KHỐI PHỔ & LC-MS

Mass Spectrometry & LC-MS

Phạm gia Huệ

Hà nội 07-08-2009
 Khối phổ (MS) là gì?
 Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.

 Kỹ thuật cung cấp thông tin về:

1. Khối lượng và công thức phân tử 1 hợp chất
2. MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân
tử
3. Thành phần định tính và định lượng của một hỗn hợp.
4. Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách
chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một
phổ khối.
5. PT được mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL
nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da).
(Dalton (Da) = amu)
 Khối phổ (MS) là gì?

Nguyên lý cơ bản là

• sự tạo thành các ion,

• các ion này được tách hay lọc theo

tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) của chúng,

• và được phát hiện.

 Các thành phần một máy MS
Nạp mẫu

R Chân không Tránh ion PT va chạm với các

L cao phân tử trong không khí
K

Detector
Nguồn ion PT khối ion
Intensity
Cường độ tín

Xử lý và lưu dữ
Signalhiệu

liệu

m/z

Phổ Khối
 1. Nguồn ion hoá

 Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử

(molecule) và các ion mảnh (fragment)

 Hai kỹ thuật chính hay dùng:

• Bắn phá electron (Electron Impact - EI):

tạo ion dùng chùm electron năng lượng
cao: phương pháp “cứng”

• Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI)

tạo ion thông qua phản ứng với các ion
thuốc thử: phương pháp “mềm”
 1.1. Bắn phá electron (EI)

• Ví dụ: Electron bắn phá methanol:

tạo cation gốc methanol, một ion phân tử:
CH3OH + 1 e-  CH3OH+. + 2 e-
• Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) được
ion hoá
• Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnh
nhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ
hơn)
1.1. Bắn phá electron (EI)

Sợi đốt

+ PT
+ khối

Khu vực
Chùm electron Gia tốc ion
 Bắn phá / ion hoá Chỉ các mảnh tích
điện được phát hiện
e- Phân mảnh
70 eV
•• [Mảnh Con]
M M+•
Mẫu F1+ + F1•
Cation gốc
/ Ion phân tử Mảnh Mảnh
2e- cation gốc
[Mẹ]

F1+• + NF1
Mảnh Mảnh
cation gốc trung hoà

F2+ + F2•
Mảnh Gốc
cation
Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền
 Pic cơ bản Phổ MS của
pentobarbital,
bắn phá
bằng electron

Khối lượng phân tử =226

Pic ion phân
Molecular tử M+.
ion peak

• Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết.

• Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55,
• Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M.
• Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%) . Cường độ pic khác tính theo
% của pic cơ bản.
1.2. Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm

• Tạo ít mảnh.

• Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4.

• Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+
CH5+ là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với
chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH+, có nhiều trên phổ
MS ion hoá hoá học dùng methan

CH4  e   CH4.  2e 
CH4.  CH4  CH5  .CH3

CH5  M  CH4  MH 

(M+1) peak
 Phổ ion hoá hoá học của
pentobarbital

Ion hoá
Cường độ tương đối

Hoá học

Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì.
Ít các pic của mảnh so với phổ EI
 2. Bộ Phân tích Khối

• Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách

các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần
riêng biệt.

• Phân loại:
Bộ phân tích từ,
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap)
Bộ phân tích thời gian bay (TOF)

•Sau đây là bộ phân tích từ

 m/z = B2r2e/2V

2.1 Bộ phân tích từ Where m = mass,

e = electron charge,
z = # of charges/ion
Magnetic field r = radius of curvature
B
Focusing slits 2 mV
r
B 2e z
Accelerating
voltage V Focused M+ M+
Ion ion

Ionizing
voltage Increase B
Radius r
Detector
Sample
Low vacuum
inlet
Ion Beam Magnetic Field

Detector
2.2 Bộ phân tích tứ cực
(Quadrupole)

• Một số ion có tỷ số m/z xác

định cộng hưởng với thế xoay
chiều xác định có thể đi thẳng qua
khoảng không đến detector. Trong
khi đó.

•Các ion khác không sẽ có quĩ đạo

không ổn định, va chạm với các
cực và bị giữ lại ở đó.

•Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác
nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector.
2.2 Bộ phân tích tứ cực
Bẫy ion (Quadrupole Ion trap)

• Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích
khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ
và đưa dần ra khỏi bẫy

• Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các
ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không
để đến detector.
2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole)

Q 1 Q Q Detector
2 3

Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau:

Ở Q1: Ở các ion được tách

Ở Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt
như nitơ, argon, heli. Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân
mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions).

Ở Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con

 Độ phân giải của máy khối phổ

• Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có

khối lượng gần nhau m1 và m2. Độ phân giải R là:
R = m 2 / (m 2 - m 1)
• Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa
hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ.
• Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000.
• Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các
ion có khối lượng gần nhau.
• Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768
máy MS cần có R= 25 000
2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)

Nguyên tắc:
• Dùng bộ phận gia tốc ion đẩy ion bay tới
detector, đo thời gian bay
• Thời gian bay được chuẩn hóa theo tỷ lệ
m/z
2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)

Ưu điểm:
• Độ phân giải rất cao (>10.000)
• Độ chính xác rất cao ( 2- 5 mDa)
Ứng dụng:
• Xác định chất mới (xác định công thức)
• Yêu cầu xác định khối lượng chính xác
• Xác định được tạp
• Đo tỷ lệ các pic đồng vị
Xác định tạp
 3. Detector

Nhân electron (electron multiplier):

Tác động của một ion lên bề mặt các

dynode khác để tạo ra các electron
ngày càng nhiều electron.
1  106 (hình bên)

Nhân quang (photomultiplier):

Các electron tạo ra theo cách trên va

chạm với một bề mặt phát quang
để tạo ra photon. Các photon này
được thu nhận và số lượng của
chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu
 Máy MS tứ cực chập 3 (Trip Quad)

TSQ
(Thermo)

WS 2005
Waters Micromass Q-Tof Premier

3
2
Waters Micromass Q-Tof Premier
1. Phun: Z-spray sạch hơn
2. T-Wave = ion optics = ion guide: tạo thành
hình ống hướng ion vào giữa, ít mất mát
ion trên đường đi
3. T-Wave thứ hai: cho MS2
4. TOF: Lựa chọn V mode/ W mode
 GC-MS

Tách bằng GC Xác định bằng MS

Có thư viện phổ chuẩn

Interface

Mass spectrometer acts as a detector for GC

 LC-MS

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các
thành phần trong pha động; không có thư viện phổ
• Để ghép nối giữa LC và MS:
• giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI
(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao diện phun điện ESI (electrospray)

ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI
• Nitơ được dùng để phun sương pha
động tạo thành một sol khí hay khí dung (aerosol) của
khí nitơ và các giọt nhỏ dung môi .
• Sol khí này dược đưa qua một khu vực
được đốt nóng. Ở đây dung môi bị loại và các
chất được ion hoá nhờ các phản ứng ion-phân tử ở áp
suất khí quyển, các electron và các ion sơ cấp được tạo
ra do phóng điện.
APCI: Atmospheric Chemical Ionization
 giao diện phun điện ES
Các giọt dung dịch thu nhỏ và tăng điện tích.
Các phân tử dung môi không tích điện bị loại
Ion hóa bằng phun điện ESI
(Electrospray Ionization)
 LC-MS

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các
thành phần trong pha động; không có thư viện phổ
• Để ghép nối giữa LC và MS:
• giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI
(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao diện phun điện ES (electrospray)

 Ví dụ Ứng dụng LC-MS

• Phát hiện tạp chất trong các thuốc tổng hợp,

• LC: pha động ACN-amoni ethanoat, C18
• giao diện phun điện.

• Sắc đồ TIC: ion mẹ rửa giải ở phút thứ 17,7 và các pic
tạp ra trước và sau đó.
•
• MS: Chất ra ở 8,35 ph cho phổ khối có các pic
thuộc ion (M+H)+ xuất hiện ở m/z = 225 và 227 theo tỷ
lệ 3:1 cho thấy sự có mặt của nguyên tử clo. Chất tạp là
quinazolin có 3 nhóm thế.
Ví dụ Ứng dụng LC-MS

Sắc đồ TIC

MS pic phút
8,35
 Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)

m/z xác định Tất cả Tất cả

 Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)
• Dạng MRM (Multiple Reaction Monitoring)

m/z xác định Tất cả m/z xác định