Безкоровайний Андрій ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 2

Завдання для самостійної позааудиторної роботи :

1. Як визначається активність ферменту?

Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою[6].
Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюга амінокислот,
який згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим
чином, і молекула (білкова глобула), що утворюється, набуває унікальних властивостей.
Декілька білкових ланцюжків можуть об'єднуватися у білковий комплекс. Найбільші рівні
структури білків — третинна та четвертинна структури — руйнуються при нагріванні або
під дією деяких хімічних речовин.
10. Одиниці активності ферментів :

1. Міжнародна одиниця активності – Основними одиницями вимірювання активності є:

міжнародна одиниця активності (МО), або стандартна одиниця - юніт (U):

1 МО відповідає такій кількості ферменту, яка каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за

1 хвилину при оптимальних умовах роботи ферменту (температури, рН, відсутність
інгібіторів або активаторів);

2.Катал – нова одиниця, яка була прийнята у 1973 році:

1 катал (кат) відповідає такій кількості каталізатора, який перетворює 1 моль субстрату за 1
секунду.Кількість каталів визначають за формулою

Міжнародна одиниця (МО) зв’язана з каталом такими відношеннями:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/хв = 60х106

мкмоль/хв = 6х107 MО,

1 MО = 1 мкмоль/хв = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

У медичних та фармацевтичних дослідженнях найбільш поширеною одиницею виміру

активності ферменту є МО

11. Що таке "специфічність дії ферменту" ?

На відміну від небіологічних каталізаторів специфічність – це одна із властивостей

ферментів, яка полягає в тому, що фермент може каталізувати перетворення одного певного
субстрату або групи подібних за структурою субстратів.

Виділяють три основні види специфічності:

1. стереохімічна – фермент, який має таку специфічність дії може каталізувати

перетворення лише одного стереоізо-мера (цис- або транс-; L-або D-). Наприклад:
 фумараза може перетворювати лише фумарову кислоту, але не її стереоізомер –
малеїнову.

2. абсолютна – фермент здатний каталізувати перетворення лише одного субстрату.

Наприклад: для уреази субстратом є виключно сечовина.

3. відносна – фермент каталізує перетворення групи подібних субстратів, наприклад, з

однаковим зв’язком. Наприклад: протеолітичні ферменти ШКТ (пепсин, трип-син,
хімотрипсин та ін.) гідролітично розщеплюють білки та пептиди, але не діють на інші
компоненти їжі.

12. Заповніть таблицю " Типи субстратної специфічності дії ферменту "

Типи специфічності Особливість процесу Приклади ферментів

Стереохімічна Фермент який має таку специфічність дії може
каталізувати перетворення лише одного
стререоізометра ( цис- або транс-,L або D- )
Абсолютна Фермент здатний каталізувати перетворення
лише одного субстрату.
Фумараза може перетворювати
лише фумарову кислоту, але не її
стереоізомер- малеїнову кислоту
Для аргінази субстратом є
виключно аргінін

Відносна Фермент каталізує перетворення групи Протеолітичні ферменти ШКТ

подібних субстратів, приклад, з однаковим
хімічним зв’язком
(пепсин, трипсин, хімотрипин. Та
інш)
Гідролітично розщеплюють
білки та пептиди, тому що
розщеплюють пептидний зв'язок.

1. Які реакції прискорюють ферменти (з точки зору термодинаміки) ?

З термодинамічної точки зору ферменти прискорюють хімічні реакції в організмі завдяки

тому, що знижують енергію активації (Ea). Без ферменту.

2. Що таке "енергія активації " і на що вона витрачається ?

Це характерний параметр процесів, зокрема хімічних реакцій, кінетика яких

описується рівнянням Арреніуса.
Енергія активації описує потенціальний бар'єр, який повинні подолати частинки для того,
щоб реакція відбулася. При підвищенні температури доля частинок із кінетичною енергією,
достатньою для подолання бар'єру, збільшується.
Енергія активації вимірюється зазвичай у Дж/моль (J/mol), кДж/моль (kJ/mol) або ккал/моль
(kcal/mol).
3. Що лежить в основі специфічності дії ферментів за гипотезою Е.Фішера ?
В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність
субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому
випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка.
4. Що лежить в основі специфічності дії ферментів за гипотезою Кошланда ?
На жаль ця модель може пояснити лише абсолютну специфічність дії ферментів, коли є лише
один субстрат для ферменту. Згідно з моделлю Кошланда активний центр ферменту є
динамічною структурою і може змінювати свою конформацію під дією молекули субстрату,
тобто субстрат індукує відповідні зміни в молекулі ферменту.
 5. Напишіть послідовність етапів каталітичного процесу (за Л.Міхаелісом і
М.Ментен) :

1. Стадія - зближення та орієнтація субстрату відносно активного центра

фермента з метою утворення фермент-субстратного комплексу – відбувається
внаслідок зв’язування субстрату з активним центром ферменту водневими,
електростатичними та гідрофобними взаємодіями, а в низці випадків –
ковалентними та координаційними зв’язками. На цьому етапі має велике
значення просторова конфігурація білкової молекули фермента, в якій жорсткі
ділянки чергуються з еластичними лінійними відрізками, що надає молекулі
фермента можливість динамічно змінюватися: приєднання субстрату до
фермента змінює структуру активного центра останнього, його функціональні
групи розміщуються так, що реакція може відбуватися. Утворення фемент-
субстратного комплексу відбувається дуже швидко, тривалість цієї стадії
залежить від концентрації субстрату, швидкості його дифузії до активного
центра фермента. енергія активації при цьому змінюється несуттєво.
2. Стадія- перетворення первинного фермент-субстратного комплексу на один
або кілька проміжних – характеризується послабленням зв'язків у субстраті, їх
розривом або утворенням нових у результаті дії каталітичних груп фермента;
формується молекула продукта. За рахунок утворення перехідних комплексів
знижується енергія активації субстрату, що зумовлює зростання швидкості
його перетворення. Ця стадія відбувається найповільніше та лімітує швидкість
усього каталізу.
3. Стадія - відокремлення від комплексу продуктів реакції, які утворилися в
процесі ферментативної реакції та перехід фермента у початковий стан.
Тривалість цієї стадії наближається до першої та визначається швидкістю
дифузії продукту в середовище.
6. Намалюйте графік залежності швидкості ферментативної реакції від
концентрації субстрату, позначте на ній константу Міхаеліса (Кm)

Кm - це Константа Міхаеліса — це концентрація субстрату, при якій швидкість дорівнює

половині максимальної.

Форма кривої ілюструє той факт, що

поступово з підвищенням концентрації
субстрату відбувається насичення
активних центрів ферменту молекулами
субстрату. Наближення до максимальної
швидкості реакції (Vmax) без подальшої
зміни цієї швидкості означає, що усі
активні центри молекул ферменту
зайняті, і подальше підвищення
швидкості неможливе – вона досягла
максимально можливого значення
(ефект насичення). Нижче на рис. 8
ілюстрований процес поступового
насичення ферменту субстратом.
 7. Характеристикою чого є константа Міхаеліса ?

У хімічній кінетиці — концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює

половині граничної (максимальної) швидкості реакції.

8. Ефект насичення – це
Наближення до максимальної швидкості реакції (Vmax) без подальшої зміни цієї
швидкості означає, що усі активні центри молекул ферменту зайняті, і подальше
підвищення швидкості неможливе – вона досягла максимально можливого значення
(ефект насичення)

9. Намалюйте графік залежності швидкості ферментативної реакції від

концентрації ферменту. Поясніть.

Рис. 1.6. Залежність

швидкості
ферментативної реакції
від концентрації
фермента (А) та
субстрату (Б)

Швидкість будь-якої ферментативної реакції залежить від концентрації фермента.

У переважній більшості випадків у початковий період реакції, за умови надлишку фермента
та невеликої кількості продукту швидкість реакції (V) прямо пропорційна його концентрації
– [Е] і має лінійний характер: V=К×[Е], де К – коефіцієнт (рис. 5.4, а). Але з часом кількість
продукту зростає і з’являється можливість для перебігу зворотної реакції, внаслідок чого
лінійна залежність втрачається.

Якщо ж концентрацію фермента залишити постійною, змінюючи лише концентрацію

субстрату [S], то графік швидкості ферментативної реакції буде описуватися гіперболою
(рис. 1.6, Б).

10. Намалюйте графік залежності швидкості ферментативної реакції від

температури. Поясніть.

Рис. 1.8. Вплив температури на

швидкість ферментативної реакції: 1 –
зростання швидкості реакції при
підвищенні температури; 2 - зниження
швидкості реакції при денатурації
ферменту
Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.Зростання температури
до певних визначених меж чинить вплив на швидкість ферментативної реакції, подібно до
впливу температури на будь-яку хімічну реакцію, що супроводжується прискоренням руху
молекул і, відповідно, прискоренням ймовірності взаємодії реагуючих речовин. Крім того,
температура може підвищувати енергію реагуючих речовин, що теж прискорює реакцію.
Однак, швидкість ферментативної реакції має свій температурний оптимум, перевищення
якого супроводжується зниженням ферментативної активності внаслідок термічної
денатурації білкових молекул (рис. 1.8).

Для більшості ферментів людини оптимальна температура 37 – 40 °С, проте в природі

існують і термостабільні ферменти: Тaq-полімераза, виділена з мікроорганізмів, яка не
інактивується навіть при 95 °С. Цей фермент використовують у науково-практичній
медицині для молекулярної діагностики захворювань із використанням методу ланцюгової
полімеразної реакції.

Зниження температури нижче оптимальної тимчасово сповільнює активність ферменту

внаслідок зменшення процесів дифузії молекул; повернення того чи іншого фермента в
оптимальне температурне середовище відновлює його активність. Цю здатність ферментів
широко використовують у медицині для пригнічення метаболічних процесів у тканинах (під
час трансплантації органів, операцій на серці), у фармації для збереження препаратів і
лікарських форм (наприклад, білкових препаратів, відварів, настоїв, емульсій тощо), у
народному господарстві, наприклад, для збереження харчових продуктів.

11. Намалюйте графік залежності швидкості ферментативної реакції від рН

середовища. Поясніть.
Рис. 1.9. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН середовища

Залежність швидкості ферментативної

реакції від pH середовища. Для кожного фермента існує певне значення рН середовища, в
якому він виявляє максимальну активність. Для пепсину воно становить 1,5 – 2,0,
піруваткарбоксилази 4,8, аргінази – 9,5 – 10,0. Проте, більшість ферментів організму людини
мають оптимум рН, наближений до нейтрального: фумараза 6,5; каталаза 6,8 – 7; уреаза 6,8 –
7,2; амілаза слини 6,8 – 7,4, карбоксипептидаза 7,5; трипсин 7,5 – 8,5, (рис. 1.9).
Вплив рН на активність фермента пов'язаний із іонізацією функціональних груп
амінокислотних залишків білкової молекули, що забезпечує оптимальну конформацію
активного центра. Відхилення рН від оптимальних величин порушує іонізацію
функціональних груп в активному центрі фермента. Так, наприклад, залуження середовища
спричинює від’єднання іонів Н+ від карбоксильних груп (СОО-), тоді як закислення, навпаки,
приєднання протонів до вільних аміногруп (NН3+). Це викликає зниження активності
ферменту, порушує спорідненість субстрату до фермента і гальмує каталітичний процес в
цілому. При значному відхиленні від оптимального значення рН може відбуватися
денатурація білкової молекули з повною втратою ферментативної активності. Зміна рН
середовища може також впливати і на просторову організацію субстрату.

12. Активатори- це речовини, які підвищують активність ферментів. Найчастіше

активаторами ферментів бувають іони магнію, марганцю, кальцію, калію,
кобальту, цинку та ін. В одних випадках іони металів (заліза, магнію, кобальту та
ін.) входять у склад простетичної групи ферменту, по-друге - полегшують
утворення фермент-субстратного комплексу, по-третє - сприяють приєднанню
коферменту до апоферменту, по-четверте - забезпечують становлення
четвертинної структури ферменту та ін.

Органічні: Жовчні кислоти ( активують підшлункову ліпазу), Ентерокіназа

(Активує трипсиноген), Вітамін С (підвищує активність оксидоредуктаз)

Не органічні: HCL (активує пепсиноген), Іони металів(Na, K, Mg, Mn),

а) Сприяють утворенню фермент-субстратного комплексу

б) Слугують донорами електронів

в) Беруть участь в утворенні активного центру( Zn-у складі карбогідрази, Fe- у

складі цитохромів, каталази, перексидази )

г) Виступають в ролі алостеричних регуляторів

13. Інгібітори– хімічні сполуки, що зменшують каталітичну активність

ферментів. Усі ферменти інгібуються в результаті денатурації білка внаслідок
нагрівання до високих температур, осаджування хімічними речовинами, гідролізу
кислотами, лугами, протеїназами.

Відповідно результат дії інгібіторів має назву інгібування, активаторів – активація.

 14. Заповніть таблицю "Типи інгібування"
типи інгібування рівняння приклади
за міцністю оборотне Наприклад, продукція енергії у
зв"язування мітохондріях залежить від
з ферментом енергетичного статусу клітини,
молекулярним показником якого є
концентрація АТФ, АДФ, АМФ та
ін. сполуки. При зростанні кількості
енергії, яка не використовується
клітиною, молекула АТФ буде
інгібітором деяких ферментів, які
задіяні в генерації цієї енергії.
необоротне Прикладом незворотного
інгібування може бути дія отруйної
речовини – диізопропілфторфосфату
(ДФФ). ДФФ утворює ковалентні
зв’язки із залишками серину в
активному центрі
ацетилхолінестерази, біологічною
функцією якої є розщеплення
нейромедіатора ацетилхоліну. В
результаті цього

Enz

А цетилхолін
накопичується у синапсах
і «отруює» організм. Залишок Сер у
складі Еnz ДФФ
Диізопропілфосфорил-фермент
За механізмом дії Конкурентне Класичним прикладом
інгібітора конкурентного інгібітора є малонова
кислота яка про тидіє зв'язуванню
активним центром ферменту
сукцинатдегідрогенази справжнього
субстрату - бурштинової кислоти
(сукцинату). Конкурентне
інгібування викликають різні
антиметаболіти, тобто сполуки,
близькі за будовою до справжніх
клітинних метаболітів: антивітаміни;
речовини, близькі до амінокислот,
пуринових та піримідинових основ і
нуклеотидів. У зв'язку з високою
біологічною активністю деякі
антиметаболіти застосовують як
антибактеріальні засоби
(сульфаніламіди, антибіотики),
протипухлинні препарати.
Конкурентне інгібування ферменту
можна перебороти за рахунок
підвищення концентрації субстрату
 в інкубаційному середовищі.
Неконкурентне Прикладами неконкурентного
(різновид інгібування можуть бути:
оборотного
інгібування) 1) дія іонів важких металів (ртуті,
свинцю, кадмію та ін.), які блокують
SH-групи активного центру. Зняти
таке інгібування допомагають
реактиватори – SH-комплексони
(цистеїн, димеркаптопропанол). Ці
сполуки містять SH-групи, які
зв’язують іони важких металів:

2) дія ціанідів CN- , які реагують з

Fe3+, що входить до складу
цитохромоксидази – ферменту
дихального ланцюга мітохондрій і
повністю блокують синтез АТФ у
клітині.

безконкурентне Цей тип інгібування спостерігають

у тому випадку, коли інгібітор
зворотно взаємодіє з ферментом
тільки після утворення фермент-
субстратного комплексу, тобто
безконкурентний інгібітор не
сполучається з ферментом у
відсутності субстрату. Інгібітор
полегшує приєднання субстрату, а
потім, зв’язуючись, інгібує фермент.
Це рідкісний вид інгібування.
субстратне Наявність надмірно високої
концентрації субстрату викликає
гальмування ферментативної
реакції. Пояснюється цей факт тим,
що молекули субстрату в надлишку
займають неправильне положення в
активному центрі фермента.
алостеричне У якості прикладу розглянемо
гліколіз – специфічний шлях
розпаду глюкози: при утворенні
надмірної кількості фруктозо-1,6-
дифосфату спостерігається
алостерична активація фермента
піруваткінази
 15. Заповніть таблицю "Використання інгібіторів ферментів в медицині"
Біохімічний Основні
Показання для
Група препаратів (фізіологічний) Ензим-мішень лікарські
застосування
ефект засоби
Нестероїдні Інгібітори Циклооксиге-наза Ацетилсаліци- Підвищення
протизапальні синтезу (простаглан- лова кислота, тем-ператури
простагландинів динсинтаза) індометацин, тіла, міалгія,
вольтарен артралгія,
невралгія,
ревматизм
Спазмолітики Інгібітори Фосфодіестераза, Ксантинол Порушення
метаболізму цАМФ (компламін), периферійного
циклічних пентоксифілін кро-вообігу,
нуклеотидів (трентал) ангіопатії,
ретинопатії
Гіпотензивні Інгібітори Ангіотензинкон- Каптоприл, Гіпертонічна
синтезу вертуючий ензим еналаприл хвороба
ангіотензину ІІ (дипептидилкар- допегіт
Інгібітори боксипептидаза
синтезу Дофамін--
катехоламінів монооксигеназа
Антиагрегаційні, Інгібітори Тромбоксан- Клопідогрель Коагулопатії,
антитромботичні синтезу синтетаза тромбо-
тромбоксану емболічні
ураження
антидепресанти Інгібітори Моноаміно- Сеган, Депресивні
психостимулятор окиснювального оксидази А, В селегілін стани. Апатія
и дезамінування психічного
нейромедіаторів походження.
Хвороба
Паркінсона
Антидіабетичні Пригнічення Альдозоредуктаза Ізодибут Діабетична
від-новлення ангіопатія
глюкози
Діючі на Накопичення Холінестераза Прозерин Міастенія,
периферійні ацетилхоліну в неврити, атонія
холінергічні холінергічних кишок і
процеси рецепторах сечового
міхура,
глаукома
Противірусні, Інгібітори РНК-полімераза, Ербісол Злоякісні
протипухлинні синтезу ДНК-полімераза рифампіцин, пухлини,
полінуклеотидів ацикловір лейкоз,
лімфограну-
лематоз, герпес
Антиалергійні Активатор Амінооксидаза Фенкарол Кропивниця,
метабо-лізму набряк Квінке,
гістаміну дерматози