Machine Translated by Google

Proc. tự nhiên học viện. Khoa

học. Hoa Kỳ Tập. 72, số 8, trang 2989-2993, tháng 8

năm 1975 Hóa sinh

Vai trò của magiê trong phosphatase kiềm Escherichia coli

( hàm lượng kim loại/ điều hòa enzyme kim loại/ tính chất quang phổ/trao đổi triti )

RICHARD A. ANDERSON, WILLIAM F. BOSRON, F. SCOTT KENNEDY VÀ BERT L. VALLEE * Phòng thí nghiệm

nghiên cứu lý sinh , Khoa Hóa sinh, Trường Y Harvard , và Khoa Sinh y học , Bệnh viện Peter Bent Brigham ,
Boston, Massachusetts 02115

Đóng góp bởi Bert L. Vallee, ngày 19 tháng 5 năm 1975

TÓM TẮT Phosphatase kiềm của E. coli, được phân lập
bằng các quy trình không làm thay đổi hàm lượng kim
loại bên trong của nó , chứa 1,3 I 0,3 g nguyên tử
magiê và 4,0 4 0,2 g nguyên tử kẽm trên mỗi phân tử
có trọng lượng phân tử 89.000. Magne sium, vai trò của
nó không được đánh giá cao, ảnh hưởng đáng kể đến chức
năng và cấu trúc của phosphatase kiềm chứa 2 hoặc 4 g
nguyên tử kẽm trên mỗi mol. Magiê không kích hoạt
apoenzyme nhưng làm tăng hoạt động của enzyme chứa . 2
g nguyên tử kẽm gấp 4,4 lần và của enzym chứa 4 g
nguyên tử gấp 1,2 lần. Các kết quả thu được với enzyme
trong đó coban được thay thế cho kẽm là tương tự.
Hơn nữa, phổ cộng hưởng từ hấp thụ và điện tử para của
coban phosphatase cho thấy tác dụng của magiê đối với hình học8,0,
Việc bổ sung magie làm thay đổi các đặc tính quang phổ
của apoenzim được hoàn nguyên với 2 g nguyên tử coban từ
hình học chủ yếu là bát diện sang hình học 4 hoặc 5 tọa độ .
Hai loại vị trí liên kết coban này đã được liên kết
tương ứng với xúc tác và ổn định cấu trúc .
Do đó, magiê kiểm soát sự chiếm chỗ của các vị trí liên
kết cấu trúc và xúc tác , đồng thời điều chỉnh hoạt động
enzym tổng hợp . Trao đổi hydro-tritium đã được sử dụng
để xác định tác động của magiê đối với sự ổn định hình
thành của phosphatase. Magiê ổn định các đặc tính cấu
trúc động , của cả apophosphatase và enzyme chứa 2 g
nguyên tử kẽm , được ổn định thêm bởi 2 nguyên tử kẽm
nữa . Vai trò của magie và các ion kim loại khác trong
các quá trình điều tiết , hiện mới chỉ bắt đầu được khám
phá đầy đủ, có thể sẽ nổi lên như một con đường quan
trọng để đạt được các hiệu ứng điều tiết trong các enzym luyện nguyên
Tầm quan trọng của kẽm trong cả xúc tác và ổn định cấu
hoặc Chelex 100 (3), được phân lập và tinh chế đến độ đồng
nhất bằng các phương pháp và quy trình ngăn chặn cả sự thất
thoát kim loại và nhiễm bẩn (2, 3). Quy trình Chelex 100 đã
được ký kết để tránh sự tiếp xúc của phosphatase với bất kỳ
tác nhân chelate hòa tan nào , do đó loại bỏ các bất thường
tiềm ẩn như những bất thường do EDTA gây ra (4, 5 ). Nồng độ
protein được xác định từ sự hấp thụ ở bước sóng 278nm sử dụng Acm'% 7,2 (2).
Tất cả các tính toán liên quan đến nồng độ mol đều dựa trên
trọng lượng phân tử của phosphatase kiềm là 89.000 (6).
Hoạt tính enzym được đo bằng p-nitrophenyl photphat, 1
mM , trong Veronal-0,4 M NaCl hoặc trong 1 M Tris -HCl, pH
250.
phối hợpMột đơn. vị hoạt động cụ thể được định nghĩa
coban
là ,umol của cơ chất bị thủy phân mỗi phút/mg protein ,
sử dụng độ hấp thụ mol ab là 1,68 X 104 đối với ion p -
nitrophenolate ở 400 nm. Bộ đệm, đồ thủy tinh và chất nền
không bị nhiễm kim loại như đã mô tả trước đây ( 7). Sau
khi chiết bằng dithizone, dung dịch đệm được bảo quản với
sự có mặt của Chelex 100, 10% v/v ( 8). Các phân tích về
kẽm, coban và magie được thực hiện bằng phép đo phổ hấp
thụ nguyên tử (9, 10) trên các mẫu đã được tro hóa trong
lò nung điện ở 4500 trong 24 giờ và sau đó được hòa tan
trong 0,1 N H2O1 (7).
Apoalkaline phosphatase được điều chế theo quy trình của
Simpson và Vallee (6) sử dụng 8-hydroxyquinoline-5-sul-. axit
fonic ; apoenzyme chứa ít hơn 0,03 g nguyên tử kẽm và 0,01 g
kim . tử magiê . Không có kim loại khác đã được phát hiện.
Các dung dịch kim loại được điều chế từ phép đo quang phổ
gọi là muối sunfat tinh khiết (Johnson Matthey & Co.) hòa tan

trúc của Escherichia coli kiềm phosphatase đã được công trong nước cất không có kim loại được sử dụng để hoàn nguyên apo

nhận từ lâu (1), nhưng sự hiện diện của lượng magiê enzym.
cân bằng hóa học (1, 2) phần lớn đã bị bỏ qua; do đó, Phổ hấp thụ khả kiến thu được bằng máy quang phổ Cary
vai trò của nó vẫn không được đánh giá cao và không bị model 14 được trang bị dây trượt hấp thụ 0-0,1 . Các phép
trừng phạt. Nghiên cứu này xác nhận sự hiện diện của đo thuận từ điện tử được thực hiện ở 50K bằng máy quang phổ
lượng magie cân bằng hóa học trong phosphatase kiềm và Varian E-9 (11).
chứng minh thêm rằng kim loại này dùng để điều chỉnh Các điều kiện và chi tiết quy trình của các thí
phương thức liên kết của kẽm và làm tăng hoạt động nghiệm hydro triti đã được mô tả (12).
enzym hơn và cao hơn những hoạt động đạt được khi chỉ
KẾT QUẢ
có kẽm . Phản ứng của quang phổ hấp thụ và cộng hưởng
14.226.123.79.
14.226.123.79
www.pnas.org
https://
trước
tháng
2023
xuống
ngày
Được
chỉ
địa
năm
IP
vào
từ
tải
26
từ4

thuận từ điện tử (EPR) của coban phosphatase kiềm đối
với magnesium mô tả chi tiết về vai trò điều tiết của
nó trong coban và liên kết kẽm gián tiếp và trong các
điều chế hoạt động tiếp theo (3, t).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phosphatase kiềm được giải phóng do sốc thẩm thấu từ không
gian chu chất của tế bào E. coli được điều trị bằng EDTA (2)
Viết tắt: EPR, cộng hưởng thuận từ điện tử .
*
Thư từ nên được giải quyết cho ai .
*
F. S. Kennedy, W. F. Bosron, R. A. Anderson, và B. L.
Vallee, đã gửi để xuất bản.
Hàm lượng kim loại của phosphatase tự
nhiên chủng E. coli phosphatase kiềm C-90 , được phân lập
ở pH 7,5 bằng quy trình sốc thẩm thấu sử dụng Chelex 100
(3), chứa 1,0-1,6 g nguyên tử magiê với trung bình 1,3 g
nguyên tử / mol protein . Hàm lượng kẽm của nó dao động
từ 3,8 đến 4,2 với trung bình 4,0 g-nguyên tử/mol enzyme
(Bảng 1, mẫu 1-4) . hàm lượng magie của kiềm phospha
tase, được phân lập từ cùng một chủng và ở cùng độ pH
nhưng sử dụng EDTA thay vì Chelex 100 (2), khá giống
nhau, dao động từ 1,1 đến 1,7 g nguyên tử magie , trung
bình 1,4 g nguyên tử / mol và từ 3,6 đến 4,2 g nguyên tử
kẽm với tuổi trung bình là 4,0 g nguyên tử/mol protein (Bảng 1 , mẫu 5-8).

2989
 Machine Translated by Google
2990 Hóa sinh: Anderson et al. Proc. tự nhiên học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 72 (1975)

Bảng 1. Hàm lượng kim loại của phosphatase kiềm Bảng 2. Liên kết cân bằng của magie, kẽm và coban với
phosphatase kiềm
Hàm lượng kim loại (g-atom/mol)+
Liên kết kim loại (g-atom/mol)
Vật mẫu* Mg+ Zn+ Tôi(Mg + Zn)
Y(Mg +
1,6 4,2 5,8 Kim loại được thêm vào
Mg Zn Coa Zn hoặc Co)
1
1,3 4,2 5,5

2
1,3 3,9 5,2 1. Mg 1,4 1,4

1,0 3,8 4,8 2. Zn 0 4,1

3 4

3. Co 0 0 5,8

1,2 4,2 5,4 4. Zn, Mg 0 0 4.1 5,8

5

1,1 4,0 5,1 5. Co, Mg 1,6 0,9 0 4.2 0 5,8 0 4,8 5,7
6

7
1,7 3,6 5,3
Phosphatase, 10 Ml M, trong Tris.HCl, 50 mM, pH 8,0, được thẩm tách
8
1,4 4,1 5,5
trong 24 giờ, 230, đối với kẽm, coban và/hoặc magiê, 100 mM. Phân tích
kim loại được thực hiện bằng hấp thụ nguyên tử (9, 10).
Trung bình 1,3 ± 0,3 4,0 ± 0,2 5,3 ± 0,3
a Các mẫu được thẩm tách như mô tả ở trên ngoại trừ trong dung dịch
đệm N-2-hydroxy ethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (Hepes) .
*
Các mẫu 1-4 được điều chế từ chiết xuất periplasmic bằng
cách sử dụng sốc os motic sau khi xử lý tế bào bằng Chelex
100 và sucrose ( 3); mẫu 5-8, Chelex 100 được thay bằng EDTA (2). thúc đẩy các hoạt động của cả kẽm và coban enzym, như
Tại Hàm lượng kim loại được xác định bằng sự hấp thụ nguyên tử của các mẫu
đã tro hóa (xem Phương pháp và Vật liệu).
được thể hiện bằng cách hoàn nguyên có chọn apoenzyme
lọc của các kết hợp khác nhau của các ion này . Hoạt động
Hàm lượng kim loại của các isoenzym khác nhau của chủng C-90
của phosphatase phụ thuộc vào hàm lượng kẽm hoặc coban của
và của phosphatase kiềm được phân lập từ các chủng E. colh
nó (6) và do đó, tác dụng của magiê đối với hoạt động phải
khác nhau , ví dụ: K-10, C4F1 và CW-3747,§ hoàn toàn có mùi
được khám phá bằng cách sử dụng các lượng khác nhau của
hậu môn . Do đó, tất cả các phosphatase kiềm được phân lập
các kim loại này . Khi ký hiệu
enzymhoạt tính của chất tạp chí
trong các điều kiện này chứa tổng cộng 5,3 ± 0,8 g nguyên tử
hoàn nguyên với nesium và 4 g nguyên tử kẽm là 100 % (Bảng
kim loại trên mỗi mol, trong đó 4 là kẽm và phần còn lại là
3, mẫu 2), hoạt tính của phosphatase kiềm chứa 2 g nguyên
magiê ( Bảng 1).
tử hoặc 4 g nguyên tử kẽm trên mỗi mol là 12% và 80 %,
Các nghiên cứu về liên kết cân tương ứng (Bảng 3, mẫu 3 và 5 ); bổ sung magiê làm tăng
các giá trị này lên 53% và 100% (Bảng 3, mẫu 4 và 2). là
bằng Sự liên kết của magie với apophosphatase phụ thuộc rõ
Các hiệu ứng tương tự được thấy khi thêm magiê vào coban
rệt vào độ pH và tăng từ 0,2 đến 1,7 g nguyên tử/mol khi độ
magiê cộng enzym phosphatase. Com hoàn nguyên với
pH tăng từ 6,8 lên 9,2$ ; ở pH 8,0, 1,4 g nguyên tử được
4 tương đương với nguyên tử g của coban (Bảng 3, mẫu 6),
liên kết trên mỗi mol (Bảng 2, mẫu 1). Kẽm ảnh hưởng đáng
nguyên tử/mol lần lượt là 32% hoặc hoạt tính của kiềm 4 g
kể đến mức độ liên kết với magie . Ở pH 6,8, sự hiện diện
phosphatase chứa 2 g nguyên tử hoặc 74% (Bảng 3 , mẫu 7 và
của kẽm làm tăng liên kết của magie từ 0,2 lên 1,3 g-nguyên
9), nhưng việc bổ sung magie làm tăng các giá trị này lên
tử/mol, trong khi ở pH 8,0 , nó tăng từ 1,4 lên 1,6 g-nguyên
90% và 100% (Bảng 3, mẫu 8 và 6 ). Việc bổ sung coban hoặc
tử/mol (Bảng 2, mẫu 1 và 4). Trong trường hợp không có
magie dư thừa vào loài cuối cùng này không ảnh hưởng đến
magie , quá trình lọc máu của apoenzim chống lại kẽm 10-4 M hoạt động hơn nữa. Do đó , mag nesium tăng cường hoạt động
dẫn đến sự kết hợp của 4,1 g nguyên tử kẽm trên mỗi mol
của cả phosphatase kiềm và coban chứa
hoặc 24 g nguyên tử, mặc dù hầu hết
(Bảng 2, mẫu 2) . Khi sử dụng nồng độ kẽm rất cao , lớp
thứ hai của các vị trí liên kết kẽm -ngoài 4 g-nguyên tử
đầu tiên -có thể được phân biệt từ đường đẳng nhiệt liên
Bảng 3. Các hoạt động cụ thể của metallicophosphatases
kết *. Quá trình quay số của apoenzim chống lại coban 10-4
M dẫn đến tổng cộng 5,8 g nguyên tử của kim loại này (Bảng Kim loại được thêm vào (g-atom/mol)

2, mẫu 3 ), nhưng đường đẳng nhiệt liên kết không phân ; Hoạt
biệt giữa các vị trí này . Cân bằng hóa học khác nhau liên mẫu Mg đồng Zn động cụ thể %
quan khi apophosphatase được thẩm tách đồng thời chống lại magiê và coban.
Apoenzyme chỉ liên kết với 4,8 g nguyên tử coban , thay vì 1 2,5 - - 2 2,5 4 3 - 2 0

5,8 và chỉ 0,9 g nguyên tử magiê , thay vì 1,4 ( Bảng 2, 2,5 - 2 4 5 - 4 - 0 54,0 ± 100
2 6,5 ± 12
mẫu 5). Việc thay thế 1 g nguyên tử coban bằng 1 g nguyên
1 28,5 ± 53
tử magiê ngụ ý rằng coban có thể liên kết với các vị trí
1 43,0 ± 2 80
thường có kẽm cũng như những vị trí liên kết với magiê .
14.226.123.79.
14.226.123.79
www.pnas.org
https://
trước
tháng
2023
xuống
ngày
Được
chỉ
địa
năm
IP
vào
từ
tải
26
từ4

Do đó, có tối đa sáu vị trí liên kết kim loại (mẫu 3, 4 và

5) . Trong số này, chỉ có hai liên kết với magie , bốn
6 2,5 4 7 - 2 8 - 1,9 ± 0,1 100
liên kết tương đối đặc hiệu với kẽm, nhưng cả sáu đều có 2,5 2 9 - 4 0,6 ± 0,1 32
thể liên kết với coban, rõ ràng là không phân biệt. 1,7 ± 0,1 90
1,4 ± 0,1 74
Tác dụng của magie đối với hoạt tính enzym của kẽm và
coban phosphatase Một mình
Apoenzim được ủ trong 10 mM Tris, pH 8,0, 250 và các ion kim
magie không tạo ra hoạt tính xúc tác đối với apoal loại được thêm vào để tạo ra tỷ lệ mol của kim loại đối với
kaline phosphatase (Bảng 8, mẫu 1), nhưng nó có tác dụng rõ rệtenzim
. trong dịch thể. Enzyme kẽm đã được thử nghiệm trong 1 M
Tris và enzyme coban trong 0,02 M Veronal-0,4 M NaCl chứa 1 mM
§ Những chủng này là món quà hào phóng của Tiến sĩ A. p-nitrophenyl phosphate ở 250; các mẫu được phép cân bằng trong
Torriani, Khoa Sinh học, Viện Công nghệ Massachusetts , 24 giờ trước khi thử nghiệm. Lượng magie dư gấp 2,5 lần được
Cambridge, Mass. bổ sung vào apoenzyme 5 giờ trước khi bổ sung loại kim loại thứ hai .
 Machine Translated by Google

Hóa sinh: Anderson et al. Proc. tự nhiên học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 72 (1975) 2991

MỘT
b

chu kỳ 3

'l/
0Vx TÔI-

500 600 500 600

BƯỚC SÓNG, nm
QUẢ SUNG. 1. Phổ hấp thụ của coban phosphatase 1 magne sium.
(A) (--- ) Enzyme 2-Co , 0,15 mM, trong Tris.HCl, 10 mM, pH 8,0;
( - ) giống nhau ngoại trừ apoenzyme đã được ủ sơ bộ với lượng
magie dư gấp 2,5 lần trong 5 giờ trước khi bổ sung coban . (B)
Tương tự như A, ngoại trừ 4 g-nguyên tử coban được thêm vào apoen
zyme .
QUẢ SUNG. 2. Phổ thuận từ electron của phos phatase kiềm
2-Co + magie. Các điều kiện như trong Hình 1. ( Vạch sáng),
2-Co phosphatase kiềm ; ( vạch đậm) trước khi bổ sung 2 g
nguyên tử coban , apoenzim đã được ủ trước trong 5 giờ với
lượng magie dư gấp 2,5 lần . Công suất vi sóng 10 mW, tần
số điều chế 100 kHz, tần số vi sóng 9,3 GHz, 50K.

nguyên tử tiium trung gian giữa các đặc tính đó của apo-

rõ rệt đối với các enzym chỉ chứa 2 g nguyên tử kẽm hoặc
coban .
Ảnh hưởng của magie đến tính chất quang phổ của coban
phosphatase Hoạt tính
của các enzym 2-Co tăng gấp 3 lần do magie gây ra trùng hợp với
những thay đổi trong hình học phối hợp của các nguyên tử
coban . Dải hấp thụ của enzym 2-Co yếu và rộng với độ hấp thụ
cực đại ở vùng 510 nm, đặc trưng của coban trong môi trường
bát diện chiếm ưu thế ( Hình 1A, đường đứt nét ). Phổ EPR
phù hợp với loại hình học này ( Hình 2, vạch sáng) . Sự có mặt
của magie tăng cường và xác định thêm phổ hấp thụ , tạo ra
và holoenzyme , nhưng theo thời gian , đường cong phân
rã trở nên giống hệt với đường cong của apoenzyme . Điều
này chỉ ra rằng 2-Zn phosphatase kém ổn định hơn so với
enzyme 4 - Zn và có thể mất hoặc trao đổi vị trí các
nguyên tử kẽm của nó , phù hợp với sự mất khả năng đảo
ngược hoạt tính enzyme của loài này (12). Bây giờ chúng
tôi thấy rằng magiê ổn định rõ rệt cấu trúc của cả
apoenzyme và của cấu trúc chứa 2 g nguyên tử kẽm , sau đó
được ổn định thêm bởi 2 nguyên tử kẽm nữa để tạo thành
holoenzyme 4-Zn 1,6-Mg (Hình 3) .
CUỘC THẢO LUẬN

các cực đại nổi bật ở 555 và 640 nm (Hình 1A, đường liền Metalloenzyme có thể chứa một hoặc nhiều bộ vị trí liên kết
nét ). Nó cũng tạo ra những thay đổi nổi bật trong phổ EPR để kim loại mà sự chiếm chỗ của các nguyên tử kim loại giống nhau
tạo ra các giá trị g là gi = 4,95, g2 = 3,98 và gs = 1,95 và hoặc khác nhau ảnh hưởng nghiêm trọng đến xúc tác, độ ổn định
giá trị g trung bình là 3,62 (Hình 2, đường đậm ). Cả phổ hấp cấu trúc hoặc cả hai. Những cân nhắc như vậy liên quan đến
thụ và phổ EPR đều phù hợp với coban ở các vị trí 4 hoặc 5 tọa phosphatase kiềm của E. coli, mặc dù chưa đạt được thỏa thuận
độ có tính đối xứng thấp . chung về hàm lượng kim loại và ý nghĩa của nó đối với chức
năng và cấu trúc.
Những phát hiện hiện tại giúp giải quyết những khác biệt
Phổ hấp thụ của enzym 4-Co là đặc trưng của coban trong quá khứ liên quan đến hàm lượng kim loại của phosphatase
trong môi trường entic ( 6 ); ngoài ra , magie tăng kiềm . Enzyme được điều chế bằng phương pháp của Simpson et
cường khả năng hấp thụ và định nghĩa quang phổ của nó (Hình. al . (2), hoặc của Bosron et al. ( 3 ), chứa 1,0-1,7 g nguyên
1B). Tuy nhiên, trong trường hợp này không có bằng tử magie và từ 3,6 đến 4,2 g nguyên tử kẽm trên mỗi phân tử phân tử
chứng về sự thay đổi trong hình học phối hợp coban . Cơ
sở của những thay đổi quang phổ , cho dù là do cấu hình
cục bộ hoặc các hiệu ứng cấu trúc khác hoặc do sự phân
bố lại các nguyên tử coban giữa các vị trí khác nhau ,
đang được thiết lập. Phổ EPR của phosphatase, chứa 4 g
nguyên tử coban , rất phức tạp cả khi có hoặc không có
magiê . Không thể nhận thấy sự phân tách hy perfine và
quang phổ giống như quang phổ của các vật liệu tập
trung từ tính . Không thể giải thích theo 3 giá trị g . _
14.226.123.79.
14.226.123.79
www.pnas.org
https://
trước
tháng
2023
xuống
ngày
Được
chỉ
địa
năm
IP
vào
từ
tải
26
từ4

Ảnh hưởng của magiê đối với quá trình trao đổi
hydro-tritium của apo- và kẽm phosphatase

Sự phục hồi của apophosphatase với 4 g nguyên tử kẽm

trên mỗi mol giúp ổn định cấu trúc động của protein một
cách đáng kể , bằng chứng là sự lưu giữ tritium bổ sung
rõ rệt ( Hình 3 ) ). Tốc độ trao đổi tritium đối với 2- GIỜ
Zn phos phatase khác với tốc độ trao đổi của apo- và 4- QUẢ SUNG. 3. Trao đổi hydro-tritium của apo- và kẽm phospha
Zn enzyme (12) . Ban đầu, enzyme 2 -Zn giữ lại tổng số tri tases + magiê. Tất cả quá trình trao đổi được thực hiện trong
Tris -HCl, 10 mM, pH 8,0, 40. Nồng độ protein là 10 mg/ml
trước khi đi qua cột lớn và 1-2 mg/ml trong các lần ủ tiếp
theo . (0) apophosphatase; (o) 2-Zn phosphatase; (&) 4-Zn
¶ Số lượng nguyên tử kim loại được thêm vào phosphatase kiềm photphataza. Các ký hiệu đóng (0, * , A) thể hiện các enzim
được xác định bằng một số Ả Rập trước ký hiệu kim loại , ví tương ứng có chứa magie; trong những điều kiện này , apoen
dụ: 2 -Zn phosphatase kiềm , 4-Zn phosphatase đề cập đến enzyme zyme liên kết 1,4 g nguyên tử magiê và các enzym 2 và 4-Zn
mà 2 và 4 g nguyên tử kẽm đã được thêm vào mỗi nốt ruồi. liên kết 1,6 g nguyên tử.
 Machine Translated by Google
2992 Hóa sinh: Anderson et al.
trọng lượng 89.000 (Bảng 1). Hầu như tất cả các báo cáo trước
đây đều trích dẫn từ 2 đến 6 g nguyên tử kẽm trên mỗi mol enzyme
(1, 2 , 5, 13-15), mặc dù một số coi bất kỳ hàm lượng kẽm nào
vượt quá 2 g nguyên tử là không quan trọng (5, 13). Ngoại trừ
các trường hợp được đề cập (1, 2), hàm lượng magie chưa được báo cáo.
Rõ ràng là nguyên tố này rất quan trọng đối với cả
hàm lượng kẽm và hoạt động tối ưu của phosphatase.
Nói chung, sự không rõ ràng về hàm lượng kim loại của
enzyme có thể là do các biến thể trong phương pháp phân tích
được sử dụng để mô tả đặc tính, giá trị trọng lượng phân tử
protein được sử dụng để xác định phép cân bằng hóa học mol và
các điều kiện phân lập được sử dụng để chọn mẫu sinh học đại diện .
Gần đây, chúng tôi đã xem xét cách thức mà những cân nhắc
này đã ảnh hưởng đến các diễn giải trước đây về dữ liệu
liên quan đến hàm lượng kim loại của phosphatase kiềm
( 3). Ngoài ra, phép ngoại suy các hiệu ứng quan sát được
khi EDTA được sử dụng để điều chế apoenzyme (4) thành
những hiệu ứng được cho là xảy ra nếu EDTA được sử dụng
trong quy trình phân lập (5, 16) đã làm phức tạp thêm các
vấn đề do các yếu tố quy trình trên tạo ra . Bảng 1 chứng
minh rằng hàm lượng kẽm và magie của phosphatase kiềm
không phụ thuộc vào việc sử dụng EDTA hay tác nhân chelate
không hòa tan Chelex 100 trong quy trình phân lập .
Dữ liệu hiện tại xác nhận rằng một mình magiê không
khôi phục hoạt động của apoenzyme và họ chứng minh
thêm rằng magiê và kẽm ảnh hưởng đến chức năng
phosphatase kiềm và liên kết kim loại một cách hợp tác (Bảng
Phụ thuộc vào độ pH của quá trình phân lập , phosphatase
kiềm chứa từ một đến hai nguyên tử magiê kiểm soát sự liên
kết của các nguyên tử kẽm có chức năng và cấu trúc . Ngược
lại, kẽm ảnh hưởng đến sự gắn kết với magie . Việc xác
nhận tác dụng hợp tác của magie-kẽm đối với hoạt động của
kẽm phosphatase được công nhận cách đây hơn một thập kỷ
( 1) giờ đây sẽ làm rõ một số đặc điểm phân tử quan trọng
đối với cơ chế hoạt động của enzyme này .
Việc không giám sát sự xuất hiện của magie trong E. colh
alkaline phosphatase đã cản trở việc nhận ra tầm quan
trọng của nó đối với chức năng, cấu trúc và hàm lượng kẽm
của enzim . Điều này cũng có thể là cơ sở cho những mâu
thuẫn trong các báo cáo tài liệu liên quan đến cả hàm
lượng kim loại và tính chất hóa học của các enzym tự nhiên
và enzym hoàn nguyên và các hoạt động tương ứng của chúng .
Hơn nữa, sự phụ thuộc đáng kể vào độ pH của liên kết magie
và việc bổ sung một lượng lớn magie ngoại sinh trong quá
trình tinh sạch enzyme đã loại bỏ hoàn toàn khả năng phát
hiện bất kỳ magie nội sinh nào , do đó che khuất vai trò
cấu trúc và chức năng của nó , bao gồm cả tác dụng đối với
kẽm . (coban) ràng buộc (1, 5, 15, 17-19). Rõ ràng là cả
magiê và kẽm đều tham gia vào quá trình xúc tác phosphatase
kiềm và ổn định cấu trúc và tương tác lẫn nhau để ảnh
hưởng đến hình học liên kết và phối hợp tương ứng của
chúng . Các kết quả của sự liên kết cân bằng rium của các
tổ hợp khác nhau của kẽm, coban và magie như là một hàm
14.226.123.79.
14.226.123.79
www.pnas.org
https://
trước
tháng
2023
xuống
ngày
Được
chỉ
địa
năm
IP
vào
từ
tải
26
từ4
của nồng độ của chúng , các hoạt động enzym hỗ trợ tương
ứng , cũng như sự hấp thụ, lưỡng sắc tròn , lưỡng sắc
vòng từ tính và phổ EPR của các loại coban khác nhau
enzyme, tất cả đều ủng hộ những kết luận này (3,$).
Các hiệu ứng magiê được nhìn thấy rõ nhất trong
coban en zime , nơi những thay đổi trong hình học
phối hợp có thể được phân biệt bằng quang phổ. Các đặc
tính hấp thụ có thể nhìn thấy của enzyme 2-Co , có chứa
magiê, gợi ý hình học tọa độ 4 hoặc 5 (Hình 1 và 2),
trong khi không có magiê , chúng biểu thị dạng hình
bát diện chủ yếu (Hình 1 và 2). Do đó, việc bổ sung
magiê làm thay đổi hình học phối hợp coban từ bát diện thành 4 hoặc 5-
Proc. tự nhiên học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 72 (1975)
phối hợp và tăng hoạt động gấp 3 lần. Trong trường hợp của
enzyme 4-Co, có sự gia tăng chung về khả năng hấp thụ (Hình 1)
đi kèm với sự gia tăng hoạt động do magie gây ra .
Những thay đổi về hoạt động và quang phổ này có thể phản
ánh những thay đổi về cấu tạo ảnh hưởng đến hình học phối
hợp và ái lực tương đối của coban hoặc kẽm đối với các vị
trí xúc tác, cấu trúc và điều tiết . Quá trình oxy hóa Co
(II) thành Co(III) trong phosphatase kiềm thể hiện một cách
tiếp cận được xác định để phân biệt giữa các vị trí này bằng
đầu dò kim loại đặc biệt phù hợp cho mục đích này (8 ) .
Magiê tăng cường rõ rệt sự ổn định về hình dạng , đặc
biệt là các enzym apo- và 2-Zn (Hình 3), đồng thời ngăn
chặn sự mất hoạt động của các loài 2-Zn (12) (Bảng 3).
Về vấn đề này , giá trị thấp của hoạt tính cụ thể của
enzym 2-Zn sau khi cân bằng trong 24 giờ khi không có
magie ( Bảng 3, mẫu 2) có thể phản ánh sự mất hoặc cân
bằng lại kẽm giữa các vị trí gắn kết khác nhau ( Bảng
3, mẫu 4; Hình 3) .
Giờ đây , magie, kẽm , histidine (20), serine (21) và arginine
(22) đều liên quan đến xúc tác ca- talysis phosphatase kiềm ,
mối quan hệ tương hỗ và sự tham gia chung của chúng trong cơ
chế enzyme cần được kiểm tra. Do hàm lượng magne sium của hầu
hết các chế phẩm phosphatase được nghiên cứu trong quá khứ là
chưa biết, nên các đặc tính động học , ví dụ, độ pH tối ưu ,
cơ chất và sự phụ thuộc vào chất đệm cũng như các hằng số xúc
2tác
vàliên
3). quan , cần được xác định bằng các chế phẩm enzyme của
magie đã biết. nội dung. Tương tự như vậy, các tính năng cấu
trúc như tương tác giữa trang web và tiểu đơn vị phục vụ cho
việc đánh giá lại quan trọng dưới ánh sáng của những phát hiện hiện tại .
Sự tồn tại của tổng cộng sáu vị trí liên kết kim loại
trên mỗi dime và tác động qua lại của magiê và kẽm (coban)
đối với liên kết (Bảng 2 và 3) có thể ảnh hưởng quan
trọng đến các suy luận cơ học trước đây dựa trên phổ
của enzim được thay thế bằng 2 đến 4 đương lượng mol
của coban (6, 23, 24 ) , đồng (25-27) hoặc mangan (28-30)
và lượng magie chưa xác định . Tác dụng của magiê đối
với phosphatase kiềm có thể chứng minh là phù hợp với các
đặc điểm như tương tác tiểu đơn vị , tính hợp tác tiêu
cực (31), phản ứng tại một điểm ( 32) và hoạt động pyrophosphatase
Tương tự, vị trí của các vị trí liên kết kim loại bằng phân
tích tia X sis ( 34 ) sẽ bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của lượng
magiê và kẽm tối ưu trong các tinh thể được sử dụng cho mục
đích này .
Đặc điểm của hàm lượng magiê và chức năng của ion này
có thể sẽ cung cấp các liên kết quan trọng còn thiếu trong
việc xác định cơ chế hoạt động của phosphatase kiềm của
E. col. Sự tham gia của magiê và các ion kim loại khác
trong các quy trình điều tiết , chỉ mới bắt đầu được
khám phá đầy đủ, có thể sẽ nổi lên như một con đường
quan trọng để đạt được các hiệu ứng điều tiết trong các kim loại.
Công việc này được hỗ trợ bởi Grants-in-Aid GM-15003;
RAA là người nhận học bổng sau tiến sĩ CA-03037; và WFB
và FSK là những người nhận Thực tập sinh theo GM-02123,
tất cả đều từ Viện Y tế Quốc gia , của Bộ Y tế , Giáo
dục và Phúc lợi .
1. Plocke, D. J., Levinthal, C. & Vallee, B. L. (1962), Biochemis
try 1, 373-378.
2. Simpson, R. T., Vallee, B. L., và Tait, G. H. (1968),
Hóa sinh học 7,4336-4342.
3. Bosron, W. F., Kennedy, F. S. và Vallee, B. L. (1975)
Hóa sinh 14,2275-2282.
4. Ulmer, DD và Vallee, B. L. (1971), Bonorganic Chemis
try, Advances in Chemistry Series 100, ACS, p. 193.
5. Csopak, H. và Szajn, H. (1973), Arch. BRóchem. BLophys.
157,374-379.
 Machine Translated by Google

Hóa sinh: Axiderson et al. Proc. tự nhiên học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 72 (1975) 2993

6. Simpson, R. T. và Vallee, B. L. (1968), Hóa sinh 7, 4343-4350. 21. Schwartz, J. H. và Lipmann, F. (1961), Proc. tự nhiên học viện. Khoa học.
Mỹ 47,1996-2005.
Thiers, R. E. (1957), Phương pháp Blochem. hậu môn. 5,273-3. 22. Daemen, F. J. M. và Riordan, J. F. (1974), Hóa sinh 13,
7. 8. Anderson, R. A. và Vallee, B. L. (1975), Proc. tự nhiên học viện. Khoa học. 2865-2871.
Mỹ 72,394-397. 23. Applebury, M. L. và Coleman, J. E. (1969), J. Blol. hóa học.
9. Fuwa, K., Pulido, P., McKay, R. và Vallee, B. L. (1964), Hậu 244,709-718.
môn. hóa học. 36,2407-2411. 24. Taylor, J. S., Lau, C. Y., Applebury, M. L. và Coleman, J. E.
10. lida, C., Fuwa, K. và Wacker, W. E. C. (1967), Attal. Hóa (1973), J. Bild. hóa học. 248,6216-6220.
sinh học. 18, 18-26. 25. Taylor, J. S. và Coleman, J. E. (1972), Proc. tự nhiên Ách. Khoa học.
11. Kennedy, F. S., Hill, H. A. O., Kaden, T. A. và Vallee, B. L. Mỹ 69,859-862.
(1972), Hóa sinh. phiến lá. độ phân giải cộng đồng. 48,1533-1539.
26. Zukin, R. S. và Hollis, D. P. (1973), J. Biol. hóa học. 249,
12. Brown, E. M., Ulmer, D. D. và Vallee, B. L. (1974), 656-658.
Hóa sinh học 13,5328-5334.
27. Csopak, H. và Falk, K. E. (1974), Biochim. lý sinh học. Acta
13. Harris, M. I. và Coleman, J. E. (1968), J. Blol. hóa học.
359,22-32.
243, 5063-5073.
28. Haffner, P. H., Goodsaid-Zulduondo, F. và Coleman, J. E.
14. Reynolds, J. A. và Schlesinger, M. J. (1968), Hóa sinh 7,
(1974), J. Blol. hóa học. 249,6693-6695.
2080-2085.
29. Zukin, R. S. và Hollis, D. P. (1975), J. Biol. hóa học. 250,
15. Lazdunski, C., Peticlerc, C. và Lazdunski, M. (1969), Eur. J.
835-842.
Blochem. 8, 510-517.
16. Csopak, H., Falk, K. E. và Szajn, H. (1972), Blochim. Blo 30. Lilia, H., Csopak, H., Lindman, B. và Folsch, G. (1975), Chim
vật lý. Acta 258,466-472. sinh học . phiến lá. Acta 384,277-282.
17. Garen, A. và Levinthal, C. (1960), Blochim. phiến lá. Acta 31. Simpson, R. T. và Vallee, B. L. (1970), Hóa sinh 9, 953-958.
38,470-483.
18. Applebury, M. L. và Coleman, J. E. (1969), J. Biol. hóa học. 32. Chappelet-Tordo, D., Iwatsubo, M. và Lazdunski, M.
244,308-318. (1974), Hóa sinh 13,3754-3762.
19. Schlesinger, M. J. và Olsen, R. (1970), Hậu môn. hóa sinh. 38, 33. Heppel, L. A., Harkness, D. và Hilmoe, R. (1962), J. Blol.
86-90. hóa học. 237,841-846.
20. Tait, G. H. và Vallee, B. L. (1966), Proc. tự nhiên học viện. Sd. 34. Knox, J. R. và Wyckoff, H. W. (1973), J. Mol. Blol. 74,
Hoa Kỳ 58, 1247-1251. 533-545.

14.226.123.79.
14.226.123.79
www.pnas.org
https://
trước
tháng
2023
xuống
ngày
Được
chỉ
địa
năm
IP
vào
từ
tải
26
từ4