Đoàn Chí Linh-B1203461

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA
----------
ĐOÀN CHÍ LINH
KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY, KHÁNG KHUẨN VÀ
KHÁNG NẤM CỦA CỦ TỎI (ALLIUM SATIVUM L.)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

LÊ THỊ BẠCH
Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
----------
ĐOÀN CHÍ LINH
KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY, KHÁNG KHUẨN VÀ
KHÁNG NẤM CỦA CỦ TỎI (ALLIUM SATIVUM L.)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

LÊ THỊ BẠCH
Cần Thơ, 2015

Luận văn tốt nghiệp Đoàn Chí Linh
LỜI CAM ĐOAN

----------
Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung bài luận văn được tham
khảo từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả thực
nghiệm mà tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi
xin cam đoan về sự tồn tại và tính trung thực khi sử dụng những dữ liệu và số
liệu này.
Đoàn Chí Linh
i
LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp cũng như quá trình
học tập và làm việc tại trường, để có được kết quả này, đầu tiên em xin gửi lời
cảm ơn chân thành và lời tri ân đến:
Các Thầy, Cô bộ môn Hóa Học - khoa Khoa Học Tự Nhiên - trường Đại
học Cần Thơ đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức quý báo
trong suốt quá trình học tập ở trường.
Cô Lê thị Bạch đã tận tình chỉ bảo, khuyến khích và tạo điều kiện cho
em hoàn thành luận văn, giúp em định hướng được con đường nghiên cứu khoa
học của riêng mình.
Quý thầy cô trong Bộ môn Hóa, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại
Học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất cho em về trang thiết bị, dụng cụ để thực
hiện luận văn.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến cố vấn học tập và tập thể lớp Hóa Học
K38 đã luôn đồng hành cùng em trong suốt 4 năm qua.
Cuối cùng, gia đình là chỗ dựa vững chắc cho con để vượt qua mọi khó
khăn, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ đã luôn ủng hộ, động viên và
chăm lo cho con về vật chất lẫn tinh thần.
Xin cảm ơn!
ii
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học ------------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Lê Thị Bạch
2. Đề tài: “Khảo sát định tính thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy
hóa, kháng khuẩn và kháng nấm của củ tỏi (Allium sativum L.)’’
3. Sinh viên thực hiện: Đoàn Chí Linh MSSV: B1203461

Lớp: Hóa Học – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ hướng dẫn
Lê Thị Bạch
iii
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học ------------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………
2. Đề tài: “Khảo sát định tính thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy
hóa, kháng khuẩn và kháng nấm của củ tỏi (Allium sativum L.)’’
3. Sinh viên thực hiện: Đoàn Chí Linh MSSV: B1203461

Lớp: Hóa Học – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện
iv
TÓM TẮT LUẬN VĂN

------------
Tỏi (Allium sativum L.) là một loại rau được biết đến như nguồn thực
phẩm chống oxy hóa tốt trên toàn thế giới… và cũng được con người sử dụng
làm gia vị, thuốc từ những năm trước công nguyên. Từ các cao điều chế được
là cao ethanol, cao n-hexane, cao ethyl acetate và cao nước, tiến hành định tính
sơ bộ thành phần hóa học cho thấy trong củ tỏi có chứa alkaloid, flavonoid,
steroid – Triterpenoid, tanin, saponin, glycoside. Khảo sát hoạt tính kháng oxy
hóa bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH, nhận thấy cao Ea có tính chống
gốc tự do vượt trội, có thể nghiên cứu về sau. Cuối cùng, khảo sát hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn của 3 loại cao là: cao n-Hexane, cao Ethyl acetate
và cao Nước. Các cao đều thể hiện khả năng kháng từ 1 – 3 VSVKĐ với giá trị
MIC từ 50 – 200 µg/ml. Trong đó, cao Hex thể hiện khả năng kháng khuẩn và
kháng nấm tốt nhất.
v
MỤC LỤC
------------
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………….......................i
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………………ii
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN………….………..iii
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN…………………..….iv
TÓM TẮT LUẬN VĂN…………………………………………………....….v
MỤC LỤC……………………………………………….………...………….vi
DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….ix
DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………x
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT……………………………..……….xii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 1
1.3 Nội dung nghiên cứu................................................................................ 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 2
2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY .......................................................................... 2
2.1.1 Giới thiệu về họ loa kèn đỏ (Amaryllidaceae) ................................. 2
2.1.2 Giới thiệu về củ tỏi (Allium Sativum L.) .......................................... 2
2.1.3 Vị trí củ tỏi trong hệ thống phân loại học thực vật .......................... 3
2.1.4 Phân bố sinh thái .............................................................................. 3
2.1.5 Tác dụng dược lý ............................................................................. 4
2.1.6 Nghiên cứu về thành phần hóa học, về hoạt tính sinh học trong và
ngoài nước ................................................................................................. 6
2.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NHÓM CHỨC ......................................... 8
2.2.1 Alcaloid ............................................................................................. 8
2.2.2 Flavonoid .......................................................................................... 8
2.2.3 Terpenoid .......................................................................................... 9
2.2.4 Steroid ............................................................................................. 10
2.2.5 Glycoside ........................................................................................ 11
2.2.6 Tamin .............................................................................................. 11
2.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA. .... 12
2.3.1 Gốc tự do ....................................................................................... 12
vi
2.3.2 Chất chống oxy hóa ....................................................................... 15

2.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 16
2.4.1 Phương pháp tách chiết hợp chất tự nhiên...................................... 16
2.4.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) ............................................................. 20
2.4.3 Phương pháp TLC-DPPH .............................................................. 24
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 25
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU....................................... 25
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .......................................................... 25
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 25
3.2.2 Dung môi và hóa chất ..................................................................... 25
3.3 QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM ............................................................ 26
3.3.1 Điều chế cao tổng EtOH, Cao Hex, Cao Ea Và Cao H20 ............... 26
3.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các cao điều chế được ..... 28
3.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng TLC – DPPH ................... 28
3.3.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao đã điều chế được .. 29
3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm .............................. 34
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN ..................... 35
4.1 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO................................................................ 35
4.2 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOẠI CAO
CHIẾT ĐIỀU CHẾ ĐƯỢC ......................................................................... 36
4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid ................................................. 36
4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid .............................................. 36
4.2.3 Khảo sát sự hiện diện steroid – triterpenoid ................................... 38
4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của glycoside ............................................... 39
4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin .................................................. 39
4.2.6 Khảo sát sự hiện diện của tanin ...................................................... 40
4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA
THEO PHƯƠNG PHÁP TLC - DPPH. ...................................................... 44
4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA 4 LOẠI
CAO (CAO TỔNG, CAO HEX, CAO EA VÀ CAO NƯỚC) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP BẪY GỐC TỰ DO DPPH .............................................. 45
4.4.1 Vitamin C ........................................................................................ 45
4.4.2 Cao Tổng EtOH .............................................................................. 46
4.4.3 Cao Hex .......................................................................................... 46
vii
4.4.4 Cao Ea ............................................................................................. 47

4.4.5 Cao Nước ........................................................................................ 48
4.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG
NẤM CỦA 3 LOẠI CAO (CAO HEX, CAO EA, CAO NƯỚC) .............. 49
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 50
5.1 KẾT LUẬN............................................................................................ 50
5.2 KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………52
PHỤ LỤC…………………………………………………………………….54
viii
DANH MỤC BẢNG

------------
Bảng 2.1 Những gốc tự do phổ biến ................................................................ 13
Bảng 3.1 Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................................ 25
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 25
Bảng 3.3 Dãy nồng độ của vitamin C .............................................................. 31
Bảng 3.4 Dãy nồng độ của cao EtOH .............................................................. 32
Bảng 3.5 Dãy nồng độ của cao Hex ................................................................ 32
Bảng 3.6 Dãy nồng độ của cao Ea ................................................................... 32
Bảng 3.7 Dãy nồng độ của cao nước ............................................................... 32
Bảng 4.1 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao tổng EtOH
.......................................................................................................................... 42
Bảng 4.2 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao Hex ...... 42
Bảng 4.3 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao Ea ......... 43
Bảng 4.4 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao nước ..... 43
Bảng 4.5 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của Vitamin C ......... 45
Bảng 4.6 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao EtOH .......... 46
Bảng 4.7 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao Hex ............. 46
Bảng 4.8 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao Ea ............... 47
Bảng 4.9 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao nước ........... 48
Bảng 4.10 Giá trị IC50 của vitamin C và các cao ............................................. 48
Bảng 4.11 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các cao ........................ 49
ix
DANH MỤC HÌNH

------------
Hình 2.1 Hình thái của củ tỏi ............................................................................. 3
Hình 2.2 Cách tính giá trị Rf ............................................................................ 23
Hình 3.1 Ngâm dầm mẫu. ................................................................................ 26
Hình 3.2 Cao hex ............................................................................................. 26
Hình 3.3 Cao Ea (a), Cao nước (b) .................................................................. 27
Hình 3.4 Quy trình điều chế các loại cao......................................................... 27
Hình 3.5 Quy trình khảo sát TCL - DPPH....................................................... 29
Hình 3.7 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa DPPH .......................... 33
Hình 4.1 Giải ly 100% CHCl3 (a), giải ly Ea:MeOH:H2O = 100:13,5:10 (b) . 35
Hình 4.2 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Dragendoff của cao EtOH ......... 36
Hình 4.3 Định tính flavonoid bằng dung dịch FeCl3 của cao EtOH ................ 37
Hình 4.4 Định tính flavonoid bằng H2SO4 của cao EtOH ............................... 37
Hình 4.5 Định tính flavonoid bằng NaOH/ethanol 1% của cao EtOH ............ 38
Hình 4.6 Định tính steroid – triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann - Burchard
của cao EtOH ................................................................................................... 38
Hình 4.7 Định tính steroid – triterpenoid bằng thuốc thử Salkowski của cao
EtOH ................................................................................................................ 39
Hình 4.8 Định tính glycoside bằng thuốc thử Felling của cao EtOH .............. 39
Hình 4.9 Định tính saponin dựa vào tính chất tạo bọt của cao EtOH ............. 40
Hình 4.10 Định tính saponin bằng thuốc thử Pb(CH3COOH)2 bão hòa của cao
EtOH ................................................................................................................ 40
Hình 4.11 Định tính tanin bằng thuốc thử Stiasny của cao EtOH ................... 41
Hình 4.12 Định tính tanin bằng thuốc thử Pb(CH3COOH)2 của cao EtOH .... 41
Hình 4.13 Kết quả TLC – DPPH, cao hex (a), cao Ea (b), cao nước (c)......... 44
Hình 4.14 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của Vitamin C ....... 45
Hình 4.15 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao EtOH ........ 46
Hình 4.16 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao hex ........... 47
Hình 4.17 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao Ea ............. 47
x
Hình 4.18 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao nước ......... 48
Hình 4.19 Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của vitamin C và các cao EtOH, Hex,
Ea, nước ........................................................................................................... 49
xi
DANH MỤC TỪ NHỮNG VIẾT TẮT

------------
TLC Thin Layer Chromatography

EtOH Ethanol
Hex n-Hexane
Ea Ethyl acetate
Me Methanol
HDL High-density lipoprotein
LDL Low-density lipoprotein
CD4 cluster of differentiation 4
ADN Deoxyribonucleic acid
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
SKLM Sắc ký lớp mỏng
DPPH Di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium
xii
Chương 1 Giới thiệu
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Tỏi (Allium sativum L.) là một loài cây thực vật dạng cây thân thảo, được
dùng làm thức ăn và thuốc từ những năm trước công nguyên trên các vùng nhiệt
đới Trung Á, về sau được trồng rộng rãi ở Hi Lạp, Ai Cập và La Mã. Hiện nay
tỏi được trồng rộng rãi ở tất cả các nước trên thế giới. Có thể sử dụng cả Lá và
củ làm thức ăn, làm thuốc chữa bệnh cho con người.
Theo các nghiên cứu của khoa học hiện đại, nguyên nhân chính gây ra
các bệnh như tiểu đường, tăng huyết áp, nhiễm khuẩn, ung thư, lão hóa… là do
strees oxy hóa, vẫn đang là mối lo ngại đối với con người bởi sự nguy hiểm và
tính phổ biến của nó. Chính vì thế, các nhà khoa học trong, ngoài nước đã nghiên
cứu và phát hiện ra nhiều công dụng của củ tỏi đối với sức khỏe của con người
trong đó nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, chống lão hóa,
chữa ung thư, tiểu đường…
Vì vây, đề tài “Khảo sát định tính thành phần hóa học, hoạt tính
kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm của củ tỏi (Allium sativum L.)’’
được thực hiện nhằm khảo sát, đánh giá sơ bộ thành phần hóa học trong củ tỏi,
khả năng kháng oxy, kháng khuẩn cũng như kháng nấm để làm rõ vấn đề trên
và góp phần tìm ra phương pháp chữa bệnh an toàn và hiệu quả hơn.
1.2 Mục đích nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu chính của đề tài là nhằm khảo sát sơ bộ thành phần
hóa học có trong củ tỏi, khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm.
1.3 Nội dung nghiên cứu

Điều tra sơ bộ, thu thập, xử lý nguyên liệu củ tỏi (Allium sativum L.).
Điều chế các loại cao có độ phân cực khác nhau (cao EtOH, cao Hex,
cao Ea và cao nước).
Khảo sát định tính thành phần hóa học có trong các loại cao điều chế
được.
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các loại cao trên bằng phương
pháp TLC – DPPH và phương pháp DPPH.
Khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của 3 loại cao (cao Hex,
cao Ea và cao nước).
1
Chương 2 Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY
2.1.1 Giới thiệu về họ loa kèn đỏ (Amaryllidaceae) [1]

Họ Loa kèn đỏ (danh pháp khoa học: Amaryllidaceae) là một họ
trong thực vật có hoa. Họ này chủ yếu là các loại cây thân thảo sống lâu năm,
mọc ra từ thân hành, thông thường có hoa sặc sỡ. Họ này chứa khoảng 60-73
chi, với khoảng trên 800-1.600 loài. Một vài chi hay được trồng trong vườn.
Họ Amaryllidaceae được công nhận, với các định nghĩa khác nhau, trong
phần lớn các hệ thống phân loại có trong thế kỷ 20, mặc dù hệ thống
Cronquist lại gộp nó trong họ Liliaceae định nghĩa rộng. Hai họ này theo truyền
thống được tách ra nhờ bầu nhụy, với bầu nhụy hạ ở Amaryllidaceae và bầu
nhụy thượng ở Liliaceae. Hệ thống APG năm 1998 công nhận họ này như là
một họ tách rời. Hệ thống APG II (2003) lại gộp họ Amaryllidaceae trong
họ Alliaceae nhưng cho phép tách ra như một họ độc lập, đều thuộc
bộ Asparagales của nhánh monocots. Hệ thống APG III (2009) sáp nhập ba họ
Amaryllidaceae nghĩa hẹp, Alliaceae và Agapanthaceae thành họ
Amaryllidaceae nghĩa rộng.
2.1.2 Giới thiệu về củ tỏi (Allium sativum L.) [2, 4, 8, 11]

Tỏi (Allium sativum L.) là một loại rau được biết đến như nguồn thực
phẩm chống oxy hóa tốt trên toàn thế giới. Được con người sử dụng làm gia vị,
làm thuốc, hay được dùng như một loại rau.
Cây thân thảo, sống hàng năm, cao 30-40 cm. Thân hành ngắn, hình tháp
gồm nhiều hành con gọi là ánh tỏi, to nhỏ không điều, xếp ép vào nhau quanh
một trục lõi, võ ngoài của thân hành mỏng, màu trắng hoặc hơi hồng. Lá phẳng
và hẹp, hình dải, mỏng, bẹ to và dài có rãnh dọc, đầu nhọn hoắt, gân song song,
hai mặt nhẵn.
Cụm hoa mọc ở ngọn thành đầu tròn, bao bọc bởi những lá mo có mũi
nhọn rất dài; hoa màu trắng hay hồng có cuống hình sợi dài; bao hoa gồm 6
phiến hình mũi mác, xếp thành hai hàng, thuôn; nhị 6, chỉ nhị có cực dài, đính
vào các mảnh bao hoa; bầu gần hình cầu.
2
Hình 2.1 Hình thái của củ tỏi
2.1.3 Vị trí củ tỏi trong hệ thống phân loại học thực vật [1]
Giới: thực vật
Ngành: thực vật hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp: Thực vật có một lá mầm (Monocotyledoneae)
Bộ: măng tây (Asparagales)
Họ: loa kèn đỏ (Amaryllidaceae)
Chi: allium L.
Loài: Allium sativum L.
2.1.4 Phân bố sinh thái [12]

Tỏi là một trong những cây trồng cổ xưa nhất còn tồn tại đến nay. Cây
có nguồn gốc ở vùng Trung Á (Tien Shan), ở đây hiện còn loài tỏi đặc hữu mọc
hoang dại là Allium longicuspis Regel. Từ 3000 năm trước Công nguyên, tỏi đã
được biết đến ở Hy Lạp. Ở ấn độ và Trung Quốc, tỏi cũng được trồng từ thời cổ
đại. Người Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Pháp đã đưa cây tỏi sang Mỹ. Ngày
nay, tỏi là cây trồng rộng rãi khắp thế giới, từ vùng có khí hậu nhiệt đới xích
đạo (5o) đến 50o vĩ tuyến ở cả hai bán cầu. Trãi qua hàng ngàn năm trồng trọt
và chọc lọc, từ loại tỏi ban đầu đã hình thành nhiều giống tỏi khác nhau, tương
đương với các thứ như A. sativum L. var. sativum; var. typicum Regel; var.
ophioscorodon (link) Doll và var. controversum (Schrader) Moore. Tất nhiên
giữa các giống này, chúng khác nhau về kích thước, hàm lượng tinh dầu, năng
suất cũng như đặc tính thích nghi với các vùng có điều kiện khí hậu khác nhau.
3
Ở việt nam, tỏi được trồng khắp các địa phương từ nam chí bắc. Hiện
đang có hai nhóm tỏi khác nhau là nhóm tỏi củ nhỏ, thơm, nhiều tinh dầu, được
trồng ở các tỉnh phía bắc vào khoảng tháng 1-2, thu hoạch vào tháng 5-6. Nhóm
tỏi củ to, trồng ở các tỉnh phía nam, nhất là ven biển miền trung, đảo Lý Sơn –
Quảng ngãi, Bình Thuận và Ninh Thuận. Loại tỏi củ to này thường được trồng
trên đất pha cát thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, nhiệt độ
22-260C. Trong khi đó, loại tỏi củ nhỏ sinh trưởng phát triển mạnh vào lúc thời
tiết còn mát và ôn hòa mùa xuân; Đến mùa hè ở nhiệt đới trên 22oC, cây đã cho
thu hoạch.
2.1.5 Tác dụng dược lý [7, 12, 13, 20]
2.1.5.1 Tác dụng tăng cường hệ miễn dịch

Tỏi có tác dụng đáng kể lên hệ miễn dịch; tăng hoạt tính các thực bào
lymphô cyte nhất là với thực bào CD4 giúp cơ thể bảo vệ màng tế bào chống
tổn thương nhiễm sắc thể ADN; kháng virus; phòng chống nhiễm trùng.
2.1.5.2 Tác dụng giảm đường huyết

Tỏi có tác dụng gia tăng sự phóng thích Insulin tự do trong máu,
tăng cường chuyển hóa glucose trong gan - giảm lượng đường trong máu
và trong nước tiểu (tác dụng tương đương với Tolbutamid, một loại sunfamid
chữa tiểu đường type II). Do đó dùng tỏi thường xuyên hàng ngày có thể chữa
bệnh tiểu đường type II cho người mắc bệnh từ 3 - 10 năm; đồng thời người
bệnh phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều cấm kỵ với người bệnh tiểu đường (từ
bỏ các chất ngọt có chứa đường; thuốc lá; bia rượu; thức ăn chiên rán, quay,
nướng; chất béo động vật, cùi dừa, dầu cọ. Hạn chế ăn muối, thịt có màu đỏ,
ngũ cốc v.v.).
2.1.5.3 Tác dụng kháng sinh

Kháng khuẩn: Các chất Azôene, dianllil disulfide, diallil - trisulfide
và các hoạt chất chứa lưu huỳnh khác (được tạo ra khi tỏi tươi giã nát) có
khả năng ức chế 70 loại vi khuẩn gram (-) và gram (+) kể cả vi khuẩn bệnh
hủi, bệnh lao. Thậm chí nó còn kháng được cả những vi khuẩn đã lờn thuốc
kháng sinh thường dùng khi phối hợp với cloramphenicol hoặc streftomicin,
tỏi làm tăng hiệu lực kháng sinh của chúng.
Kháng virus: Tỏi có thể ngăn ngừa được một số bệnh gây ra do virus như
cúm, cảm lạnh, kể cả virus gây lở mồm long móng bò, ngựa, trâu (mấy năm gần
đây Anh quốc và nhiều nước châu Âu đã khốn khổ vì bệnh này).
4
Diệt ký sinh trùng và nguyên sinh động vật: Nước ép tỏi có tác dụng chữa
bệnh đường ruột do nguyên sinh lamblia intestinalis gây ra. Với lỵ amid do
antamocba histolytica gây ra cũng bị diệt ngay ở dịch ép tỏi nồng độ thấp.Tỏi
có tác dụng diệt giun sán như giun đũa, giun kim, giun móc và trứng của chúng.
Cần chú ý: quá liều có thể bị tiêu chảy và viêm ruột (dung dịch uống và thụt).
Xua đuổi và diệt côn trùng: Nhiều loại côn trùng như dán, muỗi (aedes
truyền bệnh sốt xuất huyết, culex truyền bệnh viêm não Nhật Bản) rất sợ mùi
tỏi. Tỏi còn giết chết được các ấu trùng muỗi (loăng quăng) với liều lượng rất
thấp 25ppm cho các chất chiết hoặc 2 ppm cho dầu tỏi. Vì vậy nếu bạn để củ tỏi
tươi trong tủ đựng thức ăn thì sẽ không có dán chui vào.
2.1.5.4 Tác dụng đối với hệ thống mạch máu lưu

Tỏi làm giảm triglycerid và cholesterol trong máu tương tự clofibrat. Tỏi
làm tăng hàm lượng cholesterol tốt (HDL) và giảm hàm lượng cholesterol xấu
(LDL) do đó làm giảm các rối loạn chuyển hóa mỡ trong máu, chống xơ cứng
động mạch vành, động mạch não, động mạch ngoại vi. Tỏi có thể làm hạ huyết
áp tâm thu từ 20 - 30mmHg và hạ huyết áp tâm trương từ 10 – 20 mmHg. Tỏi
chống sinh huyết khối tương đương với aspirin nhưng không có tác dụng phụ
có hại như aspirin. Do đó dùng tỏi tươi hoặc chế phẩm tỏi thường xuyên hàng
ngày sẽ có tác dụng điều hòa huyết áp, chống bệnh tăng huyết áp; bảo vệ tim
mạch chống nhồi máu cơ tim và chống tai biến mạch máu não; đồng thời người
bệnh phải thực hiện tốt các điều kiêng kỵ như với bệnh ung thư nói trên.
2.1.5.5 Tác dụng đối với tế bào ung thư

Tỏi có tác dụng chống lại tiến trình phát triển khối u và ung thư của nhiều
loại ung thư khác nhau như: ung thư dạ dày, ung thư cột sống ung thư phổi, ung
thư vú và màng trong tử cung, ung thư kết tràng, ung thư thanh quản, v.v. Nếu
bệnh được phát hiện và điều trị sớm (ăn tỏi thường xuyên hàng ngày từ 5 đến
20 gam tỏi tươi tủy bệnh) đồng thời người bệnh tuân thủ nghiêm ngặt các điều
kiêng kỵ như từ bỏ thuốc lá; bia rượu; thức ăn nướng - quay - chiên rán. Hạn
chế ăn chất béo động vật, cùi dừa, dầu cọ, muối, các loại thịt có màu đỏ (bò, dê
lợn v.v).
2.1.5.6 Tác dụng chống nhiễm độc chất phóng xạ

Tỏi làm tăng thải trừ các chất đồng vị phóng xạ và giảm sự tích đọng các
chất đồng vị phóng xạ trong cơ thể.
Tác dụng giải độc nicotin mạn tính: Tỏi là một loại thuốc giải độc nicotin
mạn tính cho người nghiện thuốc lá và công nhân sản xuất thuốc lá rất hữu hiệu;
5
chí ít cũng làm giảm cơn nguy cấp ở tim, động mạch và các rối loạn chức năng
ruột của người bệnh.
2.1.5.7 Các tác dụng khác

Tác dụng bảo vệ gan: Trong các trường hợp nhiễm độc gan, sau khi uống
chất chiết tỏi 6 giờ, lượng lipid peroxides cao và sự tích tụ triglycerides
trong gan sẽ hạ xuống.
Tác dụng chống các bệnh đường hô hấp: Tỏi được dùng làm thuốc trị lao
khí quản, hoại thư phổi, ho gà, thuốc long đàm cho người lao phổi, trị viêm phế
quản mãn tính, viêm họng.
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, tỏi được dùng làm thuốc chống độc,
long đờm, lợi tiểu, diệt giun, tăng cường tiêu hóa, chữa dịch hạch, dịch tả, vô
kinh...
Ở Ấn Độ, các chế phẩm tỏi được dùng trong lao phổi, hoại thư phổi và
ho gà. Các bệnh lao thanh quản, luput và loét tá tràng được điều trị với dịch ép
tỏi. Ngoài ra còn dùng để chữa một số bệnh ngoài da...
Ở Nepal, tỏi có trong thành phần một số bài thuốc trị thấp khớp. Ở
Indonesia, tỏi dùng để trị đau nhức cơ, trị các vết bọ cạp đốt và vết rắn cắn…
2.1.6 Nghiên cứu về thành phần hóa học, về hoạt tính sinh học trong và
ngoài nước
Đã có rất nhiều bài nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa
học cũng như hoạt tính sinh hóc của củ tỏi
2.1.6.1 Trong nước

Nguyễn Thị Thu Hương, Khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học,
Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM, 2011, Nghiên cứu hoạt tính kháng
khuẩn của 3 loại cao chiết (cao chiết nước, cao chiết cồn, cao chiết metanol) từ
củ tỏi (Allium sativum L.) đối với 5 chủng vi khuẩn gây bệnh viêm nhiễm điển
hình và kháng thuốc phổ biến hiện nay là Tụ cầu vàng (Staphylococus aureus),
Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), Phế cầu khuẩn (Streptococus
pneumoniae), Trực khuẩn đường ruột (Escheriechia coli) và Klebsiella
teirgena. Kết quả cho thấy các cao chiết của củ Tỏi đều có khả năng kháng các
loại vi khuẩn gây bệnh trên [18].
Lê Thị Ngọc Hân, Trường Đại Học Đà Nẵng, 2012, nghiên cứu được
một số thành phần có trong tinh dầu tỏi như sau: 1 - Propene, 1 – (methylthio)
(4.00% ), Diallyl disulphide (4.90%), Trisulfide, di – 2 – propenyl (10.40%), 3
6
– vinyl – 1, 2 – dithiacyclohex – 4 - ene (11.89%), 3 – vinyl – 1, 2 –

dithiacyclohex – 5 - ene (52.28%) [20].
Nghiên cứu của nhóm tác giả Trần Hồng Thủy, Nguyễn Trung Tính, Trần
Ngọc Thiên Kim, Nguyễn Thành Nhân, Khoa Thủy Sản, Trường ĐH Nông Lâm
Tp.HCM, 2013, nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn của tỏi (Allium sativum L.)
trong điều trị bệnh do Aeromonas hydrophila trên ếch thái lan (Rana tigerina),
kết quả cho thấy Tỏi (Allium sativum L.) có khả năng kháng vi khuẩn
Aeromonas hydrophila trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Năm 2015, nhóm tác giả Võ Thị Việt Dung, Trịnh Thị Trinh, Phạm Thị
Thu Chi, Khoa Cơ bản, Trường ĐH Phạm Văn Đồng Quảng Ngãi đã Nghiên
cứu chiết xuất tinh dầu tỏi Lý Sơn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước, mẫu sau khi chiết xuất được xác định thành phần hóa học bằng phương
pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS), thu được: trisulfide (77,29%), disulfide
(14,76%), tetrasulfide (6,23%) và monosulfide (1,73%) [19].
2.1.6.2 Ngoài nước

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh hoc của cao chiết
từ củ tỏi có hoạt tính kháng oxy hóa rất mạnh, giúp phá hủy các gốc tự các hạt
tự do có thể gây tổn hại màng tế bào và DNA, góp phần làm chậm quá trình lão
hóa cũng như phòng tránh các bệnh tim và ung thư [3, 4, 13].
Nhóm tác giả Cunbao liu, Xu Yang, Yufeng Yao, Weiwei Huang, Wenjia
sun, Yanbing Ma, 2014, Nghiên cứu so sánh các hoạt động chống oxy hóa của
chất chiết xuất từ dung dịch nước tỏi và methanol được xử lý trước và sau khi
đun sôi. Bằng cách kiểm tra các hoạt động chống oxy hóa của các chất chiết
xuất trong ống nghiệm, cụ thể là, ABTS [2, 2'-azino-bis (axit 3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonic)] và DPPH (2, 2-diphenyl-1- picrylhydrazyl).
Cho thấy các dịch chiết của củ Tỏi đều có khả năng kháng oxy hóa tốt [2].
Năm 2014, các tác giả Raja Zouari Chekki, Ahmed Snoussi, Imen
Hamrouni, Nabiha Bouzouita, Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học trong tỏi. Xác định được axit béo chính là axit lauric (49,3%) và axít
linoleic (20,4%). Xác định được độ ẩm, tro và protein tương ứng là 66%, 1,4%
và 5,2%. Xác định được tính kháng oxy rất mạnh và kháng được các loại khuẩn
là Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica and Bacillus cereus
[7]
.
7
2.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NHÓM CHỨC [9]
2.2.1 Alcaloid
Alcaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực
vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất
nhiều loài thực vật có alcaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn.
Alcaloid có rất nhiều cấu trúc và đa dạng, nên để tiện lợi, các alcaloid
được chia làm ba loại: alcaloid thật, protoalcaloid và giả alcaloid
(Pseudoalcaloid).
Alcaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base,
thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp
từ các amino acid.
Các protoalcaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả
mescalin và N, N-dimetyltryptamin.
Các giả-alcaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino
acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alcaloid steroid và alcaloid terpentoid.
Alcaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử
nitơ. Tính base của các alcaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các
nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ. Các
alcaloid tính base yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan
trong nước.
Các alcaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng
thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như cloroform, dietyl eter, alcol bậc thấp.
Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung
môi hữu cơ như cloroform, dietyl eter, benzzen. Các protoalcaloid và giả
alcaloid thường dễ tan trong nước.
2.2.2 Flavonoid
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất
nhiều rau, hoa, quả… Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu
vàng); tuy vậy một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp
vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn căn bản.
Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng
benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6-
C3-C6. Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với số
8
dị nguyên tố oxigen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số
phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và
7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở
dạng tự do hoặc dạng glycosid. Các đường thường gặp nhaagts là đường D-
glucose, kế đó là D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và
acid uronic.
Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavonoid có màu
vàng nhạt hoặc màu cam; flavonoid có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có
màu vàng đến màu cam đỏ. Các isoflavon, flavonoid, flavanonol,
leucoantocyanidin, catechin kết tinh không màu. Antocyanidin thường được
hiện diện ở dạng glycosid thí dụ như: pelargonidin, cyanidin, delphinidin… tạo
màu xanh dương, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái.
2.2.3 Terpenoid
Terpenoid là những hợp chất tự nhiên mà cấu trúc hóa học dựa trên cơ
sở các phân tử isopren liên kết lại với nhau, có công thức tổng quát (C5H8)n với
n ≥ 2. Tuy là dẫn xuất của isopren nhưng isopren lại không phải là tiền chất của
quá trình sinh tổng hợp terpenoid. Chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp terpenoid
là pharnesyl pyrophosphat.
Dựa vào số đơn vị isopren, người ta phân chia thành bảy loại:
Monoterpen (C10H16), sesquiterpen (C15H24), diterpen (C20H32), sesterterpen
(C25H40), triterpen (C30H48), tetraterpen (C40H64), polyterpen (C5H8)n.
Monoterpen (C10H16) là thành phần chủ yếu của tinh dầu, hiện diện trong
khoảng 60 họ thực vật, nhưng chủ yếu trong 10 họ. Hàm lượng tinh dầu trong
cây thường thấp, khoảng 1%, ngoại trừ nụ hoa cây Đinh hương Syzygium
aromaticum (L.) có hàm lượng tinh dầu chiếm 15-20%, trong đó thành phần
chính là eugenol. Cấu trúc hóa học của các monoterpen có thể là mạch hở, 1, 2
hoặc 3 vòng với khoảng 10 khung sườn carbon cơ bản chính (có tên gọi riêng
cho khung) và nhiều khung biến đổi do sự chuyển vị các nhánh.
Sesquiterpen (C15H24): tinh dầu cũng chứa những hợp chất loại
sesquiterpen. Thường gặp các seslacton trong các cây họ Cúc. Cấu trúc hóa học
của các hợp chất tự nhiên sesquiterpen có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng
với 80 khung sườn carbon cơ bản chính.
Diterpen (C20H32): trong tự nhiên, diterpen không vòng là hợp chất
phytol. Diterpen đơn vòng là vitamin A. Diterpen bốn vòng có khung cơ bản là
9
gibberelan với thí dụ là gibberilin, chất tăng trưởng thực vật. Cấu trúc hóa học
của các diterpen có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 70 khung sườn
carbon cơ bản chính.
Sesterterpen (C25H40): trong tự nhiên, các hợp chất loại sesterterpen hiện
diện với số lượng nhỏ. Cấu trúc hóa học của các sesterterpen có thể là mạch hở,
1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 6 khung sườn carbon cơ bản chính.
Triterpen (C30H48): được phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực
vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid. Cấu trúc hóa học của các triterpen có
thể là mạch hở, 3, 4 hoặc 5 vòng với 33 khung sườn carbon cơ bản chính.
Tetraterpen (C40H64) còn được gọi là carotenoid. Các hợp chất này
thường có cấu trúc hóa học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chất có
màu từ vàng, cam đến đỏ (tùy vào số nối đôi) tạo nên màu sắc cho hoa và trái
cây. Cấu trúc hóa học của các tetraterpen có thể là mạch hở, 1 hoặc 2 vòng.
Polyterpen (C5H8)n: luôn có cấu trúc mạch hở, thẳng. Các polyterpen tự
nhiên với độ polymer hóa cao (từ 500 đến 5000 đơn vị isopren) là những hợp
chất nhựa cây hiện diện trong khoảng 300 loài thực vật. Các nối đôi của các hợp
chất tự nhiên polyterpen hiện diện hoặc tất cả ở cấu hình E hoặc tất cả ở cấu
hình E hoặc tất cả ở cấu hình Z.
2.2.4 Steroid
Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật
và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng
cyclopentanoperhydrophenan trên hoặc trong một vài trường hợp hiếm gặp là
dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên.
Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp giống như triterpen với chất liệu cơ
bản là pharnesyl pyrophosphat.
Steroid phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc
saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật
(phytosterol, β-sitosterol, ergosterol, stigmasterol…).
Steroid có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở
các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Steroid là chất không phân cực,
rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, caroten; tan nhiều trong các dung môi
không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các
dung môi này để chiết steroid.
10
2.2.5 Glycoside
Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận
cây: lá, vỏ, hạt… Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng.
Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và
phần không đường thường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzym thực
vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và
đường phân.
Phần đường của glycosid: Phần đường phổ biến là D-glucose, D-
galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid
galacturonic và một số đường khác.
Phần aglycon của glycosid: Phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các
loại hợp chất tự nhiên như: monoteroen, sesquiterpen, diterpen, triterpen,
steroid, iridoid, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenyl…
Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong petroleum
ether, hexane, benzen nhưng tan được trong chloroform, diethyl ether (các
monoglycoside), tan tốt trong alcol, nước.
2.2.6 Tamin
Tamin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật.
Người ta gặp tamin hằng ngày trong cuộc sống (trà, rượu vang đỏ, nhiều loại
trái cây nhất là trong võ trái măng cục…). Các tamin có trọng lượng phân tử
khoảng 500-3000. Các tamin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo
trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt.
Khi nếm tamin, có cảm giác se lưỡi là do tamin làm kết tủa các enzym
có trong nước bọt, khiến nước bọt bị mất tính chất của nó là làm trơn láng phần
bề mặt trong của miệng; cũng vì lý do này các loài động vật ăn cỏ ít chọn ăn các
loài cây có chứa hàm lượng tamin cao. Các nghiên cứu cho thấy có sự biến mất
tamin cũng như nhiều loại hợp chất phenol trong nhiều loại quả chín (so với khi
còn quả xanh) là do cây cỏ đó đã sử dụng lại các hợp chất nói trên.
Tamin được chia thành hai nhóm chính là “tamin thủy giải được” và
“tamin hóa đặc” tùy theo việc tamin có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc
dung dịch acid.
Tamin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glucose với acid
galic. Người ta cũng chia loại tamin này ra là tamin galic và tamin ellagic.
11
Tamin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol thí dụ như catechol
hoặc epicatechol. Loại này khác với tamin thủy giải được vì nó không bị thủy
giải dưới tác dụng của acid vô cơ hóa.
2.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA.
2.3.1 Gốc tự do [2, 5, 13, 17]
2.3.1.1 Khái niệm gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử mà ở lớp
ngoài cùng có những electron chưa ghép đôi. Vì có năng lượng cao và kém bền
nên các gốc tự do dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hóa-khử, polymer
hóa, phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, AND,… gây rối loạn
các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử bị các gốc tự do
tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, sau đó lại tiếp tục
tấn công các phân tử khác, tạo nên một phản ứng dây chuyền gây ra các biến
đổi có hại cho cơ thể. Gốc tự do cũng có thể tồn tại độc lập, nhưng chỉ trong
khoảng thời gian rất ngắn. Chúng cũng có thể kết hợp với nhau tạo nên một
phân tử mới.
2.3.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do

Có hai nguồn gốc phát sinh cơ bản: nội sinh và ngoại sinh
2.3.1.2.1 Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được hình thành do những quá trình
chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể.
Chẳng hạn như trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp tế bào, một số điện
tử có thể bị rò rỉ, sau đó chúng tương tác với oxy và hình thành nên gốc
superoxide. Khoảng 2-5% oxy sử dụng cho sự trao đổi chất hiếu khí trong ti thể
chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species-
ROS). Bên cạnh đó, quá trình thực bào của các tế bào bạch cầu khi có các sinh
vật lạ xâm nhập vào cơ thể cũng như sinh ra các gốc tự do, thông qua việc hoạt
hóa enzym NADPH-oxidase ở màng bạch cầu, enzym này xúc tác cho phản ứng
giữa oxi và NADPH tạo nên gốc tự do superoxide O2-, từ đó tạo ra nhiều gốc
tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể.
Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể còn có thẻ tham gia vào các
phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân hủy lipid hydroperoxide tạo gốc
tự do peroxide, sau đó gốc tự do này tham gia vào phản ứng dây chuyền peroxide
12
hóa lipid gây hại cho cơ thể. Ngoài ra, việc vận động gắng sức cũng phát sinh
nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim.
2.3.1.2.2 Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

Gốc tự do ngoại sinh hình thành do các yếu tố bên ngoài như ô nhiễm
môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thuốc lá, rượu
bia, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thức ăn…
Việc sử dụng nhiều loại thuốc trị bệnh cũng có thể tạo ra các gốc tự do,
như các kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung như như bleomycin và
các loại thuốc cản trở sự phát triển của tế bào… Xạ trị điều trị ung thư cũng là
một nguyên nhân sinh ra gốc tự do, các bực xạ được sử dụng trong xạ trị tác
động và truyền năng lượng cho các thành phần của tế bào, sinh ra các gốc tự do,
các gốc tự do này tiếp tục phản ứng với oxy hòa tan trong dịch tế bào sinh ra
các ROS, tiếp tục gây ra các dây chuyền phản ứng khác gây tổn thương tế bào,
bất lợi cho cơ thể. Hút thuốc cũng như hít phải khói thuốc lá gây ra những tổn
thương cho đường hô hấp, mà nguyên nhân một phần là do lượng lớn các gốc
tự do bền trong nhựa thuốc như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và
hydroquinon có trong khói thuốc lá gây ra những tổn thương cho phế nang…
Bảng 2.1 Những gốc tự do phổ biến
Chất oxy hóa Mô tả

O2- , anion superoxide
Trạng thái khử 1 electron của O2, tạo thành nhiều
phản ứng tự oxy bởi chuỗi dẫn chuyền điện tử. Có
sự phóng thích Fe2+ từ những protein có S liên kết
với ion sắt và ferritin. Phản ứng tạo ra H2O, trong
điều kiện có hoặc không có sự xúc tác của enzyme.
H2O2 là tiền chất để tạo thành OH
H2 O2 , hydrogen Trạng thái khử 2 electron, được tạo thành từ O2-
peroxide hoặc trực tiếp khử O2

OH, hydroxyl radical Trạng thái khử 2 electron, được tạo thành bởi phản
ứng Fenton và sự phân ly của peroxynitrite, phản
ứng này sẽ tấn công phần lớn các thành phần tế bào
ROOH, hydroperoxide Được tạo thành bởi những phản ứng oxy hóa với các
hữu cơ thành phần của tế bào như lipid hoặc base nitơ
 
RO , alkoxy và ROO , Những gốc tự do có oxy ở trung tâm. Những dạng
peroxy lipid tham gia trong phản ứng peroxide hóa…
ONOO , peroxynitrite Được tạo thành từ phản ứng giữa O2- và NO. Lipid
-
hòa tan và những chất tương tự trong phản ứng với

acid hypochloric. Sự proton hóa tạo thành acid
peroxynitrite, các phản ứng này sẽ tạo ra những gốc
tự do hydroxyl và nitơ dioxide
13
2.3.1.3 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Khi số lượng gốc tự do nằm trong khả năng kiểm soát của cơ thể, chúng
đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống trong cơ thể.
Chẳng hạn như trong quá trình hô hấp tế bào nhằm tạo ra năng lượng cho
các hoạt động sống, có bản chất là chuỗi phản ứng oxy hóa-khử và các gốc tự
do là các sản phẩm trung gian cho chuỗi phản ứng này. Gốc tự do còn có vai trò
khá lớn trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, góp phần tiêu diệt các sinh vật có
hại xâm nhập vào cơ thể, đồng thời quét dọn các tế bào già cõi, tế bào chết trong
cơ thể, tạo điều kiện cho các tế bào mới khỏe mạnh sinh sôi và phát triển. Ngoài
ra, gốc tự do còn góp phần ức chế, tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào
ung thư.
2.3.1.4 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Khi cơ thể ở trạng thái khỏe mạnh, cơ thể có khả năng sinh ra các chất
chống oxy hóa giúp trung hòa lượng gốc tự do sinh ra trong quá trình chuyển
hóa của cơ thể cũng như các gốc tự do ngoại sinh. Thế nhưng khi bước sang
tuổi trung niên hay khi cơ thể không đạt trạng thái sức khỏe, cân bằng vốn có
giữa gốc tự do và chất chống oxy hóa bị phá vỡ, kéo theo đó là hàng loạt chuỗi
phản ứng bất lợi lên các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào, dẫn đến
hàng loạt các tổn thương và kết quả là sự hoạt động bất thường của các cơ quan.
Các gốc tự do tấn công lên màng tế bào, làm màng tế bào mất dần chức
năng sinh học, quá trình trao đổi chất từ đó bị cản trở, các mô dần bị thoái hóa
và sau cùng dẫn đến sự chết tế bào. Hậu quả từ sự tấn công đó là hàng loạt các
bệnh như Parkinson, Alzheimer, các bệnh về thần kinh, tim mạch, đái tháo
đường, suy giảm hệ thống miễn dịch, ung thư… Ngoài ra, khi cơ thể bị yếu đi,
hiệu suất làm việc của hệ thống enzym sửa sai với nhiệm vụ loại đi những điểm
bị hư hỏng ADN cũng giảm đi, khi đó gốc tự do dễ dàng tấn công vài nhóm
đường deoxyribose và base nitơ của nhóm purin, pirimidin của AND, sinh ra
các thể đột biến gây hại cho cơ thể.
2.3.1.5 Gốc tự do di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium (DPPH)

[2, 6]
Nguyên tắc: di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium (DPPH) là

gốc tự do ổn định trong methanol, không tự kết hợp để tạo thành nhị phân tử.
DPPH là một gốc tự do có bước sóng hấp thu cực đại tại 517nm và có màu tím.
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa DPPH bằng cách cho
14
hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại ban đầu và màu
của dung dịch phản ứng cũng nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Bản chất của phương pháp bẫy gốc tự do DPPH là phản ứng giữa chất
kháng oxy hóa và gốc tự do DPPH bằng cách nhận điện tử hay H. Thông qua
độ hấp thu của DPPH còn lại để xác định khả năng kháng oxy hóa của mẫu thử.
2.3.2 Chất chống oxy hóa [3, 13, 17]
2.3.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là chất trực tiếp hoặc gián tiếp ngăn cặn, trung hòa
hay loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do với cơ thể. Chúng ta có thể trực
tiếp phản ứng với gốc tự do, tạo nên sản phẩm mới kém hoạt động hơn nhằm
ngăn phản ứng dây chuyền do gốc tự do gây ra. Cũng có thể gián tiếp tạo phức
với các ion kim loại chuyển tiếp hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho quá trình
hình thành gốc tự do, giúp ngăn cản sự hình thành của gốc tự do.
2.3.2.2 Phân loại chất chống oxy hóa

Có nhiều cách để phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu
trúc của chất chống oxy hóa. Cũng có thể phân loại gốc tự do dựa trên bản chất
enzyme hoặc không có bản chất enzyme của gốc tự do
2.3.2.2.1 Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme

Đây là một hệ thống các chất oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào,
nhằm duy trì căn bằng giữa lượng gốc tự do và chất chống oxy hóa trong cơ thể,
giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công do các gốc tự do gây ra trong suốt các quá
trình sinh lí và bệnh lí. Hệ thống này gồm các enzyme như: superoxide
dismutase, glutathion peroxidase, catalate.
2.3.2.2.2 Chất chống oxy hóa không bản chất enzyme

Bên cạnh các chất chống oxy hóa có bản chất enzyme có nguồn gốc nội
sinh, cơ thê còn có các chất chống oxy hóa không mang bản chất enzyme cũng
có nguồn gốc nội sinh như vitamin A, glutathione, glycin, methionine,… và các
chất chống oxy hóa ngoại sinh có trong thực phẩm như vitamin C, vitamin E,
flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpene, carotenoid,…
15
2.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Phương pháp tách chiết hợp chất tự nhiên
2.4.1.1 Dung môi tách chiết

 Dung môi
Do cấu tạo cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử
(polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh
vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát
hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có
trọng lượng phân tử nhỏ.
Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính
ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các
hợp chất tự nhiên có tính ái nước. Điều này được thực hiện bằng cách chiết
những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng
dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi
vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên).
Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết
tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến
dưỡng thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong muốn cô lập. Các hợp chất
tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không
thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm,
mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng. Vì vậy, khi tiến
hành thực nghiệm phải thu nhập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực
tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp.
Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng
kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng mấy chiết Soxhlet…
Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc
được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30 – 40oC
vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt.
 Lựa chọn dung môi để tách chiết
Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy,
hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết xong dung môi đó có thể được
loại bỏ dễ dàng. Cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy do có
nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetraclorua…
Dung môi dùng để chiết cần thỏa một số điều kiện sau:
16
- Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì dung môi dễ hao hụt
do bay hơi dẫn đến cháy nổ.
- Không tác dụng hóa học với các chất có trong nguyên liệu và không
bị thay đổi tính chất khi sử dụng lại.
- Nhiệt hóa hơi thấp để tránh tiêu hao nhiều nhiệt.
- Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán.
- Không tạo thành hỗn hợp nổ đối với không khí, không được có những
tạp chất bay hơi và khi bay hơi không được để lại các tạp chất có mùi
lạ.
- Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị. Không gây mùi đối với sản
phẩm và không độc hại với người sử dụng.
- Dễ tìm và rẽ tiền.
 Một số điều cần thiết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất
Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy
tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất là
chất dẻo hóa. Các chất dẻo hóa lẫn vào dung môi do dung môi thường được
chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo.
Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl)phthalat
và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa
trong cây cỏ đang khảo sát.
Chloroform, dichloroform có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như
brucin, strychnin, ephedrine… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và
một hợp chất giả tạo khác. Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân thủy, sự
khử nước, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ.
Diethyl ether ít được sự dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy,
độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo peroxid dễ gây
nổ. Peroxid này rất hoạt động, có thể oxid hóa các hợp chất mang nhiều nối đôi
liên hợp như carotenoid.
Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm
cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid.
Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất
glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycosid tại nối acetal làm mất đi phần
đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị.
17
Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở
nhiệt độ 30 – 40oC, chưng cất ở nhiệt độ cao có thể làm hư một số hợp chất kém
bền nhiệt.
 Sự hòa tan các hợp chất trong dung môi
Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể
dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết.
Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có
các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch carbon dài, alcol
béo, ester béo, acid béo…), các thành phần của tinh dầu (monoterpen,
sesquiterben, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thực vật (phytosterols),
các chất màu thực vật như carotene…
Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có các sesquiterben,
diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycosid bị thủy giải, các
monoglycosid (chỉ mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu.
Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như
chlorophyl, các glycosid (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp
với các acid hữu cơ, các muối amine, các tamin, các hydrate carbon có trọng
lượng phân tử nhỏ như monosacarid, oligosacarid, các protein thực vật, các
muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhầy, chất gôm…
2.4.1.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi nguyên liệu [9]
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật
đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết lỏng – rắn.
Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm
sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet… Ngoài ra, còn có
thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháo sử dụng chất lỏng
siêu tới hạn (lưu chất siêu tới hạn), chiết có sự hỗ trở của vi sóng.
2.4.1.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng [9]

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban
đầu (thí dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được
cao alcol thu ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều
chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó
cô lập riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Người
ta dùng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung
dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
18
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum
ether) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester
béo...); dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometan…)
hòa tan tốt các hợp chất có tính phân trung bình (các hợp chất có chứa nhóm
chức ether, aldehyde, ketone, ester…) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ như
methanol, nước,…) sẽ tan tốt trong các hợp chất phân cực mạnh (các hợp chất
có chứa nhóm chức –OH, -COOH…)
Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol
thô được hòa tan vào pha nước. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại
không hòa tan với nước và loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi
pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy độ phân cực của dung
môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm lớp
trên hoặc ở dưới so với pha nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến
dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl
acetate, n-butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện
nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết cho đến khi không
còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực
hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom lại chung, làm khan nước với chất
làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4… sau đó cô quay thu hồi dung môi ta
thu được cao chiết tương ứng. Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết
vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước và chiết
bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần
so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung
môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không
còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Cũng
có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một
tấm kính sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kính.
Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng – lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia
tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và
nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi.
2.4.1.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm [9]

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt
nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác vói một
lượng lớn mẫu cây.
19
Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng, có
nắp đậy.
Phương pháp thức hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tinh
khiết vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng
trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào
thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc
ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp
theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm
một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết
bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy
lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài).
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định
trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể
thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mất thời gian.
Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng chất làm khan và
được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.
Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều, gồm sự
ngấm kiệt, sự ngâm dần, sự trích với máy chiết Soxhlet… Ngoài ra, còn có sự
chiết với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu
tới hạn.
2.4.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [10]
2.4.2.1 Nguyên tắc

SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải
thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Quá trình tách các hợp chất
xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh. Do đó SKLM
thuộc sắc ký lỏng, có thể là sắc ký lỏng – lỏng hay sắc ký lỏng – rắn.
Trong SKLM có 4 loại cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân
tử nhưng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn. Các chất cần tách trong SKLM có thể
khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang đối với phương chuyển động của
dung môi. Do đó chất làm pha tĩnh cần có đặc tính nở rộng theo cả chiều dọc và
chiều ngang.
20
2.4.2.2 Chất hấp phụ

Trong SKLM, cần dùng bột chất hấp phụ rất mịn, không thể dùng loại
bột sắc ký cột vì nó có kích thước lớn hơn gấp hàng chục lần. Các chất hấp phụ
thường dùng là:
Silicagel (hay kieselgel – Gel của acid silicic): là chất hấp phụ được sử
dụng rộng rãi nhất hiện nay, kích thước hạt 10 – 40 µm, diện tích bề mặt 200 –
400 m2/g, được loại sắt bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion
clorid và lắng gạn loại các hạt nhỏ lơ lửng, sau đó sấy 120oC trong 48 giờ. Hoạt
tính hấp phụ của nó do nhóm –OH trên bề mặt quyết định. Do đó hàm lượng ẩm
tăng sẽ làm giảm hoạt độ.
Nhôm oxyd: trong SKLM có 3 dạng oxyd nhôm, đó là oxyd nhôm trung
tính, acid, base. Tùy theo từng đối tượng cần tách mà lựa chọn loại oxyd nhôm
sử dụng cho phù hợp.
Kieselguhr: là một loại bột nhẹ, màu vàng xám chứa khoảng 70 – 95%
SiO2, phần còn lại gồm các oxyd nhôm, sắt, kền, Mg, Ca, P, S… Các tính chất,
thành phần, hoạt độ và kích thước của hạt kieselguhr thay đổi theo hãng sản
xuất. Kieselguhr là một chất hấp phụ yếu, dùng tách các chất phân cực như
cetoacid, lacton… và thường được dùng làm chất mang cho pha tĩnh trong chất
sắc ký phân bố. Đôi khi người ta còn sử dụng hỗn hợp kieselguhr – thạch cao
và kieselguhr – silicagel với tỉ lệ 1 : 1.
Thạch cao : được điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl2 và H2SO4 với
tỉ lệ đồng phân tử, đun 70 – 80oC, gạn lấy CaSO4, rửa tới trung tính, sấy 48 giờ
ở 115 – 120oC.
Cellulose: là chất cao phân tử thiên nhiên có công thức [C6H7O2(OH)3]n,
được dùng dưới dạng bột mịn và thường không cần chất kết dính. Cellulose
thường dùng để tách các hợp chất thân nước, các vết thu được khá tròn, ít biến
dạng và thời gian phân tích ngắn. Để làm tăng hoạt tính của cellulose, một số
tác giả khuyên nên xử lý cellulose bằng hỗn hợp methanol, acid formic và nước
hoặc bằng isopropanol, acid acetic và nước. Nhược điểm chính của cellulose là
không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử mạnh như NaOH, H2SO4…
Các chất hấp phụ khác:
 Polyamid (còn gọi là đất tẩy trắng): có thể phân tách các hợp chất
có chứa nhóm chứa phenol.
 Nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ – hữu cơ: là loại silicagel được
sulfon hóa (hoặc gắn các gốc có khả năng trao đổi ion khác), đó
21
là cationit có nhóm –SO3H nên có thể sử dụng trong môi trường

acid mạnh.
2.4.2.3 Dung môi

Đây là yếu tố có thể thay đổi để đạt được mục đích phân tách. Việc lựa
chọn dung môi không có một quy tắc cụ thể nào mà thường phải sắc ký sơ bộ
để thăm dò hệ dung môi thích hợp.
Nếu mẫu phân tách có ái lực yếu với chất hấp phụ thì nên lựa chọn chất
hấp phụ có hoạt tính cao và dung môi ít phân cực.
Nếu mẫu thử có khả năng bị hấp phụ mạnh thì nên dùng chất hấp phụ có
hoạt tính yếu và dung môi phân cực mạnh. Hệ dung môi chọn càng đơn giản
càng tốt và luôn dùng loại dung môi tinh khiết.
Việc lựa chọn dung môi và chất hấp phụ rất quan trọng cần được căn cứ
vào một số yếu tố sau:
 Tính chất của hỗn hợp chất cần phân tách (độ hòa tan, độ phân
cực, số lượng và đặc tính các nhóm chứa hóa học).
 Khả năng hấp phụ của pha tĩnh.
 Độ bay hơi, độ nhớt, sự phân lớp và độ tinh khiết của hỗn hợp
dung môi.
Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ theo thứ tự tăng dấn như sau:
CH=CH2 < OCH3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH2 < OH < COOH.
2.4.2.4 Quá trình và kỹ thuật sắc ký
2.4.2.4.1 Chấm dung môi lên bản mỏng

Với lớp mỏng dính chắc có thể đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới
khoảng 1 - 2 cm. Dùng ống mao quản hay micropipet chấm dung dịch lên bản
mỏng cách 2 mép bên của bản khoảng 1 – 2 cm; khoảng cách giữa các vết chấm
cách nhau ít nhất là 1 cm. Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm
phải gọn, nhỏ chứa lượng thử khoảng 1 – 10 µg. Lượng chất chấm có ảnh hưởng
tới sự di chuyển của vết, làm thay đổi vị trí của nó trên sắc ký đồ.
2.4.2.4.2 Khai triển sắc ký

Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha
tĩnh.
22
Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình. Lưu ý: các vết chấm
không được chạm trực tiếp vào pha động trong bình. Sau khi dung môi chạy
đến các đầu trên của bản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh mức dung môi trên
kính, để khô hay sấy khô.
2.4.2.4.3 Phát hiện các vết trên bản mỏng

Có nhiều phương pháp để phát hiện các vết như qua màu sắc tự nhiên
của vết, phun các thuốc thử cho màu đặc trưng hay phát quang dưới ánh sáng
tử ngoại, huỳnh quang. Trong trường hợp này thêm một chất huỳnh quang vào
pha tĩnh: các bản mỏng sẽ sáng (huỳnh quang) khi soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn
có bức xạ 254 nm), nơi có chất sẽ tối hoặc có huỳnh quang màu khác với nền
sáng của bản mỏng.
Vị trí các vết trên sắc ký đồ có thể xác định nhờ chỉ số Rf. Trị số Rf được
tính như sau:
Vạch dung môi

b a
Vạch xuất phát
Hình 2.2 Cách tính giá trị Rf
Giá trị Rf được tính theo công thức:

𝑎
𝑅𝑓 =
𝑏
Trong đó:
a là khoảng cách từ vạch xuất phát đến trung tâm chất.
b là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.
2.4.2.5 Ứng dụng của SKLM
2.4.2.5.1 Định tính và thử độ tinh khiết

SKLM là một phương pháp rất hiệu quả và đơn giản để xác định nhiều
chất giống nhau. Về nguyên tắc có thể xác định các chất nhờ trị số Rf của nó.
Tuy nhiên vì có quá nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nên trong thực tế ngưới ta
thường xác định các chất bằng sắc ký so sánh chất thử với các chất chuẩn trên
23
cùng một sắc đồ. Nếu vết chất X ngang với vết chất chuẩn A (Rf của X bằng với
A) trên các sắc ký đồ với các hệ dung môi khác nhau thì có thể xác định khá
chắc chắn rằng X là chất A. Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ
không có vết lạ.
2.4.2.5.2 Bán định lượng – định lượng

Đo cường độ màu của vết bằng cách đo quang với ánh sáng phản chiếu
đi qua sắc ký đồ và đơn giản hơn nữa so bằng mắt. Phương pháp thông dụng
nhất là cạo lấy bột chứa đó, đem định lượng bằng máy đo quang phổ hay một
phương pháp thích hợp khác.
2.4.3 Phương pháp TLC-DPPH [13, 16]

Sắc kí bản mỏng kết hợp với việc hiện hình bằng DPPH (TLC-DPPH) là
một phương pháp cải biến của sắc kí bản mỏng thông thường cho phép định tính
khả năng kháng oxy hóa của một chất hay của các cao chiết thực vật. Cao chiết
sau khi được tách bằng bản mỏng sẽ được hiện hình bằng dung dịch DPPH. Các
thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng trên nền tím của DPPH
tương tự như khi ủ dung dịch chất kháng oxy hóa với cao chiết. Phương pháp
này có thể sử dụng cho cả bản mỏng pha thường và cả pha đảo.
Ưu điểm của phương pháp này là cho phép định tính nhanh các thành
phần gây ra hoạt tính kháng oxy hóa nên cho phép sử dụng để sàng lọc các hợp
chất có hoạt tính kháng oxy hóa từ thực vật. Đồng thời, nó còn cho phép đánh
giá định tính khả năng kháng oxy hóa của các thành phần kém phân cực vốn rất
khó khi sử dụng phương pháp DPPH thông thường do khả năng hòa tan kém
của chúng trong các dung môi phân cực như ethanol, methanol.
24
Chương 3 Phương pháp nghiên cứu
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiện Hóa Lý, Khoa Khoa Học Tự
Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ
Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2015 đến tháng 11/2015
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị

Bảng 3.1 Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú
Tủ sấy Dùng để sấy nguyên liệu và dụng cụ
Máy cô quay
Bếp điện
Cân điện tử
Ống đong 10ml, 100ml…
Bình lóng 1000ml
Bercher 50ml, 100ml, 250ml…
Pipet
Micropipet 10 - 1000µl
Dụng cụ thủy tinh: phễu lọc, ống
nghiệm, đũa thủy tinh...
3.2.2 Dung môi và hóa chất

Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên dung môi, hóa chất Ghi chú

Ethanol 96o Việt Nam
N-hexane Trung Quốc
Ethyl acetate Trung Quốc
Nước Cất Việt Nam
Methanol Trung Quốc
Acetone Trung Quốc
DPPH: C18H12N5O6 M = 394,08
25
3.3 QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM
3.3.1 Điều chế cao tổng EtOH, Cao Hex, Cao Ea Và Cao H20
3.3.1.1 Điều chế cao tổng ethanol

Củ tỏi được mua ở chợ Thốt Nốt, Quận Thốt Nốt, Thành Phố Cần thơ
với khối lượng mẫu tươi khoảng 10 kg. Mẫu được bỏ vỏ, bâm nhỏ và đem phơi
khô trong bóng mát, thu được 1,8 kg mẫu khô. Xay mẫu bằng máy xay sinh tố
thành bột mịn, khối lượng bột mịn khô khoảng 1,6 kg.
Chia mẫu khô thành 3 phần, cho vào túi vải, tiến hành ngâm dầm các túi
vải này với ethanol 96o, chúng được chứa trong bình thủy tinh dung tích 10L.
Khoảng 5 - 7 ngày sau, lọc dịch chiết và cô quay dịch lọc, thu được cao tổng
ethanol. Làm tương tự như thế với 3 lần tiếp theo. Khối lượng cao ethanol tổng
thu được khoảng 110g.
Hình 3.1 Ngâm dầm mẫu.
3.3.1.2 Điều chế các cao Hex từ cao tổng ethanol

Từ 110g cao tổng ethanol, chia thành nhiều phần, đem chiết lỏng – lỏng
với n-hexane. Phần cao còn lại chiết với dung môi phân cực hơn. Khối lượng
cao Hex điều chế được khoảng 27g (mhex = 27 g)
Hình 3.2 Cao hex

26
3.3.1.3 Điều chế cao Ea từ cao tổng ethanol

Từ phần còn lại sau khi chiết với Hex, chia thành nhiều phần, đem chiết
lỏng – lỏng với Ea. Chiết nhiều lần để đảm bảo chiết kiệt. Gom các dịch chiết,
cô quay, thu được cao Ea. Phần còn lại đem chiết với dung môi phân cực hơn.
Khối lượng cao Ea điều chế được khoảng 11g (mEa = 11g). Phần còn lại là cao
H20.
.
(a) (b)
Hình 3.3 Cao Ea (a), Cao nước (b)
Quá trình điều chế cao tổng EtOH và các cao Hex, Ea, nước được tóm tắt trong
sơ đồ sau:
Mẫu tươi (củ tỏi)

1. Bỏ vỏ, bâm nhuyễn
10kg
2. Phơi khô trong bóng mát
Mẫu khô 1,8 kg
Xay nhuyễn Bột mịn khô

1,6kg
1. Chiết lỏng – lỏng với hex Cao tổng

2. Cô quay 110kg
Phần còn lại Cao Hex 27g

1. Chiết lỏng – lỏng với Ea
Phần còn lại
2. Cô quay
Cao Nước
Cao Ea 11g
72g
Hình 3.4 Quy trình điều chế các loại cao

27
Nhằm chứng minh việc chiết phân bố các cao đã thành công, phương
pháp sắc kí bản mỏng đã được tiến hành trên các cao thu được. Trên cùng một
bản mỏng kích thước (6,5 x 5 cm), các mẫu cao với khối lượng xấp xỉ 100 g
được chấm thành một dãy với chiều dài 1 cm, khoảng cách giữa các vết chấm
và với hai biên là 0,5 cm. Thực hiện trên hai bản khác nhau rồi giải ly trong hai
hệ dung môi tương ứng là 100% CHCl3 và EA:MeOH:H2O = 100:13,5:10 với
quãng đường di chuyển của dung môi kể từ vạch xuất phát là 5 cm. Hiện hình
bằng dung dịch vanillin trong dd H2SO4 10% rồi làm khô sau đó hư nóng trên
bếp điện.
3.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các cao điều chế được
Sử dụng một số thuốc thử đặc trưng để định tính các nhóm hợp chất có
trong các loại cao
3.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng TLC – DPPH
Chuẩn bị các dung dịch: Dung dịch các cao Hex, Ea và nước được pha
bằng cách cân 10 mg pha thành 10 mL trong methanol thu được dung dịch 1
mg/mL. Dung dịch DPPH được pha bằng cách cân chính xác 5,0 mg DPPH
khan rồi pha thành 5 mL trong methanol. Dung dịch DPPH sau khi sử dụng
được trữ trong ngăn đá tủ lạnh để dùng cho lần kế tiếp.
Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng sử dụng là loại bảng pha thường, kích
thước 2x6,5 cm. Vạch xuất phát cách trái, phải mỗi cạnh 0,5 cm, cách cạnh dưới
1 cm. Quãng đường giải ly là 5 cm tính từ vạch xuất phát.
Quy trình: Đầu tiên, 10 L cao chiết 1 mg/mL được quét thành một băng
mỏng dài 1 cm trên bản mỏng. Giải ly bản mỏng trong hệ dung môi thích hợp.
Bản mỏng sau khi giải ly được để khô 5 phút trong tủ hút rồi tiến hành nhúng
bản mỏng trong dung dịch DPPH. Dung dịch DPPH được thay mới sau mỗi lần
nhúng. Thấm khô bản mỏng bằng giấy rồi để trong bóng tối 30 phút[16]. Tiến
hành ghi nhận kết quả, các thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng
sáng trên nền tím.
28
Hình 3.5 Quy trình khảo sát TCL - DPPH
3.3.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao đã điều chế được
Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hoạt tính kháng
oxy hóa như phương pháp ferric thiocyanate FTC, phương pháp ức chế gốc tự
do NO, phương pháp TEAC (khử gốc tự do ABTS)… Tuy nhiên, phương pháp
bẫy gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu vì dễ thực
hiện, độ chính xác cao… [13, 14]
3.3.4.1 Nguyên tắc của phương pháp bẫy gốc tự do DPPH [2, 3, 4]
DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium) là gốc tự do bền
(tránh ánh sáng), dung dịch có màu tím, bước sóng hấp thu cực đại tại 517nm.
Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách góp điện
tử hình thành trạng thái bền (tạo ra gốc tự do mới bền hơn – chất kháng oxy hóa
dạng phân tử trung hòa hay tạo ra phân tử mới bền – chất kháng oxy hóa dạng
gốc tự do), làm giảm khả năng hấp thu tại bước sóng cực đại, màu của hỗn hợp
dung dịch phản ứng dần chuyển sang vàng nhạt.
Khả năng kháng oxy hóa thường biểu diễn thông qua phần trăm ức chế I
(%). Phần trăm ức chế I (%) được biểu diễn bằng biểu thức sau:
𝑂𝐷𝑐 −(𝑂𝐷𝑠 −𝑂𝐷𝑚 )
𝐼% = × 100% (*)
𝑂𝐷𝑐
Trong đó:
I (%) là phần trăm ức chế gốc tự do DPPH
ODc là giá trị mật độ quang của hỗn hợp không có mẫu thử
ODS là giá trị mật độ quang của hỗn hợp có mẫu thử
ODm là giá trị mật đọ quang của mẫu chất khảo sát
29
3.3.4.2 Cơ chế
Chất kháng oxy hóa là chất ngăn chặn quá trình oxy hóa bằng cách góp
điện tử để hình thành liên kết bền – loại bỏ gốc tự do hay kìm hãm sự oxy hóa
bằng cách tự oxy hóa.
Bản chất của phương pháp bẫy gốc tự do DPPH là phản ứng giữa chất
kháng oxy hóa và gốc tự do DPPH để loại bỏ gốc tự do DPPH bằng cách nhận
điện tử hay H . Thông qua độ hấp thu của DPPH còn lại để xác định khả năng
kháng oxy hóa của mẫu thử.
N N
N NH
O2N NO2 + R H O2N NO2 + R
NO2 NO2
Diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl
Hình 3.6 Phản ứng loại bỏ gốc tự do của DPPH
3.3.4.3 Lựa chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng
3.3.4.3.1 Bước sóng đo

Theo các nghiên cứu trước, có nhiều cực đại hấp thu của DPPH với
khoảng hấp thu cực đại từ 515-520 nm. Trong trường hợp này, cực đại hấp thu
của DPPH được chọn là 517 nm [14].
3.3.4.3.2 Thời gian phản ứng

Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng thời gian phản ứng khác nhau,
dao động từ 5-10 phút, tuy nhiên thời gian tối ưu nhất thường được dùng cho
phản ứng là 30 phút vì hầu hết các chất chống oxy hóa đối chứng thường dùng
như: BHT, vitamin C, propyl gallate… cần đến 30 phút để phản ứng làm sạch
gốc tự do DPPH xảy ra hoàn toàn. Vì thế, thời gian phản ứng là 30 phút được
chọn cho thí nghiệm [14].
3.3.4.3.3 Nồng độ thích hợp dùng cho phản ứng

Độ hấp thu theo nồng độ DPPH trong khoảng nồng độ từ 10 – 40 µg/ml,
độ hấp thu tỉ lệ thuận với nồng độ DPPH và không đổi sau 30 phút [15]. Trong
trường hợp này, nồng độ DPPH được chọn là 40 µg/ml.
30
3.3.4.3.4 Dung môi dùng cho phản ứng

Dung môi dùng cho phản ứng phải vừa hòa tan được DPPH, vừa hòa tan
được chất thử. Gốc tự do DPPH không tan trong nước, tan tốt trong các dung
môi hữu cơ phân cực như ethanol, methanol nên các dung môi này được dùng
phổ biến cho phản ứng. Trong trường hợp này, dùng methanol để hòa tan
DPPH[14].
3.3.4.4 Chuẩn bị hóa chất
3.3.4.4.1 Chuẩn bị Dung dịch DPPH

Cân chính xác 5 mg DPPH, hòa tan trong 5 ml Methanol. Trộn điều thu
được dung dich DPPH có nồng độ 1 mg/ml. Bảo quản trong tủ lạnh và pha mới
mỗi ngày.
3.3.4.4.2 Chuẩn bị vitamin C (chuẩn)

Chuẩn bị dung dịch vitamin C gốc: cân chính xác 10,0 mg vitamin C rồi
định mức đến 10 mL bằng methanol. Lắc đều đến khi tan hoàn toàn thu được
dung dịch vitamin C nồng độ 1 mg/mL. Dùng micropipet rút 1 mL dung dịch
vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung
dịch gốc vitamin C nồng độ 100 g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp.
Từ dung dịch vitamin C 100 g/mL, pha thành dung dịch vitamin C có nồng độ
khác nhau như sau:
Bảng 3.3 Dãy nồng độ của vitamin C
Thể tích vitamin C Nồng độ vitamin C Thể tích vitamin C cần
100 µg/ml (µl) (µg/ml) pha (ml)
0 0
10 1
20 2 1
30 3
40 4
50 5
3.3.4.4.3 Chuẩn bị mẫu phân tích

Cân chính xác 10 mg cao, hòa tan trong 10 ml Methanol và loc bỏ phần
không tan. Trộn đều, thu được dung dịch cao có nồng độ 1 (mg/ml). Bảo quản
ở nhiệt độ phòng 25oC. Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các
cao được bố trí theo các bảng sau:
31
Cao EtOH
Bảng 3.4 Dãy nồng độ của cao EtOH
Thể tích cao EtOH Nồng độ cao EtOH Thể tích cao EtOH cần
1 mg/ml (µl) (µg/ml) pha (ml)
20 20
23 23
26 26 1
29 29
32 32
35 35
Cao Hex
Bảng 3.5 Dãy nồng độ của cao Hex
Thể tích cao Hex Nồng độ cao Hex Thể tích cao Hex cần
10 10
15 15
20 20 1
25 25
30 30
35 35
Cao Ea
Bảng 3.6 Dãy nồng độ của cao Ea
Thể tích cao Ea Nồng độ cao Ea Thể tích cao Ea cần pha
1 mg/ml (µl) (µg/ml) (ml)
5 5
8 8
11 11 1
14 14
17 17
20 20
Cao Nước
Bảng 3.7 Dãy nồng độ của cao nước
Thể tích cao nước Nồng độ cao EtOH Thể tích cao nước cần
50 50
60 60
70 70 1
80 80
90 90
100 100
32
3.3.4.5 Tiến hành thí nghiệm

Phản ứng được thực hiện trong tuýp eppendorf 2 mL được bọc bằng giấy
sẫm màu. Nồng độ DPPH trong thử nghiệm được chọn là 40 g/mL. Phản ứng
được thực hiện bằng cách hút chính xác một lượng dung dịch cao chiết và
methanol cho vừa đủ 960 µL rồi lắc đều, thêm 40 mL dung dịch DPPH đã pha.
Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút đo độ hấp thu tại
bước sóng 517 nm. Thí nghiệm được tiến hành theo quy trình sau:
Lắc điều, ủ
trong 30
Thêm phút
Chất thử DPPH
Đo độ hấp thu
V1 µ ở 517 nm
Methanol
Hình 3.7 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa DPPH
3.3.4.6 Đánh giá khả năng ức chế DPPH [2], [4], [7]
IC50
IC50 là nồng độ của mẫu chất khảo sát mà tại đó ức chế 50% gốc tự do,
tế bào hay enzyme… IC50 là giá trị dùng để đánh giá hoạt tính của mẫu. Mẫu có
hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp và ngược lại.
Cách xác định IC50
Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do DPPH của mẫu chất khảo sát ở nhiều
nồng độ khác nhau.
Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do DPPH của mẫu chất khảo sát được
thực hiện thông qua giá trị mật độ quang (giá trị mật độ quang càng lớn thì khả
năng ức chế DPPH của mẫu chất khảo sát càng nhỏ và ngược lại).
Biểu thức (*) cho thấy phần trăm ức chế I% tỉ lệ bậc nhất với nồng độ
mẫu khảo sát. Từ giá trị nồng độ mẫu khảo sát và mật độ quang tương ứng, xây
dựng đường thẳng tuyến tính có dạng y = ax + b (1) ( y là phần trăm ức chế gốc
tự do DPPH của mẫu chất khảo sát, x là nồng độ mẫu khảo sát tương ứng, x>0)
Thay y = 50 vào phương trình (1), thu được giá trị x. Đó chính là nồng
độ ức chế 50% gốc tự do DPPH (hay IC50)
33
3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt
tính kháng sinh của 3 mẫu chiết là: cao Hex, cao Ea và cao nước. Được thực
hiện trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp
hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane & Kandel (1996).
Các chủng vi sinh vật kiểm định

 Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 )
 Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 11774 )
Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATC11632)
 Nấm sợi: Aspergillus niger (439)
Fusarium oxysporum (M42)
 Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
Mẫu được gửi đo tại phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Hàm Lâm
Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, địa chỉ nhà 1H, số 18 Hoàng Quốc Việt,
Cầu Giấy – Hà Nội.
34
Chương 4 Kết quả thực nghiệm và thảo luận
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
4.1 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Từ 10 kg củ tỏi tươi ban đầu sau khi phơi khô và xay thành bột được 1,6
kg, điều chế được 110g cao EtOH. Từ 110g cao EtOH, điều chế được 27g cao
hex, 11g cao Ea và 72g cao nước.
Hiệu suất chiết cao EtOH từ nguyên liệu ban đầu:
110
𝐻% = × 100 = 6,875%
1600
Hiệu suất chiết cao Hex từ cao EtOH:
27
𝐻% = × 100 = 24,55%
110
Hiệu suất chiết cao Ea từ cao EtOH:
11
𝐻% = × 100 = 10%
110
Hiệu suất chiết cao Nước từ cao EtOH:
72
𝐻% = × 100 = 65,45%
110
Kết quả sắc kí bản mỏng các cao phân đoạn thô cho thấy khi giải ly trong
hệ 100% CHCl3, dễ dàng quan sát thấy giữa cao Hex và cao EA hầu như không
có bất kì vết nào trùng nhau. Trong khi đó, việc giải ly trong hệ EA:MeOH:H2O
= 100:13,5:10 giúp quan sát thấy sự khácnhau hoàn toàn giữa cao EA và cao
nước.
(a) (b)
Hình 4.1 Giải ly 100% CHCl3 (a), giải ly Ea:MeOH:H2O = 100:13,5:10 (b)
35
4.2 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOẠI CAO
CHIẾT ĐIỀU CHẾ ĐƯỢC
4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid

Định tính bằng thuốc thử Dragendorff [9]
Công thức:
Dung dịch A: hòa tan 8 g Bi(NO3)3.H2O trong 25 mL HNO3 30%
Dung dịch B: hòa tan 28 g KI và 1 mL HCl 6 N trong 5 mL nước cất.
Hỗn hợp A và B, để yên trong tủ lạnh 50C cho kết tủa màu sậm và tan
trở lại, lọc, thêm nước cất cho đủ 100 mL thu được thuốc thử.
Hiện tượng: Thuốc thử này cho kết tủa màu cam nâu với dung dịch acid
loãng có chứa alkaloid
Thực nghiệm: lấy 1 ml dung dich cao tổng cho vào ống nghiệm, sau đó
cho từ từ thuốc thử Dragendorff .
Kết quả: xuất hiện kết tủa màu cam nâu, phản ứng dương tính.
Hình 4.2 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Dragendoff của cao EtOH
4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Định tính bằng thuốc thử FeCl3 [9]
Thực nghiệm: Nhỏ dung dịch FeCl3 vào 1 ống nghiệm có dịch chứa
flavonoid/ethanol sẽ xuất hiện kết tủa màu xanh đen đôi khi màu nâu đỏ.
Kết quả: xuất hiện kết tủa xanh đen, phản ứng dương tính.
36
Hình 4.3 Định tính flavonoid bằng dung dịch FeCl3 của cao EtOH
Định tính bằng thuốc thử H2SO4 đậm đặc [9]

Nhỏ dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 1 ống nghiệm có dịch chứa
flavonoid/ethanol sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng đậm đến cam, màu đỏ hoặc
xanh dương đỏ, hoặc màu từ cam đến đỏ.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml cao ethanol, thêm vài giọt dung
dịch H2SO4 đậm đặc.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu nâu đỏ, phản ứng dương tính.
Hình 4.4 Định tính flavonoid bằng H2SO4 của cao EtOH
Định tính bằng thuốc thử 1% NaOH/ethanol [9]

Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong ethanol,
có màu từ vàng đến cam-đỏ.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml cao ethanol, thêm vài giọt thuốc
thử 1% NaOH/ethanol.
Kết quả: dung dịch sau khi thêm thuốc thử có màu cam-đỏ, phản ứng
dương tính.
37
Hình 4.5 Định tính flavonoid bằng NaOH/ethanol 1% của cao EtOH
4.2.3 Khảo sát sự hiện diện steroid – triterpenoid

Định tính bằng thuốc thử Liebermann - Burchard [9]
Thực nghiệm: 1 mL anhydride acetic, 1mL chloroform, làm lạnh, thêm
1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho cao tổng ở dạng rắn hoặc pha trong choloform.
Hiện tượng: Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh
dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
Kết quả: xuất hiện kết tủa màu cam, phản ứng dương tính.
Hình 4.6 Định tính steroid – triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann -
Burchard của cao EtOH
Định tính bằng thuốc thử Salkowski [9]

Thực nghiệm: Hòa tan 1 - 2 mg cao tổng ở dạng rắn trong 1 mL
chloroform và nhỏ thêm vào 1 mL H2SO4 đậm đặc.
Hiện tượng: Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm,
xanh, xanh tím.
Kết quả: xuất hiện màu đỏ, phản ứng dương tính.
38
Hình 4.7 Định tính steroid – triterpenoid bằng thuốc thử Salkowski của cao
EtOH
4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của đường khử

Định tính bằng thuốc thử Fehling [9]
Felling A: CuSO4
Felling B: Kali natri tartrat
Cho vào ống nghiệm vài giọt Fehling A, vài giọt Felling B theo tỉ lệ 1 :
1, lắc, ta thấy xuất hiện màu xanh thẫm, thêm mẫu thử rồi đem đun cách thủy.
Nếu có glycoside thì sau một thời gian đun sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
Hiện tượng: có kết tủa đỏ gạch, phản ứng dương tính
Hình 4.8 Định tính đường khử bằng thuốc thử Fehling của cao EtOH
4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin

Dựa vào sự tạo bọt của saponin [9]
Ống nghiệm 1: 5 mL HCl 0.1 N (pH =1) + 3 giọt dung dịch alcol chứa
mẫu thử.
Ống nghiệm 2: 5 mL NaOH 0.1 N (pH=13) + 3 giọt dung dịch alcol chứa
mẫu thử
39
Bịt miệng 2 ống nghiệm , lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát
cột bọt trong 2 ống nghiệm
Nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.
Kết quả: cả hai ống đều không có bọt, phản ứng âm tính.
Hình 4.9 Định tính saponin dựa vào tính chất tạo bọt của cao EtOH
Thuốc thử Pb(CH3COOH)2 bão hòa [9]

Phản ứng dương tính có saponin khi xuất hiện kết tủa.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1ml mẫu thử, thêm từ từ dung dịch
Pb(CH3COO)2 bão hòa vào.
Kết Quả: Xuất hiện kết tủa, phản ứng dương tính.
Hình 4.10 Định tính saponin bằng thuốc thử Pb(CH3COO)2 bão hòa của cao
EtOH
4.2.6 Khảo sát sự hiện diện của tanin

Định tính bằng thuốc thử Stiasny [9]
Thực nghiệm: 20 mL formol 36 %, 10 mL HCl đậm đặc.
40
Hiện tượng: Phản ứng dương tính có tannin khi có trầm hiện màu đỏ
Kết quả: Xuất hiện trầm hiện màu đỏ, phản ứng dương tính.
Hình 4.11 Định tính tanin bằng thuốc thử Stiasny của cao EtOH
Thuốc thử Pb(CH3COOH)2 bão hòa [9]

Phản ứng dương tính có saponin khi xuất hiện kết tủa.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1ml mẫu thử, thêm từ từ dung dịch
Pb(CH3COO)2 bão hòa vào.
Kết Quả: Xuất hiện Kết tủa, phản ứng dương tính.
Hình 4.12 Định tính tanin bằng thuốc thử Pb(CH3COOH)2 của cao EtOH
41
Cao Tổng
Bảng 4.1 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao tổng EtOH
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết luận
Alkaloid Dragendroff Kết tủa màu cam-nâu +
FeCl3 5% Kết tủa màu xanh-đen +
H2SO4 đậm đặc Dung dich màu nâu-đỏ +
Flavonoid
NaOH/ethanol
Dung dich màu cam-đỏ +
1%
Liebermann –
Steroid - Kết tủa màu cam +
Burchard
Triterpenoid
salkowski Dung dịch có màu đỏ +
stiasny Xuất hiện trầm màu đỏ +
Tanin
Pb(CH3COO)2 Có kết tủa +
Phản ứng tạo bọt Không có bọt -
Saponin
Đường khử Fehling Có kết tủa đỏ gạch +
Kết luận: thành phần cao tổng EtOH gồm có 6 loại hợp chất trên là
alkaloid, flavonoid, steroid – Triterpenoid, tanin, saponin, đường khử.
Cao Hexane
Bảng 4.2 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao Hex
FeCl3 5% Kết tủa màu xanh-đen -
H2SO4 đậm đặc Dung dich màu nâu-đỏ -
Flavonoid
NaOH/ethanol
Dung dich màu cam-đỏ -
1%
Liebermann –
Steroid - Kết tủa màu cam +
Burchard
Triterpenoid
salkowski Dung dịch có màu đỏ +
stiasny Xuất hiện trầm màu đỏ -
Tanin
Pb(CH3COO)2 Có kết tủa -
Saponin
Pb(CH3COO)2 Có kết tủa -
Kết luận: thành phần cao hex gồm có 3 loại hợp chất là alkaloid, steroid
– triterpenoid, đường khử.
42
Cao Etyl Acetat

Bảng 4.3 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao Ea
H2SO4 đậm đặc Dung dich màu nâu-đỏ +
Flavonoid
NaOH/ethanol
Dung dich màu cam-đỏ +
1%
Liebermann –
Steroid - Kết tủa màu cam -
Burchard
Triterpenoid
salkowski Dung dịch có màu đỏ -
stiasny Xuất hiện trầm màu đỏ +
Tanin
Saponin
Kết luận: trong thành phần cao EA gồm 5 loại hợp chất là alkaloid,
flavonoid, tanin, saponin, đường khử.
Cao Nước
Bảng 4.4 Kết quả định tính của một số nhóm hợp chất có trong cao nước
Alkaloid Dragendroff Kết tủa màu cam-nâu -
H2SO4 đậm đặc Dung dich màu nâu-đỏ -
Flavonoid
NaOH/ethanol
Dung dich màu cam-đỏ -
1%
Liebermann –
Steroid - Kết tủa màu cam -
Burchard
Triterpenoid
salkowski Dung dịch có màu đỏ -
stiasny Xuất hiện trầm màu đỏ -
Tanin
Phản ứng tạo bọt Có tạo bọt +
Saponin
Đường khử Fehling Có kết tủa đỏ gạch -
Kết luận: trong thành phần cao nước gồm có 2 loại hợp chất là tanin,
saponin.
43
4.3 KẾT QUẢ KHẢO KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA THEO PHƯƠNG
PHÁP TLC - DPPH.
Hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết hex, Ea và nước của tỏi được
đánh giá định tính bằng phương pháp TLC-DPPH. Bản mỏng sau khi giải ly với
hệ như sau:
 Cao hex (100 % CHCl3)
 Cao Ea (Ea:MeOH:H2O = 100:13,5:10)
 Cao Nước (Ea:MeOH:CH3COOH:H2O = 10:3:2:1)
Những thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh có màu vàng
sẽ càng đậm trên nền tím của DPPH sau 10 phút ủ trong bóng tối.
(a) (b) (c)

Hình 4.13 Kết quả TLC – DPPH, cao hex (a), cao Ea (b), cao nước (c)
Kết quả TLC-DPPH của các cao chiết cho thấy cao EA có nhiều thành
phần kháng oxy hóa nhiều nhất với 3 vết kháng oxy hóa mạnh (Rf = 0,5; 0,7 và
0,9 ) trong khi đó cao Hex cao có ít thành phần kháng hơn là 2 vết (Rf = 0,16 và
0,6), còn cao nước kháng yếu nhất với các thành phần kháng không đáng kể.
44
4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA 4
LOẠI CAO (CAO TỔNG, CAO HEX, CAO EA VÀ CAO NƯỚC) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP BẪY GỐC TỰ DO DPPH
4.4.1 Vitamin C
Bảng 4.5 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của Vitamin C
Nồng độ Vitamin C Mật độ quang Phần trăm ức chế (%)
(µg/ml)
0 1,010 0
1 0,882 12,67
2 0,758 24,95
3 0,662 34,46
4 0,561 44,46
5 0,429 57,52
Vitamin C
70
Phần trăm ức chế %
57.52
60
y = 10.921x + 2.049 44.46
50
R² = 0.9969 34.46
40
30 24.95
20 12.67
10
0
0 1 2 3 4 5 6
Nồng độ Vitamin C
Hình 4.14 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của Vitamin C
 Đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ vitamin C được thể hiện trong
[Hình 4.14], Từ phương trình đường chuẩn y = 10,921x + 2,049, ta tính được
IC50(Vitamin C) của Vitamin C: 4,39 µg/ml.
45
4.4.2 Cao Tổng EtOH

Bảng 4.6 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao EtOH
Nồng độ cao Mật độ quang Phần trăm ức
EtOH ODm ODs ODc chế (%)
(µg/ml)
20 0,105 1,190 13,41

23 0,267 1,120 31,92
26 0,312 1,034 1,253 42,38
29 0,344 0,902 55,47
32 0,399 0,761 71,11
35 0,440 0,623 85,40
Cao Tổng
100 y = 4.6722x - 78.539 85.40
Phần trăm ức chế (%)
71.11
80 R² = 0.996
55.47
60 42.38
31.92
40
13.41
20
0
15 20 25 30 35 40
Nồng độ (µg/ml)
Hình 4.15 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao EtOH
 Đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ cao tổng được thể hiện trong
[Hình 4.15], Từ phương trình đường chuẩn y = 4,6722x – 78,539, ta tính được
IC50(EtOH) của cao tổng EtOH: 27,51 µg/ml.
4.4.3 Cao Hex

Bảng 4.7 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao Hex
hex (µg/ml) ODm ODs ODc chế (%)
10 0,325 1,217 28,06
15 0,355 1,105 43,95
20 0,478 1,041 1,24 54,60
25 0,540 0,990 63,71
30 0,627 0,927 75,81
35 0,743 0,851 51,29
46
Cao Hex
91.29
100
y = 2.4046x + 5.4662

75.81
80 63.71
R² = 0.9927 54.60
60 43.95
40 28.06
20
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Hình 4.16 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao hex
 Đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ cao Hex được thể hiện trong
IC50(Hex) của cao hex: 18,52 µg/ml.
4.4.4 Cao Ea
Bảng 4.8 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao Ea
Ea (µg/ml) ODm ODs ODc chế (%)
5 0,043 1,148 11,10

8 0,086 1,010 25,66
11 0,126 0,856 1,243 41,27
14 0,135 0,628 60,34
17 0,299 0,620 74,18
20 0,308 0,416 91,31
100 Cao EA 91.31

74.18
80 y = 5.3871x - 16.695
60.34
R² = 0.9987
60
41.27
40 25.66
20 11.10
0
0 5 Nồng
10 độ (µg/ml)
15 20 25
Hình 4.17 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao Ea
47
 Đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ cao Ea được thể hiện trong
IC50(Ea) của cao Ea: 12,38 µg/ml.
4.4.5 Cao Nước

Bảng 4.9 Nồng độ, mật độ quang và phầm trăm ức chế của cao nước
nước (µg/ml) ODm ODs ODc chế (%)
50 0,045 1,009 25,62
60 0,053 0,896 34,95
70 0,055 0,731 1,296 47,84
80 0,061 0,631 56,02
90 0,067 0,491 67,28
100 0,072 0,400 74,69
Cao nước
100
y = 1.0015x - 24.048 74.69

80 67.28
R² = 0.9955 56.02
60 47.84
34.95
40 25.62
20
0
40 50 60 70 80 90 100 110
Hình 4.18 Đồ thị thể hiện % ức chế DPPH theo nồng độ của cao nước
 Đường chuẩn phần trăm ức chế theo nồng độ cao nước được thể hiện trong
IC50(nước) của cao nước: 73,94 µg/ml.
Bảng 4.10 Giá trị IC50 của vitamin C và các cao
Mẫu phân tích IC50 (µg/ml)
Vitamin C 4,39
Cao tổng EtOH 27,51
Cao Hex 18,52
Cao Ea 12,38
Cao nước 73,94
48
Nhận xét: Giá trị IC50 của các cao chiết đều cao hơn IC50 của vitamin C.
Các cao chiết đều kháng yếu hơn vitamin C nhưng vẫn có tính kháng oxy hóa
mạnh.
Khả năng khử 50% DPPH của vitamin C và các

73.94
Giá trị IC50 (µg/ml) 80 mẫu
70
60
50
40 27.51
30 18.52
20 12.38
10 4.39
0
Vitamin C Cao tổng Cao Hex Cao Ea Cao nước
EtOH
Mẫu đối chứng vitamin C và các mẫu thử EtOH, Hex,
Ea, nước
Hình 4.19 Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của vitamin C và các cao EtOH, Hex,
Ea, nước
4.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG
NẤM CỦA 3 LOẠI CAO (CAO HEX, CAO EA, CAO NƯỚC)
Bảng 4.11 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các cao
Mẫu Nồng Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml) Nhận
độ Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm móc Nấm men xết
ban E. P. B. S. A. F. S. C.
đầu coli aeruginosa subtillis aureus niger oxysporum cerevisiae albicans
µg/ml
Cao 200 100 (-) 100 (-) 50 (-) (-) (-) Kháng
Hex 3
VSVKĐ
Cao 200 (-) (-) (-) (-) 200 (-) (-) (-) Kháng
Ea 1
VSVKĐ
Cao 200 (-) (-) (-) (-) 200 (-) (-) Kháng
nước 1
VSVKĐ
Nhận xét: cả 3 mẫu đều thể hiện khả năng kháng từ 1 – 3 VSVKĐ với
giá trị MIC từ 50 – 200 µg/ml. Trong đó, cao Hex thể hiện khả năng kháng
khuẩn và kháng nấm tốt nhất, kháng được 3 VSVKĐ là E. coli, B. subtullis, A.
niger với giá trị MIC lần lượt là 100 µg/ml, 100 µg/ml và 50 µg/ml. Cao Ea và
cao nước kháng được 1 VSVKĐ là A. niger với giá trị MIC là 200 µg/ml.
49
Chương 5 Kết luận và kiến nghị
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN

Qua quá trình thực hiện đề tài “Khảo sát định tính thành phần hóa
học, hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm của củ tỏi
(Allium sativum L.)’’ đã thu được một số kết quả như sau:
Điều chế được các cao gồm: cao EtOH tổng, cao Hex, cao Ea, cao nước.
Khối lượng của từng loại cao (trên 1600g mẫu ban đầu) như sau: cao EtOH là
110g, hiệu suất 6,875%; cao hex là 27g, hiệu suất 24,55%; cao Ea la 11g, hiệu
suất là 10% và cao nước là 72g và hiệu suất là 65,45%.
Định tính sự hiện diện của các nhóm hợp chất có trong cao EtOH tổng
và đã xác định có sự hiện diện của 6 nhóm hợp chất: alkaloid, flavonoid, steroid-
triterpenoid, tanin, saponin và đường khử. Trong cao hex xác định được có sự
hiện diện của 3 nhóm hợp chất: alkaloid, steroid-triterpenoid và đường khử.
Trong cao Ea xác định được được sự hiện diện của 5 nhóm hợp chất: alkaloid,
flavonoid, tanin, saponin và đường khử. Trong cao nước xác định được có sự
hiện diện của 2 nhóm hợp chất: tanin và saponin.
Khảo sát được tính kháng oxy hóa của 4 loại cao đã điều chế được. Giá
trị IC50 của các cao đều lớn hơn so IC50 của vitamin C. Điều này chứng tỏ khả
năng kháng oxy hóa của các cao yếu hơn vitamin C nhưng vẫn có tính kháng
oxy hóa mạnh. Trong đó, cao Ea có hoạt tính kháng oxy hóa tốt nhất trong các
cao điều chế được với IC50 là 12,38 µg/ml.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cho thấy cả 3 mẫu đều thể
hiện khả năng kháng từ 1 – 3 VSVKĐ với giá trị MIC từ 50 – 200 µg/ml. Trong
đó, cao Hex thể hiện khả năng kháng khuẩn và kháng nấm tốt nhất, kháng được
3 VSVKĐ là E. coli, B. subtullis, A. niger với giá trị MIC lần lượt là 100 µg/ml,
100 µg/ml và 50 µg/ml. Cao Ea và cao nước kháng được 1 VSVKĐ là A. niger
với giá trị MIC là 200 µg/ml.
5.2 KIẾN NGHỊ

Do hạn chế về thời gian nên đề tài chưa khảo sát toàn diện về củ tỏi. Hy
vọng đề tài sẽ được tiếp tục phát triển theo các hướng sau:
 Khảo sát thêm hoạt tính kháng oxy hóa bằng các phương pháp
khác như ABTS•+, LOL, NO•…
 Thử nghiệm thêm một số hoạt tính sinh học khác của củ Tỏi như
kháng ung thư, trị đái tháo đường…
 Định lượng được các hợp chất có trong từng loại cao.
50
Chương 5 Kết luận và kiến nghị
 Cô lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết có
trong từng loại cao phân đoạn, đồng thời khảo sát hoạt tính sinh
học của chúng.
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO

----------
[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Amaryllidaceae.
[2] Cunbao liu, Xu Yang, Yufeng Yao, Weiwei Huang, Wenjia sun, Yanbing
Ma, 2014, determination of antioxidant activity in Garlic (Allium Sativum)
extracts subjected to boiling Process in vitro, 2(7), pp 383 – 387.
[3] Siti Fairuz Che Othman, Syed Zahir Idid , Mustapha Suleiman Koya ,
Aisyah Mohamed Rehan, Kamarul Rahim Kamarudin, 2011, antioxidant study
of garlic and red onion: a comparative study, 34(2): 253 – 261.
[4] Reena lawrence1, Kapil lawrence, 2011, antioxidant activity of garlic
essential oil (Allium Sativum) grown in north Indian plains.
Chapter 1 [5] Anna Capasso, 2013, antioxidant action and therapeutic efficacy
of Allium Sativum L. 18, 690 – 700.
[6] Tsan-Chang Chang, Hui-Ting Chang, Shang-Tzen Chang, Sun-Fa Lin,
Yi-Huang Chang, Hung-Der Jang, A Comparative Study on the Total
Antioxidant and Antimicrobial Potentials of Ethanolic Extracts from Various
Organ Tissues of Allium spp, 2013, 4, 182 – 190.
[7] Raja Zouari Chekki, Ahmed Snoussi, Imen Hamrouni, Nabiha
Bouzouita, 2014, Chemical composition, antibacterial and antioxidant
activities of Tunisian garlic (Allium sativum) essential oil and ethanol extract,
3(4), 947 – 956.
[8] Dima Mnayer, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Emmanuel Petitcolas,
Tayssir Hamieh, Nancy Nehme, Christine Ferrant , Xavier Fernandez, Farid
Chemat, 2014, Chemical Composition, Antibacterial and Antioxidant Activities
of Six Essentials Oils from the Alliaceae Family, 19, 20034 – 20053.
[9] Nguyễn kim phi phụng, 2007, các phương pháp phân lập hợp chất hữu
cơ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM.
[10] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008, các phương pháp phân tích hiện đại.
[11] https://en.wikipedia.org/wiki/Garlic.
[12] Phạm Hoàng Hộ, 2000, cây cỏ việt nam, NXB trẻ.
[13] R.T.Narendhirakanan, K.Rajeswari, 2010, In vitro antioxidant
properties of three varieties of Allium Sativum L. extracts, 7(S1), S573 – S579.
[14] Om P. Sharma, Tej K. Bhat, 2009, DPPH antioxidant assay revisited,
1202 - 1205
[15] Mai Văn Hiếu, 2015, Khảo sát thành Phần hóa học và hoạt tính kháng
oxy hóa của bạch đầu ông Vernonia Cinerea. Luận văn tốt nghiệp Đại Học.
[16] Hari Datta Bhattarai, Babita Paudel, Soon Gyu, Hong kum lee, Joung
Han Yim, 2008, Thin layer chromatography analysis of antioxidant constituents
of lichens from antarctica. 62: 481 – 484.
52
[17] Đái Thị Xuân Trang, 2015, bài giảng thử nghiệm sinh học.
[18] Nguyễn Thị Thu Hương, Khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học,
Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM, 2011, bước đầu nghiên cứu hoạt
tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết từ tỏi (Allium sativum) đối với một
số loại vi khuẩn gây bệnh ở người.
[19] Võ Thị Việt Dung, Trịnh Thị Trinh, Phạm Thị Thu Chi, Khoa Cơ bản,
Trường ĐH Phạm Văn Đồng Quảng Ngãi, 2015, Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu
tỏi Lý Sơn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
[20] Lê Thị Ngọc Hân, Trường Đại Học Đà Nẵng, 2012, Xác thành thành
phần hóa học của tinh dầu tỏi Lý Sơn – Quảng ngãi. Luận văn tốt nghiệp.
53
PHỤ LỤC
----------
54

Đoàn Chí Linh-B1203461

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Đoàn Chí Linh-B1203461

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐOÀN CHÍ LINH

KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cần Thơ, 2015

ĐOÀN CHÍ LINH

KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cần Thơ, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Xin cảm ơn!

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: Lê Thị Bạch

3. Sinh viên thực hiện: Đoàn Chí Linh MSSV: B1203461

4. Nội dung nhận xét:

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………

3. Sinh viên thực hiện: Đoàn Chí Linh MSSV: B1203461

4. Nội dung nhận xét:

TÓM TẮT LUẬN VĂN

2.3.2 Chất chống oxy hóa ....................................................................... 15

4.4.4 Cao Ea ............................................................................................. 47

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC TỪ NHỮNG VIẾT TẮT

TLC Thin Layer Chromatography

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục đích nghiên cứu

1.3 Nội dung nghiên cứu

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY

2.1.1 Giới thiệu về họ loa kèn đỏ (Amaryllidaceae) [1]

2.1.2 Giới thiệu về củ tỏi (Allium sativum L.) [2, 4, 8, 11]

Hình 2.1 Hình thái của củ tỏi

2.1.4 Phân bố sinh thái [12]

2.1.5 Tác dụng dược lý [7, 12, 13, 20]

2.1.5.1 Tác dụng tăng cường hệ miễn dịch

2.1.5.2 Tác dụng giảm đường huyết

2.1.5.3 Tác dụng kháng sinh

2.1.5.4 Tác dụng đối với hệ thống mạch máu lưu

2.1.5.5 Tác dụng đối với tế bào ung thư

2.1.5.6 Tác dụng chống nhiễm độc chất phóng xạ

2.1.5.7 Các tác dụng khác

2.1.6.1 Trong nước

– vinyl – 1, 2 – dithiacyclohex – 4 - ene (11.89%), 3 – vinyl – 1, 2 –

2.1.6.2 Ngoài nước

2.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NHÓM CHỨC [9]

2.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA.

2.3.1 Gốc tự do [2, 5, 13, 17]

2.3.1.1 Khái niệm gốc tự do

2.3.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do

2.3.1.2.1 Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

2.3.1.2.2 Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

hòa tan và những chất tương tự trong phản ứng với

2.3.1.3 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

2.3.1.4 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

2.3.1.5 Gốc tự do di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium (DPPH)

Nguyên tắc: di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium (DPPH) là

2.3.2 Chất chống oxy hóa [3, 13, 17]

2.3.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa