‫به نام خدا‬

‫بیوتکنولوژی دارویی‬

‫جلسه هفدهم ( آخر)‬

‫اعضای گروه‪ :‬فریال فرازیان‪ -‬پوریا محدث‪ -‬الهام رحیمی فر‪ -‬سارا صحیحی‪ -‬بهارک حسنعلی زاده‪ -‬مینا نورصالحی‪ -‬نازنین شهبازی‬

‫***‬

‫یک واکسن علیه بیماریهای عفونی چگونه تولید میشود؟‬

‫در گذشته از فرم کشته شده یا ضعیف شده میکروب برای تولید واکسن استفاده میکردند (عاملی که به عنوان‬

‫آنتی ژن عمل میکند و سیستم ایمنی بدن را تحریک میکند)‪.‬‬

‫در سطح باکتری یک سری پروتئینهای سطحی وجود دارد که ‪ expose‬اند به سمت خارج‪ .‬و اینها خاصیت‬

‫آنتی ژنیسیته باالیی دارند و اینها هستند که میتوانند سیستم ایمنی را تحریک کنند و ما در طراحی‬

‫واکسنهای نوترکیب از این قسمت ها استفاده میکنیم و بررسی میکنیم که کدام یک از پروتئینهای باکتری‬

‫به سطح میآیند‪ .‬که شاید یک پروتئین نصفش داخل باشد و نصفش بیرون باشد‪ ،‬آن نصف بیرونی را بررسی‬

‫میکنیم تا ببینیم پتانسیل این را دارد که به عنوان آنتیژن برای طراحی واکسن استفاده شود یا نه‪ .‬پس در‬

‫طراحی واکسن یک یا چند پروتئینی که پتانسیل باالیی دارند را انتخاب میکنیم‪.‬‬

‫توالی اسیدآمینه (ژن پروتئین) را داریم‪ ،‬یعنی چه قسمت هایی بیرونند‪ .‬در سایتهای ‪ NCBI‬یا سایت مربوط‬

‫به پروتئینها‪ .‬این توالیها را میتوانیم بدهیم و آنالیز کنیم که کدام یک از پروتئینهای سطحی که ‪expose‬‬

‫شده توانایی بیشتری برای تحریک سیستم ایمنی دارد‪.‬‬

‫خب اینکه پروتئین هست‪ ،‬ما می توانیم ‪ DNA‬آن را سنتز کنیم‪ ،‬یعنی توالی اسیدآمینه را به ‪ DNA‬تبدیل‬

‫کنیم و آنچه ساختیم را که مثالً ‪ 2‬پروتئین یا ‪ 3‬پروتئین است را با یک لینکری( ‪ )linker‬به هم وصل میکنیم‬

‫‪1‬‬
‫که هرکدام مجزا بتوانند شکل فضایی خود را حفظ کنند و هرکدام جداگانه موقعیت خود را داشته باشند و با‬

‫مجموع مثالً ‪ 3‬تا از این قطعات یک واکسن خوبی بتوانیم بسازیم‪.‬‬

‫پس توالی پروتئینهای سطحی را میتوانیم به ‪ DNA‬تبدیل کنیم و آنها را با لینکر به هم متصل کنیم و‬

‫سپس آن را بیان کنیم‪ .‬حال پروتئینهای سطحی را که به صورت نوترکیب بیان کردیم به عنوان واکسن‬

‫معرفی میکنیم‪ .‬و دیگر از میکروب استفاده نکنیم بلکه دقیقاً از قسمتهایی که میتواند خاصیت واکسن را‬

‫ایجاد کند استفاده کنیم (نقاط آنتی ژنیسیته)‪.‬‬

‫در اسالید های ‪ 2-7‬مثال ‪ E.coli‬زده شده است که ما پروتئینهای سطحی آن را بررسی می کنیم و ‪3‬‬

‫پروتئین را انتخاب میکنیم (همان مراحل قبل تکرار میشوند)‪.‬‬

‫اسالید ‪:8‬‬

‫‪2‬‬
‫‪ 3‬پروتئین به نامهای ‪ EspA ،intimin‬و ‪( Tir‬اسمها مهم نیستند چون فقط مثالاند) نشان داده شده است‬

‫که پروتئین اول از همه بزرگتر است و ‪ ۷۱7‬اسیدآمینه دارد‪ .‬همهی این ‪ ۷۱7‬اسیدآمینه در بیرون باکتری‬

‫(سطح باکتری) نیست و بعضی قسمتهای آنها داخل است‪ .‬و ‪ 282‬اسید آمینهی آن مشخص شده به عنوان‬

‫پروتئینی که ما برای تهیهی واکسن استفاده میکنیم‪ .‬پروتئین دوم که همان ‪ EspA‬است کالً ‪ ۱۷2‬آمینواسید‬

‫دارد که از این ‪ ۱۷2‬ما از ‪ ۱2۱‬آمینواسید آن برای تهیهی واکسن استفاده میکنیم‪ .‬و در آخر پروتئین ‪Tir‬‬

‫که کالً ‪ ۵۵۷‬اسیدآمینه دارد که ما از ‪ ۱۱3‬آمینواسید آن استفاده میکنیم‪ .‬پس این ‪ 3‬تیکهای را که انتخاب‬

‫کردیم کنار هم قرار میدهیم و ساختاری میسازیم که واکسن نوترکیب ما را شکل میدهد‪.‬‬

‫اسالید ‪:۷‬‬

‫پس همان ‪ ۱2۱‬و ‪ ۱۱3‬و ‪ 282‬اسیدآمینهای که انتخاب کردهایم را به وسیله لینکر به هم متصل میکنیم‪.‬‬

‫توالی پروتئین آنها را در اسالید ‪ ۷‬میبینید و آن توالیهایی که بین آنها است بیشتر ‪ EAAA‬دارد و این‬

‫لینکرها در ساختار فضایی پروتئین تأثیر ندارد‪ ،‬مثالً ما از پرولین استفاده نمیکنیم‪ ،‬چون ساختار پروتئین را‬

‫خم میکند سپس این اسید آمینهها را کنار هم قرار میدهیم و به صورت ژن سنتز میکنیم‪ .‬اگر بخواهیم این‬

‫را در ‪ E.coli‬بیان کنیم باید این (آمینو اسیدهایی که با لینکر به هم متصلند) توالیاش و‬

‫‪3‬‬
‫‪ codon optimize‬اش براساس کدون اوپتیمایز باکتری ای کالی باشد‪ .‬پس این آمینه اسیدها سنتز‬

‫میشوند و سپس به وکتور کلونینگ میبریم و از آنجا به وکتور بیانی میبریم و از وکتور بیانی به باکتری مثالً‬

‫‪ E.coli‬میبریم تا بیان شود و سپس میتوانیم آن را تزریق کنیم و میزان آنتیبادی را چک کنیم‪.‬‬

‫قبل از اینکه وارد مراحل بعدی شویم‪ ،‬معموالً یکسری کارهای بیوانفورماتیکی انجام میشود به عنوان مثال‬

‫پایداری ‪ RNA‬را اندازه گیری می کنند و ساختار دوم و سوم پروتئین را پیش بینی می کنند تا مطمئن شوند‬

‫که هرکدام ‪ Fold‬خود را گرفته و شکل فضایی خود را حفظ میکند و یا اینکه ‪ Linker‬ها درست عمل‬

‫میکنند یا خیر که هرکدام نرم افزار خاص خود را دارند‪.‬‬

‫برای اینکه بدانیم وکتور ما منتقل شده است یا خیر‪ ،‬پرایمرهای اختصاصی ‪ Forward‬و ‪ reverse‬برای هر‬

‫قطعه انجام میدهیم و میتوان پرایمر ‪ Forward‬را از اولین پروتئین و ‪ reverse‬را از آخرین پروتئین انتخاب‬

‫کرده و به کمک ‪ PCR‬تکثیر کنیم‪ ،‬در نتیجه پرایمرها برای تأیید کار ما الزم هستند‪.‬‬

‫قدم بعدی این است که ژن مورد نظر را وارد وکتور کلونینگ کنیم مثالً وارد وکتور ‪ PUC57‬کنیم‪.‬‬

‫در اسالید ‪ ۱۱‬میبینیم که طول قطعه ما ‪ 1680bp‬است به عالوهی دوتا ‪ Linker‬که آن را با آنزیم ‪BamHI‬‬

‫و ‪ Hind III‬برش داده و وارد ‪ PUC57‬میکنیم برای اینکه مطمئن شویم که ژن ما منتقل شده است‪،‬‬

‫بهترین کار ‪ PCR‬است اما اگر ‪ PCR‬نداشتیم بهترین کار این است که دوباره آن قطعه را جدا کنیم و روی‬

‫ژل ببریم‪ .‬در شکل میبینیم که ژن ما با همان تعداد باز‪ ،‬در پایین قرار گرفته و ‪ PUC57‬که سنگینتر بوده‬

‫‪4‬‬
 ‫در باال است‪( .‬وکتور چون سنگینتر است باالتر قرار میگیرد و ژن در پایین آن) پس در نتیجه ‪digestion‬‬

‫را انجام داده و در الکتروفورز مقایسه میکنیم‪.‬‬

‫ژل‬
‫‪sds page‬‬
‫ﭼﮕﻮﻧﻪ ﻣﯿﺒﻨﺪد؟‬
‫‪،‬ﻣﻮاد اوﻟﯿﻪ ﺑﺮای ﺳﺎﺧﺖ ‪:‬اﮐﺮﯾﻞ آﻣﯿﺪ‬
‫‪sds،‬‬
‫ﺗﺮﯾﺲ‪ ،‬ﺗﯿﻤﺮ‪ ،‬ﺗﺮپ آﻣﯿﻨﻮ ﭘﺮ ﺳﻮﻟﻔﺎت‬
‫‪TEMED‬‬
‫دارﯾﻢ ﮐﻪ اﮐﺮﯾﻞ آﻣﯿﺪ را ﭘﻠﯽ اﮐﺮﯾﻞ آﻣﯿﺪ ﻣﯿﮑﻨﺪ و ﺳﻤﯿﺘﺶ را ا‬
‫ز ﺑﯿﻦ ﻣﯿﺒﺮد‬
‫‪.‬و آﺧﺮ از ﻫﻤﻪ اﺿﺎﻓﻪ ﻣﯿﮑﻨﯿﻢ ﮐﻪ ﺑﺎﻋﺚ ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن ژل ﻣﯿﺸﻮد‬

‫بعد از وکتور کلونینگ‪ ،‬باید آن را وارد وکتور بیانی کرد ‪ .‬به عنوان مثال ‪ PET28a‬که این کار با همان‬

‫آنزیمهای ‪ BamHI‬و ‪ Hind III‬انجام شده است‪ .‬اینجا هم میتوان برای اطمینان از انتقال‪ ،‬با ‪،digestion‬‬

‫قطعه را درآورده و در روی ژل ‪ Run‬میکنیم معموالً بعد از استخراج پالزمید آن را انجام میدهند‪.‬‬

‫توضیحات اسالید ‪:۱۱‬‬

‫بعد از ساختِ قطعهی مورد نظر‪ ،‬آن را وارد یک ‪ E.coli‬بیانی میکنیم مثل ‪ BL21‬یا ‪ .K12‬زمانی که‬

‫پروتئین بیان شد‪ ،‬آن را استخراج کرده و روی ژل الکتروفورز میبریم (ژل پلی آکریل آمید یا همان ژل‬

‫‪)SDS PAGE‬‬

‫در ژلی که در اسالید مشاهده میکنیم‪ ،‬یکی از قطعهها‪ ،‬پروتئین نوترکیب ما است که از قبل اندازهی آن را‬

‫میدانیم‪ ،‬برای اینکه مطمئن شویم پروتئینی است که ما ساختیم و یا برای خود اِکالی است‪ ،‬باید تست وسترن‬

‫بالت بگذاریم یعنی ژل ‪ SDS page‬را منتقل کنیم به کاغذ نیتروزسلولز یا کاغذ نایلونی و با آنتیبادی‬

‫‪ ۱( histag‬تا هیستیدین)‪ ،‬آن را تأیید میکنیم که ژن ما بیان شده در اِکالی یا خیر‪.‬‬

‫‪5‬‬
‫در اسالید ‪ ۱7‬هم وسترن بالت برای آن قطعه را میبینیم که بعد از منتقل کردن به کاغذ‪ ،‬میتوان متوجه‬

‫شد که این پروتئین ما هست یا خیر‪.‬‬

‫بعد از آن این پروتئینها را می توان به موش تزریق کرد و میزان ‪ IgG‬آن را اندازهگیری کرد و کارهای حیوانی‬

‫را آن را انجام داد‪.‬‬

‫پایان‪‬‬

‫‪6‬‬