2.2.

Các kỹ thuật chiết tách hợp chất hữu cơ [2, 6, 12, 17]
2.2.1. Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Nguyên tắc: Dung môi không phân cực (ether dầu hỏa, n-hexane,…) sẽ hòa tan
tốt các hợp chất có tính không phân cực (các ancol béo, ester béo,…). Dung môi phân
cực trung bình (diethyl ether, chloroform,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực
trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether -O-, aldehyde -CH=O, ceton -CO-,
ester -COO-,…). Dung môi phân cực mạnh (methanol,…) hòa tan tốt các hợp chất có
tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH,…).
Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng thường được áp dụng để chiết hợp chất cần quan tâm
ra khỏi dung dịch ban đầu và phân chia cao ancol thô ban đầu chứa nhiều loại hợp
chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực
khác nhau. Trong trường hợp này, cao ancol thô ban đầu có dạng sệt dẻo hoặc dạng
bột khô, trong khi đó kỹ thuật chiết lỏng-lỏng cần có một pha nước để làm pha căn
bản, vì vậy cần hòa tan cao ancol thô này vào nước. Trong thực nghiệm, cao ancol thô
thường hòa tan rất kém trong nước, để khắc phục điều này, trước tiên phải hòa tan cao
ancol vào một lượng tối thiểu ethanol, tiếp theo rót dung dịch ethanol này vào một
lượng lớn nước.
Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện trong bình, trong đó cao ancol thô ban đầu
được hòa tan vào pha nước. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan
với nước hoặc loại có thể tạo hỗn hợp với nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp
chất có tính phân cực khác nhau. Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà
pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước. Việc chiết được thực hiện lần
lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực như ether dầu hỏa
hoặc n-hexane, ether ethyl, chloroform, ethyl acetate, butanol,…Với mỗi loại dung
môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung
môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung
môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan
nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, đuổi dung môi thu được
cao chiết.
Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như
các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất thì có thể
sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và
của pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần
chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng
như pha hữu cơ. Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một dung dịch chiết lần thứ n lên
trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt
kiếng. Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng có nhược điểm là do lắc bình lóng nhiều lần,
nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn
trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các
cách như trình bày sau hoặc sử dụng phương pháp trích pha rắn.
Một vài lưu ý khi sử dụng dung môi trong chiết lỏng-lỏng:
- Khi dung môi trong bình chiết tạo nhũ tương, sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào
trong bình chiết, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng
của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp.
Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm dung dịch.
- Muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitrile và nước. Một lượng tối
thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitrile:nước (1:1) sẽ
làm dung dịch này tách thành hai lớp, lớp trên với lượng thể tích nhỏ là acetonitrile,
lớp dưới với lượng thể tích nhiều là nước. Nếu tiếp tục cho thêm NaCl vào hỗn hợp
dung dịch nói trên thì lớp acetonitrile càng tách ra càng nhiều.
- Độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước.
2.2.2. Kỹ thuật chiết rắn-lỏng
2.2.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém,
phức tạp.
Dụng cụ: Gồm một bình bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một
van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để
hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi
tinh khiết.
Tiến hành: Thân, rễ hoặc lá cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu
không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn hoặc mẫu có tính
nhầy nhựa hoặc có thể trương nở,… sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt
được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, trên lớp
bông thủy tinh gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên
bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ
từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp
mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thường là
12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chảy ra từng giọt và đồng thời mở
khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho
vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết
chảy ra khỏi bình này.
Hiệu quả của phương pháp: So với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này
đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn,
vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất
sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết. Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột
cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để
bốc hơi và xem còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã
chiết kiệt.
Ưu điểm: Dược liệu được chiết kiệt, dịch chiết đầu đậm đặc.
Nhược điểm: Năng suất thấp, lao động thủ công.
2.2.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật ngâm dầm cũng tương tự kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi
hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm
bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy.
Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây
nhầm lẫn là hợp chất đó có trong cây.
Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ
yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào
cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được
lọc qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có cao chiết. Tiếp theo rót dung môi mới
vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi
chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn,
xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ. Mỗi lần ngâm dung
môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ
hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Dung
môi sau khi thu hồi, được làm khan và cất quay chân không để thu hồi dùng cho lần
sau.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện.
Nhược điểm: Năng suất thấp, thao tác thủ công. Mất nhiều thời gian, có thể từ
vài giờ đến vài tuần. Chiết một lần thì chưa kiệt, chiết nhiều lần thì tốn dung môi.
2.2.2.3. Kỹ thuật chiết Soxhlet
Bột thực vật xay thô được đặt trong một túi vải và đặt trong ngăn chiết của bộ
Soxhlet. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu và đun hồi lưu. Lưu ý thể tích dung
môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu. Dung
môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông
xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ bột cây. Ở bình cất, chất tan
được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp bột
cây để hòa tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi bột cây được chiết kiệt.
Ưu và nhược điểm của kỹ thuật chiết Soxhlet:
Ưu điểm Nhược điểm
- Tiết kiệm dung môi. - Kích thước của bộ Soxhlet làm giới hạn lượng mẫu
- Không tốn công lọc và cần chiết. Máy loại lớn nhất với bình cầu dung tích 15
châm dung môi mới. lít, có thể chứa 10 lít dung môi và ngăn chiết chứa
- Chiết kiệt hợp chất trong 800g mẫu. Với máy nhỏ hơn, chỉ có thể cho vào mỗi
mẫu vì mẫu luôn được chiết lần vài trăm gam mẫu, muốn chiết lượng lớn cần phải
bằng dung môi tinh khiết. lặp lại nhiều lần.
- Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các
chất kém bền nhiệt dễ bị phá hủy như carotenoid.
- Không thực hiện được sự khuấy trộn.
- Do toàn hệ thống đều bằng thủy tinh gia công nên
giá thành của thiét bị khá cao, lại dễ vỡ và khó tìm
được các bộ phận thay thế.
2.2.2.4. Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn hơi nước
Kỹ thuật này đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính chất
bay hơi được như tinh dầu. Muốn khảo sát tinh dầu của cây nên tiến hành việc lôi
cuốn hơi nước trên mẫu cây tươi để tránh thất thoát tinh dầu. Các nghiên cứu cho thấy
với mỗi loài cây, hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu sẽ khác nhau tùy theo
bộ phận của cây, thổ nhưỡng nơi cây mọc, thời gian để héo cây trước khi thực nghiệm
cũng như kỹ thuật sử dụng để lấy tinh dầu ra khỏi cây.
Dụng cụ: Có thể tự lắp ráp lấy hệ thống lôi cuốn hơi nước kiểu cổ điển với
những dụng cụ thủy tinh có sẵn trong phòng thí nghiệm (bình cầu, erlen, bếp đun, ống
ngưng hơi, các ống nối bằng thủy tinh,…) hoặc theo kiểu cải tiến Dean-Stark. Kiểu
cải tiến Dean-Stark có hai loại ống gạn, để sử dụng với loại tinh dầu nhẹ hơn nước
hoặc loại nặng hơn nước. Trên thành ống gạn có khắc các vạch (mL) để giúp biết ngay
thể tích tinh dầu vừa được lôi cuốn.
Tiến hành: Sự lôi cuốn hơi nước thường được thực hiện trên cây tươi mới thu
hái về. Mẫu cây được cắt nhỏ, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho
phần thể tích của cả mẫu cây và nước chỉ chiếm tối đa hai phần ba thể tích bình cầu.
Lắp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc
thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm
lạnh, ngưng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách
thành hai lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu. Tùy theo các tài liệu cho biết loài thực vật
khảo sát có chứa tinh dầu loại nặng hoặc nhẹ hơn nước, khi ráp hệ thống sẽ lựa chọn
ống gạn cho phù hợp. Lớp tinh dầu thu được từ ống gạn luôn có chứa một lượng nhỏ
nước, cần phải được xử lý bằng cách hòa tan vào diethyl ether, làm khan nước, lọc và
đuổi dung môi.
2.2.2.5. Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Chiết siêu âm-UAE)
Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng nhanh khả năng chiết xuất. Chiết siêu âm là
phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20.000 Hz. Dùng siêu âm có thể rút ngắn
thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa hai pha bằng cách
phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo
trộn của hỗn hợp, ngoài ra còn do làm nóng tại chỗ của siêu âm.
 Trong công nghiệp, sóng siêu âm được tạo ra bằng máy phát sóng siêu âm điện
từ hoặc điện áp có khả năng làm thay đổi bước sóng, thường sử dụng các tấm thép
nickel xếp với nhau để tạo ra dòng điện xoay chiều tạo ra từ trường, tần số lên đến 200
kHz, ở tần số cao tạo khả năng phát sóng siêu âm. Hiệu suất chiết xuất bằng siêu âm
cao là do làm tăng khả năng thẩm thấu của dung môi qua thành tế bào, tạo ra các lỗ
bằng cách hình thành các bọt bong bóng trong dung môi, và tạo ra áp lực cơ học mạnh
làm tăng khả năng di chuyển, va chạm của các tế bào.
Phương pháp này lần đầu tiên đưa vào ứng dụng trong công nghiệp dược đã
được Schultz và Klotz mô tả trong công trình nghiên cứu nâng cao hàm lượng alcaloid
từ vỏ Cinchona trong môi trường nước với bước sóng 2400 Hz. Hiệu suất chiết bằng
sóng siêu âm phụ thuộc vào bước sóng, công suất thiết bị phát sóng và thời gian chiết.
Nhiều nghiên cứu quan sát về khả năng làm tăng va chạm bề mặt của sóng siêu âm,
chiết bằng sóng siêu âm có thể rút ngắn thời gian xuống chỉ còn 5-15 phút, so với
phương pháp chiết ngâm mất hàng giờ.
Ưu điểm: Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành dễ dàng. Thiết bị
không quá đắt tiền. Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng.
Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này ưu tiên áp dụng để chiết các hoạt chất
không bền với nhiệt. Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết, tiết
kiệm năng lượng đầu vào.
Nhược điểm: Dung môi khó được làm mới trong quá trình chiết xuất, vì vậy
hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly. Thời gian lọc và rửa dịch
chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc dịch
chiết có thể bị nhiễm bẩn. Sự thoái hóa bề mặt đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến
hiệu suất chiết.
2.2.2.6. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng-MAE)
Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của
dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2
tác động là sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả
hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt
nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều.
 Tiến hành: Chiếu vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và
dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng
lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi
sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực
tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản. Điều
này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn.
Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí
nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet)
do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có
những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có
nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp
theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng
phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm
lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc
với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương
pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alcaloid,...
Ưu và nhược điểm của kỹ thuật chiết vi sóng:
Ưu điểm Nhược điểm
- Không có quán tính nhiệt. - Khó áp dụng cho quy mô công nghiệp vì
- Hiệu suất chiết cao hơn một số phương đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là không
pháp chiết thông thường. nhỏ để có đủ công suất.
- Sản phẩm trích ly chất lượng tốt. - Nhiệt độ sôi của các dung môi đạt được
- Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ rất nhanh, có thể gây nổ.
môi trường (Năng lượng sạch, dễ chế tạo - Không áp dụng cho các phân tử không
và dễ kiểm soát). phân cực.
- Thời gian chiết nhanh. Có tác dụng đặc
biệt với các phân tử phân cực.
2.2.2.7. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn-SFE)
Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu (1897) nhưng mãi đến thập niên 1980,
phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ
nghệ để chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị
và nhất là hoa bia (hop).
Một hợp chất sẽ hiện diện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ
và áp suất cao hơn giá trị tới hạn tương ứng của nó.
CO2 được sử dụng phổ biến nhất vì có áp suất và nhiệt độ tới hạn thấp, giá tiền
rẻ, bền về mặt hóa học, không độc, không dễ cháy, có độ nhớt thấp, khả năng khuếch
tán cao nên được chọn sử dụng trong phương pháp chiết siêu tới hạn để chiết hợp chất
ra khỏi cây cỏ. Một ưu điểm nữa là dễ loại CO2 ra khỏi hỗn hợp dung dịch chiết chỉ
đơn giản bằng cách giảm áp suất. Mặc dù nó là loại dung môi không phân cực nhưng
nó vẫn có ái lực ở mức độ nào đó đối với các hợp chất phân cực. Để có thể làm tăng
thêm tính phân cực của nó, đôi khi người ta trộn CO2 với hợp chất có tính phân cực là
methanol (chỉ thêm 1-5 mol %).
Dụng cụ: Hệ thống gồm một nguồn cung cấp CO2, một máy bơm, một nồi hấp
áp suất để chứa mẫu cần thiết, một bộ phận thu nhận mẫu đã chiết được. Với các bộ
phận vừa mô tả, người ta có thể tự ráp lấy một hệ thống, tuy nhiên các nhà sử dụng
thường mua trọn bộ. Khí CO2 loại tinh khiết, không được lẫn nước, hydrocarbon,
halocarbon,… Máy bơm tạo được áp suất cao và giữ được áp suất này không đổi, để
có thể đưa CO2 đạt được trạng thái siêu tới hạn. Bộ phận chứa mẫu cần chiết: là thùng
bằng thép không gỉ, chịu đựng được áp suất và nhiệt độ cao, có gắn bộ phận kiểm tra
áp suất và nhiệt độ, thường đây là nồi áp suất. Bộ phận giảm áp và bộ phận nhận mẫu.
Tiến hành: Mẫu chiết có thể là cây cỏ hoặc dung dịch lên men vi sinh vật. Nếu
là mẫu cây, cần xay nhỏ để việc chiết được thực hiện nhanh chóng. Hỗn hợp cần chiết
được đặt vào nồi hấp áp suất ở nhiệt độ phòng. Nồi này được khóa chặt lại và cho
luồng khí CO2 sục vào để đuổi hết không khí ra khỏi nồi. Khi nồi hấp áp suất được
đun lên đến nhiệt độ mong muốn và được chỉnh áp suất đến 300±5 bar, cho chất lỏng
siêu tới hạn CO2 đi ngang qua mẫu chiết đặt trong nồi và ra khỏi nồi để đi đến bộ phận
giảm áp. Tại bộ phận giảm áp, áp suất bị hạ xuống đưa đến hệ quả là chất lỏng siêu tới
hạn CO2 biến thành khí CO2, khí này được dẫn trả về máy bơm để tiếp tục quá trình
chiết, còn chất chiết sẽ kết tủa xuống và được dẫn vào bộ phận tiếp nhận thành phẩm
đã chiết được. Có loại thiết bị cấu tạo bộ phận nhận mẫu rời, có loại cấu tạo với bộ
phận nhận mẫu được nối trực tiếp vào máy sắc ký khí hoặc máy HPLC, để có thể khảo
sát ngay sản phẩm vừa thu nhận được.
Một số lưu ý: Điều chỉnh mẫu cần chiết: trong một vài trường hợp đặc biệt,
mẫu cần chiết có thể được điều chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm cho thấm
ướt. Nếu hợp chất chiết có tính phân cực, một lượng nhỏ nước thêm vào để làm thấm
ướt mẫu cần chiết sẽ giúp việc chiết thêm dễ dàng. Nếu hợp chất chiết có tính không
phân cực, một lượng nhỏ dầu hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết sẽ giúp việc chiết
thêm dễ dàng. Chất cho thêm (modifier): CO2 chỉ phù hợp để chiết các hợp chất có
tính chất từ không phân cực đến phân cực trung bình, nên nếu muốn chiết hợp chất có
tính phân cực, cần bổ sung chất thêm như methanol, chlorua methylen, acetone,…
Ưu điểm: Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán thấm vào bên trong
mẫu chiết nhiều hơn so với sự chiết bằng dung môi với các phương pháp khác. Có độ
nhớt thấp, có áp suất hơi cao hơn so với bất kỳ dung môi lỏng thông dụng nào. Có sự
chọn lọc cao đối với loại hợp chất cần muốn chiết ra khỏi cây cỏ, vì thế thu được chất
chiết tương đối sạch, ít lẫn các loại hợp chất khác mà phần nghiên cứu không quan
tâm đến. Tính chất kém phân cực của CO2 có thể được bổ sung bởi chất thêm vào.
Phù hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt độ. Phương pháp này sử dụng ít dung môi,
có tính chọn lọc cao các loại hợp chất cần chiết tách, chất chiết được tương đối sạch, ít
làm hư hại chất cần thiết và nhất là thân thiện với môi trường.
Nhược điểm: Phải mua sắm thiết bị chuyên dùng, đắt tiền. Sự hiện diện của
nước trong mẫu chiết thường hay gây khó khăn cho sự chiết, tuy nhiên việc thấm ướt
mẫu chiết có thể giúp sự chiết được dễ dàng hơn. Phương pháp chiết siêu tới hạn
không thích hợp với mẫu chiết ở dạng lỏng vì rất khó giữ ổn định cùng lúc hai pha ở
áp suất cao. Nếu mẫu là dạng gel, dạng lỏng thì cần phải cố định mẫu này lên trên một
chất mang rắn ví dụ như đất sét hoặc tẩm mẫu lên tờ giấy lọc, rồi mới đặt vào nồi hấp
áp suất. Khó lường được việc chiết trên một loại mẫu mới, cần phải có nhiều nghiên
cứu mới có thể tìm được các thông số tối ưu để chiết thành công. Có một vài loại hợp
chất không phù hợp để áp dụng phương pháp này. Phương pháp chiết bằng chất lỏng
siêu tới hạn thường sử dụng dung môi là CO2 không phù hợp để chiết các hợp chất có
tính phân cực. Muốn cải thiện tính phân cực của CO2 cần bổ sung chất thêm vào.
2.2.2.8. Kỹ thuật chiết dưới áp suất cao (PLE)
Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết xuất hiện đại là chiết
dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction - PLE). Khả năng hòa tan của các chất
trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các
chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng
dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường,
việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa
hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này,
người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của
chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất.
Khi nhiệt độ tăng lên 10oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi.
Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với
vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của
dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-200oC và
áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết.
Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu, PLE đã được sử dụng để chiết ở quy
mô phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay chiết các chất ở quy mô lớn. Ví dụ,
chiết dioxin bằng toluen hoặc toluen + 5% acid acetic (150oC, 150 bar), chiết chất béo
trong các hạt dầu bằng n-hexane (100oC, 100 bar), chiết hypericin trong Hypericum
perforatum bằng acetonitrile (100oC, 100 bar).
Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất dược liệu là chiết
bằng nước nóng dưới áp suất (pressurized hot water extraction, PHWE). Do điểm tới
hạn của nước khá cao nên trong PHWE người ta dùng áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào
khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100-2000C. Đặc tính (độ phân cực) của
nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có thể chiết được các chất
kém phân cực hơn.
Ưu điểm: Sử dụng được nhiều loại dung môi, chiết được nhiều chất phân cực
và không phân cực hơn phương pháp chiết siêu tới hạn. Dung môi chiết giảm, thời
gian chiết giảm, hiệu suất tăng.
 Nhược điểm: Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền.
So sánh một số kỹ thuật chiết xuất được mô tả tóm tắt ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4. So sánh các kỹ thuật chiết truyền thống và hiện đại
Tên Mô tả Thời Dược Dung Chi Ưu điểm Nhược điểm
gian liệu Môi Phí
Soxhlet Dược liệu đặt 3-48h 1-30g 150-500 Thấp Thao tác đơn Thời gian lâu.
trong ống giấy lọc mL giản. Không Lượng dung
và cho dung môi cần lọc. môi nhiều.
qua.
UAE Dược liệu được 10-60 1-30g 50-200 Thấp Dễ sử dụng. Lượng dung
ngâm trong dung phút mL môi nhiều.
môi và nhúng siêu Phải lọc.
âm.
SFE Dược liệu được để 10-60 1-5g 30-60 Cao Chiết nhanh. Nhiều thông
trong bình chịu áp phút mL Ít dung môi. số cần theo
suất cao và liên Không cần dõi.
tục đưa dụng môi lọc.
siêu tới hạn đi qua. Độ chọn lọc
cao.
MAE Dược liệu được 3-30 1-10g 10-40 Vừa Dễ thao tác. Dung môi
ngâm trong dung phút mL phải Chiết nhanh. chiết phải hấp
môi và chiếu xạ vi Tiêu thụ thụ vi sóng.
sóng. lượng dung
môi vừa phải.
PLE Dược liệu được 10-20 1-30g 15-60 Cao Chiết nhanh.
làm nóng và cho phút mL Ít dung môi.
dung môi đi qua Không cần
dưới áp suất cao. lọc.
Từ Bảng 2.4 cho thấy, các phương pháp chiết tách hiện đại thể hiện nhiều ưu
điểm hơn các phương pháp chiết truyền thống (Soxhlet) như: thời gian chiết ngắn hơn,
lượng dung môi tiêu thụ ít hơn, độ chọn lọc và hiệu quả chiết cao hơn, một số kỹ thuật
chiết an toàn và thân thiện với môi trường hơn (chiết siêu tới hạn). Tuy nhiên, các kỹ
thuật chiết tách hiện đại cũng tồn tại một số nhược điểm như vốn đầu tư cao, một số
kỹ thuật khó triển khai khi nâng cấp lên quy mô công nghiệp.
2.3. Định danh thành phần hóa học của sản phẩm chiết [6, 16]
Từ mẫu cây thô, áp dụng các kỹ thuật chiết trình bày ở các phần trên để có
được cao chiết ancol toàn phần hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau. Trước
khi bắt đầu quá trình sắc ký cột để cô lập các hợp chất tinh khiết, người ta thường
muốn biết xem cao chiết này có thể chứa những loại hợp chất thiên nhiên mà người
nghiên cứu muốn cô lập (trường hợp đã có mục tiêu cụ thể để theo đuổi) hoặc có thể
chứa các loại hợp chất nào (để định hướng công việc và có các biện pháp xử lý thích
hợp)
Trước tiên, cần biết một số đặc điểm của cao chiết về độ hòa tan (tính ưa nước,
tính ưa dầu), tính acid-base, điện tích của phân tử, độ bền, kích thước của phân tử…
2.3.1. Tìm hiểu một số đặc điểm của cao chiết
2.3.1.1. Tính ưa nước, tính ưa dầu
Muốn biết độ phân cực của một hỗn hợp nào đó, cần thao tác như sau: Lấy một
lượng nhỏ mẫu và làm cho mẫu thật khô (nên sử dụng lò sấy chân không để chất
không bị hư hại bởi nhiệt độ), chia mẫu khô làm hai phần và thực hiện hai việc như
sau:
- Hòa tan dung môi: Cho chất khô vào bảy ống nghiệm với số lượng bằng nhau, với
mỗi ống nghiệm cho vào một loại dung môi từ không phân cực đến phân cực: hexane
(hoặc ether dầu hỏa), chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, acetonitrile,
methanol và nước. Độ hòa tan của chất khô sẽ cho biết khá rõ về độ phân cực của mẫu
chất khảo sát. Tuy nhiên nếu mẫu khảo sát là hỗn hợp các chất có tính hòa tan khác
nhau, dung dịch khảo sát sẽ cho thấy có phần tan và phần không tan, cần phải ly tâm
hoặc lọc để lấy 2 phần tan và không tan khảo sát riêng. Lưu ý đôi khi hợp chất tan sẽ
liên kết với các chất không tan để trở thành chất cũng không tan, xử lý trường hợp này
bằng cách khuấy trộn hỗn hợp bằng cơ học hoặc bằng sóng siêu âm (sử dụng bồn sóng
siêu âm, ultrasound batch).
- Phân chia trong hai hệ dung môi không hòa tan vào nhau: Cho chất khô vào lần lượt
trong các hệ sau: ethyl acetate – nước, chloroform (hoặc dichloromethane) – nước;
hexane – nước. Quan sát xem chất khô phân chia nhiều vào trong dung môi nào.
Trong trường hợp với một hệ hai dung môi nào đó mà chất khô không tan vào pha nào
cả, phải kiểm tra chất này có tạo thành một lớp không tan hiện diện tại mặt phân cách
giữa hai dung môi. Lý do là mẫu chất không tan vào trong dung môi nào nên nó kết
tủa, hãy nhân cơ hội đó mà lọc để lấy hợp chất.
2.3.1.2. Đặc tính acid/base (pKa)
Tiến hành gần giống như 2.3.1.1 nhưng nên sử dụng một số lượng mẫu chất
nhiều hơn để thử nghiệm cho kết quả rõ hơn, dễ quan sát. Chuẩn bị 3 ống nghiệm lớn.
Hòa tan mẫu chất khô vào nước để có hỗn hợp huyền phù. Rót dung dịch vào mỗi ống
nghiệm trên với lượng thể tích bằng nhau. Nhỏ một hai giọt acid hoặc base vào ống
sao cho một ống có dung dịch pH = 3, một ống có pH = 7 và một ống có pH = 10. Rót
dung môi hữu cơ (ethyl acetate hoặc chloroform) vào mỗi ống. Trong mỗi ống, các
hợp chất sẽ phân chia giữa hai pha như sau
HA + H2O H3 O+ + A -
Pha hữu cơ Pha nước
2.3.1.3. Điện tích của hợp chất
Sử dụng 4 loại nhựa trao đổi ion: Nhựa trao đổi-cation mạnh SP, nhựa trao đổi-
cation yếu CM, nhựa trao đổi-anion QAE, nhựa trao đổi-anion yếu DEAE. Mỗi loại
nhựa sử dụng 100 mg nhựa cho mỗi 1 mL dung dịch mẫu chất thử. Mẫu chất thử khô
được hòa vào nước để có một hỗn hợp huyền phù.
Chuẩn bị 12 ống nghiệm lớn. Rót dung dịch huyền phù vào mỗi ống nghiệm
với lượng thể tích bằng nhau. Nhỏ một hai giọt acid hoặc base vào các ống này sao
cho có ba ống với dung dịch ống có pH = 3, ba ống có pH = 7 và ba ống có pH = 10.
Mỗi một loại nhựa trao đổi ion được cho vào 3 ống. Khuấy trộn nhẹ dung dịch
và nhựa rồi để yên cho nhựa lắng xuống đáy ống nghiệm. Lọc hoặc gạn lấy phần dung
dịch nổi bên trên để khảo sát, bằng cách so sánh phổ UV hoặc các kỹ thuật khác giữa
phần dung dịch nổi bên trên với dung dịch ban đầu.
Biết rằng nhựa trao đổi-anion yếu diethylaminoethyl (viết tắt là DEAE), chứa
nhóm chức hoạt động -N+, sẽ gắn chặt các hợp chất có tính acid mạnh và không gắn
được hợp chất có tính acid yếu (vì thế các loại hợp chất này sẽ hiện diện trong phần
dung dịch nổi bên trên). Nhựa trao đổi-cation yếu carboxymethyl (viết tắt là CM),
chứa nhóm chức hoạt động -COO- sẽ gắn chặt các hợp chất có tính base mạnh QAE
sẽ gắn được tất cả các hợp chất có tính base mạnh và base yếu.
 Từ kết quả này có thể suy đoán được hợp chất cần khảo sát có tính acid mạnh/
yếu hoặc tính base mạnh/yếu, từ đó có thể tìm được phương pháp thích hợp để cô lập
chúng.
2.3.2. Phân tích hóa-thực vật của cao chiết
Cây cỏ thường có chứa các hợp chất tự nhiên như: Steroid, alcaloid, flavonoid,
glycoside, saponin, tannin, antraquinon, xanthone, coumarin, iridoid, acid hữu cơ,…
Để tìm hiểu sơ bộ xem cao chiết có thể chứa loại hợp chất nào trong những loại hợp
chất trình bày trên, có thể áp dụng phương pháp sau.
Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là tách các hợp chất hữu cơ thành
các nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất này trong các
dung môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng
các thuốc thử đặc trưng.
Tiến trình phân tích sơ bộ hóa-thực vật được trình bày trong Sơ đồ 2.1. Cách
thực hiện như sau:
2.3.2.1. Chiết cao thô với diethyl ether
Trong một erlen 250 mL, cho vào 5 g cao chiết thô và 30 mL diethyl ether,
khuấy trộn đều trong vòng 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự
chiết với diethyl ether vài lần cho đến khi dung dịch chiết lần cuối không màu. Vậy, sẽ
có dung dịch chiết diethyl ether. Phần bã không tan được giữ lại để thực hiện phần
tiếp theo.
Cho dịch chiết diethyl ether vào bình lóng, chiết với 3 x 20 mL dung dịch nước
KOH 10%, trong bình lóng có hai lớp: Lớp kiềm và lớp diethyl ether.
- Lấy lớp nước kiềm cho vào becher, trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi
trung tính, sẽ thấy tủa. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hòa tủa này vào 5 mL ethanol 90o và
chia dung dịch này vào đều 3 ống nghiệm.
+ Ống 1: Nhỏ vài giọt dung dịch KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có
antraglycosid.
+ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho vào một ít Mg kim loại, nếu thấy màu
đỏ, có thể có flavonoid.
+ Ống 3: Nhỏ một giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc có vết mờ,
có thể có acid béo.
- Lấy lớp diethyl ether: Cho vào bình lóng, rửa dung dịch ether này với nước cất (3 x
20 mL), tiếp theo chiết với dung dịch nước H2SO4 2% (3 x 5 mL), sẽ có hai lớp: Lớp
ethyl ether và lớp nước acid.
+ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alcaloid. Thuốc thử
Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Dragendorff cho tủa màu cam; thuốc thử
Bouchardar cho tủa màu nâu.
Sơ đồ 2.1. Định tính sự hiện diện của các loại hợp chất tự nhiên có trong cao chiết
+ Lớp ethyl ether được chia đều vào ba chén sứ và bốc hơi đến khô:
Chén 1: Nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu.
Chén 2: Nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh, có thể có carotenoid.
Chén 3: Sử dụng thuốc thử Lieberman (Ac2O/ H2SO4): Nhỏ 10 giọt anhydride
acetic vào chén để hòa tan cắn, tồi rót hết dung dịch này vào một ống nghiệm. Nhỏ
chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu thấy mặt
phân cách giữa hai dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng lục hoặc lục đỏ, có thể
phytosterol (steroid thực vật).
2.3.2.2. Chiết bã cao còn lại bằng ethanol 90o nóng
Bã cao sau khi chiết với ether ethyl được chiết nóng với ethanol 90o. Bã cao
được cho vào một erlen 250 mL đặt trên một chiếc bếp cách thủy, chiết với ethanol
90o (3 x 30 mL). Sau mỗi lần chiết, lọc ngang qua một tờ giấy lọc, gộp ba lần chiết lại
để có dung dịch ancol. Phần bã không tan được giữ lại để thực hiện phần tiếp theo.
Dung dịch ancol được chia đều thành 6 phần, mỗi phần khoảng 15 mL dung dịch.
- Phần 1: Pha loãng dung dịch ancol với 4 lần thể tích nước cất. Kiềm hóa bằng dung
dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa. Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc.
+ Phần tủa được hòa với 1 mL chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào thuốc thử
Lieberman gồm 1 mL anhydride acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống
nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh dương lục, có thể có
steroid.
+ Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa. Lọc lấy tủa và hòa tủa với 3-4 mL
ethanol 90o và chia đều vào hai ống nghiệm.
Ống 1: Cho vài giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antralycosid.
Ống 2: Cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu
đỏ, có thể có flavonoid.
- Phần 2: Pha loãng dung dịch ancol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào hai
ống nghiệm.
+ Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri, sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu
xanh đen, có thể có tannin.
+ Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ.
- Phần 3: Dung dịch ancol được cô cách thủy cho đến cạn. Hòa cặn này với 3-4 mL
H2SO4 2%. Dung dịch này được thử với 3 loại thuốc thử alcaloid: Mayer, Dragendorff
và Bouchardat. Nếu dương tính với tất cả ba loại thuốc thử, có thể có alcaloid.
- Phần 4: Dung dịch ancol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 4-5 mL nước
cất, đun nóng và lọc. Cho dung dịch lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc
thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử.
- Phần 5: Pha loãng dung dịch ancol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống
nghiệm. Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ. Ống 2: Kiềm hóa, nếu có màu lục. Nếu cả 2
ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có anthocyanoside.
- Phần 6: Chia dung dịch ancol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi cách thủy đến
cạn.
+ Ống 1: Cho vào 5 mL nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài
của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.
+ Ống 2: Cho vào 0,5 mL chloroform và 0,5 mL anhydride acetic. Nhỏ chầm chậm
vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân cách xuất
hiện màu tím, có thể có saponin triterpene; nếu ở mặt phân cách xuất hiện màu xanh
dương lục, có thể có saponin steroid.
2.3.2.3. Chiết phần bã cao còn lại với dung dịch H2SO4 1%
Phần bã không tan, được chiết với dung dịch nước H2SO4 1%; 3 lần, mỗi lần 20
mL. Lọc và chia đều vào 5 ống nghiệm.
- Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.
- Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl ether (3 x 5 mL).
Lóng lấy lớp diethyl ether này với dung dịch H2SO4 1%. Lóng lấy lớp nước, để định
tính với 3 loại thuốc thử alcaloid: Mayer, Dragendorff và Bouchadat. Nếu dương tính
với tất cả 3 loại thuốc thử, có thể có alcaloid.
- Phần 3: Cho vào dung dịch lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc thử
Fehling B, đun cách thủy, nếu có kết tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử. Tất cả ba
loại thuốc thử, có thể có alcaloid.
- Phần 4: Trung hòa acetate natri, sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh
đen, có thể có tannin.
- Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích ethanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có hợp
chất đường loại acid uronic.
2.3.3. Tổng hợp kết quả thử nghiệm và nhận xét
Sau khi đã thử nghiệm như phần 2.3.2, cần phải làm bảng tổng kết để có thể
đánh giá xem cao chiết có hoặc không có chứa những loại hợp chất tự nhiên nào.
Bảng đánh giá có thể được trình bày như ví dụ trong Bảng 2.5.
Bảng đánh giá được trình bày với các ký hiệu (-) nghĩa là âm tính, không có
hiện diện và ký hiệu (+) là dương tính, có hiện diện. Đôi khi người ta ghi thêm các ký
hiệu (++) hoặc (+++) nghĩa là hiện diện ở nồng độ cao hơn. Các ký hiệu (+), (++)
hoặc (+++) chỉ có ý nghĩa so sánh tương đối trong cùng một điều kiện thí nghiệm,
giúp cho người quan sát đánh giá rõ hơn về hàm lượng của một loại hợp chất trong
cao chiết.
Ví dụ trong Bảng 2.5 hợp chất “đường khử” hiện diện (+) trong dung dịch
diethyl ether, nhưng hiện diện nhiều hơn gấp 3 lần trong dung dịch chiết ethanol nên
được ghi (+++).
Từ Sơ đồ 2.1 nhận thấy một loại hợp chất tự nhiên nào đó, thí dụ steroid, có thể
hòa tan vào hai loại dung môi khách nhau là diethyl ether và ethanol. Điều này có
nghĩa là mẫu cây có chứa hai hợp chất steroid: Một hoà tan trong diethyl ether và một
hòa tan trong ethanol. Cả hai đều là loại steroid nhưng có gắn thêm những nhóm chức
có tính phân cực khác nhau.
Trong cùng một cây cũng có thể có nhiều hợp chất tuy cùng là loại alcaloid
nhưng có thể có khung sườn khác nhau và mang các nhóm chức khác nhau nên có độ
phân cực khác nhau. Vì vậy có alcaloid tan trong dung môi diethyl ether mà cũng có
alcaloid không tan trong diethyl ether, nhưng tan trong ethanol.
Bảng 2.5. Ví dụ về tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết
Loại dung dịch chiết Thuốc thử Kết quả Hợp chất tự nhiên
Acid
Ethyl
Ethanol sulfuric
ether
1%
+ + KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglucosid
Nhỏ dịch trên
+ Để lại vết ố Acid béo
giấy lọc
Mg/ HCl đậm Có vòng màu Flavonoid có tính
- +
đặc đỏ phân cực
Thuốc thử Có màu lục
+ Phytosterol
Lieberman đỏ
Bốc hơi còn lại
+ Có mùi thơm Tinh dầu
cắn
Không có
- H2SO4 đậm đặc Không màu
carotenoid
Mayer,
Alcaloid có tính ít
+ - Bouchardat Có tủa màu
phân cực
Dragendorff
Lắc mạnh dung
- - Không có bọt Không saponin
dịch
+ ++ FeCl3 Màu lục đen Tannin
Không sủi Không có acid hữu
- Na2CO3
bọt cơ
Thuốc thử Tủa màu đỏ
+ +++ Đường khử
Fehling A, B gạch
Pha loãng với
+ Có tủa nhiều Acid uronic
ethanol 90o