ĐỊNH LƯỢNG E.

COLI GIẢ ĐỊNH – KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN

NHẤT ( MPN)
Đây là một phương pháp được dùng để đánh giá số lượng các vi sinh vật theo số lượng vi
sinh vật có xác xuất lớn nhất mà nó hiện diện trong 1 đơn vị thể tích của mẫu . Đồng thời
phương pháp MPN này có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể nuôi cấy
được trong môi trường lỏng chọn lọc và cho một kết quả biểu kiếnthích hợp .
Phạm vi áp dụng của phương pháp này là :đó là hướng dẫn chung để ta định lượng E.coli
xuất hiện trong thực phẩm hoặc thức ăn nuôi bằng kỹ thuật đó là nuôi cấy môi trường và
ta tính xác xuất lớn nhất sau khi ta đem đi ủ ở nhiệt độ 35oC hoặc ở nhiệt độ 37oC ,sau đó
ta ủ ở nhiệt độ 45oC
Với phương pháp định lượng này ta sẽ dựa vào kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Bình thường với việc định lượng bằng
phương pháp MPN ta được thực hiện 3 lần lặp lại với nhau ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên
tiếp , tổng cộng lại ta có 3 x 3 = 9 ống nghiệm tất cả . Số lượng của các ống nghiệm lặp
lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp MPN này càng
I. Quy trình thực hiện được làm như sau :
- Đầu tiên chúng ta sẽ pha loãng mẩu cần pha tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên
tiếp => sau khi pha xong ta đem chúng đi Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp => kiểm
tra kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật đó => sau đó ta ghi nhận
số lượng ống dương tính (+) ở từng độ pha loãng => tra bảng Mac Crady
Môi trường nuôi cấy thì ta sẽ có : Môi trường tăng sinh chọn lọc
Môi trường chọn lọc thứ 2
Hoà tan mẫu : Pepton 1,0 g
Chất pha loãng có thành phần sẽ gồm : Natri clorua 8,5g
Nước cất 100 ml
Sau đó ta sẽ hòa tan các thành phần đó vào nước nếu cần thì ta có thể đem đi đun
nóng .Xong ta chỉnh sao cho sau khi tiệt trùng thì pH của nó sẽ là 7,0 ở nhiệt độ là 25o C .
 Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc : nồng độ đơn và nồng độ Kép
Đối với nồng độ kép : ta sẽ lấy 3 ống nghiệm có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc
nồng độ kép với các thánh phần như sau: Tryptoza ( 40,0g) , Lactoza ( 10,0g ),Dikali
hidro phosphat (K2HPO4) (5,5 g) ,Kali dihidro phosphat (KH2PO4) (5,5g ) ,Natri clorua
(10,0g), Natri lauryl sunfat [CH3(CH2)11OSO3Na] (0,2 g), Nước ( 1000ml ).
 Ta sẽ dùng Pipet vô trùng để ta chuyển 10 ml mẩu thữ nếu mẫu thử của ta là chất lỏng
hoặc là 10 ml huyền phù ban đầu , hoặc nếu là các sản phẩm ở các dạng khác => vào mỗi
ống nghiệm trên .
Đối với nồng độ đơn : ta sẽ lấy 3 ống nghiệm có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc
nồng độ đơn với các thánh phần như sau: Tryptoza ( 20,0g) , Lactoza ( 5,0g ),Dikali
hidro phosphat (K2HPO4) (2,75g) ,Kali dihidro phosphat (KH2PO4) (2,75g ) ,Natri
clorua (5,0g), Natri lauryl sunfat [CH3(CH2)11OSO3Na] (0,1 g), Nước ( 1000ml)
Khác với nồng độ kép thể tích ta lấy là 10ml thì nồng độ đơn ta chĩ lấy 1ml thực hiện
như sau ta sẽ dùng Pipet mới đã vô trùng để ta chuyển 1 ml mẩu thữ nếu mẫu thử của ta
là chất lỏng hoặc là 1 ml huyền phù ban đầu , hoặc nếu là các sản phẩm ở các dạng khác
=> vào mỗi ống nghiệm trên .
Còn đối với mỗi dịch pha loãng tiếp theo (từ 10-1 đến 10-2 tương ứng với mẫu
thử) tiến hành tương tự như nồng độ đơn . Dùng pipet mới khác vô trùng cho mỗi
dung dịch pha loãng. Trộn kỹ chất nuôi cấy và trộn môi trường.
Ủ ấm :
Sao khi đã cho các thành phần có khối lượng tương ứng thì ta sẽ đem đi Ủ các ống môi
trường chọn lọc nồng độ kép , nồng độ đơn và mỗi dịch pha loãng tiếp tiếp theo vào bên
torng của tủ ấm ( ở nhiệt độ là 35oC hoặc là 37oC trong 24h ± 2h . Nếu ở giai đoạn này,
sẽ xuất hiện một là sự sinh khí hoặc hai là không rõ ràng, trường hợp nếu khí được tạo
thành thì chúng ta sẽ đem đi ủ tiếp đến 48 h ± 2 h. sau đó đem xét nghiệm các ống sinh
khí .
Từ các ống có môi trường nồng độ đơn và nồng độ đã sinh khí ,sau đó ta nuôi cấy một
loạt các ống mới có chứa môi trường lỏng chọn lọc.
Sau đó tiếp tục đem đi ủ ở nhiệt độ là 45oC từ 24 giờ đến 48 giờ và đem đi xét nghiệm
loạt ống nghiệm mới đó về sinh khí .
Từ các ống môi trường nồng độ chọn lọc đã sinh ra khí ta cấy một loạt các ống nghiệm
chứa nước trypton.
Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ 45oC trong 24 giờ đến 48 giờ và đem đi xét nghiệm mới về
sinh Indo.
Cuối cùng Xác định số có xác xuất lớn nhất của E.coli giả định dựa theo bảng MPN
( như hình ) ứng với số lướng các ống đã ủ cho ta thấy được sự sinh khối của môi trường
chọn lọc ,môi trường Indo và trong nước trypton .
Những điểm nổi bật của phương pháp :
 Phương pháp MPN cho phép chúng ta xác định được vi sinh vậ có nồng độ thấp
( nhỏ hơn 100 tế bào / ml hoac g )
 Giúp xác định được những tế bào sống
 Định lượng chọn lọc số vi sinh vật
Nó có các khuyết điểm như :
+ Quy trình nó phức tạp ,phải
+ Phải sử dụng nhiều dụng cụ .
+ Tốn nhiều thơi gian