер и ке се одстране се што не треба и она кое ке се добие е
бунарче со вкотвени антитела 4 и 2 од нив поврзани со антиген,откога го имаме тоа додаваме
секундарно антитело спремен раствор со некои сини секундарни антитела кои ке се врзат со црвен
антиген но со друг епитоп на антигенот и ке се поврзат за другиот епитоп на антигените црвени кои
се врзани за црвените примарни антитела и поради структура која се обраузва како сендвич се вика
СЕНДВИЧ ЕЛИСА.Откога го имаме овој сендвиич нормално секундарно антитело има ензим и голем
дел не се врзале од секундарни антитела лебдат во растворот и на
нив има ензим и затоа пак декантираме и промиваме и поентата е
тоа што ке го добиеме во бунарче со вкотвени антитела антиген
нивен и секундарни антитела со ензим додаваме безбоен раствор
каде ензимот ке го конвертира во обоен раствор и ке се добие боја
и врз база на тоа колку е обоено мериме апсорбанца имаме
стандардна крива која сме ја направиле со проби каде сме знаеле
колку антиген има и ке добиеме кирва а врз база на апсорбанца
која сме ја добиел за непознатото ја нанесуваме на y оска и
бараме пресек со стандардната крива и наоѓаме колкава е
концентрацијата на антигенот.

Компетитивна ЕЛИСА :Кај оваа елиса имаме примерок во кој имаме даден антиген (црвен) но
незнаеме колку е сега земаме антитела 100 пример и ги ставаме во растворот и знаеме дека ке се
врзат со тие антигени во растворот и ги оставаме да се инкубираат и некои ке се врзат некои ке
останат слободни и откога ке помине време земаме од тој раствор и го ставаме во бунарче во кое го
има црвениот антиген и го ставаме растворот кој се инкубирал и дел од антителата си се врзале со
антигените кои биле во растворот а дел не се врзале и останале слободни само тие кои останале
слободни од првична тест проба ке се врзат за овие антигени од бунарчето и ке направиме
декантирање промивање и тоа кое ке го добиеме е бунарче со црвени антигени и за нив врзани
антитела кои во првиот примерок не се врзале туку останале и потоа пак ставаме екундарно
антитело кое ке се врзе за примарното за Fc регионот на секундарното антитело имаме ензим и пак
ке испираме декантираме и на крај добиваме бунарче со потребни елементи и во него ставаме
безбоен раствор кој по 5мин ке даде обојување и врз база на обојување може да одредиме колку
антигени имало на почеток ,да речеме дека имаме обвојување со апсорбанца пример 0.1 и од
стандардна крива гледаме дека е тоа 3 антитела значи дека сме имаел 3 антитела кои биле врзани а
ние на почеток ставивме 100 ,значи 97 се врзале и сме ги ситуриле и измиле затоа 97 се врзале и
сме имале 97 антигени во серумот уште на почеток.100 сме ставиле 97 се врзале останале само 3
слободни кои зафатиле одредени позиции во бунарче.

Директна ЕЛИСА:И со оваа метода тестираме колку антигени има.Имаме бунарче во кое има некоја
супстанца врз која може да се залепат одредени антигени и имаме одреден примерок каде сметаме
дека има одредени антигени од интереси кои сакаме да тестираме дали ги има пример зелени се.Го
ставаме примерокото во празното бунарче во кое има “лепак“ и го оставаме одредено време да
одстои и самите антигени со тек на време ке си се испозалепат по површина на бунарче и ке го
оставиме така 24 часа и ке го истуриме раствор и ке добиеме бунарче врз кое ке има антигени и сега
ние незнаеме колку антигени има и затоа во бунарче додаваме антитела на кои ке има ензим
директно на нив и ке ги додадеме и тие ке си се исповрзат за антигените и ке останат некои
слободни антитела кои нема да се врзат со ништо и затоа после некое време ке декантираме и
измиеме и на површина ке останат само тие кои се врзале со антигенот и пак ставаме безбоен
супстрат кој ке се обои и врз база на обојување ке одредиме концентрација на антигени .Ова е
побрза метода зашто не користиме 2 антитела ги оставаме антигени да се залепат и само додаваме
антитела кои имаат ензим на нив кои се специфични за тој антиген и ке ги измиеме тие кои се
врзале и понатаму врз база на обојување ке видиме колкава била конц на антигени во првичниот
раствор и ова е директна елиса.

ЕЛИСПОТ АНАЛИЗА:која е исто така базирана на ЕЛИСА само што наместо да одредуваме колку
антигени антитела има во даден раствор одредуваме кои клетки од дадена популација продуцираат
антитела или антигени.Да речеме дека имаме еден петриев сад каде имаме некоја популација на
клетки и незнаеме кои од тие клетки ни прават одредени антитела и како тоа да го одредиме?
Земаме друга петриевка чија цела површина ке биде обложена со одреден антиген и ке ја ставиме
популацијата од клетки врз нив и да речеме дека клетки во еден регион само продуцираат такви
антитела портокалови или соодветни за антигените од површина на петирев сад.И тие антитела ке
се врзат за антигените на место каде се продуцираат,потоа ги трзаме во парчиња клетките на страна
и ке направиме промивање и ке додадеме секундарно антитело кои ке се врзат на примарните
антитела кои се веќе прикачени за антигените од петриев сад секундарни антитела имаат ензим и тој
ензим ке претвори супстрат одреден во продукт правиме промивање за да ги тргнеме секундарните
антитела кои не се врзале и добиваме плоча каде во еденд ел ке имаме ензими на секундарни
антитела и кога ке го ставиме безбојниот раствор само во тој дел каде се создале антителата ке стане
виолетово обоен и поентата е дека таму стоела популација на клетки која ја знаеме и таа ни го прави
тоа антитело од интерес.Може да биде и обратно антитела на површина од петриев сад а да видиме
која популација на клетки ни прави цитокини и место антигени ке вметнеме антитела кои се врзани
за тие цитокини и како сендвич елиса ке биде само што ке добиеме продукција на даден антиген
или антитело од страна на клетките.