Биомедицина нанотехнологии

ГЕОРГИ ЙОРДАНОВ
БИОМЕДИЦИНСКИ
НАНОТЕХНОЛОГИИ
PL интензитет, a.u.
480 530 580 630 680

дължина на вълната, nm
Университетско издателство1 „Св. Климент Охридски“

Медицинската информация, представена в тази книга, е единствено с
образователна цел и не може да служи и/или да се възприема като препоръка
за лечение или медицински съвет.
Рецензент
проф. дн Маргарита Попова
© 2022 Георги Георгиев Йорданов

© 2022 Университетско издателство „Св. Климент Охридски“
ISBN 978-954-07-5341-6
2
Съдържание
Предговор..................................................................................................5
Предговор от автора................................................................................6
Част I. Основи на биомедицинските нанотехнологии .......... 8
1.Увод в биомедицинските нанотехнологии .................................. 9
1. Нанотехнологии и наномедицина ................................................... 9
2. Наночастици за диагностика ......................................................... 15
3. Нанолекарства и наноносители ..................................................... 23
4. Наночастици за хипертермична терапия ...................................... 26
5. Наночастици за ваксини ................................................................ 27
6. Проблеми и перспективи ............................................................... 28
2. Получаване, модификация и преработка на наночастици ... 32
1. Общи методи за получаване .......................................................... 32
2. Методи за пречистване и разделяне ............................................. 41
3. Модификация и биоконюгация ..................................................... 48
4. Концентриране и сушене ............................................................... 49
5. Стерилизация .................................................................................. 53
3. Физикохимични свойства и методи за анализ ........................ 58
1. Оптични свойства ........................................................................... 58
2. Електрични свойства ...................................................................... 72
3. Седиментация и аналитично ултрацентрофугиране ................... 84
4. Колоидна стабилност ..................................................................... 86
4. Методи за морфологичен и структурен анализ ..................... 100
1. Микроскопски методи ................................................................. 100
2. Спектрални методи ...................................................................... 109
3. Дифракционни методи ................................................................. 112
4. Определяне на молекулна маса ................................................... 117
5. Термични методи.......................................................................... 121
5. Основи на нанофармакологията .............................................. 124
1. Предмет на нанофармакологията ................................................ 124
2. Взаимодействия между наночастици и протеини ..................... 125
3. Ендоцитоза на наночастици ........................................................ 131
4. Фармакокинетика на наночастиците .......................................... 137
5. Лекарствено доставяне с наноносители ..................................... 145
6. Лекарствено освобождаване от наноносители .......................... 159
3
6. Основи на нанотоксикологията ............................................... 171
1. Основни положения ..................................................................... 171
2. Методи за изследване................................................................... 175
3. Цитотоксични механизми ............................................................ 183
4. Органна и системна токсичност .................................................. 187
Част II. Наночастици за биомедицината ........................... 197
7. Полупроводникови наночастици ............................................. 198
1. Видове квантови точки ................................................................ 198
2. Оптични свойства ............................................................................... 200
3. Методи за получаване .................................................................. 208
4. Повърхностна модификация ....................................................... 218
5. Биоконюгация ............................................................................... 222
6. Биомедицински приложения ....................................................... 225
7. Фармакологични аспекти............................................................. 234
8. Метални наночастици ................................................................ 241
1. Видове метални наночастици ...................................................... 241
2. Исторически бележки .................................................................. 242
3. Оптични свойства ......................................................................... 243
4. Получаване.................................................................................... 246
5. Модификация и биоконюгация ................................................... 253
9. Магнитни наночастици ............................................................. 281
1. Видове магнитни наночастици.................................................... 281
2. Магнитни свойства ....................................................................... 281
3. Методи за получаване .................................................................. 284
4. Модификация и биоконюгация ................................................... 288
10. Органични наноносители ........................................................ 308
1. Полимерни наночастици .............................................................. 308
2. Полимерни мицели ....................................................................... 319
3. Протеинови наночастици............................................................. 327
4. Липозоми....................................................................................... 329
5. Липидни наночастици .................................................................. 338
Цитирана литература.......................................................................346
Азучен указател.................................................................................394
4
Предговор
Нанотехнологиите обединяват множество научни дисциплини, като

химия, биология, физика, медицина и инженерство, и са една от най-бързо
развиващите се научни области през последното десетилетие. Този факт
предопределя и необходимостта от бърза адаптация на учебната програма
и обучение, съобразено с последните новости в науката. Настоящият учебник
е оригинално помагало в обучението на студенти в областта на наномеди-
цината. Представеният материал е подходящ за студенти от специалности
в областта на химията, биологията и материалознанието, като умело съче-
тава богатия изследователски опит на автора с научните достижения в
областта, достъпни в англоезичната литература.
Авторът е структурирал своя учебник в десет глави, които са разделе-
ни в две части: 1. Общо представяне на биомедицинските нанотехнологии
(включва 6 глави) и 2. Представяне на някои от основните видове наночас-
тици използвани в биомедицината (включва 4 глави). В първата част са
въведени основни понятия и методи за получаване и модифициране на
наночастици за терапия, диагностика и ваксини, както и техните по-важни
физикохимични свойства. Разгледани са и основните методи за охаракте-
ризирането им. В две последователни глави са представени основните
понятия и изследвания във фармакологията и токсикологията, които имат
важно значение за приложението на наноматериалите. Втората част пред-
ставя основните методи за получаване, функционализиране и характери-
зиране на физикохимичните свойства на неорганични наночастици, поли-
мерни мицели, протеини и липидни наноструктури, използвани за диаг-
ностика и терапия.
Бързото развитие на нанотехнологиите налага необходимостта от честа
актуализация и допълване на наличната информация. Представените
основни понятия, методи и подходи са допълнени с нови данни от послед-
ните години в областта. Учебникът отговаря и на отдавнашната необходи-
мост от издание на български език, което да даде необходимата научна
основа за една по-широка аудитория от студенти, дипломанти, специали-
занти и докторанти в една интердисциплинарна област като наномеди-
цината.
проф. дн М. Попова
5
Предговор от автора
Приложението на нанотехнологиите в биологията, медицината и фар-

мацията е една от най-интензивно развиващите се интердисциплинарни
области на съвременната наука. Предлаганото издание е първи опит да се
обхване материята, която авторът преподава на студенти в Софийския
университет от 2010 година насам. Само по себе си това обстоятелство
говори за неизбежните несъвършенства при предприетото начинание.
Трябва да се отбележи, че към настоящия момент англоезичната научна
литература изобилства с материали, отнасящи се до различни аспекти на
биомедицинските нанотехнологии. Въпреки това авторът на настоящото
издание е убеден, че остава място за един труд, който да представи на
български език в синтезирана и възможно най-достъпна за студентите
форма основните положения в тази обширна интердисциплинарна област.
Материята е разпределена в две части.
В първата част са разгледани някои общи направления от биомеди-
цинските нанотехнологии, основни моменти от получаването, преработ-
ката и свойствата на наноколоидните дисперсии, както и някои методи за
охарактеризирането им. Информацията, представена в тези глави, би била
от по-голяма полза за студентите от нехимическите специалности. Послед-
ните две глави от тази част са посветени на основните принципи на нано-
фармакологията и нанотоксикологията. Разгледани са взаимодействията на
наночастици с биоструктури (протеини, клетки и организми), основните идеи
за доставяне на лекарства чрез наночастици и някои проблеми с токсич-
ността на наночастиците.
Във втората част са разгледани основните видове неорганични нано-
частици, намиращи приложение във фундаменталните биологични изслед-
вания, in vitro диагностиката и терапията – полупроводникови, метални
(златни и сребърни) и магнетитни наночастици. Описани са най-характер-
ните за тях размерно-зависими физикохимични свойства, основните мето-
ди за получаване, функционализиране и биомедицински приложения. Пос-
ледната глава е посветена на някои наноколоидни лекарствени носители
– мицели и наночастици от синетични полимери, протеини, както и някои
видове липидни наноструктури. Упоменати са данни от клиничния опит
с някои от лицензираните за употреба нанопрепарати.
Това структуриране на материала води до някои повторения от първата
част във втората въпреки опитите да бъдат минимизирани. Степента, в
която са третирани отделните глави и методи за анализ, се отличава с
6
известна неравномерност, което в голяма степен се определя от тради-
циите на четения курс и от подготовката на автора. Така например частта
за спектроскопските методи за анализ би могла да се разшири, но тези
методи са широко преподавани в различни курсове и са отразени в редица
учебни помагала и монографии. В едно бъдещо издание биха могли да се
включат и допънителни глави, посветени на други наноматериали.
През последните години бяха публикувани извънредно много данни в
областта на биомедицинските нанотехнологии. Множество от водещите
трудове по дискутираните теми са цитирани в текста, но явявайки се учеб-
но пособие, тази книга не претендира и няма за цел пълнота на библио-
графията и не може да замени специализираните монографии и обзорите,
създадени от специалистите по различните теми, засегнати в курса. След-
ва винаги да се има предвид фактът, че биомедицинските нанотехнологии
се развиват с изключително бързи темпове и някои от представените в
настоящото издание концепции не бива да се приемат като твърдо уста-
новени факти. Независимо колко правилна изглежда някоя идея, научният
подход изисква тя безпристрастно да се проверява. Почти всички примери
от медицинската научна литература, които са цитирани в това издание, са
експериментални разработки с неизяснени изцяло ефикасност и безопасност.
Схемите и илюстрациите, представени на фигурите в книгата, са дело
на автора. Също така представените данни (спектри и снимков материал)
са от експерименти, проведени от автора с техническата подкрепа от коле-
ги, работещи със съответната апаратура.
Книгата може да бъде от полза на всички, проявяващи интерес към
биомедицинските нанотехнологии. Поради интердисциплинарния харак-
тер на третирания материал и нивото, на което е изложен, книгата може
да е полезна на широк кръг читатели и студенти от различни специалности.
Всички конструктивни препоръки относно подобряването на книгата ще
бъдат приети с благодарност и взети предвид при бъдещи издания.
доц. дн Г. Йорданов
7
ЧАСТ I
ОСНОВИ НА БИОМЕДИЦИНСКИТЕ
8
Глава 1
УВОД В БИОМЕДИЦИНСКИТЕ
Нанотехнологии и наномедицина. Наночастици за диагностика. Наночасти-

ци за терапия (нанолекарства и лекарствени наноносители, наночастици за
хипертермична терапия). Нановаксини. Проблеми и бъдещи перспективи.
1. НАНОТЕХНОЛОГИИ И НАНОМЕДИЦИНА
Нанотехнологиите обхващат получаването, охарактеризирането и при-

ложението на различни наноструктурирани материали. Като нанострукту-
ри могат да се дефинират различни обекти, чиито размери са в интервала
от 1–100 nm (1 nm = 10-9 m). Ограничението в размера е условно и се
основава главно на това, че наноразмерните (представката нано- произли-
за от гръцката дума νάνος, означаваща „джудже“) обекти обикновено про-
явяват размерно-зависими свойства (абсорбция и флуоресценция, магнит-
ни свойства и др.), различни от тези на съответните обемни материали,
при размери под 100 nm. В някои случаи се имат предвид свойства като
стабилност, оптични свойства на дисперсията, определена биологична ак-
тивност и други, при което за нанообекти се приемат и такива с размери
до около 300 nm. На дефиницията за наноразмерни обекти отговарят на-
ноструктури, получавани под формата на нанокомпозити (макроскопични
материали, в които са вградени наночастици) още в древността (Sharon,
2019). Любопитни примери за такива материали са стъкла и керамики с
диспергирани в тях метални (медни, златни или сребърни) наночастици
(Freestone et al., 2007; Sciau, 2012), дамаскинската стомана, съдържаща
9
Глава 1. Увод в биомедицинските нанотехнологии
въглеродни нанотръбички (Reibold et al., 2007) и синьото багрило на маите

от Чичен Ица – индигово багрило, което е вградено в нанопореста глина,
осигуряваща стабилността му (Domenech et al., 2011).
В областта на химията системното изучаване на частиците с размери
от 1 до 100 nm започва преди повече от век. В своя класически учебник
по химия на колоидите от 1917 г. Ричард Зигмонди (Richard Zsigmondy)
представя класификация на хетерогенните системи според размера на час-
тиците и определя водните дисперсии с размери на частиците от 1 до 100
nm като хидрозоли или същински колоиди (Zsigmondy, 1917) (същите
системи днес често се наричат наночастици или наноколоиди). Някои от
тези хидрозоли са били приготвяни от неорганични вещества, а други –
от различни полимери. Така наречените в днешно време „мокри“ методи
(използващи разтвори и течна дисперсна среда) и към настоящия момент
са обект на колоидната и полимерната химия.
Приложението на колоидите в медицината и биологията също не е
рожба на съвремието. Например провежданите преди повече от век из-
следвания в тази област са обобщени в книгата Colloids in Biology and
Medicine на проф. Хайнрих Бечхолд (Heinrich Jakob Bechhold) от 1919 г.
(Bechhold, 1919). Пример за наноколоиден фармацевтичен продукт с дъл-
гогодишно приложение е сребърният препарат коларгол, разработен през
1897 г., който съдържа сребърни наночастици с размери около 15 nm
(Jimenez–Lamana et al., 2014) и се използва до днес за третиране на някои
бактериални инфекции. Още в самото начало на ХХ век са описани експе-
рименти с използване на метални колоиди за третиране на рак (McClurg
et al., 1915). През 1986 г. е дадено обяснение на феномена на акумулиране
на колоиди в солидни тумори, наречен от Хироши Маеда (Hiroshi Maeda)
ефект на повишената пропускливост и задържане (EPR ефект), заемащ
централно място в съвременната нанофармакология (Fang et al., 2011). Още
с първите експерименти с интравенозно инжектиране на колоиди се уста-
новява акумулацията им в черния дроб, далака, костния мозък и въобще в
клетките на ретикулоендотелната система, където се локализират повече-
то инжектирани частици, отколкото в тумора. Този проблем с локализа-
цията на интравенозно приложени наночастици в макрофагите и ендотел-
ните клетки остава в голяма степен нерешен при опитите за третиране на
тумори и към настоящия момент. През 70-те години на ХХ век в полимер-
ната и фармацевтична химия навлизат понятията нанокапсули и нано-
частици за означаване на колоидни частици с размери обикновено под
500 nm, които имат за цел да бъдат натоварени и ползвани като носители
на лекарствени и други биологично активни вещества (Couvreur et al.,
1977; 1979).
10
Дефинирането на съвременните нанотехнологии само според размера

на обектите е прекалено общо и включва най-различни области от науката,
като колоидна химия, материалознание, органична химия, молекулярна
биология, физика на полупроводниците, микроелектроника и други. Кон-
цепциите за директно манипулиране на атоми и молекули, които впослед-
ствие вдъхновяват множество разработки в съвременните нанотехноло-
гии, са дискутирани публично за първи път по време на лекцията „There’s
plenty of room at the bottom“ на известния физик Ричард Файнман (Richard
Feynman), изнесена на 29-ти декември 1959 г. в Калифорнийския техно-
логичен институт (Caltech). Терминът нанотехнология (nanotechnology) е
използван за първи път от японския учен Norio Taniguchi през 1974 г. за
описание процесите за получаване на тънки филми от различни материа-
ли, при които размерите се контролират в нанометровия диапазон.
През 80-те години на ХХ век започва интензивно развитие на науката
за клъстерите (clusters), разработване на нови и усъвършенстване на вече
известни микроскопски и други техники за морфологичен и структурен
анализ, откриват се фулерените и полупроводниковите наночастици (кван-
тови точки, quantum dots, QDs). Тези и други открития полагат основите
на съвременните тенденции в развитието на химичните нанотехнологии,
които набират популярност през 90-те години и се очертават като една от
приоритетните области за финансиране на научните изследвания в редица
държави.
През 2000 година в САЩ стартира Националната нанотехнологична
инициатива (National Nanotechnology Initiative, NNI) по предложение на
Майкъл Роко (Mihail Roco) при администрацията на президента Бил
Клинтън. Нейната основна цел се състои в целенасоченото подпомагане
на научни разработки, иновации и трансфер на нанотехнологии в пазарни
продукти. След 2000 година се установява и става все по-общоприета
дефиницията за нанообекти, а именно това са обекти, които в поне едно
измерение имат размер под 100 nm. Това важи най-вече за неорганичните
наночастици (полупроводникови, метални, магнитни и др.), при които
действително се наблюдават нови характерни за тях размерно-зависими
свойства. Установеното в полимерната химия понятие за наночастици,
включващо частици и структури по-големи от 100 nm, продължава да се
използва и до момента. В следващото изложение като наночастици ще
бъдат означавани неорганични частици с размери под 100 nm и някои
органични типично колоидни частици с размери до около 300 nm.
В литературата наночастиците често се означават с наименования
според формата им – нанопръчки, наносфери, нанокапсули, наноигли,
нанолистове и др. Наночастиците от типа ядро/обвивка се означават с
11
поставянето на символа @ между емпиричните формули на състава на

ядрото и обвивката; например означението CdSe@ZnS означава наночас-
тици с ядро от CdSe и обвивка от ZnS. Нанокомпозитни са материали, в
които наночастици са включени в твърда среда (матрица). В нанокомпо-
зитите взаимодействията частица–матрица може да са относително силни
и да маскират свойствата на изолираните наночастици. С намаляване раз-
мера на частиците отделните фази (хомогенните части на хетерогенната
система) стават все по-слабо дефинирани и става все по-трудно да се пре-
кара ясна граница между хомогенна и хетерогенна система, между аморф-
но и кристално състояние.
Характерните за наночастиците размерно-зависими ефекти се проявя-
ват най-силно при най-малките частици, често при размери под 10 nm.
Най-малките структури, с размери около и под 1 nm, се означават като
клъстери. При наночастиците съотношението повърхност–обем е отно-
сително голямо, като голяма част от изграждащите ги атоми се намират
на повърхността на частиците. С увеличаване размера на частицата про-
центът на градивните частици, които се намират на повърхността на
частицата, бързо спада. Например при размер 1 nm на молекулите, от кои-
то е изградена наночастицата, при 10 nm-ова наночастица, около 30% от
молекулите ще бъдат по повърхността на частицата, докато при 100 nm-
ова частица този процент ще бъде около 3%, а при 1000 nm-ова частица –
само около 0,3%. Когато даден материал е под формата на наночастици,
това обикновено води до повишена реакционна способност, понижена
температура на топене, изменени температури на полиморфни превръща-
ния, различни междуатомни разстояния и повишена разтворимост в
сравнение със същия материал под формата на макроскопични частици
(различната разтворимост на малките и големите частици може да се
обясни с уравнението на Гибс–Томсон). Освен тези общи размерно-зави-
сими свойства, при някои видове наночастици се наблюдават специфични
за тях свойства, които не са характерни за съответните макроскопични
материали, като размерно-зависима абсорбция и флуоресценция на свет-
лина (при полупроводниковите наночастици), суперпарамагнетизъм (при
магнитните наночастици), плазмонна абсорбционна ивица (характерна за
металните наночастици) и др.
Наночастици могат да бъдат получени чрез различни физични и хи-
мични методи, които се класифицират най-общо като дисперсионни, кон-
дензационни и дисперсионно-кондензационни (вж. Гл. 2; §1). При диспер-
сионните методи микронно-размерни или по-големи частици се раздро-
бяват механично (в колоидни мелници, чрез ултразвук, или друг метод)
до по-малки наночастици, докато при кондензационните методи се
12
използват наноутаителни процеси или химични реакции, при които от

йонни и молекулни разтвори се образуват наночастици. Дисперсионно-
кондензационните методи включват първоначално раздробяване на обем-
ни материали чрез лазер или електрическа плазма до отделни атоми или
клъстери, които след това агрегират в наноразмерни частици. Прилагане-
то на плазмени, горивни, електрохимични, епитаксиални и други методи
обикновено цели получаването на наночастици за технически приложе-
ния, за нуждите на катализа и материалознанието, и няма да бъдат раз-
глеждани в настоящото издание. Наночастиците за биомедицински при-
ложения най-често се получават чрез колоидно-химични методи. В тази
светлина, става ясно значението и основополагащата роля на колоидната
химия за успешното развитие на биомедицинските нанотехнологии. Ос-
новните концепции на колоидната химия са описани в множество класи-
чески и съвременни учебници и познаването им е от ключово значение за
развитието на нанотехнологиите (Norde, 2003; Cosgrove, 2005).
Наномедицината е интердисциплинарна област, изучаваща приложе-
нието на нанотехнологиите в медицината. Повечето изследвания в нано-
медицината са концентрирани в областта на нанофармакологията и нано-
токсикологията – разработката и приложението на различни наночастици
за диагностика, терапия и превенция, както и изучаване на техния токси-
кологичен профил. Обекти на изследвания в наномедицината са различни
видове наночастици: полупроводникови, метални, магнитни, хидроксид-
ни, полимерни, липидни и др. (някои от тях са представени на фиг. 1.1).
Характерните за тези наночастици свойства са в основата на многобройни
опити за диагностични и терапевтични приложения – използване на нано-
частици като имунофлуоресцентни маркери, контрастни агенти, диагнос-
тични сензори, терапевтични средства, лекарствени носители, компонен-
ти на ваксини и др.
В настоящото издание ще бъдат разгледани общите принципи при био-
медицинските (диагностични и терапевтични) приложения на някои видо-
ве неорганични и органични наночастици. Методите, използвани за полу-
чаването на такива наноматериали, са в основата си колоидно-химични,
при които обаче следва да се отчитат и биомедицинските изисквания
свързани със специфичното им приложение. Чрез подходящо функциона-
лизиране, осигуряващо взаимодействие с биологични макромолекули и
клетки, наночастиците могат да бъдат полезни при различни биомедицин-
ски изследвания и приложения. Наноформулировките, предназначени за
терапевтични приложения, обикновено се подлагат на допълнителни про-
цедури, осигуряващи дълготрайното им съхранение и стерилност.
13
Фиг. 1.1. Електронномикроскопски изображения на някои видове наночастици, изпол-

звани в наномедицината: а) полупроводникови нанокристали от CdSe, б) златни наночас-
тици, в) сребърни наночастици, г) наночастици от полибутилцианоакрилат, д) албуминови
наночастици, е) наноструктуриран алуминиев хидроксид
Трябва да се отбележи, че на фона на огромния брой научни публика-

ции по темата съществуват ограничен брой нанофармацевтични продукти
в клинична употреба, като например паклитаксел натоварен в албуминови
наночастици (Desai, 2016), SMA-неокарциностатин (Maeda, 2001), някои
липозомни лекарствени форми (Bulbake et al., 2017) и др. Към настоящия
момент се отличават с широка употреба иРНК-ваксините срещу SARS-
Cov-2 на основата на липидни наночастици (Aldosari et al., 2021). От друга
страна, съществуват фармацевтични препарати, които са в клинична упо-
треба от десетилетия, въпреки че не са популярни като нанотехнологични
продукти, но дефакто съдържат наночастици. Такива са някои препарати
14
за третиране на желязодефицитни състояния, съдържащи наноразмерен

ферихидроксид (Fütterer et al., 2013), препарати с колоидно сребро, напри-
мер коларгол, който съдържа сребърни наночастици (Jimenez–Lamana et
al., 2014), ваксини, съдържащи наноструктурирани алуминиеви хидрокси-
ди и фосфати (Shardlow et al., 2018), и др.
2. НАНОЧАСТИЦИ ЗА ДИАГНОСТИКА
Наночастиците, притежаващи потенциал за приложение в диагности-

ката, основно в методите in vitro (извън живия организъм) за детектиране
на антитела, антигени, клетъчни рецептори, нуклеинови киселини и някои
методи за разделяне на молекули и клетки, представляват хибридни (орга-
нично-неорганични) частици с характерни за тях физикохимични свой-
ства (флуоресценция, повърхностен плазмон резонанс, суперпарамагне-
тизъм). Носител на това свойство се явява неорганичната компонента, а
органичната (най-често полимерна) обвивка осигурява стабилността на
частиците и осъществява свързването на частиците със специфични анти-
тела или олигонуклеотиди, необходимо за приложението им в диагности-
ката. Неорганични наночастици с такива специфични физикохимични
свойства, които ще бъдат разгледани, са полупроводниковите (квантови
точки, QDs), металните (златни, сребърни) и магнитните наночастици
(табл. 1.1) (Azzazy and Mansour, 2009).
Поради факта, че някои неорганични наночастици могат да бъдат ток-
сични и/или неразградими в биологични условия, приложението им върху
живи организми (in vivo) е ограничено. Тези наночастици могат да намерят
приложение като реагенти при различни in vitro диагностични тестове и
анализи. Някои неорганични частици, например сребърни, ферихидрок-
сидни и магнитни, могат да намерят терапевтични приложения, съответно
при третиране на бактериални инфекции, желязодефицитни състояния и
при магнитната хипертермична терапия. Тези и други потенциални въз-
можности за биомедицински приложения ще бъдат разгледани в главите,
посветени на съответните видове наночастици (Част II).
Чрез своята органична обвивка неорганичните наночастици могат да
бъдат свързани химически с различни органични вещества и биологични
молекули в зависимост от изискванията на конкретното приложение. Не-
органичните наночастици обикновено се модифицират с хидрофилни или
амфифилни вещества, осигуряващи вододиспергируемост и колоидна
стабилност. Допълнително могат да бъдат модифицирани с молекули,
чрез които специфично да се свързват с определени целеви субстрати.
15
Най-често наночастиците за диагностични приложения се модифицират с

антитела за целите на имунните диагностични методи, чрез които се цели
специфично детектиране на определени антитела, антигени, протеини,
повърхностни клетъчни рецептори и др. Поради това, в следващите пара-
графи ще бъде обърнато внимание на различните видове антитела, начи-
ните за свързването (конюгирането) им с наночастици и използването им
в някои имунодиагностични методи. Ще бъдат разгледани и някои методи
за свързване (конюгация) на наночастици с олигонуклеотиди за целите на
някои генетични анализи. Възможностите за приложения на магнитните
наночастици в образната диагностика ще бъдат разгледани в Гл. 9.
Таблица 1.1. Някои видове неорганични наночастици за диагностични приложения

Наночастици Материали Специфични свойства Приложения
Полупроводни- CdSe, CdTe, Абсорбция и Имунофлуоресцентен
кови (квантови CdSe/ZnS, и флуоресценция на анализ, FRET-сензори,
точки) др. светлина, зависещи от флуоресцентни
размера на частиците маркери.
Метални Au, Ag, Pt и Повърхностен Имунодиагностика,
др. плазмон резонанс контрастни агенти за
ТЕМ
Магнитни Fe3O4, γ- Суперпарамагнитни Магнитна
Fe2O3 и др. свойства биосепарация, магнитни
контрастни агенти.
Антителата (известни още като имуноглобулини, Ig) са протеини,

които участват при идентифицирането и неутрализирането на чужди за
организма обекти (като бактерии и вируси). Антителата разпознават и се
свързват специфично с определена част (епитоп) от чуждия за организма
антиген. Антителата могат да неутрализират патогените чрез директно
свързване в комплекс антиген–антитяло, участвайки в антитяло-зависи-
мата клетъчно-медиирана цитотоксичност (ADCC), фагоцитозата и акти-
вирането на комплемента. При бозайниците има известни различни класо-
ве (изотипове) антитела (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM). Антителата от класове
IgE, IgD и IgG са мономерни, IgA са димери, а тези от клас IgM са пента-
мерни (фиг. 1.2). Антителата се синтезират от плазмени клетки (плазмо-
цити) – вид бели кръвни клетки. Антителата IgA се образуват в областта
на лигавиците (на дихателния, храносмилателния и урогениталния тракт)
и се намират в някои биологични течности (слюнка, сълзи, кърма), IgD
участват в стимулирането на базофилните клетки и мастоцитите да произ-
веждат антимикробни фактори, IgE се свързват с алергените и водят до
отделяне на хистамин от базофилите и мастоцитите и участват в противо-
паразитната защита на организма, IgM се намират в мономерна форма по
16
повърхността на В-клетките и като секреторна пентамерна форма и участ-

ват в елиминирането на патогените в началните етапи на хуморалния иму-
нен отговор, а антителата IgG представляват главната част от антителния
имунен отговор.
Схематично представени, мономерните антитела (IgD, IgE, IgG) имат
формата на буквата Y с два еднакви свързващи антигена участъци (т.е.
антителата са бивалентни – свързващи два антигена). Всеки край на тези
два участъка съдържа паратоп (paratope), чрез който може специфично да
се свърже с определена част от антигена, наречена епитоп (epitope). Ако
антигените имат повече от един епитоп, е възможно образуването на мрежа от
взаимодействия, водещи до утаяване (преципитация) на антигена и антитяло-
то. Формирането на комплекс антиген–антитяло е в основата на имуно-
диагностични методи като ELISA, имунофлуоресценция, имуноблот или
Уестърн блот (Western blot), имунодифузионни, имуноелектрофорезни,
имунохроматографски и други методи.
IgD, IgE, IgG IgA IgM
Фиг. 1.2. Схематично представяне на различните класове антитела (мономерните IgD, IgE
и IgG, димерните IgA и пентамерните IgM)
В диагностичната и изследователската практика намират приложение

най-вече антитела от клас IgG, произведени в различни експериментални
животни (мишки, зайци, кози, коне и др.). Моноклоналните антитела се
получават от идентични клетки, които са получени от един клон (от една
изходна клетка). Тези антитела могат да разпознават специфични целеви
молекули и намират приложение в имунохистохимичната и имунофлуо-
ресцентната диагностика. Молекулата на антитялото се състои от 4 поли-
пептидни вериги – две леки (L-вериги) и две тежки (Н-вериги). Веригите
са свързани чрез дисулфидни мостове и различни нековалентни взаимо-
действия (фиг. 1.3). Свързващите антигена участъци са разположени в
NH2-края на двете вериги и се означават като Fab, докато карбоксилният
край на веригите се означава като Fc участък и бива разпознаван от Fc
рецептори на някои имунни клетки (макрофаги и др.).
17
Фиг. 1.3. Молекула на антитяло IgG (схема)
Молекулите на антителата могат да се свържат по различни начини с

наночастици, които се определят от повърхностните свойства и вида на
функционалните групи от органичната обвивка на наночастиците. Най-
често това става чрез ковалентно свързване на карбоксилна група от повърх-
ността на наночастицата и амино група от молекулата на антитялото (съз-
даване на амидна връзка чрез карбодиимидна реакция) (фиг. 1.4). При
тази реакция се използва водоразтворим карбодиимид (EDC), който при
стайна температура образува реакционоспособен присъединителен про-
дукт, който лесно реагира с амино група от молекулата на антитялото (при
реакцията понякога се използва и добавка от N-хидроксисукцинимид,
NHS) (Sehgal and Vijay, 1994). Известни са и други методи за ковалентно
свързване на антитела с наночастици, например с използване на клик-
реакции, най-често, реакция между азид и алкин с получаване на петчле-
нен триазолов пръстен (Thorek et al., 2009).
Възможно е и нековалентно свързване, например с използване на спе-
циално синтезирани адаптерни протеини, които от една страна се свърз-
ват електростатично с наночастицата, а от друга с Fc-края на антитялото
(Goldman et al., 2002). Като своеобразен адаптерен протеин може да по-
служи и стрептавидин, чрез който към наночастицата може да се асоциира
биотинилирано (конюгирано с биотин) антитяло, при което се използва
силното нековалентно взаимодействие биотин-стрептавидин (Mason et
18
al., 2005). След осъществяване на свързването между антителата и нано-

частиците следва разделяне на наночастиците от излишъка несвързани
антитела, което обикновено се осъществява чрез центрофугиране или гел-
филтруване.
Фиг. 1.4. Схематично представяне на ковалентно свързване на карбоксил-функционали-

зирани наночастици (NP) с антитела чрез карбодиимидна реакция (пояснения в текста)
Съществуват два основни проблема при свързването на антитела с

наночастици:
1. Трудно контролиране броя на антителните молекули, свързани с една
наночастица. Обикновено се получават наночастици, свързани с раз-
личен брой антителни молекули, което се явява препятствие при
строго количествени анализи.
2. Съществува вероятност за понижаване афинитета на антитялото към
антигена вследствие от конформационни промени в молекулата на
антитялото, настъпили при свързването му с наночастицата.
Възникването на тези проблеми следва да се отчита при разработва-
нето на нови модифицирани с антитела наночастици. Методът и условия-
та на модифицирането трябва да се оптимизират с цел получаване на на-
ночастици, свързани с еднакъв и известен брой молекули от антитялото и
същевременно максимално запазване на афинитета към антигена.
Наночастиците, модифицирани с антитела, могат да се използват за
диагностични цели чрез т.нар. маркирани имунни реакции. Това са група
реакции в съвременната серологична диагностика, характеризиращи се с
висока чувствителност и специфичност, при които използваните антитела
(или антигени) се свързват (маркират) с подходящи маркери (флуорохро-
ми, радиоизотопи или ензими), чрез които се установява образуване на
антиген–антитяло комплекс. Някои неорганични наночастици могат да се
използват като такива маркери. Например квантовите точки като флуоро-
хроми, златните наночастици за визуализация (благодарение на високия
им екстинкционен коефициент) и магнитните наночастици за количестве-
ни измервания (чрез подходящи магнитометри) (Azzazy and Mansour,
2009). Маркираните имунни реакции могат да се извършват в течна среда
19
или върху твърд носител, при което се налага промиване за отстраняване

на несвързаните в комплекса антиген–антитяло маркирани компоненти.
Основната цел при това е запазване на специфичността и афинитета на
антитялото към съответната целева молекула (структура) и същевременно
запазване на характерните за наночастицата свойства.
Маркираните антитела могат да се свържат с целевите антигени чрез
два основни метода (фиг. 1.5):
а) директен (пряк) метод (на Coons), при който конюгираното (марки-
рано) с наночастица антитяло се свързва директно с антигена;
б) индиректен (непряк) метод (на Weller–Coons), при който антигенът
се свързва със съответното антитяло, към което се свързва конюгирано
(маркирано) с наночастица друго антитяло.
Фиг. 1.5. а) директно и б) индиректно свързване на наночастица (модифицирана с анти-

тела) с целева молекула (антиген): 1 – антиген; 2 – антитяло „А“, свързващо антигена; 3 –
антитяло „Б“, свързващо антитяло „А“; 4 – наночастица (NP)
Директният метод изисква наличие на специфични маркирани с нано-

частици антитела, свързващи целевия антиген. За всеки търсен антиген е
необходимо да се разполага със съответно маркирано антитяло, което се
явява недостатък на метода. Този недостатък е решен при двуетапния ин-
директен метод, при който в първия етап се осъществява образуването на
антиген–антитяло комплекса (антитялото не е маркирано), а във втория
етап се прибавя маркирано антитяло от антигамаглобулинов серум (анти-
телата от антигамаглобулиновия серум се свързват с немаркираните анти-
тела от първоначално образувания антиген–антитяло комплекс). Инди-
ректният метод може да се ползва за доказване и на антитела, включител-
но автоантитела при автоимунни заболявания.
Използването на наночастици като маркери на антителата има за цел
визуализирането и/или количестено измерване на образувания комплекс
антиген–антитяло при имунните методи за диагностика. Това може да
20
бъде осъществено с различни методи благодарение специфичните свой-

ства на наночастиците. Например антитела, свързани с полупроводникови
наночастици, могат да бъдат проследени чрез флуоресценцията на нано-
частиците (т.е. наночастиците се явяват в качеството на флуресцентни
маркери, подобно на широко използваните за тази цел органични флуоро-
фори). При облъчване с ултравиолетова светлина тези наночастици из-
лъчват видима светлина с различен цвят в зависимост от размера и съста-
ва на наночастицата. Такива антитела следователно могат да намерят
приложение при различни имунофлуоресцентни методи за изследване.
Антителата, свързани с метални наночастици, могат да бъдат проследени
с оптичен микроскоп в режим на наблюдение в тъмно поле, тъй като
металните наночастици силно разсейват видима светлина (El–Sayed et al.,
2005). Антитела, свързани със златни наночастици, могат да се наблюда-
ват лесно и чрез трансмисионен електронен микроскоп (TEM), тъй като
бивайки изградени от елемент със сравнително голяма относителна атом-
на маса, тези наночастици силно абсорбират електроните – методът е из-
вестен като имунозлатен метод (Immunogold staining, IGS) и е въведен
през 1971 г. (Faulk and Taylor, 1971). Златните наночастици могат да се
използват и за визуалното (на око) или количествено (колориметрично)
определяне на антителата благодарение на високия им екстинкционен
коефициент (силно абсорбират видима светлина), както и на разликата в
цвета в диспергирано (червен) и агрегирано (син) състояние (Larguinho
and Baptista, 2012). Касетъчните антигенни и антителни тестове за SARS-
Cov-2 също съдържат маркирани със златни наночастици антитела
(González et al., 2020; Li Z. et al., 2020). Магнитни наночастици, свързани
с антитела, могат да се използват за магнитно разделяне (сепарация) на
различни антигени или за количественото им определяне със специални
магнитометри (Tassa et al., 2011).
Реакцията с образуване на комплекс антиген–антитяло е в основата на
множество диагностични и други аналитични методи. Някои от тях ще
бъдат разгледани в Част II. Такива са класическите серологични реакции
аглутинация и преципитация, различните имунофлуоресцентни методи,
имунозлатните методи и др.
Освен като маркери за антитела, флуоресцентните, златните и магнит-
ните наночастици могат да намерят приложение и в някои генни техники
за диагностика и анализ, например при ДНК-хибридизационните методи,
при които се налага свързването на наночастиците с различни олигонук-
леотиди.
Олигонуклеотидите представляват къси едноверижни ДНК или РНК
молекули, които обикновено се получават чрез твърдофазен химичен
21
синтез и намират голямо приложение в различни диагностични и изсле-

дователски методи. Голяма част от тези методи се основават на хибриди-
зационни реакции – свързване на олигонуклеотидите чрез водородни
връзки (каквито са връзките в двуверижните нуклеинови киселини) с ком-
плементарни на тях участъци от ДНК или РНК. При тези реакции е важно
да се установи качествено, а понякога и да се измери количествено тази
хибридизация. За тази цел е необходимо олигонуклеотидите да бъдат мар-
кирани с подходящи маркери, най-често флуоресцентни с цел да бъдат
визуализирани (например чрез флуоресцентен микроскоп) и/или количес-
твено охарактеризирани чрез различни флуориметрични техники. Чрез
такива методи за диагностика могат да бъдат установени някои хромозом-
ни изменения (делеции, транслокации, изменен кариотип) или да бъдат
идентифицирани патогенни микроорганизми (Samanta and Medintz, 2016;
Jamdagni et al., 2016).
Олигонуклеотиди за флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) могат
да бъдат маркирани с квантови точки (Bentolila, 2010). Магнитни нано-
частици могат да се използват като маркери за олигонуклеотиди, при кое-
то количеството на така маркирания олигонуклеотид може да бъде изме-
рено чрез магниторезистивен сензор (Schotter et al., 2004). Златните нано-
частици също намират приложение за установяване на хибридизационни
взаимодействия. Методът е основан на промяна в оптичната абсорбция на
златните наночастици в зависимост от разстоянието между тях – червени
при липса на хибридизация (когато наночастиците са в диспергирано със-
тояние) и сини при наличие на хибридизация на олигонуклеотидите, кога-
то наночастиците са близо една до друга (Elghanian et al., 1997). Същият
принцип може да се използва при приложение на златните наночастици
за установяване на антиген–антитяло и други взаимодействия (Гл. 8, §6.1).
Една от възможностите за конюгиране (свързване) на наночастица с
олигонуклеотид е чрез модифициране на наночастицата със стрептавидин
(протеин, проявяващ силен афинитет към биотин) и използване на биоти-
нилирани олигонуклеотиди (Bentolila, 2010). Други възможности включ-
ват използване на амино-функционализирани частици, които да бъдат ко-
нюгирани с олигонуклеотиди чрез карбодиимидна реакция (Schroedter
and Weller, 2002; Dubertret et al., 2002) (фиг. 1.6), амино-производни на
олигонуклеотиди да бъдат конюгирани с карбоксил-функционализирани
наночастици (Algar and Krull, 2006), както и директно свързване на моди-
фицирани с тиолови групи олигонуклеотиди с повърхността на наночас-
тицата (Elghanian et al., 1997; Singh et al., 2010; Banerjee et al., 2016).
22
Фиг. 1.6. Конюгиране на амино-функционализирана наночастица с олигонуклеотид чрез

EDC (N-(3-(dimethylamino)-propyl)-N'-ethyl-carbodiimide) и имидазол
Съществуват опити за приложението на магнитни и метални наночас-

тици като контрастни агенти в живи организми, за in vivo диагностика,
например като контрастни агенти при някои томографски методи за об-
разна диагностика (Rümenapp et al., 2012; Dong et al., 2019). Тези възмож-
ности за приложения ще бъдат разгледани в съответните глави, посветени
на тези видове наночастици, тъй като разбирането на принципите на мето-
дите е свързано с по-дълбокото познаване на свойствата на тези наночас-
тици. Трябва да се отбележи обаче, че инжекционното приложение на
тези наночастици в живи организми не е с напълно изяснена безопасност.
3. НАНОЛЕКАРСТВА И НАНОНОСИТЕЛИ
Наночастиците с фармакологично действие представляват частици,

изградени от лекарствени вещества, или частици, които се явяват носи-
тели на активната субстанция. Примери за наночастици, представляващи
лекарствена субстанция или биологично активно вещество, са някои фе-
рихидроксидни препарати за инжекционно приложение при третиране на
желязодефицитни състояния (Fütterer et al., 2013). Сребърните наночас-
тици в качеството им на антибактериални средства, например коларгол),
също могат да се причислят към този тип. Известни са и други примери
за биологично активни вещества, получени под формата на наночастици
или нанопрахове (Müller and Junghanns, 2006). Получаването на лекар-
ствените вещества под тази форма има за резултат повишена дисперги-
руeмост на малкоразтворими субстанции и улеснена абсорбция.
23
Приложението на нанотехнологиите в медицината предлага известни

възможности за целево доставяне на лекарствени вещества (targeted drug
delivery) до определени патологични тъкани и клетки в организма. Чрез
целевото доставяне на биологично активното вещество до мястото на дей-
ствие се явява възможност за понижаване на ефективната доза и странич-
ните ефекти на лекарственото вещество. Използването на наноносители
цели повишаване наличността на лекарството в патологичната област за
по-продължителен период, което би довело до подобряване на терапев-
тичния индекс (съотношението между токсичната и терапевтичната доза)
(Attia et al., 2019) (вж. Гл. 5, §4). За тази цел могат да се използват раз-
лични органични и неорганични наноносители. Органични наноносители
се явяват различни полимерни мицели и полимерни наночастици, про-
теинови наночастици, липидни наноструктури, различни резервоарни
системи (като липозоми, полимерозоми, ниозоми) и др. Част от тях са
разгледани накратко в Гл. 10. Неорганични лекарствени наноносители
могат да бъдат някои наночастици от калциев фосфат, злато и железни
оксиди (Paul and Sharma, 2020). Особен интерес представляват мезопорес-
тите силикатни материали (Vallet–Regí et al., 2018; Popova, 2021). Такива
материали могат да бъдат получени чрез зол-гелен синтез в мицеларни
разтвори на амфифилни вещества с последващо пречистване, калцинира-
не и включване на лекарствени вещества (Szegedi et al., 2012; Trendafilova
et al., 2017; Popova et al., 2018a,b; Popova et al., 2020).
Голямата полза от наноносителите е възможността да се повлияе на
фармакокинетиката на лекарствените вещества, която включва резорб-
цията, разпределението, биотрансформацията (метаболизма) и излъчва-
нето (екскрецията) на лекарствените средства. При това механизмът на
лекарственото действие (взаимодействието на лекарствените молекули с
определени биологични структури – рецептори, ензими и др.) се очаква
да не се влияе значително, тъй като той се определя главно от структурата
на лекарствената молекула, която следва да остава непроменена при нато-
варването на лекарството в носителя. Ако обаче лекарствените молекули
имат потенциал да взаимодействат с различни биомолекули и рецептори,
тоест има няколко механизма на въздействие върху клетките, различната
субклетъчна локализация на лекарственото вещество със и без наноноси-
тел може да промени съотношението между тези механизми (Evangelatov
et al., 2016). Възможността на някои наноносители да преодоляват биоло-
гични мембрани и физиологични бариери (кръвно-мозъчната и др.) пред-
лага една алтернатива за транспорт на биологично активни вещества, кои-
то не преминават през тези бариери (Jia et al., 2020) (вж. Гл. 5, §5). Нано-
24
носители за лекарства се разработват основно за потенциално приложе-

ние в онкологията за доставяне на лекарства до солидни тумори, за доста-
вяне на ваксини до антиген-презентиращи клетки, за доставяне на анти-
биотици при вътреклетъчни инфекции, както и за доставяне на лекарства
до мозъка (през кръвно-мозъчната бариера). Във всички тези случаи се
касае за парентерално приложение на наноформулировките, въпреки че
са разработени и наноносители за други форми на приложение.
Друга възможност за повлияване лекарствения ефект с използването
на наноносители е механизмът на навлизане (пенетрация) в клетката и
вътреклетъчното разпределение. Лекарствените молекули обикновено
преминават през биологичните мембрани чрез дифузия, а в някои случаи
и чрез различни видове активен транспорт (голяма част от биологично
активните вещества оказват своя ефект чрез взаимодействие с рецептори,
разположени по външната повърхност на клетъчната мембрана без да
проникват във вътрешността на клетките). Наноносителите навлизат в
клетките чрез различни видове ендоцитоза (фагоцитоза, клатрин-зависи-
ма ендоцитоза, макропиноцитоза и др.) и първоначално попадат в мем-
бранно-ограничена вътреклетъчна везикула, наречена ендозома (вж. Гл.
5, §3). Ендозомната локализация на наноносителите може да повлияе
вътреклетъчната локализация на лекарственото вещество и по този начин
да промени ефекта му върху клетъчните процеси (Sahay et al., 2010).
Следва да се отбележи също така и възможността за контролирано
освобождаване на лекарствените вещества от наноносителите (вж. Гл. 5,
§6). Профилът на лекарственото освобождаване от наноносителите зави-
си от множество фактори: природата на носителя и натовареното вещест-
во, начина на нановарване, условията на освобождаване (температура,
йонна сила, киселинност и окислително-редукционен потенциал на среда-
та, наличието на определени ензими, протеини и други фактори). Тази
зависимост може да се използва за постигане на стимулирано или пусково
(triggered) освобождаване на натовареното вещество при промяна на фак-
торите на средата. Съществуват възможности за създаване на наноноси-
тели, от които натовареното вещество може да бъде освободено при про-
мяна в киселинността, температурата, редокси-потенциала и други факто-
ри – т.нар. освобождаване в резултат на външен стимул (Fang et al., 2021).
Съществува също така възможност повърхността на наноносителите
да бъде модифицирана със специфични лиганди и моноклонални антите-
ла, чрез които наноносителят може да се свърже с рецептори, разполо-
жени по клетъчните мембрани на целеви клетки. В това се състои т.нар.
концепция за активно насочване на наноносителите, която може да наме-
ри потенциално приложение при разработването на наноносители за
25
доставяне на лекарствени вещества до туморни клетки, за доставяне на

антибиотици до инфектирани клетки и др. (Гл. 5, §5.2).
Не на последно място, при използването на наноносители следва да се
има предвид промяната в токсикологичния профил на лекарственото
вещество, както и проява на нови странични ефекти, дължащи се както на
промяната в биоразпределението на лекарственото вещество, фармакоки-
нетиката и биологичното действие. Тук трябва да се вземат предвид въз-
можностите за натрупване на бавно разградим материал от носителя в
определени клетки и тъкани, локални и системни възпалителни реакции,
както и реакции на свръхчувствителност, особено при инжекционно при-
ложение, водещи до тежки състояния, например остър респираторен дис-
трес синдром (ARDS) и смърт (Merle et al., 2017). Някои въпроси на нано-
фармакологията и нанотоксикологията са разгледани в Гл. 5 и 6.
4. НАНОЧАСТИЦИ ЗА ХИПЕРТЕРМИЧНА ТЕРАПИЯ
Хипертермичната (хипертермия: повишаване на температурата) тера-

пия представлява медицинска процедура, при която определена тъкан или
част от тялото се излага на повишена температура с цел увреждане и/или
премахване на патологично изменени клетки (най-вече ракови клетки).
Локалната хипертермия в областта на солиден тумор може директно да
предизвика клетъчна смърт в раковите клетки чрез коагулация и денату-
рация на клетъчните протеини или да доведе до увреждане на клетките,
като по този начин повишава чувствителността им към лъчетерапия и
цитостатици. Предполага се, че хроничната исхемия (недостиг на кисло-
род и хранителни вещества) и относително киселата среда (като следствие
от образуване на повече млечна киселина поради неефективното окисли-
телно фосфорилиране) в солидните тумори поставят раковите клетки в
относително по-неблагоприятни условия спрямо околните нормални тъ-
кани, което се явява причина за относително по-голямата им чувствител-
ност към хипертермично въздействие. Умерената хипертермия (около 40–
42 °C) може да доведе до повишена пропускливост на кръвоносните съдо-
ве и да повлияе кръвообръщението през тумора, което на свой ред да
улесни акумулирането на полимерни лекарства и наночастици в туморна-
та тъкан (вж. описанието на т.нар. ефект на повишена пропускливост и
задържане, EPR, в солидни тумори в Гл. 5, §5.4). Температури над 50 °C
предизвикват коагулация на множество протеини, необратимо увреждане
и смърт на клетките.
26
Локална хипертермия може да се получи при облъчване на златни

наночастици с лазер (фототермия), както и при поставяне на магнитни на-
ночастици в променливо магнитно поле (магнитна хипертермия). Фото-
термичната терапия с метални наночастици, както и магнитната хипер-
термия с магнитни наночастици, са експериментални методи за третиране
на тумори (вж. Гл. 8, §6.3 и Гл. 9, §5.7).
5. НАНОЧАСТИЦИ ЗА ВАКСИНИ
От близо век в повечето инактивирани ваксини се използва гелообра-

зен алуминиев хидроксид като адсорбент, наречен адювант, представля-
ващ своеобразен носител на съдържащите се в тези ваксини антигени. В
качеството на антигени се използват инактивирани токсини (при анти-
токсичните ваксини, каквито са тези против тетанус и дифтерия) и/или
протеини от инактивирани микроорганизми (или протени, произведени
чрез рекомбинантна ДНК технология). Установено е, че класическият
адювантен гел се състои от нанокристален алуминиев оксихидроксид,
организиран в микроскопични (1–20 µm) агрегати (Hem and White, 1995).
Гелообразният алуминиев фосфат, използван за същите цели, е аморфен
и се състои от наноразмерни сфероидни частици, формиращи микрораз-
мерни агрегати (фиг. 1.7).
(а) (б)
Фиг. 1.7. Електронномикроскопско (ТЕМ) изображение на ваксинални адюванти: (а) алу-
миниев хидроксид от хепатит Б ваксина; (б) алуминиев фосфат от пневмококова ваксина
Функцията на ваксиналните адюванти е да усилят имуногенността на

антигена (способността му да предизвиква имунен отговор), което позво-
лява използването на малки количества антиген за постигане на силен и
дълготраен имунен отговор. Има предложени няколко различни механиз-
ми, обясняващи това действие на адювантите, в това число и ролята им на
27
антигенни носители, доставяйки ги целево до фагоцитиращите антиген-

презентиращи клетки (antigen-presenting cells, APC) (дендритни клетки,
макрофаги) (Shi et al., 2019).
В някои случаи е показано, че наноразмерни частици, които се явяват
антигенни носители, могат да бъдат по-ефективни ваксинални адюванти
от микроразмерните агрегати (Li X. et al., 2014). Приложението на нано-
технологиите в производството на ваксини, т.нар. нановаксинология, пред-
ставлява интензивно развиващо се направление (Mamo and Poland, 2012).
Като наноадюванти и компоненти на нановаксини са предложени най-
различни системи: наноразмерни неорганични оксиди, полимерни нано-
структури, липозоми, липидни наночастици, вирусоподобни наночастици
и други (Smith et al., 2015; Pati et al., 2018) (вж. Гл. 5, §5.5).
До масово приложение при хора достигнаха така наречените инфор-
мационни РНК (иРНК) ваксини срещу вируса SARS-Cov-2, съдържащи
липидни наночастици в качеството на иРНК носители, и могат да бъдат
причислени към продуктите на нановаксинологията (Alfagih et al., 2020;
Verbeke et al., 2021). Тези ваксини не съдържат протеинов антиген в чист
вид, а иРНК, в която е кодирана информацията за производството на ви-
русен протеин от трансфектираните клетки (клетките, в които е въведена
иРНК), който на свой ред се явява антиген. Липидните наночастици, които
се явяват носители на иРНК, са от ключово значение за ефективното тран-
слиране на иРНК в протеин, тъй като количеството на този протеин зависи
от количеството интактни иРНК молекули, достигащо цитоплазмата на
клетката, съответно от ефективността на наночастиците като иРНК доста-
вящи системи (вж. Гл. 10, §5.3).
6. ПРОБЛЕМИ И ПЕРСПЕКТИВИ
Настоящите проблеми в биомедицинските нанотехнологии могат да се

групират условно в две групи – проблеми от технологичен характер и
проблеми от биомедицински характер. Тези две групи от проблеми са в
голяма степен взаимозависими.
Проблемите от химико-технологичен характер включват най-често оп-
тимизиране на процедурата за получаване на наночастици с оптимални
свойства, наложени от специфичното им биомедицинско (диагностично и
терапевтично) приложение. Един от съществените проблеми за разреша-
ване в биомедицинските нанотехнологии е свързан със стабилността на
наноформулировките, тяхното съхранение и различните методи за прера-
ботка при подготовката им за приложение. Например важно е процесите
28
на стерилизация на парентералните формулировки и лиофилизацията (не-

обходима за дълготрайното им съхранение) да не променят физикохимич-
ните характеристики на наночастиците и състава на дисперсиите.
Проблемите от биомедицински характер произлизат от характера на
взаимодействието между наночастиците и биологични структури. В реди-
ца случаи тези взаимодействия, както и факторите, които ги определят, са
все още недостатъчно изяснени. Това поражда необходимост от съсредо-
точаване на бъдещите изследвания именно върху тези проблеми, чието
изясняване би разширило и повишило възможностите за приложение на
нанотехнологиите при решаване на различни биомедицински проблеми.
Въпреки множеството научни съобщения за подобрен терапевтичен
индекс при използването на лекарствени наноносители, съществуват ня-
кои ограничения, които следва да се имат предвид при разработването на
нови нанолекарства. Все още съществуват трудно преодолими препят-
ствия пред постигането на желаното биоразпределение на наноносители-
те в целевите патологични области в организма, които са най-често след-
ствие от сложни реакции на живия организъм към нано- и микроразмер-
ните обекти. Въпреки тези трудности много изследвания са насочени към
допълнително изясняване на реалните възможности и ограничения на
наноносителите. Различни характеристики на наноносителите определят
хода на взаимодействието им с различни протеини, биологични клетки и
с живия организъм като цяло. Такива се явяват размерът на носителите,
електрокинетичният им потенциал, относителната хидрофилност на по-
върхността им, наличието на определи функционални групи и др. Мето-
дите, чрез които биват охарактеризирани наноносителите, са разгледани
накратко в Гл. 3 и 4, а взаимодействията им с протеини и биологични
клетки и ефектът на характеристиките на носителите върху тези взаимо-
действия са разгледани в Гл. 5.
Сред по-важните проблеми на наномедицината и нанотехнологиите
като цяло стои и въпросът с токсичността на наноматериалите. Изучава-
нето токсичността на наноматериалите е обект на нанотоксикологията
(Monteiro–Riviere and Tran, 2014). Поради малките си размери и голямото
отношение повърхност/обем, както и някои принципно нови свойства,
наноматериалите могат да се проявяват като токсиканти по отношение на
живите клетки и организми. Нанотоксикологията е свързана от една стра-
на с токсикологията на финните частици, а от друга – с токсикологията на
материалите, изграждащи наночастиците. В допълнение, повишената ре-
активност на наноматериалите в сравнение със съответните макроско-
пични материали, възможността да навлизат в клетките чрез ендоцитоза
29
и да взаимодействат с различни биологични структури и системи (напри-

мер с компонентите на имунната система), както и да преминават през
различни физиологични бариери (кръвно-мозъчна, плацентарна, ендотел-
на и др.) определя специфичния им токсикологичен профил, който следва
да се има предвид, най-вече при наноматериалите за in vivo приложения.
Някои основни положения в нанотоксикологията, както и някои механиз-
ми на токсичното действие на определени видове наночастици са разгле-
дани в Гл. 5.
РЕЗЮМЕ
Въведение в нанотехнологиите и наномедицината. Нанотехнологиите обхващат
получаването, охарактеризирането и приложението на различни наноматериали. Като
наноструктури могат да се дефинират различни обекти, които в поне едно измерение
на пространството имат размери в интервала от 1–100 nm (1 nm = 10-9 m). Обикновено
в този интервал от размери свойствата на дисперсната фаза започват да се различават
от тези на съответния макроскопичен материал. Като се имат предвид биологичната
активност и някои други свойства (предимно при органичните наночастици), за нано-
обекти в някои случаи се приемат и такива с размери под 500 nm. Наномедицината
(биомедицински нанотехнологии) е интердисциплинарна област на съвременната
наука, чиито обект се явява приложението на нанотехнологиите в медицината и фар-
мацията. Тук попадат различни наноматериали, чиито уникални свойства са в осно-
вата на редица (все още предимно експериментални) приложения в диагностиката,
терапията и превенцията (например използване на наночастици като биологични мар-
кери, контрастни агенти, компоненти на имунологични тестове, терапевтични сред-
ства, ваксини и др.).
Наночастици за диагностиката и биологичните изследвания. Наночастиците с
потенциал за приложение в диагностиката се състоят от наноразмерно неорганично
ядро с характерни физикохимични свойства (флуоресценция, повърхностен плазмон
резонанс, суперпарамагнетизъм), обвито с хидрофилни вещества, придаващи водо-
диспергируемост на наночастиците, и специфични лиганди и антитела, позволяващи
специфично свързване на наночастиците и детектиране на целевата структура. На-
пример флуоресцентни и метални наночастици могат да се използват за маркиране на
антитела и визуализирането на маркираните антитела визуално или чрез различни
микроскопски техники позволява приложението им за изследване на различни кле-
тъчни и субклетъчни структури, както и за приложение в имунологичната диагности-
ка. Магнитни наночастици, свързани с антитела, могат да се ползват за магнитно
разделяне на различни антигени.
Наночастици за лекарствено доставяне. Наномедицината предлага възможности за
целево доставяне на лекарствени вещества до патологични тъкани и клетки в орга-
низма. Чрез такова целево доставяне се явява възможност за понижаване на ефектив-
ната доза и страничните ефекти на лекарственото вещество. Съществуват възмож-
ности за контролирано освобождаване на натовареното вещество от наноносителя,
доставяне до солидни тумори, фагоцитиращи клетки, преминаване през кръвно-
30
мозъчната бариера, активно насочване към целеви клетки и като цяло комплексна
промяна на фармакокинетиката на лекарственото вещество.
Наночастици за хипертермична терапия. Хипертермичната терапия е медицинска
процедура, при която определена тъкан или част от тялото се излага на повишена
температура с цел премахване на патологично изменени клетки. Локална хипертер-
мия може да се получи при облъчване на златни наночастици с лазер (фототермия),
както и при поставяне на магнитни наночастици в променливо магнитно поле (маг-
нитна хипертермия).
Нановаксини. Наночастици могат да служат и като носители на антигени и нуклеи-
нови киселини в състава на ваксини. Така антигените биват ефективно поглъщани от
антиген-презентиращите клетки, а нуклеиновите киселини биват стабилизирани и се
осигурява трансфекцията на клетките. Към момента широко приложение намират
иРНК-ваксини на основата на липидни наночастици.
Настоящи проблеми и бъдещи перспективи. Настоящите проблеми в биомеди-
цинските нанотехнологии могат да се групират условно в две взаимосвързани групи,
проблеми от химико-технологичен и такива от биомедицински характер. Сред по-
важните проблеми на наномедицината са въпросите, свързани с възпроизводимото и
ефективно получаване на монодисперсни по размери и със зададени физикохимични
свойства наночастици, проблемите свързани с тяхното биоразпределение, терапев-
тичната ефективност, токсичност и стабилност при обработка (стерилизация и лиофи-
лизация) и дълготрайно съхранение.
31
Глава 2
ПОЛУЧАВАНЕ, МОДИФИКАЦИЯ И
ПРЕРАБОТКА НА НАНОЧАСТИЦИ
Общи методи за получаване (кондензационни методи, дисперсионни мето-

ди, дисперсионно-кондензационни методи, получаване на наночастици в
течна среда, плазмохимични методи, пиролизни методи, биосинтези). Ме-
тоди за пречистване и разделяне (диализа, ултрафилтруване, гел-филтрува-
не, центрофугиране, екстракция). Модификация и биоконюгация. Концен-
триране и сушене. Стерилизация.
1. ОБЩИ МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ
През 1909 г. Svedberg предлага методите за получаване на колоиди да

се разделят на две основни групи: кондензационни и дисперсионни
(Svedberg, 1909). При кондензационните методи се излиза от разтвори, от
които при създаване на подходящи условия молекулите или йоните на
разтворените вещества агрегират до получаване на частици или се отделя
неразтворим в дисперсната среда продукт от протичаща в системата хи-
мична реакция, образувайки дисперсната фаза. При дисперсионните ме-
тоди дисперсната фаза се раздробява механично в дисперсната среда до
достигане на подходящите размери на частиците. В съвременната англо-
езична научна литература се налагат две понятия, обозначаващи два прин-
ципно различни подхода при получаването на наноразмерни обекти:
подход от долу нагоре (bottom-up approach) и подход от горе надолу (top-
down approach). В контекста на колоидно-химичните методи за полу-
чаване на наночастици може да се приеме, че кондензационните методи
32
Глава 2. Получаване, модификация и преработка на наночастици
представляват своеобразен подход от долу нагоре (bottom-up), докато

дисперсионните методи съответстват на подхода от горе надолу (top-
down). За подбирането на подходящите условия за получаване на нано-
частици чрез кондензационни методи основен проблем е контролът на
зародишообразуването и растежа на зародишите до образуване на нано-
частици. При дисперсионно-кондензационните методи материалът първо
се диспергира до атоми или клъстери (например във волтова дъга или чрез
мощен лазер), които след това бързо се свързват в наночастици (например
вж. Гл. 8, §4.1). Тези подходи са схематично илюстрирани на фиг. 2.1.
Фиг. 2.1. Схематично представяне на основните подходи при получаване на колоидни

наночастици: а) дисперсионни (top-down); б) кондензационни (bottom-up); в) дисперсионно-
кондензационни
1.1. Кондензационни методи (bottom-up approach)
При кондензационните методи се изхожда от молекулни разтвори, от

които при подходящи условия се получава неразтворимо вещество, об-
разуващо нова фаза в системата, съответно формиращо (нано)частиците
на дисперсната фаза. Най-общо, кондензационните методи се разделят на
физични (при които не протичат химични реакции) и химични (при които
неразтворимото в дисперсната среда вещество, от което се формира дис-
персната фаза, се образува като продукт на химична реакция).
33
1.1.1. Физични кондензационни методи
Тук се причисляват основно различни наноутаителни методи, основа-

ни на замяна на разтворители. Тези методи се прилагат предимно за полу-
чаване на дисперсии от органични вещества – полимерни, протеинови,
липидни и други наночастици. Например при тези методи се приготвя
разтвор на веществото в разтворител, в който разтворимостта му е висока
(смесваем с вода органичен разтворител – ацетон, THF и др.) и този раз-
твор се смесва с вода (или воден разтвор, съдържащ колоидни стабилиза-
тори), в която веществото е малко разтворимо. При това молекулите на
разтвореното вещество формират отделна фаза (наночастици) и следва из-
парение на органичния разтворител. Подмяната на разтворителя (на орга-
ничен с вода), която води до формиране на частици, може да се реализира
и чрез диализа, или чрез емулгиране с последващо изпарение на органич-
ния разтворител (различни варианти на тези методи са описани в Гл. 10).
1.1.2. Химични кондензационни методи
Химичните кондензационни методи са сред най-разпространените

методи за получаване на наночастици за биомедицински приложения. Те
се основават на химични реакции, протичащи в течна среда, при които се
получава неразтворим продукт, като при подходящи условия този про-
дукт не образува груба дисперсия и съответно не се утаява, а дава стабил-
ни наночастици. Например по този начин се получават дисперсии на ме-
тални наночастици при реакция на водни разтвори на метални соли с
подходящи редуктори (Гл. 8, §4.2). Тук се отнасят и всички „мокри“ (про-
тичащи в течна среда) утаителни методи за получаване на наночастици от
различни малко разтворими вещества, като малко разтворими халкогени-
ди (вж. Гл. 7, §3), оксиди и (окси)хидроксиди (Fe3O4, Fe(OH)3, AlO(OH) и
др.) чрез хидролиза или утаяване с основи от водни разтвори на съответ-
ните соли (Гл. 9, §3), зол-гелните синтези с контролирана хидролиза на
подходящи прекурсори и др. Полимеризацията, при която се получават
полимерни наночастици (например емулсионната полимеризация), също
е химичен кондензационен метод (вж. Гл. 10, §1). Повечето от така полу-
чените наночастици са стабилизирани с органични вещества.
1.2. Дисперсионни методи (top-down approach)
При дисперсионните методи се извършва раздробяване на дисперсната

фаза до достигне желаната големина на частичките. Раздробяването може
34
да е механично, чрез мелница (например планетарна), ултразвук или хо-

могенизатори при високо налягане.
Различни топкови мелници се използват са раздробяване основно на
твърди неорганични материали, като в някои случаи е възможно някои
материали да участват в химични превръщания при тези условия (т. нар.
механохимични процеси) (Baláž et al., 2013). При този тип мелници ве-
ществото подлежащо на раздробяване се смесва със „смилащи топки“ със
сферична форма, направени от ахат, стомана, циркониев оксид или друг
твърд материал и се поставят в смилачна камера (цилиндър) – съд, въртящ
се с високи обороти (няколко хиляди оборота в минута). По време на про-
цеса топките се удрят една в друга, както и в стените на смилачната каме-
ра, при което попадналите между тях частици от веществото се раздробя-
ват и смесват. Т. нар. планетарни мелници са топкови мелници, носещи
наименованието си от начина на въртене на смилачните камери (цилин-
дри), които се закрепват върху въртящ се диск, при което се въртят заедно
с диска, но и около собствената си ос. Основният проблем при използва-
нето на механични мелници е замърсяването на раздробявания материал
с вещество, което е откъснато от повърхността на смилащите топки и сми-
лачната камера в процеса на смилане. Смилането на материалите зависи
от размера на смилащите топки, времетраенето на процеса, характеристи-
ките на смилания материал и др.
Механичната хомогенизация на течна дисперсна фаза в течна среда
(при взаимно несмесваеми течности) е класически метод за получаване на
емулсии. Механичното емулгиране може да се осъществи в колоидна мел-
ница (хомогенизатор), при което капките на течната дисперсна фаза се
разкъсват механично до по-малки капки при преминаването на сместа
между повърхностите на бързо въртящ се ротор и статор. Емулгирането
може да се улесни чрез намаляване на повърхностното напрежение между
двете фази, например чрез прибавяне на определени разтворители или по-
върхностно активни вещества. Хомогенизацията под високо налягане е
основен метод за получаване на наноемулсии от стопени липиди във вода
като първи етап при получаването на липидни наночастици (Liedtke et al.,
2000) (вж. Гл. 10, §5.2.1).
Някои материали, например метали, могат да бъдат диспергирани (раз-
прашени) до атомно състояние в условия на електричен разряд или при
облъчване с мощен лазерен импулс. Образуваните при тези условия атоми
бързо се свързват в наночастици. Тези методи като цяло включват етап на
диспергиране на изходния материал, последван от кондензационен етап
на формиране на наночастиците, поради което се означават като диспер-
сионно-кондензационни (вж. §1.3).
35
1.3. Дисперсионно-кондензационни методи
Тези методи са в основата си главно физични и включват дисперсио-

нен етап, последван от кондензация и формиране на дисперсната фаза. От
гледна точка на концепцията за „bottom-up“ и „top-down“ подходите, тези
методи биха могли да се причислят към подхода „top-down“ (от горе надо-
лу), имайки предвид началното (обемен материал) и крайното състояние
(дисперсия на наночастици). Методите са приложими при получаването
на метални наночастици и са разгледани подробно в Гл. 8, §4.1. В тези
случаи се изпарява известно количество метал, потопен в дисперсната
среда (вода), под действие на електрическа (волтова) дъга или мощен
лазерен импулс, при което образуваните метални атоми кондензират с
образуване на наночастици в дисперсната среда. Тези методи имат пре-
димство, че не ползват други реагенти, освен самия метал и по този начин
повърхността на получените метални наночастици е свободна от органич-
ни вещества, чиста и готова за последваща модификация.
1.4. Образуване на наночастици в течна среда
Голяма част от наночастиците за биомедицински приложения се полу-

чават чрез кондензационни методи в течни среди, поради което тук ще
бъде обърнато внимание на процесите на зародишообразуване и растеж
на частиците в тези условия и факторите, които оказват влияние. При кон-
дензационните методи за получаване на колоидни дисперсии основният
момент е образуването на зародиши на новата фаза в системата и нараст-
ването им до получаване на частиците с крайния размер.
Зародиши от нова фаза могат да се образуват в преситени разтвори, т.е.
разтвори, в които концентрацията на разтвореното вещество е по-висока
от равновесната концентрация (разтворимостта) за дадените условия.
Пресищането може да се постигне чрез химична реакция, при която се
получава малко разтворимо съединение, или чрез промяна на условията,
като например промяна в състава на средата (смяна на разтворителя, при-
бавяне на преципитиращ агент и др.). Нарастването на получените заро-
диши може да се осъществи чрез отлагане на допълнително количество
материал от новата фаза върху повърхността на зародиша (чрез протичане
на химична реакция, процеси на зреене и др.), чрез свързване на отделни
зародишни частици помежду им (коагулационно нарастване) или чрез
комбинация от двата механизма. Когато отлагането на веществото върху
повърхността на частицата е съпроводено с трудности (например преодо-
36
ляване на бариера от адсорбирани по повърхността други вещества), ско-

ростта на растеж намалява и контролираното получаване на по-малки
частици се улеснява. Поради тази причина използването на подходящи
стабилизиращи частиците агенти е от ключово значение при получаване-
то на наночастици чрез така наречените „мокри методи“. Тези вещества
стабилизират иначе твърде нестабилните и склонни към агрегиране нано-
частици.
Класическите идеи за получаване на монодисперсни по размер частици
са дадени през 1950 г., популярни като „модел на LaMer“ (LaMer and
Dinegar, 1950). Според тези идеи получаването на частиците трябва да се
проведе по такъв начин, че да се осъществи относително разделяне във
времето на процеса на зародишообразуване от процеса на растеж на заро-
дишите. В първия етап следва да се създаде достатъчно голямо пресища-
не, при което да протече бързо хомогенно зародишообразуване. Вслед-
ствие на образуване на зародишите пресищането в системата спада до
такава степен, че скоростта на зародишообразуване силно намаява, но
пресищането да е достатъчно за нарастване на получените зародиши (фиг.
2.2). Основната идея на разделяне на зародишообразуването от последва-
щия растеж във времето е често срещана практика при получаването на
монодисперсни по размери наночастици. Например при повечето синтези
на полупроводникови наночастици реакцията се провежда чрез бързо
смесване на реагентите (най-често чрез бързо инжектиране на единия
реагент към останалите), чрез което се цели бързо образуване на зароди-
шите в началото на процеса, последвано от нарастването им. Подбирането
на оптималните условия за получаване на наночастици с желано разпреде-
ление по размери става обикновено по емпиричен път.
Механизмът от фиг. 2.2 може да бъде описан по следния начин:
(i) Атомите, молекулите или йоните, разтворени в дисперсната среда,
от които се получават наночастиците, в литературата понякога се
означават като „мономери“ (да се прави разлика с аналогичното
понятие от областта на полимерите) (Peng et al., 1998). При пови-
шаване концентрацията на „мономери“ (например в резултат на
протичаща химична реакция) се достига до пресищане (C>CS), при
което хомогенното зародишообразуване е възможно, но бавно.
(ii) Пресищането с „мономер“ достига нивото Cmin, при което хомоген-
ното зародишообразуване започва да протича бързо, в резултат на
което настъпва бърз спад в концентрацията на „мономер“.
(iii) След спад на концентрацията на „мономер“ под Cmin (в резултат на
бързо протеклото зародишообразуване) образуването на зародиши
се забавя и протича предимно растеж на вече получените зародиши
37
до формиране на наночастици (отлагането на „мономерите“ върху

повърхността на вече образувани зародиши става по-бързо от обра-
зуването на нови зародиши).
Фиг. 2.2. Относително изменение на концентрацията на разтворено в средата вещество

(условно означено като „мономер“ – атоми, йони или молекули, от които се образуват
частиците) във времето при получаване на монодисперсни частици с относително бързо и
кратко зародишообразуване, последвано от растеж на частиците. В началото концентра-
цията на „мономер“ бързо се повишава, надминавайки равновесната (СS) и минималната
концентрация, при която започва хомогенното зародишообразуване (Сmin). След проти-
чане на зародишообразуването, концентрацията спада и при стойности СS<С<Сmin е доста-
тъчна за поддържане растежа на частиците без да протича значимо образуване на нови
зародиши
Според този модел концентрацията на частици (брой частици в еди-

ница обем) като функция на времето би се увеличила рязко в началото, по
време на образуването на нови зародиши, оставайки относително посто-
янна по време на растежа им. Въпреки някои критики към модела на
LaMer (Whitehead et al., 2019, 2021), този модел и негови модификации са
все още широко приети за качествено описание на механизма за образу-
ване на частици (в т.ч. наночастици, макар че в редица случаи моделът не
може да опише количествено процесите). При протичането на бързи реак-
ции, водещи до бързо и голямо пресищане в началото на процеса, може
да се очаква бързо зародишообразуване и получаване на голям брой и
малки по размер частици (съответно, при по-малък брой зародиши се
38
получават по-големи частици при едно и също количество изходни веще-

ства). Концепцията за получаване на монодисперсни по размери частици
чрез растеж на предварително формирани зародиши („seeded growth“)
също произлиза от класическата теория за зародишообразуване и растеж
на частици (означавана в литературата със съкращението CNT, Classical
Nucleation Theory) (Polte, 2015).
След публикуването на модела на LaMer, Reiss стига до заключението,
че ако растежът на частиците зависи само от потока „мономер“ към по-
върхността на частицата, по-малките частици ще нарастват по-бързо в
сравнение с по-големите, което би довело до т.нар. фокусиране на разме-
ра, т.е. намаляване ширината на разпределението по размери с времето
(Reiss, 1951). Този механизъм обаче не отчита допълнителни процеси,
като например оствалдовото зреене, което става значимо в края на про-
цеса, при изчерпване на реагентите, респ. на „мономерите“. При оствал-
довото зреене материал от по-малките частици се прехвърля към по-
големите, при което големите частици нарастват, а по-малките стават още
по-малки и разпределението по размери се уширява, т.е. размерът се
„дефокусира“ (Sugimoto, 1987; Peng et al., 1998). Оствалдовото зреене е
наречено по името на откривателя на това явление, Wilhelm Ostwald,
който го е наблюдавал през 1896 г. Количественото описание на процеса
е направено от Lifshitz, Slyozov и Wagner (Lifshitz and Slyozov, 1961;
Wagner, 1961), поради което е известно като LSW теория. Равновесната
концентрация (разтворимостта) на материала, от който са изградени час-
тиците, е по-ниска за по-големите частици, което може да се свърже с
уравнението на Гибс–Томсон (Gibbs–Thomson). Така се получава разлика
в равновесните концентрации (разтворимостите) между по-малките и по-
големите частици, вследствие на която по-големите частици растат за
сметка на разтварянето на по-малките.
Получаването на колоидни и наночастици чрез агрегация на по-малки
клъстери може да се опише на базата на теорията на Smoluchowski за агре-
гационната кинетика, при която се приема, че нарастването на агрегата
става чрез случайни сблъсъци между две частици на всеки етап от нараст-
ването на агрегатите. В някои случаи на растеж на нанокристали се уста-
новява агрегационен механизъм, например при сребърни наночастици
(Woehl et al., 2014), както и нарастване чрез коалесценция на клъстери с
магически размери при наночастици от CdTe (Dagtepe et al., 2007). Схе-
матична илюстрация на някои процеси, които могат да протекат по време
на растежа на наночастици е показана на фиг. 2.3.
39
Фиг. 2.3. Някои основни механизми на растеж на наночастици: а) отлагане на „мономери“

върху повърхността на частицата; б) коагулация на зародишни частици или клъстери; в)
оствалдово зреене (предаване на „мономери“ от по-малките към по-големите частици).
Като „мономери“ са означени разтворени в дисперсната среда атоми, йони или молекули,
от които са изградени наночастиците
От литературата са известни някои кинетични уравнения за описание

на зародишообразуването и растежа на наночастици (Rempel et al, 2009;
Van Embden et al., 2009; Polte, 2015). Теоретично дори е показано, че
дифузионно ограничение не е необходимо за описание на фокусирането
на размера (Rempel et al., 2009). Най-изучени са процесите на растеж при
полупроводниковите (квантовите точки) и металните наночастици.
1.5. Плазмохимични методи
Плазма, получена при електричен разряд над течен разтвор, може да

се използва за получаване на метални наночастици. При тези процеси се
образуват разнообразни реактивни частици на границата между плазмата
и течния разтвор, някои от които могат да редуцират метални йони от
разтворена в течността метална сол до получаване на метални наночас-
тици (от сребро, злато, платина) (Kaushik et al., 2019). Следва да се отбеле-
жи, че класическите електроразрядни методи за получаване на колоиди
чрез потопени в разтвор метални електроди, какъвто е методът на Бредиг
и някои негови по-съвременни варианти, също могат да се разглеждат
като плазмени методи. Същите методи могат да се използват и за получа-
ване на наночастици от метални оксиди (от съответния метал, от който са
изработени електродите на плазмения прибор). При използване на орга-
нични вещества има възможност да се получат различни въглеродни
наноструктури (нанотръбички, нанодиаманти). Например при плазма в
газова фаза Ar/H2/етанол е докладвано получаването на нанодиаманти
(Kumar et al., 2013).
40
1.6. Пиролизни методи
Пиролизните методи за синтез на наночастици се основават на кон-

тролирано изгаряне или нагряване до висока температура на подходящи
прекурсори, при което настъпва окисление на прекурсора или термично
разлагане. Чрез тези методи се получават предимно наночастици от раз-
лични метални оксиди (Teoh et al., 2010). Размерът и морфологията на
наночастиците зависят от различни фактори, като вида на прекурсора,
температурния режим на процеса, присъствието на органични субстанции
(синтетични или биополимери) ограничаващи агрегацията и растежа на
частиците и др.
1.7. Биосинтези
Биосинтетичните методи за получаване на наночастици се основават

на синтез с помощта на микроорганизми – бактерии, дрожди и др. (Li X.
et al., 2011; Malik et al., 2017). Към биосинтезите се числят и методи, при
които се използват растителни екстракти, съдържащи различни вещества,
изпълняващи функция на колоидни стабилизатори и/или редуктори (нап-
ример за получаване на метални наночастици). Чрез такива методи са по-
лучени различни видове неорганични наночастици: полупроводникови
(основно сулфидни) (вж. Гл. 7, §3.4), метални (от злато и сребро) (вж. Гл.
8, §4.3) и магнетитни (вж. Гл. 9, §3.8).
2. МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ И РАЗДЕЛЯНЕ
При получаването на наночастици дисперсната система често съдържа

излишно количество електролити и други нискомолекулни вещества, част
от които може да са продукт на реакцията на получаване и често се налага
тяхното отстраняване от дисперсията. За тази цел се прилагат разнообраз-
ни методи за пречистване и разделяне на частиците от нежеланите ниско-
молекулни компоненти, като диализа, гел-филтруване и др.
2.1. Диализа
При диализата, нискомолекулните компоненти на дисперсията дифун-

дират през пореста мембрана, която е пропусклива за молекулите на раз-
творителя и нискомолекулните вещества, но не пропуска частиците на
41
дисперсната фаза. Обичайната процедура за провеждане на диализа се

състои в затваряне на определена част от дисперсията за пречистване в
торбичка от диализна мембрана и потапянето и в дестилирана вода или
друга течна среда (фиг. 2.4а). След продължително време (часове, дни)
нискомолекулните компоненти на дисперсията преминават в средата из-
вън диализната мембрана, а в диализната торбичка остава пречистена ко-
лоидна дисперсия. Външната среда може да се подменя периодично или
поточно, за да се осигури максимален концентрационен градиент и уско-
ряване на дифузията. Понякога нискомолекулните компоненти на диспер-
сията могат да окажат стабилизиращ ефект (например цитратните йони
при някои метални наночастици) и тяхното отстраняване чрез диализа
може да доведе до дестабилизиране и коагулиране на наночастиците.
Нискомолекулните компоненти (електролити, малки органични молекули
и йони) трябва да са с молекулна маса, съответно размер на молекулите,
които са достатъчно малки, че да преминат през порите на мембраната.
Съществуват диализни мембрани (предимно нитроцелулозни) с различен
размер (cut-off size) на порите, който се дефинира чрез най-малката отно-
сителна молекулна маса на полимер, който се задържа от мембраната.
(а) (б)
Фиг. 2.4. Схематично представяне на: а) диализа, и б) електродиализа. 1) диализна мем-
брана; 2) колоидна дисперсия; 3) вода; 4) бъркалка; 5) електроди
Отстраняването на електролити от колоидните дисперсии чрез диализа

може да се ускори от прилагането на електрично поле чрез процес, означа-
ван като електродиализа (фиг. 2.4б). При електродиализата дисперсията,
която се пречиства от нежелани електролити, е отделена от чистата вода
с две диализни мембрани, като в съответните изпълнени с вода простран-
ства се поставят два електрода (най-често платинови) и се подава подхо-
дящо постоянно напрежение. В електричното поле йоните се движат към
42
съответните електроди и дифундират по-бързо през мембраните (Shaw,

1992, p. 18). При всички случаи на диализа трябва да се осигури разбър-
кване на системата за ускоряване на процеса.
2.2. Ултрафилтруване
Ултрафилтруването представлява разделяне на дисперсната среда от

дисперсната фаза чрез филтърни мембрани с много фини пори (10–100
nm). При един от методите над дисперсията се прилага налягане или
вакуум под филтърната мембрана (или комбинация от двете). При друг
метод се използват микроцентрофужни филтри, при което налягането,
оказвано от дисперсията над филтърната мембрана, се създава чрез цен-
тробежна сила в центрофуга. Филтратът се събира в центрофужна епру-
ветка при високооборотно центрофугиране. Методът намира приложение
за концентриране на разтвори на високомолекулни вещества, наночас-
тици, за разделяне на макромолекули с различни размери (молекулни
маси), при което се използват ултрафилтърни мембрани с желана големи-
на на порите.
При микрофилтруването размерът на порите на мембраните са обикно-
вено от 0,1 до 10 μm. По-големият размер на порите в сравнение с ултра-
филтруването улеснява процеса, поради което не е нужно прилагането на
високо налягане или ваккум. Това филтруване обикновено се осъществява
чрез филтърни устройства, при които дисперсията се подава чрез сприн-
цовка (syringe filters). При достатъчно малки размери на порите (<450 nm)
микрофилтруването може да се използва за премахване на бактерии от
филтрата, тъй като бактериите обикновено се задържат от филтърната
мембрана поради по-големите си размери. По този начин например могат
да се стерилизират дисперсии на наноструктури, чиито размери са доста-
тъчно малки (<100 nm) и преминават през филтърната мембрана. Следва
да се има предвид, че някои наночастици могат да проявяват афинитет
към материала, от който е изработена филтърната мембрана, и следова-
телно да се адсорбират и задържат по филтъра, въпреки че са по-малки от
порите му и се очаква да преминават през него. При обикновеното фил-
труване, например през филтърна хартия, порите на филтъра обикновено
са по-големи от 10 μm и такова филтруване може да се използва само за
отстраняване на по-големи агрегати (или други онечиствания) с микронни
размери.
При използване на ултрафилтруването за аналитични цели, като на-
пример количествено проследяване концентрацията на някой нискомоле-
кулен компонент в дисперсната среда, следва да се има предвид възможна
43
адсорбция на компонента върху мембраната на филтъра, което може да

доведе до значително намаляване на измерената концентрация в дисперс-
ната среда и съответно до грешен резултат от изследването.
2.3. Гел-филтруване
Гел-филтруването (gel-filtration), означавано още като гел-проникваща

хроматография (gel-permeating chromatography, GPC), е вид молекулно-
ситова хроматография (size-exlusion chromatography, SEC), при която
веществата се разделят според големината на молекулите им при пропус-
кане на изследвания разтвор през колонка с гранули от гелообразен прос-
транствено-омрежен полимер (декстран, полиакриламид). В зависимост
от съотношението полимер-омрежващ агент могат да се приготвят грану-
ли с различен размер на порите, като по-малки пори се получават при
използване на по-голямо количество омрежващ агент. В порите на гело-
образните гранули могат да проникнат само молекулите с достатъчно
малък размер и да се задържат известно време, докато по-големите моле-
кули и наночастици се отмиват по-бързо от потока разтворител и първи
напускат колонката (фиг. 2.5).
Фиг. 2.5. Схематично представяне на задържане на нискомолекулните примеси от порес-

тите гелни гранули при гел-филтруването
Чрез набор от гранули с различна порьозност методът може да намери

приложение за разделяне на нискомолекулни от високомолекулни веще-
ства, разделяне на макромолекули според молекулната им маса и др.
Методът се използва и при разделянето на лекарствени наноносители с
натоварено в тях лекарствено вещество от ненатовареното лекарство,
44
разтворено в дисперсната среда. Като метод за определяне на молекулно-

масовото разпределение на полимери, вж. Гл. 4, §4.1.
2.4. Центрофугиране
Центрофугирането е процес, при който чрез използване на центрофуж-

на сила се ускорява седиментацията в хетерогенни системи чрез центро-
фуга. Лабораторната центрофуга е устройство, чрез което хетерогенната
система (суспензия, емулсия, зол) се завърта в епруветка (или специална
кювета) около фиксирана ос на ротация с ъглова скорост ω. При постоян-
но ъглово ускорение дадена частица започва да се движи равномерно с
постоянна крайна скорост (Regel and Wilcox, 2001).
При центрофугиране на микрохетерогенна дисперсна система фазата
с по-голяма плътност се отдалечава от центъра на ротация (към дъното на
епруветката), докато фазата с по-малка плътност се придвижва към цен-
търа на ротация. В повечето случаи (най-вече при неорганичните наночас-
тици) плътността на дисперсната фаза е по-голяма от тази на дисперсната
среда, като при центрофугиране частиците на дисперсната фаза се утаяват
(седиментират) и образуват седимент (утайка), а останалата бистра теч-
ност над седимента (отделената от частиците дисперсна среда) се нарича
супернатант (supernatant). Супернатантът може да бъде отделен от седи-
мента чрез отдекантиране или чрез отпипетиране с подходяща пипета.
Ъгловата скорост ω (в единици rad/s) на центрофугата се свързва с броя
обороти в минута NRPM (RPM – Revolutions Per Minute) по следния начин:
2 2
 N RPM (2.1)
60
Ускорението при центрофугиране (  r ) обикновено се дава чрез без-

2
размерната величина RCF (Relative Centrifugal Force), която показва колко

пъти ускорението е по-голямо от земното ускорение g (×g). Величината
RCF може да се изчисли от NRPM и радиуса на ротора r чрез следното
уравнение:
 2r
RCF   1,12  10 5 rcm N RPM
2
(2.2)
g
45
Скоростта на седиментация Vt (в единици m/s) е пропорционална на

ъгловото ускорение с коефициент на пропорционалност s, наречен коефи-
циент на седиментация:
r
Vt   s 2 r (2.3)
t
Коефициентът на седиментация се измерва в секунди (s), но за удоб-

ство се използва мерната единица сведберг (Svedberg, S), при което 1 S =
10-13 s. Коефициентът на седиментация не зависи от ускорението, а само
от свойствата на частиците и средата. Коефициентите на седиментация и
други характеристики на наночастиците могат да се получат чрез анали-
тично ултрацентрофугиране (вж. Гл. 3, §3). Теоретично може да се изве-
де израз за коефициента на седиментация за сферична частица с плътност
ρp и радиус R, движеща се във флуид с плътност ρm и вискозитет η под
действие на ускорение ω2r:
2R 2
s ( p   m ) (2.4)
9
При положение че ρp > ρm частиците ще седиментират към дъното на

центрофужната епруветка, докато при ρp < ρm частиците ще изплуват към
повърхността на дисперсията. Очевидно, че при ρp = ρm скоростта на
частиците ще бъде нула. Това се използва за изолиране на частици чрез
центрофугиране в плътностен градиент (Li P. et al., 2018). За тази цел,
проба от частиците се центрофугира в епруветка, в която плътността на
дисперсната среда нараства от повърхността към дъното (например в
среда, получена чрез наслояване на разтвори на захароза с различна кон-
центрация). В началото частиците се движат към дъното на епруветката,
в посока на нарастващата плътност на средата, докато плътността им не
се изравни с тази на средата, при което частиците престават да седименти-
рат и образуват слой, от който могат да бъдат изолирани.
Диференциалното центрофугиране е метод за разделяне на полидис-
персна смес от частици на определен брой отделни по-монодисперсни
фракции, различаващи се по коефициентите на седиментация. Чрез етап-
но изменение на ъгловата скорост (броят обороти за единица време) и
времето на центрофугиране могат да се отделят фракции с различен кое-
фициент на седиментация, съдържащи различни по размери частици (ако
частиците са от различен материал, плътността им може да е различна).
46
Методът намира приложение също така в клетъчната биология при изоли-

ране на различни фракции от клетъчни органели. Същият подход намира
приложение и за изолиране на по-монодисперсни фракции от наночас-
тици изхождайки от полидисперсна проба. Първоначално се изолират по-
големите частици при по-ниски обороти и за по-кратко време на центро-
фугиране, след което от получения супернатант могат да се изолират
последователно фракции от по-малки частици (с по-малък седиментацио-
нен коефициент) като поетапно се повишават оборотите и времето на цен-
трофугиране (фиг. 2.6).
Фиг. 2.6. Схематично представяне на процеса на разделяне на полидисперсна проба на три

отделни фракции (NP1, NP2, NP3; с намаляващ размер, R) чрез диференциално центрофу-
гиране. При всеки следващ етап се изолира и центрофугира супернатанта от предходното
центрофугиране и се повишават оборотите (RPM).
Като метод за разделяне на дисперсната фаза от дисперсната среда,

центрофугирането намира широко приложение в молекулярната биоло-
гия, биохимията, както и в биомедицинските нанотехнологии (Sun et al.,
2018). Методът може да намери приложение за пречистване и концентри-
ране на дисперсиите, подмяна на дисперсната среда, определяне на степен
на лекарствено натоварване и скорост на освобождаване, гравиметричен
анализ (определяне на масовата част на дисперсната фаза), подготовка на
проби за анализи и други. За разделяне на наночастици се използват висо-
коскоростни центрофуги (NRPM ~30,000) и аналитични ултрацентрофуги
(вж. Гл. 3, §3). Някои по-големи (>200 nm) и плътни частици могат да се
утаят и с микроцентрофуги (NRPM ~15,000).
47
2.5. Екстракция
Някои неорганични наночастици могат да бъдат екстрахирани от една

дисперсна среда в друга (например от водна в органична среда или обрат-
но) чрез подходящи лиганди, които се свързват към повърхността на
частиците, като по този начин променят повърхностните свойства и съот-
ветно стабилността на наночастиците в различни дисперсни среди. Чрез
този метод наночастици, получени в една среда, могат да бъдат отделени
от странични продукти, нереагирали изходни вещества и разтворители
чрез селективната им екстракция в друга среда. За да е успешно транс-
ферирането на частиците, екстрахиращият лиганд трябва да е разтворим
в съответната фаза, в която трябва да се екстрахират частиците, както и
да се свързва достатъчно силно с повърхността им. Например златни на-
ночастици синтезирани във водна среда могат да бъдат успешно екстра-
хирани в хексан чрез обвиването им с минимално количество от хидро-
фобния лиганд додекантиол без постсинтетично пречистване (остатъкът
от реагентите и продуктите на реакцията остават разтворени във водната
фаза) (Martin et al., 2010).
3. МОДИФИКАЦИЯ И БИОКОНЮГАЦИЯ
Функционализирането на наночастиците представлява процес на доба-

вяне на нови функции и свойства чрез химическа модификация на повърх-
ността на частиците (Adamo et al., 2017; Sanità et al., 2020). Функционали-
зирането може да се осъществи по няколко начина. Най-целесъобразният
начин (при който се спестява допълнителен етап на модификация) е въ-
веждане на веществата, съдържащи желаните функционални групи, в
състава на частиците при процеса на получаването им. Тези вещества
обикновено играят ролята на стабилизиращи агенти в процеса на форми-
ране на наночастиците и се ориентират по повърхността им. Такива могат
да бъдат различни нискомолекулни и полимерни амфифилни вещества,
някои бифункционални вещества (например меркаптокарбоксилни кисе-
лини) и др. Често по този начин се въвеждат вещества, съдържащи поли-
етиленгликолови остатъци (PEG), а съответните частици се означават
като PEGилирани (PEGylated). PEG-модификацията е важна за колоидна-
та стабилност на наночастиците, но също така определя и взаимодействи-
ето между протеини и наночастици, проникването на наночастиците в
клетки чрез ендоцитоза и биоразпределението на нанолекарствени форми
след инжекционно въвеждане (Pelaz et al., 2015). Друг начин за въвеждане
48
на желана функционална група е чрез химична трансформация на налич-

ни по повърхността на частиците функционални групи. Модификация
може да се реализира и чрез използване на бифункционални (съдържащи
две функционални групи) органични съединения, които чрез едната функ-
ционална група се свързват химически за повърхността на наночастицата,
а другата предоставя желаната функционалност. Така могат да бъдат мо-
дифицирани наночастици от полупроводникови материали (QDs) (Wang
L. et al., 2020), оксиди и хидроксиди (Neouze and Schubert, 2008; Ahangaran
and Navarchian, 2020), метали (Nagarajan et al., 2019) и други. Функциона-
лизирането на наночастици, които нямат подходящи и/или достатъчно
реакционоспособни функционални групи по повърхността си, например
хидрофобни наночастици (обвити с плътна органична обвивка от алкилови
остатъци), биха могли да бъдат обвити с амфифилни полимери, носещи
подходящи функционални групи, или да бъдат включени в хидрофобната
вътрешност на мицели (вж. Гл. 7, §4). Конкретни методи за модификация
на различни видове неорганични (QDs, метални, магнетитни) наночасти-
ци са разгледани в съответните параграфи в Гл. 7, 8 и 9.
Биоконюгацията представлява свързване (конюгация) на наночастици
с биологични молекули (протеини, нуклеинови киселини, въглехидрати и
др.). Често се използват карбодиимидни реакции, клик-реакции, свързва-
не на основата на взаимодействието стрептавидин–биотин, електроста-
тични и други взаимодействия, някои по-типични от които са разгледани
в съответните параграфи в Гл. 7, 8, 9 и 10 (Sperling and Parak, 2010;
Werengowska–Ciećwierz et al., 2015).
4. КОНЦЕНТРИРАНЕ И СУШЕНЕ
4.1. Концентриране
Често получените дисперсии на колоиди (вкл. наночастици) са в зна-
чителна степен разредени и понякога се налага да бъдат концентрирани
до известна степен, за да бъдат използвани или допълнително обработва-
ни. Някои методи за пречистване на колоидните дисперсии, като ултра-
филтруване, центрофугиране и екстракция, могат да се използват и за
концентриране на дисперсиите, при което известна част от дисперсната
среда се отстранява или се подменя с по-малко количество нова дисперсна
среда. Частично или изцяло дисперсната среда може да бъде отстранена
и чрез изпарение под вакуум. В някои случаи дисперсията може да бъде
49
охладена с цел контролирана кристализация на разтворителя, при което

дисперсията се концентрира след отстраняване на кристалите.
Следва да се има предвид, че при всички методи за концентриране на
дисперсиите съществува вероятност за дестабилизиране и коагулация на
диспергираните частици. Вероятността за удари между частиците нара-
ства при повишаване на частичковата концентрация, което може да бъде
предпоставка за ускоряване на коагулацията при нестабилни дисперсии.
В случаите, при които дисперсната среда съдържа електролити, при изпа-
рение на разтворителя се повишава електролитната концентрация, което
може да повлияе стабилността на частиците, особено в случаите на елек-
тростатично стабилизирани наноколоиди. Чрез центрофугиране и ултра-
филтруване могат да се концентрират колоидни дисперсии, при което се
избягва повишаването на концентрацията на разтворимите компоненти на
дисперсната среда, което се получава, ако се отстрани само част от разтво-
рителя чрез изпарение. Както при всички методи за концентриране на
наноколоидни дисперсии, така и при центрофугирането съществува въз-
можност за агрегиране на частиците (възможно е слепване на частиците
на дъното на центрофужните епруветки). При изпарителните методи
следва внимателно да се контролира температурата, тъй като някои водни
дисперсии са нестабилни при нагряване.
4.2. Сушене
В някои случаи се налага сушене на колоидните дисперсии, т.е. мак-

симално пълно отстраняване на разтворителя. Сушене на дисперсиите се
налага при подготовка на проби за анализ, при който се изисква пробата
да е в сухо състояние, например при изследвания чрез прахова рентгенова
дифракция, инфрачервена спектроскопия в KBr таблетки, термични мето-
ди за анализ и други. От друга страна, някои нанолекарствени формули-
ровки е необходимо да бъдат изсушени с цел дълготрайно съхранение на
наночастиците и запазване на лекарственото вещество, особено в случаи-
те, при които лекарственото вещество хидролизира под действие на вода-
та в дисперсната среда. В изсушената дисперсия е трудно развитието на
микроорганизми, които често изискват определена минимална влажност
на средата.
В голяма част от случаите, особено при дисперсиите, изсушени чрез
лиофилизация или разпрашително сушене (spray drying), частиците на
дисперсната фаза могат успешно да бъдат редиспергирани в съответния
разтворител. Някои наноструктури, като например някои липозоми, са
нестабилни при сушене.
50
4.2.1. Лиофилизация
Лиофилизацията (lyophilisation, cryodesiccation или freeze-drying) е

процес на сушене (дехидратация), който цели отстраняване на водата,
съдържащата се в даден материал, с цел дълготрайно съхранение, стаби-
лизация на материала и/или улеснено транспортиране. При лиофилиза-
цията разтворът или дисперсията се замразява и водата се отстранява чрез
сублимация (преминаване от твърда в газова фаза) под вакуум. Процесът
намира широко приложение във фармацевтичната, хранително-вкусовата
промишленост, биотехнологичните производства и др.
Процесът се провежда в устройства, наречени лиофилизатори, най-
общо по следния начин. Дисперсията, подлагана на лиофилизация, е жела-
телно да бъде максимално концентрирана (но стабилна) и да се осигури
възможно най-голяма повърхност за бързо протичане на процеса. Към
дисперсията обикновено се прибавят вещества, които намаляват необра-
тимото слепване между частиците на дисперсната фаза при замразяване-
то, наречени криопротектори (глюкоза, манитол, захароза и др.). Охлаж-
дането трябва да стане под тройната точка на разтворителя при такова
налягане и температура, при които са в равновесие твърдата и газовата
фаза, за да се избегне разтопяване на замразената дисперсия при понижа-
ване на налягането. В лабораторни условия водните дисперсии обикнове-
но се замразяват в бани от сух лед и етанол (при около –50 °C до –80 °C).
Замразяването на дисперсиите е от ключово значение за провеждане на
успешна лиофилизация без значително агрегиране на частиците и осигу-
ряване на обратимо редиспергиране на получения лиофилизат. За тази цел
следва да бъдат подходящо оптимизирани условията на замразяване (ско-
рост на замразяване, температура, подбор на подходящи криопротектори
в оптимални концентрации). При контролирано понижаване на налягане-
то (<0,1 torr) ледът сублимира, като парите се охлаждат от хладник при
около –50 °C, за да предпази вакуум-помпата от попадане на вода. След
лиофилизацията полученият материал се съхранява в плътно затворен
съд. По време на процеса топлината на сублимация се компенсира с леко
нагряване на пробата във вакуум камерата или от топлината на околната
среда, ако пробата е поставена в колба, свързана към вакуума (фиг. 2.7)
(Ward and Matejtschuk, 2019).
Лиофилизираните материали лесно се хидратират и диспергират,
което е особено важно за някои фармацевтични препарати. Обикновено
на лиофилизация се подлагат фармацевтични продукти, нестабилни във
водни разтвори, които под лиофилизирана форма могат да се съхраняват
с години. В тази категория попадат и някои наноколоидни лекарствени
51
форми. Основен проблем при получаването на лиофилизирани наночас-

тици е оптимизирането на условията, при които агрегацията на частиците
е минимална, така че при редиспергиране на лиофилизирания продукт във
вода да не се съдържат агрегати.
Фиг. 2.7. Схематична илюстрация на лиофилизатор
4.2.2. Разпрашително сушене
Някои наноколоидни формулировки могат да бъдат изсушени и чрез

процедура, известна като разпрашително сушене (spray drying). При този
метод разтворът, подлаган на сушене, се диспергира на фини капчици
чрез пулверизатор в поток от горещ въздух или инертен газ (азот, аргон).
Получените при пулверизирането капки са с размери обикновено <200
µm. При по-малък размер на капчиците разтворителят се изпарява по-
бързо (поради по-голямата обща повърхност), като това определя отно-
сително голямата производителност на метода. Полученият след изпаре-
ние на разтворителя прахообразен продукт (с размери на частичките обик-
новено <20 µm) се улавя чрез циклонен или високоволтов електроста-
тичен прахоуловител (фиг. 2.8). Получените с разпрашително сушене
нанопрахове се проучват и за потенциално инхалационно приложение
(Malamatari et al., 2020).
Недостатък на метода се явява високата температура на изсушаващия
газ, което може е проблем при сушене на системи, чувствителни към
нагряване. В тези случаи може да се понижи температурата и да се увели-
чи обемът на сушилната камера, съответно времето на престояване на
52
капките в камерата, и/или да се понижи налягането в камерата с цел уско-

ряване на изпарението. Методът намира приложения във фармацев-
тичната, хранително-вкусовата промишленост и в други индустриални
производства на сухи прахообразни материали.
Фиг. 2.8. Схематична илюстрация на разпрашителна сушилня: 1) вход за газов поток; 2)

нагревател; 3) вход за течната дисперсия (или разтвор); 4) пулверизатор; 5) фини капки; 6)
прахообразен продукт; 7) циклонен прахоуловител; 8) изход за газов поток
5. СТЕРИЛИЗАЦИЯ
За биомедицинските приложения на наночастичкови дисперсии в по-

вечето случаи е необходимо системите да бъдат стерилизирани, т.е. да
бъдат отстранени или убити всички форми на микробиален живот (виру-
си, бактерии, гъби, спорови форми и др.). Стерилността на дисперсиите е
от особено значение при парентерални нанолекарствени форми. Стерил-
ността на дисперсните системи е важна и с цел тяхното дълготрайно
съхранение, при което следва да бъдат запазени свойствата и състава им,
тъй като определени микроорганизми могат да се развиват в дисперсната
система, използвайки някои от компонентите за източник на хранителни
вещества. Стерилизация може да се постигне чрез прилагане на топлина,
химични вещества, йонизиращо лъчение или филтруване, както и чрез
подходяща комбинация от тези методи. От особено значение за подбора
на най-подходящия метод за стерилизация са физикохимичните свойства
на системата, която трябва да бъде стерилизирана (Vetten et al., 2014).
53
5.1. Термична стерилизация
Термичната стерилизация бива суха и влажна. Сухата стерилизация се

провежда във въздушен стерилизатор обикновено за няколко часа при
160–170 °C. Влажната (парна) стерилизация се провежда за 15–30 минути
под налягане в автоклав с въздух и водни пари при 121 °C. Изваряването
във вода (при 100 °C) за същото време не е достатъчно за убиването на
множество бактериални и гъбни спори и е неподходящо за пълна стери-
лизация. Термичната стерилизация е неприложима при термочувстви-
телни материали (полимери, някои липиди, някои биологично активни
вещества). Освен това разтворимостта на полиетоксилираните нейоно-
генни ПАВ (които често се използват за получаване на полимерни мицели
за лекарствено доставяне или като стабилизатори на хидрофобни нано-
частици) намалява с повишаване на температурата, което може да доведе
до помътняване и дестабилизиране на дисперсиите.
5.2. Химична стерилизация
За стерилизиране може да се приложи обработка с определени вещест-

ва (стерилизанти, дезинфектанти), като някои алдехиди (формалдехид,
глутаров алдехид), озон, водороден пероксид, етиленов оксид и други.
Също така, ограничение на химичната стерилизация се явява високата
реактивност на използваните за целта вещества, които могат да реагират
с компонентите на дисперсията и да променят съществено състава и ста-
билността на частиците. Някои наночастичкови дисперсии се характери-
зират с антимикробна активност и могат да се съхраняват без да се развият
бактерии, например дисперсиите на сребърни наночастици.
5.3. Стерилизация чрез микрофилтруване
Отстраняването на микроорганизми от дисперсии на наноструктури,

съдържащи компоненти, които са чувствителни на топлина, химични
агенти и лъчения може да се осъществи чрез микрофилтруване, при което
дисперсията се прекарва през стерилна филтърна мембрана с големина на
порите ≤ 200–450 nm. В този случай обаче се отстраняват ефективно само
бактериите, микроскопичните гъби и водорасли, но не и по-малките виру-
си. Стерилизацията чрез филтруване е подходяща за дисперсии, при които
размерът на наноструктурите е достатъчно малък, за да позволи премина-
ване през порите на филтърните мембрани (<150 nm), например при
мицеларните разтвори, полупроводниковите наночастици (QDs) и др.
54
Някои наночастици, макар и достатъчно малки, могат да се адсорбират и

задържат по филтърните мембрани.
5.4. Лъчева стерилизация
Като най-подходяща и универсална за използване при почти всички

видове наночастичкови дисперсии се явява лъчевата стерилизация. Из-
ключения правят дисперсиите, при които някой от компонентите се явява
нестабилен и претърпява химично превръщане под действието на изпол-
званото лъчение. При този вид стерилизация най-често се прилагат гама-
лъчи, ултравиолетови (UV), електронни и рентгенови (X-rays) лъчи. Общо
неудобство на лъчевите методи е необходимостта от специални предпаз-
ни мерки за персонала, особено при работа със силно йонизиращи лъче-
ния (гама и рентгенови лъчи). Стерилизацията с ултравиолетови лъчи се
провежда чрез облъчване с живачна лампа с дължина на вълната на излъч-
ваната светлина 254 nm. Недостатъците на метода се явяват непропускли-
востта на обикновеното стъкло за UV-лъчи (дисперсия следва да е поста-
вена в кварцов съд), силното разсейване на ултравиолетовите лъчи от
колоидните дисперсии и невъзможността лъчението да проникне с доста-
тъчен интензитет в дълбочина на пробата. Също така следва да се има
предвид, че ултравиолетовите лъчи могат да инициират разнообразни
фотохимични реакции при някои от компонентите на пробата. При облъч-
ване с гама-лъчи обикновено доза от >15–20 kGy (1 Gy = 1 J/kg) е доста-
тъчна за стерилизация. Като източници на гама-лъчи служат радиоактив-
ни изотопи, най-често кобалт-60 (60Co) или цезий-137 (137Cs). Йонизира-
щите лъчения (гама-лъчи, рентгенови лъчи) могат да предизвикат йониза-
ция и химични реакции на разпадане в пробите. Недостатък на гама-
източниците е също невъзможността да бъдат изключени когато не се
използват, което налага използване на специални камери за съхранение на
радиоактивния източник. Останалите източници на лъчения (рентгенови,
UV, електронни) могат да бъдат изключени. Облъчването на пробите с
рентгенови или гама-лъчи не ги прави радиоактивни.
РЕЗЮМЕ
Методи за получаване. Различават се няколко подхода при получаването на коло-
иди, в т.ч. наночастици: дисперсионни (top-down), кондензационни (bottom-up) и
дисперсионно-кондензационни (метод на Бредиг, лазерно разпрашаване). Конденза-
ционните методи са най-прилагани, тъй като по същество включват всички нанопре-
ципитационни (утаителни) процеси и „мокри“ (протичащи в течна среда) химични
55
реакции с получаване на наночастици. Известни са плазмохимични и пиролизни

методи, но по-рядко намират приложение за биомедицината. При биосинтетичните
методи се използват микроорганизми или извлеци от растителни суровини. В почти
всички методи се прилагат колоидни стабилизатори, най-често органични амфифил-
ни вещества, които остават адсорбирани по повърхността на получените наночасти-
ци. При разпрашаването на метали с лазер в течна среда се получават чисти от орга-
нични примеси метални наночастици.
Пречистване и разделяне. При диализа нискомолекулните компоненти на диспер-
сията дифундират през пореста мембрана, която е пропусклива за молекулите на раз-
творителя и нискомолекулните вещества, но не пропуска частиците на дисперсната
фаза. При ултрафилтруването дисперсната среда се разделя от дисперсната фаза чрез
филтърни мембрани с много фини пори (10–100 nm) чрез прилагане на налягане над
дисперсията и/или вакуум под филтърната мембрана. При друг вариант се използват
микроцентрофужни филтри, при които под действие на центрофужна сила филтратът
се събира в епруветка по време на центрофугиране. За разделяне на наночастици от
нискомолекулни компоненти в дисперсната среда се използва гел-филтруване, при
което нискомолекулните примеси се задържат при преминаване на дисперсията през
хроматографска колона с порести гелни гранули (примесите се задържат в порите на
гранулите, а наночастиците преминват през колоната). За разделяне на наночастиците
от дисперсната среда с центрофугиране се използват високооборотни центрофуги.
При диференциалното центрофугиране полидисперсна проба, съдържаща наночасти-
ци с различни размери, може да се раздели на фракции чрез етапно повишаване на
скоростта (оборотите) и времетраенето на центрофугирането, като при всеки следващ
етап на центрофугиране се подлага супернатанта от предходния етап. За екстракция
на наночастици от една в друга фаза (при което онечистванията остават в изходната
фаза) се използват лиганди с подходяща полярност и сила на свързване с повърхност-
та на наночастиците.
Модифициране и биоконюгация. Чрез химична модификация на повърхността на
наночастиците се осигурява диспергируемост във водна среда, колоидна стабилност
и възможност да свързване с биологични молекули (биоконюгация). Вещества с оп-
ределени функционални групи могат да бъдат въведени по повърхността на части-
ците в самия процес на получаването им или постсинтетично, чрез лиганден обмен,
химична модификация на повърхността или включване на наночастиците в мицели
от амфифилни вещества с желаните функционални групи. Конюгацията с биологични
молекули често е ковалентна (чрез карбодиимидни реакции, клик-реакции и др.), но
може да е електростатична или основана на друг вид взаимодействия.
Концентриране и сушене. Ултрафилтруване, центрофугиране и екстракция могат да
се използват и за концентриране на дисперсиите, при което известна част от дисперс-
ната среда се отстранява или се подменя с по-малко количество нова дисперсна среда.
Част от дисперсната среда може да бъде отстранена чрез изпарение или кристализа-
ция. Следва да се има предвид, че при концентриране на дисперсиите съществува
вероятност за дестабилизиране и коагулация на частиците. За изсушаване (почти
пълно отстраняване на разтворителя) се прилагат най-често лиофилизация (сублима-
ционно сушене) или разпрашително сушене. Получаването на нанопрахове чрез раз-
прашително сушене е важно не само за дълготрайното съхранение на чувствителни
към влага материали, но и за получаване на нанолекарствени форми за инхалационно
приложение.
56
Стерилизация. Стерилността на нанодисперсиите за биомедицината е важна за оси-

гуряване на дълготрайното им съхранение, както и за приложението им, особено на
парентералните нанолекарствени форми. Класическата термична стерилизация често
е неприложима поради нестабилност при нагряване на много от дисперсиите и особе-
но на някои органични наноструктури. Като най-използвана се явява радиационната
(най-често с гама-лъчи) стерилизация, но трябва да се има предвид възможността за
протичане на химични промени в материалите, индуцирани от йонизиращото лъче-
ние.
57
Глава 3
ФИЗИКОХИМИЧНИ СВОЙСТВА И МЕТОДИ
ЗА АНАЛИЗ
Оптични свойства (разсейване на светлина, методи за анализ на основата на

светоразсейването, абсорбция и абсорбционна спектроскопия, флуоресцен-
ция и флуоресцентни методи). Електрични свойства (повърхностен заряд,
двоен електричен слой, електрофореза и методи за анализ, електрокинети-
чен потенциал). Седиментация и аналитично ултрацентрофугиране. Коло-
идна стабилност (механизми на стабилизация, агрегация, методи за изслед-
ване на колоидната стабилност).
1. ОПТИЧНИ СВОЙСТВА
1.1. Разсейване на светлина
При пропускане на лъч светлина през хетерогенна дисперсна система

(в т.ч. колоидни и нанодисперсии), светлината се разсейва поради разли-
ката в коефициентите на пречупване на дисперсната фаза и дисперсната
среда. Разсейването на светлина от колоидните дисперсии се нарича тин-
далов ефект (Tyndall effect), който е по-силно изразен при по-голям раз-
мер на частиците и при по-голяма разлика в коефициентите на пречупване
(фиг. 3.1). Пречупването и отразяването на светлинните лъчи от частици-
те е причина за опалесценцията и мътността на колоидните дисперсии.
Теоретично описание на светоразсейването от частици много по-мал-
ки от дължината на вълната на светлината е дадено за пръв път от Лорд
Рейли (John William Strutt, 3-ти Барон Рейли, Lord Rayleigh; наричан също
Релей) (Strutt, 1871). Приближението е валидно за частици, които са много
58
Глава 3. Физикохимични свойства и методи за анализ
по-малки (поне 10 пъти) от дължината на вълната. Разсейването е обрат-

нопропорционално на четвъртата степен на дължината на вълната (~λ−4),
което означава, че светлина с по-къса вълна (например синя светлина) ще
се разсейва много по-силно от светлина с по-дълга вълна (например чер-
вена светлина). При по-големи частици, съизмерими с дължината на свет-
линната вълна, разсейването на Рейли преминава в разсейване на Ми (по
името на немския физик Gustav Mie) (Mie, 1908).
Фиг. 3.1. Разсейване на лазерна светлина от дисперсия на сребърни наночастици (разреден

коларгол в бехерова чаша, снимана отгоре): 1) дисперсия; 2) лазерен източник (λ=650 nm);
3) разсеяна светлина от преминал през дисперсията лазерен лъч
След средата на ХХ век изследването на разсеяната светлина от коло-

идни дисперсии и разтвори на макромолекулни вещества се използва за
получаване на ценни данни за големината и формата на частиците, както
и за молекулната им маса (за полимерни молекули) (Xu, 2002; Berne and
Pecora, 2000; Bohren and Huffman, 1998).
1.2. Методи за анализ на основата на светоразсейването
1.2.1. Ултрамикроскоп
Разсеяната от колоидни частици светлина може да се наблюдава с кон-

струирания от Richard Zsigmondy и Henry Siedentopf ултрамикроскоп око-
ло 1902 г, докато са работили за фирмата Цайс (Zeiss) в Германия. През
1925 година Richard Zsigmondy взима Нобелова награда за химия за
изследванията му в областта на колоидите, голяма част от които са про-
ведени с ултрамикроскопа. При този микроскоп се използва интензивен
59
светлинен източник (лазер в по-съвременните варианти), светлината от

който се пропуска през тесен процеп, фокусира се и се прекарва през
кювета с изследваната дисперсия (фиг. 3.2). На 90° спрямо светлинния
лъч се разполага обектива на обикновен оптичен микроскоп, с който се
наблюдават частиците на дисперсната фаза като движещи се (брауново
движение) светещи точки на тъмен фон. Образът на частиците в ултра-
микроскопа не отговаря на действителните им големина и форма, а се
наблюдават като точкови източници на разсеяна светлина. Ако се знае
обема на наблюдаваната част от дисперсията, с ултрамикроскопа може да
се установи директно концентрацията на частици в дисперсията. Удобен
за тази цел е поточният ултрамикроскоп на Дерягин и Власенко. Разсея-
ната светлина от частиците на дисперсната фаза може да се наблюдава
също с обикновен оптичен микроскоп в режим на тъмно поле. За тази цел
се използва тъмнополев кондензор, чрез който наблюдавания обект се
облъчва със светлина по такъв начин, при който светлината преминава
през обекта без да попада директно в обектива, в който попада само разсе-
яна от частиците светлина (например чрез т.нар. кардиоиден кондензор).
При наблюдение на молекулни разтвори зрителното поле на микроскопа
е тъмно, а в присъствие на колоидни частици върху тъмното поле се
открояват светещи точки.
Фиг. 3.2. Схематично представяне на ултрамикроскопски принцип за наблюдение на

колоидни частици чрез странично осветяване на дисперсията с източник на силна светли-
на и наблюдение на разсеяната от частиците светлина с микроскоп на тъмно поле
Най-малките частици, при които може да се наблюдава разсеяната

светлина чрез ултрамикроскоп и тъмнополев микроскоп, са ~10–20 nm
60
(фиг. 3.3). Тези частици обаче трябва да могат силно да разсейват светли-
на (при достатъчно интензивен светлинен източник), каквито са метални-
те наночастици. За да се наблюдават частици, които по-слабо разсейват
светлината, размерът им трябва да бъде значително по-голям.
Фиг. 3.3. Сребърни наночастици (~20 nm) от коларгол при наблюдение с микроскоп в
режим на тъмно поле с обектив 40х и кардиоиден тъмнополев кондензор. Частиците се
виждат като точкови източници на отразена светлина и извършват брауново движение,
при което по-големите частици се движат по-бавно в сравнение с по-малките. Светлите
точки не съответстват на реалните размери на частиците, които представляват точкови
източници на разсеяна светлина (снимка: Г. Йорданов)
1.2.2. Траекторен анализ на наночастици
При наблюдение на колоидна дисперсия чрез ултрамикроскоп се уста-

новяват множество хаотично движещи се частици. Това движение на час-
тиците е известно като брауново движение (Brownian motion) по името на
ботаника Робърт Браун (Robert Brown), който наблюдава това явление
през 1827 г.). Движението на брауновите частиците се явява резултат от
обмен на кинетична енергия при сблъсъците между тях и движещите се
молекули на дисперсната среда. Това обяснение на брауновото движение
е дадено от Айнщайн през 1905 г. (Einstein, 1905), а опитно доказателство
за такова тълкуване е дадено от Жан Перен през 1909 г. (Perrin, 1909;
Newburgh et al., 2006). Дифузионният коефициент (D) на колоидна час-
тица може да се свърже с изменението на положението на частицата по
61
оста x (означено като Δ), извършено за време t, чрез следното уравнение,

дадено от Айнщайн:
2
D (3.1)
2t
Приравнявайки уравнение (3.1) с уравнението на Стокс–Айнщайн

(Stokes–Einstein) за сферични частици, се получава:
2 RT
 (3.2)
t N A 3r
Тук NA е числото (константата) на Авогадро (Avogadro), R е универ-

салната газова константа, T е абсолютната температура, η е вискозитетът
на дисперсната среда, r е радиусът на частицата.
С помощта на това уравнение Жан Перен провежда класическите си
експерименти (1909 г.) за определяне числото на Авогадро, при които
отместването Δ е било определено чрез ултрамикроскоп, а радиусът на
частиците е бил определен чрез седиментационен метод. Обратно, при
известно число на Авогадро, вискозитет и температура на дисперсната
среда, методът може да се използва за определяне размера на частиците.
По-малките частици се характеризират с по-голям дифузионен коефи-
циент, съответно се движат с по-висока скорост в дисперсната среда.
Този принцип стои в основата на траекторния анализ на наночастици
(Nanoparticle Tracking Analysis), при който се прилага принципът на ул-
трамикроскопа чрез оптичен микроскоп със специална кювета за частич-
ковата дисперсия, през която се пропуска лазерен лъч (фиг. 3.4). Разсеяна-
та от движещите се частици светлина попада в обектива на микроскопа и
движението им се записва от видеокамера, а получените данни се обра-
ботват софтуерно за изчисляване размера на всяка отделна проследена
частица (при положение, че са налични данни за вискозитета и темпера-
турата на дисперсната среда по време на измерването). Чрез обработка на
данните за достатъчно голям брой частици се получава хистограмата на
разпределението им по размери. Методът има предимство пред DLS (вж.
§1.2.5) с това, че дисперсията се наблюдава директно визуално и че се
получават бързо (в реално време) данни за дифузионния коефициент и
размера на всяка отделна частица от разпределението без необходимостта
от сложна математическа обработка на сумарния сигнал от светоразсей-
62
ването. Полученото разпределение по размери е реално, с висока раздели-

телна способност, тъй като размерът за всяка отделна частица се прибавя
поотделно към разпределението и не е нужно познаването коефициентите
на рефракция на дисперсната фаза и дисперсната среда. В допълнение,
може директно да се определи частичковата концентрация в дисперсията,
тъй като е известен обемът на дисперсията, която се наблюдава. Възмож-
но е да се наблюдава движението на флуоресцентни наночастици, ако се
използва лазер с подходяща дължина на вълната. Недостатък на метода се
явава това, че много малки частици (под 20–30 nm в диаметър) не могат
да бъдат детектирани, като тази долна граница на детектиране е достижи-
ма само за силно разсейващи светлината (като например метални – сре-
бърни и златни) наночастици.
Фиг. 3.4. Принцип на траекторния анализ на наночастици
При траекторния анализ съществува възможност за определяне на

електрофоретичната мобилност и съответно на ζ-потенциала на частиците
чрез наблюдение на движението им в електрично поле (вж. §2.3).
1.2.3. Нефелометрия
Нефелометрията е метод за анализ, при който се измерва интензитета

на светлина, разсеяна от частиците на дисперсната фаза, като детекторът
за разсеяната светлина обикновено е разположен на 90° спрямо светлин-
ния лъч от източника (фиг. 3.5). Наименованието на метода произлиза от
гръцката дума „nephos“, означаваща „облак“, съответстващо на приложе-
нието му за измерване на аерозоли и мътни дисперсии. Нефелометрията
63
се предпочита при изследване на разредени дисперсии, докато турбиди-

метрията се прилага при по-концентрирани дисперсии (вж. §1.2.4). Пред-
почита се използване на разредени дисперсии, за да се минимизира вто-
рично разсейване. При релеево разсейване интензитета на разсеяната от
дисперсията светлина Ir, отнесена спрямо интензитета на падащия светли-
нен поток I0, може да се свърже с концентрацията С и диаметъра на
сферични частици (D) в изследваната проба чрез следното уравнение (Ю.
Ляликов, Физико-химические методы анализа, 1964 г., с. 69):
Ir D6
 kC 4 (3.3)
I0 
В това уравнение λ е дължината на вълната на използваната светлина, к е

константа, която зависи от коефициентите на пречупване на средата и
частиците, от разстоянието до частиците, както и от ъгъла образуван от
падащата и разсеяната светлина, които параметри обикновено са посто-
янни за дадена изследвана система. За частици с постоянен размер и при
постоянна дължина на вълната интензитетът на разсеяната светлина ще е
правопропорционален на частичковата концентрация, която може да бъде
определена по този начин чрез предварително построена калибровъчна
крива.
Фиг. 3.5. Измерване на разсеяната светлина при нефелометрията
Нефелометрията намира приложение в имунологията (за определяне

на антитела или антигени на основата на образуването на комплекси
антиген–антитяло, които разсейват светлина), за определяне на частичко-
ви замърсявания във води и въздух, за детектиране на дим (детектори за
пожар) и др.
64
1.2.4. Турбидиметрия
Турбидиметрията е метод за анализ, при който се измерва намалява-

нето на интензитета на монохроматична светлина при преминаването ѝ
през колоидна дисперсия вследствие на разсейването от частиците на дис-
персната фаза. При турбидиметрията се измерва трансмисията на светли-
на T% = It.100/I0 или оптичната плътност (подобно на абсорбцията на свет-
лина; A = lg(I0/It)) чрез абсорбционен спектрофотометър или турбидиме-
тър. Поради трудностите при точното измерване на малки разлики между
два интензивни сигнала, турбидиметрията се предпочита при изследване
на по-концентрирани дисперсии, за разлика от нефелометрията, която е
по-подходяща за по-разредени дисперсии. При релеево разсейване интен-
зитета на преминалата през дисперсията светлина It, отнесена спрямо ин-
тензитета на падащия светлинен поток I0, може да се свърже с концентра-
цията С и диаметъра D на частиците в изследваната проба чрез следното
уравнение (Ляликов, Физико-химические методы анализа, 1964 г., с. 69):
I0 D3
lg  klC 4 (3.4)
It D  4
В това уравнение λ е дължината на вълната на използваната светлина, к и

α са константи, които зависят от природата на дисперсията и метода на
измерване. За частици с постоянен размер и при постоянна дължина на
вълната, оптичната плътност ще е правопропорционална на частичковата
концентрация, която може да бъде определена по този начин чрез предва-
рително построена калибровъчна крива.
При постъпване на монохроматичен лъч светлина с интензитет I0 в
колоидна дисперсия интензитетът на лъча отслабва по посока на разпро-
странението му вследствие на разсейването. Отслабването на интензитета
на лъча до стойност I се изразява чрез следната зависимост:
I  I 0 exp( N .l. ) (3.5)
Където N е бройната концентрация на частиците в единица обем, l е

дължината на кюветното пространство, през което преминава лъча, а σ е
турбидитетен коефициент (коефициент на мътност или на разсейване),
който зависи от размера на частиците, дължината на вълната и природата
на дисперсията. Тази зависимост наподобява закона за абсорбция на свет-
лина (на Буге–Ламберт–Беер), но за разлика от абсорбцията светлинната
65
енергия се разсейва. Турбидиметричните измервания следва да се про-

веждат при такива дължини на вълната, при които частиците или други
компоненти на дисперсната среда не поглъщат светлина. Когато намале-
нието в интензитета на светлината, преминала през дисперсията, се дължи
само на разсейване, е валидна следната зависимост на турбидитетния кое-
фициент от дължината на вълната λ:
  k s (3.6)
В това уравнение s е параметър, зависещ по сложен начин от размера

на частиците и природата на дисперсията, и не зависи от частичковата
концентрация. Тази зависимост може да се определи експериментално за
даден вид частици в определена дисперсна среда. Параметърът s се опре-
деля чрез изследване зависимостта на оптичната плътност (еквивалентна
на екстинкцията Е) на дисперсията от дължината на вълната λ на изпол-
званата светлина чрез спектрофотометър (Bateman et al., 1959):
lg Е  s lg   const (3.7)
Зависимостта, изразена чрез уравнение (3.7), е линейна при частици

съизмерими и по-малки от дължините на вълната, при които се провежда
измерването, като при много малки частици (например при D<50–100 nm)
стойността на s става практически равна на 4, каквато се очаква при ре-
леево разсейване. При по-големите частици s<4 и зависи по сложен начин
от размера на частиците.
Турбидиметрията намира рутинно приложение в имунологичните из-
следвания за определяне на протеини в биологични течности на основата
на образуване на комплекси антиген–антитяло. При имунотурбидимет-
ричния метод се използват латексни частици, модифицирани с антитела,
които свързват специфично изследвания протеин и аглутинират. Получе-
ните агрегати разсейват светлина и се определят с турбидиметър. Турби-
диметрично се определя и концентрация на клетки, най-често бактерии, в
течна среда. При тези измервания за калибриране се използват стандартни
суспензии, например класическите суспензии от бариев сулфат, предло-
жени още от McFarland (1907). По-съвременните стандарти за мътност в
турбидиметрията съдържат латексни частици с определена големина и
концентрация.
66
1.2.5. Динамично светоразсейване (DLS)
Динамичното светоразсейване (Dynamic Light Scattering, DLS; Photon

Correlation Spectroscopy, PCS; или Qausi-Elastic Light Scattering, QELS)
представлява техника, чрез която може да се определи разпределението
по размери на субмикронни частици в дисперсия, дифузионните им кое-
фициенти, молекулна маса на полимери в разтвор и др. Хаотичното брау-
ново движение на диспергираните частици предизвиква флуктуации в
локалната им концентрация и съответно локални флуктуации в показате-
ля на пречупване на средата. При преминаване на лазерен лъч през такава
среда част от светлината ще бъде разсеяна от тези флуктуации. Информа-
ция за коефициента на дифузия на частиците се съдържа в зависещата от
времето т.нар. корелационна функция на разсеяната светлина. Ако е известна
формата на частиците, размерът им може да бъде изчислен с използване на
съответни формули. За сферични частици връзката между дифузионния
коефициент D и радиуса R на частиците се дава от уравнението на Стокс–
Айнщайн (Stokes–Einstein):
k BT
D (3.8)
6R
Тук T е абсолютната температура, kB е константата на Болцман, η е

вискозитетът на средата.
Принципна схема на получаване на информация за размера на колоид-
ни частици чрез DLS анализ е показана на фиг. 3.6. Лазерен лъч облъчва
изследваната проба, при което се регистрират флуктуациите в интензите-
та на разсеяната светлина като функция на времето. Флуктуациите в
интензитета на разсеяната светлина се измерват чрез детектор (фотоумно-
жител), разположен под ъгъл спрямо лазерния лъч (обикновено 90°).
Данните постъпват в корелатор, където се обработват по подходящ начин,
при което се получават данни за дифузионния коефициент и разпределе-
нието по размери. Обработката на експерименталните данни е сравнител-
но проста при разсейване от монодисперсни сферични частици. При
полидисперсни образци интерпретацията на експерименталните данни се
усложнява. Могат да бъдат получени няколко параметъра на полидис-
персното разпределение: среден размер на частиците, ширина на разпре-
делението и асиметрия на разпределението по размери. Чрез DLS анализ
на светоразсейването от дисперсии на частици с известен размер може да
се определи вискозитета на течността, в която са диспергирани частиците.
При използване на електрофоретична кювета за дисперсията може да бъде
67
получена информация за електрокинетичните свойства на частиците (вж.

§2.3). Подробна информация за различните методи и алгоритми, изпол-
звани при получаването на тези данни, може да бъде намерена в специали-
зираната литература (Berne and Pecora, 2000). Примерно типично разпре-
деление по размери на полибутилцианоакрилатни (РВСА) частици, полу-
чено чрез DLS анализ, е показано на фиг. 3.7.
Фиг. 3.6. Принципна схема на получаване и обработка на данните при DLS
18
16
14
12
% в клас
10
8
6
4
2
0
0 100 200 300 400
размер, nm
Фиг. 3.7. Типично разпределение по размери на натоварени с еконазол полибутилциано-

акрилатни частици, получено чрез DLS анализ. Частиците са получени чрез емулсионна
полимеризация в присъствие на полисорбат 80
68
1.3. Абсорбция и абсорбционна спектроскопия
Абсорбцията на светлина (А) се свързва с относителното намаление на

интензитета на светлинен лъч монохроматична светлина от начален ин-
тензитет I0 до I при преминаване през проба с дебелина (път на лъча през
пробата) l:
I0
A  lg   .l.C (3.9)
I
В това уравнение С е концентрацията на поглъщащото светлина ве-

щество, а ε се нарича абсорбционен (екстинкционен) коефициент. Този
коефициент зависи от дължината на вълната (която зависимост определя
абсорбционния спектър на веществото), но не зависи от концентрацията
и дебелината на пробата l. Уравнение (3.9) е израз на фундаменталния за-
кон на Буге–Ламберт–Беер (Bouguer–Lambert–Beer), на който са основани
спектрофотометричните методи за анализ (Perkampus, 1992; Kumar, 2013).
Абсорбцията на светлина от частиците на дисперсната фаза зависи от
нейния химичен състав (например от характера на химичните връзки,
наличие на хромофорни групи и др.) или вследствие на проява на специ-
фични свойства при някои неорганични наночастици (метални и полу-
проводникови). Абсорбцията на светлина при металните наночастици се
явява следствие на повърхностния плазмон, докато абсорбцията при полу-
проводниковите наночастици (квантови точки) е следствие от възбужда-
нето на електрони от валентната зона до зоната на проводимост. От абсорб-
ционните спектри може да се получи информация например за формата и
агрегационното състояние при метални наночастици, за размера, кон-
центрацията и разпределението по размери при полупроводниковите нано-
частици, и др. Оптичните свойства на полупроводниковите и металните
наночастици за разгледани по-подробно в Гл. 7 и 8, съответно. Законът на
Буге–Ламберт–Беер е валиден и при абсорбиращи светлина наночастици,
като при постоянна дължина на вълната абсорбцията е пропорционална
на концентрацията на наночастици в изследваната проба (Yu et al., 2003;
Jimenez-Lamana et al., 2014).
Абсорбционните спектрофотометри биха могли да се използват и като
турбидиметри, при което се измерва оптичната плътност на мътни дис-
персии (при условие, че изследваните дисперсии не абсорбират, а само
разсейват светлината).
69
1.4. Флуоресценция и флуоресцентни методи
Флуоресценцията е процес на излъчване на светлина от вещество, кое-

то е абсорбирало светлина или енергия от друго електромагнитно лъче-
ние. При флуоресценцията не се наблюдава промяна в молекулната мул-
типлетност и емисията протича много бързо (~10-9 до 10-7 s) след възбуж-
дането и за окото не е възможно да схване флуоресцентната емисия след
отстраняване на източника на възбуждане, за разлика от фосфоресцен-
цията, при която се променя молекулната мултиплетност и протича като
много по-бавен процес. Интензитетът на флуоресценцията зависи от дъл-
жината на вълната на възбуждащото лъчение и обикновено е максимална,
когато енергията на възбуждащото лъчение съответства на енергията на
максимума в абсорбционния спектър.
Флуоресценцията се измерва чрез флуоресцентен спектометър, при
който пробата се облъчва със светлина с подходяща дължина на вълната,
при което се измерва спектърът на излъчената от пробата светлина (ин-
тензитет на излъчената светлина като функция на дължината на вълната)
(фиг. 3.8) (Lakowicz, 2006).
Фиг. 3.8. Принципна схема на флуоресцентен спектрофотометър
Като светлинен източник се използва ксенонова дъгова лампа или друг

широкоспектърен източник, излъчващ светлина с широк диапазон от дъл-
жини на вълната. Дължината на вълната на възбуждащото лъчение се
подбира с монохроматор (призмен или решетъчен) и се насочва към кюве-
тата с пробата. Кюветите могат да бъдат обикновени, правоъгълни (квар-
цови, с полирани стени, понякога с две съседни огледални стени за по-
добра чувствителност), за едно измерване или проточни. Емитираната от
70
пробата светлина се разлага с втори монохроматор и се измерва с фото-

детектор, разположени на 90° спрямо възбуждащия лъч. Освен флуорес-
центни спектри, могат да се снемат и т.нар. спектри на възбуждане. При
снемане спектъра на възбуждане се измерва интензитетът на флуоресцен-
цията при постоянна дължина на вълната (обикновено отговаряща на
флуоресцентния максимум) като функция на дължината на вълната на
възбуждащото лъчение. Видът на спектъра на възбуждане съответства на
абсорбционния спектър.
Характерна флуоресценция притежават полупроводниковите наночас-
тици, при които дължината на вълната на флуоресцентната емисионна
ивица зависи от размера на частиците. Флуоресценцията при тези частици
е в основата на използването им като флуоресцентни маркери, FRET ана-
лиз и други биомедицински приложения, които са разгледани в Гл. 7.
Някои наночастици могат да бъдат свързани с флуоресцентни вещес-
тва, например полимерни наноносители, натоварени с флуоресцентни
багрила или някои флуоресциращи лекарствени молекули. Такива нано-
частици са видими като светещи точки с флуоресцентен микроскоп (фиг.
3.9) и да бъдат проследени визуално в хода на взаимодействието им с
живи клетки (Diaspro, 2011). Така може да бъде установено вътреклетъч-
ното им разпределение и дори да се получи известна колчествена оценка
за проникването им в клетките (Yordanov et al., 2013).
Фиг. 3.9. Принципна схема на флуоресцентен микроскоп
71
Флуоресцентната спектроскопия може да се използва за определяне

концентрации на флуоресциращи вещества. В тези случаи методът може
да намери приложение при определяне степента на лекарствено натовар-
ване и скорост на освобождаване от наноносители и др. Изследването на
изменението на флуоресцентните спектри и флуоресцентната кинетика
(излъчвателното време на живот) може да даде важна информация за
процесите на взаимодействие и енергиен обмен между флуорофорните
молекули в рамките на наноструктурите.
Поточната цитометрия е друг аналитичен метод, използващ флуорес-
ценция. Чрез нея могат да се преброяват и разделят различни биологични
клетки, намиращи се в суспензия въз основа на свързването им с различни
флуоресцентни маркери. Този метод е разгледан в Гл. 7, §6.6.
2. ЕЛЕКТРИЧНИ СВОЙСТВА
2.1. Повърхностен заряд
При колоидните дисперсии частиците на дисперсната фаза притежават

заряд, чиито произход най-често се явява като следствие от адсорбция на
йони (или йонизиращи се органични молекули) от дисперсната среда и/
или йонизация (дисоциация или протониране) на функционални групи от
повърхността на частиците. Зарядът, дължащ се на йонизиращи се групи,
често зависи от рН на дисперсната среда, тъй като най-често в йонизация-
та участва водороден катион. Например такива групи са карбоксилните
групи (–СООН), които при йонизация дават отрицателно заредени кар-
боксилатни йони (–СОО–), както и амино групите (–NH2), които при про-
тониране дават положително заредени амониеви йони (–NH3+). По повърх-
ността на протеинови наночастици се намират както карбоксилни, така и
амино групи, като степента на тяхната йонизация зависи от рН на средата:
при ниски стойности на рН голяма част от карбоксилните групи ще са не-
йонизирани, докато амино групите ще са протонирани, което обуславя
сумарен положителен заряд на повърхността, и обратно, при високи стой-
ности на рН карбоксилните групи ще са предимно депротонирани, докато
повечето амино групи няма да са протонирани, което обуславя сумарен
отрицателен заряд на частицата. Стойността на рН, при която броят на
положителните и отрицателните заряди се изравнява и общият заряд на
частицата е нула, се нарича изоелектрична точка (isoelectric point, IP).
Когато на повърхността на дисперсната фаза няма йонизиращи се гру-
пи, най-вероятно е зарядът на частиците да се обуславя от адсорбция на
72
определени йони от дисперсната среда. Повечето нейонизиращи се повърх-

ности придобиват отрицателен заряд при контакт с водни среди. Този
факт често се обяснява като следствие от тенденцията анионите от разтво-
ра (които често са по-слабо хидратирани и по-поляризуеми от катионите)
да се адсорбират на фазовата граница в по-голяма степен от катионите.
Възможно е частиците да бъдат модифицирани с молекули, които на свой
ред съдържат йонизиращи се групи (например тиогликолова киселина,
различни полиелектролити и др.), при чиято йонизация възниква електри-
чен заряд. Заредени повърхности проявяват тенденция да адсорбират пре-
ференциално противоположно заредени йони от дисперсната среда. При
силна адсорбция на противойоните е възможно дори обръщане знака на
заряда (например при селективната адсорбция на повърхностно активни
йони, поливалентни йони и полиелектролити).
Повърхностите на частици, изградени от някои йонни вещества, могат
да придобият заряд при контакт с водна среда вследствие на преферен-
циална дисоциация на йоните на веществото в средата. Например AgI,
поставен в контакт с водна среда, придобива отрицателен повърхностен
заряд вследствие на преференциална дисоциация и разтваряне на Ag+
йони (Shaw, 1992, p. 176).
Механизмите на възникване на заряд на частиците в някои полярни
органични разтворители (например нискомолекулни алкохоли), в които е
възможна, макар и частична йонизация на някои вещества и функцио-
нални групи, до известна степен наподобяват тези във водна среда. Някои
колоидни частици могат да имат заряд, който е важен за стабилността на
дисперсията в неполярни органични разтворители. Установено е, че такъв
заряд може да възникне при наличие на донорно-акцепторни взаимодей-
ствия между повърхността на частицата и диспергиращия (стабилизиращ)
агент и/или стерична стабилизация на йоните. Така възникнал заряд може
силно да се повлияе от наличието дори на следи от полярни вещества в
дисперсията (Martin et al., 2010; Lee et al., 2015).
2.2. Двоен електричен слой
За описание на електричните свойства на колоидните частици се из-

ползва представата за двойния електричен слой, формиращ се от повърх-
ността на дисперсната фаза на известно разстояние в дисперсната среда.
Първата представа за възникване на двоен електричен слой при контакт
между твърда и течна фаза е дадена от Херман фон Хелмхолц (Hermann
von Helmholtz) (Helmholtz, 1853). Според този модел срещу плосък слой
от заряди по повърхността на твърдата фаза се образува плосък слой от
73
противоположно заредени йони, като по този начин формираната струк-

тура наподобява плосък кондензатор с дебелина от порядъка на молекул-
ните размери, в рамките на която потенциалната разлика между повърх-
ността на твърдата фаза и дисперсната среда намалява относително бързо.
Впоследствие някои експерименти са показали, че двойният слой би
могъл да прониква по-дълбоко в дисперсната среда. За описание на тези
наблюдения се въвежда представата за дифузионен слой, при който йони-
те, компенсиращи зарядите по повърхността на твърдата фаза, не са под-
редени в слой, а са разпределени дифузно (вследствие на термичното дви-
жение на йоните и молекулите в разтвора) и концентрацията им непрекъс-
нато спада с отдалечаване от повърхността на твърдата фаза, достигайки
постоянната концентрация (равномерно разпределение на йоните), харак-
терна за вътрешността на дисперсната среда. Този модел е описан теоре-
тично от Луис Гуи (Louis Gouy) и Давид Чапмeн (David Chapman) (Gouy,
1910; Chapman, 1913). Според тази теория повърхностният потенциал ψ0
на фазовата граница се изменя плавно до нула във вътрешността на
дисперсната среда.
Ото Щерн (Otto Stern) свързва представите на Helmholtz с тези от
модела на Gouy–Chapman и предлага модел, който по-добре отговаря на
действителността (Stern, 1924). Този модел приема, че йоните с противо-
положен заряд, които компенсират заряда на повърхността на твърдата
фаза, се разпределят в два слоя. Първият е с по-малка дебелина и се раз-
полага близо до повърхността (щернов слой), съответстващ на адсорбира-
ни на повърхността на твърдата фаза противойони. Вторият слой се със-
тои от електростатично привлечени йони и е дифузен. Според модела на
Helmholtz електрическият потенциал между повърхността на дисперсната
фаза и вътрешността на дисперсната среда спада относително бързо в рам-
ките на тънкия адсорбционен слой, докато при модела на Gouy–Chapman
спадът на потенциала в относително дебелия дифузионен слой става по-
бавно. При модела на Stern потенциалната разлика между твърдата фаза
и средата спада стръмно в първия адсорбционен слой, след което намаля-
ва по-бавно в дифузионния слой. При проследяване промяната на елек-
тричния потенциал с отдалечаване от повърхността на дисперсната фаза
могат да се разграничат повърхностен, щернов и електрокинетичен (дзета)
потенциал. Повърхностният потенциал ψ0 съответства на общата потен-
циална разлика между повърхността на твърдата фаза и вътрешността на
дисперсната среда. Щерновият потенциал ψd е потенциалната разлика
между дисперсната среда и външната граница на щерновия слой. Между
щерновата равнина и дифузионния слой следва да се разполага тясна
област, в която се наблюдава бърза промяна в скоростите на движение на
74
йоните и молекулите, наречена равнина на прехлъзване. Потенциалната

разлика между равнината на прехлъзване и вътрешността на дисперсната
среда се означава като електрокинетичен (дзета; ζ) потенциал. Предпо-
лага се, че молекули на дисперсната среда са адсорбирани върху йоните
от щерновия слой и се придвижват заедно с частицата в дисперсната сре-
да. Поради това се очаква, че равнината на прехлъзване се разполага на
малко по-голямо разстояние от щерновата равнина, и следователно ζ-по-
тенциалът е малко по-малък по абсолютна стойност от ψd-потенциала
(фиг. 3.10). В някои приближения обаче се приема, че ψd ~ ζ.
Фиг. 3.10. Схематично представяне на структурата на двойния електричен слой според

модела на Щерн (Stern) в зависимост от разстоянието от повърхността на частицата:
разпределение на йоните (горе); промяна в електрическия потенциал ψ (долу)
При наличие на специфична адсорбция на йони електрическият по-

тенциал в слоя на Stern може да се измени значително. При адсорбция на
поливалентни противойони и/или при силна адсорбция на противойони
(например при адсорбция на повърхностно активни йони, чиито заряд е
противоположен на повърхностния заряд), потенциалът се променя много
бързо и е възможно да промени знака си в рамките на слоя на Stern –
75
наблюдава се т.нар. „презареждане“ на частицата (фиг. 3.11а), при което

ψ0 и ψd имат противоположни знаци. При специфична адсорбция на
повърхностно активни йони, имащи едноименен заряд с повърхността на
дисперсната среда, е възможно ψd да има същия знак, но по-голяма абсо-
лютна стойност от ψ0 (фиг. 3.11б) (Shaw, 1992, p. 183).
Фиг. 3.11. Промяна на електрическия потенциал в двойния електричен слой при специ-
фична адсорбция на йони с: а) противоположен заряд и промяна на знака на потенциала в
щерновия слой; б) едноименен заряд спрямо повърхностния заряд ψ0
Според теорията на Gouy–Chapman за дифузионния слой потенциалът

при потенциали по-малки от 25 mV зависимостта на потенциала (ψ) от
разстоянието (х) в дифузионния слой може да се опише от т.нар. уравне-
ние на Дебай–Хюкел (Debye–Hückel), според което потенциалът намалява
експоненциално с разстоянието (Israelachvili, 2011, p. 313). Ако се приеме,
че дифузионният слой започва от щерновия слой в посока към дисперсна-
та среда (според модела на Stern) и ψd ~ ζ, намаляването на потенциала в
дифузионния слой може да се опише приближено като:
 x   d e  kx  e  kx (3.10)
Дължината 1/k е известна като дебаева дължина (Debye length) и се

явява характеристична дължина на намаляването на потенциала или
„дебелина на слоя“. При разстояние х = 1/k с приближение се получава:
 к   / 2.718
1 (3.11)
За водни разтвори на електролит с еднозарядни (z = 1) йони (например

NaCl) и температура 25 °C (298 K) дебаевата дължина (в nm) зависи от
76
молната концентрация на електролит (M, в mol/l) в дисперсната среда по

следния начин (Israelachvili, 2011, p. 312):
k 1  0.304 / M (3.12)
Например за разтвор на NaCl, 1/k = 30,4 nm при 0,1 mM, 9,6 nm при 1,0
mM, 3,04 nm при 10 mM, 0,96 nm при 0,1 M, и 0,3 nm при 1 M. В чиста
вода при pH 7, дебаевата дължина е 960 nm, или почти 1 µm.
2.3. Електрофореза и методи за анализ
Под електрофореза на колоидни дисперсии се разбира насоченото дви-

жение на частиците на дисперсната фаза спрямо дисперсната среда в при-
съствие на електрично поле. Експерименталните изследвания са показа-
ли, че за електрофорезата е съществен ζ-потенциалът. Движението на час-
тиците се извършва в посока на положителния електрод (анафореза), ако
са натоварени отрицателно и по посока на отрицателния електрод (ката-
фореза), ако са натоварени положително. Движението на колоидни части-
ци в електрично поле може да се демонстрира в U-видна стъклена тръба,
запълнена с колоидна дисперсия, върху която се наслоява индиферентен
електролит (дестилирана вода), в който са потопени инертни електроди
(от платина, злато, въглерод). Експериментална установка от този тип е
предложена за първи път от шведския биохимик Арне Тизелиус (Arne
Tiselius) и носи неговото име (Tiselius, 1937). За своите изследвания върху
електрофорезата през 1948 година Тизелиус е удостоен с Нобелова награ-
да за химия (изследванията му са били съсредоточени основно върху се-
румни протеини). При подаване на постоянно напрежение на електродите
се наблюдава бавно отместване на равнината между колоида и електро-
лита в посока на електрода, който е противоположно зареден спрямо заря-
да (ζ-потенциала) на частиците, откъдето този метод е известен като
метод на подвижната граница. Повечето електрофоретични изследвания
се провеждат във водни среди, но се изследва и въпросът за заредени
наночастици в органични разтворители (Yordanov et al., 2006; Martin et al.,
2010). Подобен експеримент, проведен с полупроводникови наночастици
от CdSe, стабилизирани с трибутилфосфин и диспергирани в толуен, е
демонстриран на фиг. 3.12.
77
Фиг. 3.12. Демонстрация на електрофореза на наночастици от CdSe (стабилизирани с три-

бутилфосфин и диспергирани в толуен) в U-видна тръба и графитови електроди. Частици-
те, видимо по червения цвят на дисперсията, се придвижват към отрицателния електрод
след приложено напрежение от 400 V за 15 часа (експеримент: Г. Йорданов)
2.3.1. Микроелектрофореза
Електрофоретичното движение на наночастици може да се наблюдава

директно чрез ултрамикроскоп. Методът е известен като микроелектро-
фореза и се осъществява чрез ултрамикроскопско наблюдение на частици
в цилиндрична или правоъгълна електрофоретична клетка, към електро-
дите на която се подава постоянно или по-често осцилиращо напрежение
(фиг. 3.13). С това е свързан и основният недостатък на метода – много
сложната картина на придвижването на частиците и течността в затворе-
ната електрофоретична клетка и това, че истинската електрофореза (непо-
влияна от електроосмотични явления) може да се наблюдава само на
определени стационарни нива в клетката. Използването на променливи
електрически полета е предложено от Сведберг и Андерсон (Svedberg and
Andersson, 1919) и позволява значително намаляване поляризацията на
електродите и електролизата, при което преместването на частиците се
наблюдава като осцилации около едно положение и се проектира като
чертички, чиято дължина е пропорционална на електрофоретичната им
скорост. Микроелектрофорезата е в основата на определянето на ζ-потен-
циала при някои по-съвременни ултрамикроскопски апарати, например
при траекторния анализ на наночастици (вж. §1.2.2).
78
Чрез измерване скоростта на придвижване на отделна частица (ν; често

се измерва в микрометри за секунда, µm/s) се определя нейната електро-
форетична подвижност (μе) при известна сила на електричното поле (Е):
e  v / E (3.13)
Силата на електричното поле Е се определя като съотношение на при-

ложеното напрежение към разстоянието между електродите (често се
измерва във волт за сантиметър, V/cm). Така се получава често използва-
ната мерна единица за електрофоретична подвижност µm.cm/V.s.
Фиг. 3.13. Принцип на класически прибор за микроелектрофореза и определяне на елек-

трофоретичната подвижност
2.3.2. Електрофоретично светоразсейване
Електрофоретичната подвижност може да се определи и с електрофо-

ретично светоразсейване (Electrophoretic Light Scattering, ELS), базирано
на динамичното лазерно светоразсейване (DLS; вж. §1.2.5). Принципите,
теорията и апаратурата за електрофоретично светоразсейване могат да бъ-
дат намерени в специализираната литература (Ware, 1974; Josefowicz and
Hallett, 1975; Xu, 2002, p. 289). Най-общо принципът на метода се състои
в следното. В отсъствие на електрично поле частиците извършват брауно-
во движение, докато в електрично поле придобиват насочено движение.
Движещите се в електричното поле частици се облъчват с лазерен лъч,
при което разсейват светлината. Честотата на разсеяната светлина зависи
от скоростта на частиците поради доплерово отместване (Doppler shift).
За точно определяне на доплеровото отместване втори лазерен (референ-
тен) лъч се смесва с разсеяната светлина (фиг. 3.14).
79
Фиг. 3.14. Принцип на електрофоретичното светоразсейване (ELS)
При смесването на двата лъча и обработка на получения сигнал се по-

лучава честотен спектър (разпределение) на доплеровите отмествания на
разсеяната светлина. При известна геометрия на апарата е възможно от
честотното разпределение на доплеровите отмествания да се изчисли раз-
пределението на частиците по скорости. Ако е известна силата на елек-
тричното поле, от разпределението по скорости се получава разпределе-
нието по електрофоретични подвижности, а от него може да се изчисли
разпределението по ζ-потенциали (вж. §2.4).
Друг метод за обработка на данните от електрофоретичното светораз-
сейване е фазовия анализ на разсеяната светлина, PALS (Phase Analysis
Light Scattering). При PALS се измерва фазовото отместване между раз-
сеяната светлина и референтния лазерен лъч. PALS позволява измервания
при висока йонна сила (обикновено >10 mM), но не дава информация за
разпределението, а единична средна стойност. Това означава, че данните
от PALS са валидни само за проби, които са мономодални по отношение
на ζ-потенциала. Друг важен фактор, който трябва да бъде отчетен, осо-
бено при висока йонна сила на дисперсната среда, е поляризацията на
електродите и съответно по-нисък ефективен електричен потенциал меж-
ду тях при електрофорезата, при което изчислените стойности на електро-
форетичната подвижност могат да се окажат по-ниски от реалните. Мето-
дите, основани на светоразсейване, са трудно приложими при по-големи
частици (>100 µm) и частици с ниска стабилност, които се утаяват бързо
в аналитичната кювета и излизат извън обсега на лазерния лъч. Съвремен-
ните апарати за ELS/DLS позволяват измервания при различни темпера-
тури, могат да се оборудват с автоматични титатори за определяне зависи-
мостта на ζ-потенциала от рН, позволяват измерване електропроводност-
та на дисперсията, измервания при висока йонна сила (чрез PALS) и др.
80
2.4. Електрокинетичен потенциал
От измерената електрофоретична подвижност може да се изчисли ζ-

потенциала (даван в mV). В елементарната теория на електрокинетичните
явления при радиус (а) на частицата, който многократно надвишава де-
баевата дължина (1/к), тоест при к.а>>1 може да се приложи приближе-
нието на Smoluchowski, даващо връзка между ζ-потенциала и електрофо-
ретичната подвижност µе (Delgado et al., 2005):

   (3.14)
 r 0 e
В това уравнение, наричано уравнение на Helmholtz–Smoluchowski за

електрофорезата, η и εr са динамичния вискозитет и относителната ди-
електрична проницаемост на средата, съответно. Това уравнение е прило-
жимо за сравнително големи частици във водни дисперсии, съдържащи
електролити (където дебаевата дължина е около няколко нанометра; за
дисперсии с йонна сила на чистата вода уравнението не е валидно). За
малки частици (наночастици) и при относително голяма дебаева дължина
(в разредени дисперсии или такива в неполярни разтворители при к.а<1)
се дава следното уравнение (на Hückel–Onsager):
3
  e (3.15)
2 r  0
В останалите случаи общата връзка между електрофоретичната подвиж-

ност и ζ-потенциала в класическите теории е обобщена чрез следното
уравнение:
3 1
  e (3.16)
2 и  0 f (ka )
В това уравнение f(ka) е известна като функция на Хенри (Henry, 1931),

чиято числена стойност в крайните случаи е ~1,5 при приближение на
Smoluchowski (при по-големи частици и водни среди, съдържащи елек-
тролити) и ~1,0 при приближение на Hückel (при наночастици и разредени
или неводни среди) (фиг. 3.15).
81
Фиг. 3.15. Илюстрация на условията за приложение на уравненията на Hückel и Smoluchowski

за връзка между ζ-потенциала и електрофоретичната подвижност (µ)
Голяма част от експерименталните работи върху електрокинетичните

явления са посветени на зависимостта на ζ-потенциала от електролитната
концентрация. В общия случай повишаването на йонната сила води до
намаляване на дебаевата дължина, свиване на двойния електричен слой и
намаляване на абсолютната стойност на ζ-потенциала (Arias et al., 2001).
Адсорбцията на нейоногенни повърхностно активни вещества върху
електрически заредена повърхност на колоидни частици води до отмест-
ване на равнината на прехлъзване по-далече от повърхността на частицата
и по този начин до намаляване на ζ-потенциала. При адсорбция на амфи-
филни нейоногенни полимери, отместването на повърхнината на прехлъз-
ване е по-голямо при полимери с по-голяма молекулна маса (Barany, 2015).
Зависимостта на ζ-потенциала от рН на средата се определя от вида на
функционалните групи по повърхността на частиците и възможността им
за йонизация, зависеща от рН. Например частици имащи по повърхността
си йонизиращи се групи (карбоксилни групи, амино групи, наночастици
от някои метални оксиди и други) в повечето случаи показват силна зави-
симост на ζ-потенциала от рН, който може да е положителен при ниски
стойности на рН и намалява, преминавайки през нула, достигайки отри-
цателни стойности при по-високо рН (Arias et al., 2001; Angelova and
Yordanov, 2017) (фиг. 3.16).
82
Фиг. 3.16. Зависимост на ζ-потенциала на частици от ферифосфат (FePO4) и алуминиев

фосфат (AlPO4) от рН на средата (вж. Angelova and Yordanov, 2017)
Стойността на рН, при която стойността на ζ-потенциала става нула,

се нарича изоелектрична точка (Isoelectric point, IP). Ако стабилността на
частиците се определя само от електростатично отблъскване (без допъл-
нителна стерична стабилизация), стабилността им в изоелектричната точ-
ка е най-ниска и има вероятност да коагулират. Като общо правило се
смята, че дисперсиите на електростатично-стабилизирани частици стават
нестабилни при ζ-потенциали, които по абсолютна стойност са по-малки
от 20–30 mV. Когато частиците са стерично стабилизирани чрез адсорб-
ция на нейоногенни ПАВ или полимерни колоидни стабилизатори, дис-
персиите могат да са стабилни във времето и при иначе относително
ниски стойности на ζ-потенциала (<10 mV).
Известни са опити за установяване ефекта на ζ-потенциала на наночас-
тици върху адсобцията на протеини (вж. Гл. 5, §2) и биологичната актив-
ност на частиците, което прави тази величина от интерес при охарактери-
зирането на наночастици предназначени за биомедицински приложения
(Roser et al., 1998; Honary and Zahir, 2013; Owens and Peppas, 2006; Oh and
Park, 2014a; Foroozandeh and Aziz, 2018). При опитите за корелация на ζ-
потенциала на наночастици с биологичната им активност (в т.ч. токсич-
ност, ендоцитоза в различни клетки и др.) трябва да се има предвид, че
измерването на ζ-потенциала в чисти физиологични буфери и разтвори не
дава адекватна оценка за реалната му стойност в биологични течности и
среди при физиологични условия. Биологичните течности и средите за
83
култивиране на биологични клетки съдържат протеини и електролити,

които значимо изменят стойността му в сравнение със стойностите, изме-
рени в чисти физиологични буфери. Физиологичната температура (~37 °C)
също е по-висока от стандартната (25 °C), при която се провеждат повече-
то рутинни измервания.
3. СЕДИМЕНТАЦИЯ И АНАЛИТИЧНО
УЛТРАЦЕНТРОФУГИРАНЕ
Когато са поставени в центрофуга, колоидните частици започват бавно

да се утаявят (да седиментират), ако плътността им е по-голяма от плът-
ността на дисперсната среда, или да се придвижват към повърхността на
дисперсията („обратна седиментация“), ако са с по-малка плътност от тази
на дисперсната среда. При дисперсиите с по-големи и по-плътни частици
на дисперсната фаза може да се наблюдава седиментация след продължи-
телно престояване и под действие на земната гравитация. Седиментация-
та на колоидните дисперсии може многократно да се ускори, ако диспер-
сията се центрофугира, при което ускорението, действащо върху частици-
те може да достигне стотици хиляди пъти земното ускорение. След доста-
тъчно дълго време при постоянно ускорение в дисперсната система се
установява седиментационно равновесие, при което гравитационната
сила се изравнява с дифузията (следствие от установения концентрацио-
нен градиент на частиците).
Някои приложения на центрофугирането за разделяне на полидис-
персни проби от наночастици са споменати в Гл. 2, §2.4. Когато се цели
разделяне на компонентите на дисперсията с цел изолирането им, се
прилага препаративно ултрацентрофугиране. Изследването скоростта на
седиментация, както и на седиментационното равновесие се извършват
чрез аналитична ултрацентрофуга, при която изследваната дисперсия се
центрофугира при много високи обороти (десетки хиляди обороти в ми-
нута) в специална кювета с кварцови прозорчета, която позволява наблю-
дение на процеса на седиментация на дисперсната фаза чрез оптични
методи – например чрез изменението на оптичната плътност, рефрак-
ционния коефициент или флуоресценцията (за флуоресциращи проби)
(фиг. 3.17).
Теоретичните основи на аналитичното ултрацентрофугиране за опре-
деляне молекулната маса на макромолекули и анализ на колоиди, както и
конструкцията на първата ултрацентрофуга са дело главно на Сведберг
(Svedberg and Nichols, 1923; Svedberg and Rinde, 1924). В негова чест е
84
наречена и единицата за измерване на коефициента на седиментация (1

Svedberg = 10-13 sec, вж. Гл. 2, §2.4). При съвременните ултрацентрофуги
роторът се върти в термостатирана вакуумна камера (~10-4 mmHg) чрез
електромотор, газова или маслена турбина. Специален ротор с гнезда за
аналитични кювети с кварцови прозорчета позволява наблюдение на про-
бата по време на центрофугирането и проследяване движението на под-
вижната граница и разпределението на концентрацията на молекули или
частици в кюветата (при въртенето на ротора, на всеки оборот кюветата
преминава през хода на светлинен лъч и оптична система за измерване
концентрационния профил на молекули или частици).
Фиг. 3.17. Схематично представяне на принципа на получаване на данни при аналитично

ултрацентрофугиране: а) ход на светлинния лъч, и б) профил на оптичната плътност на
дисперсията по дължината на кюветата от повърхността към дъното (разстояние х)
Радиусът r (cm) на сферични частици (съответно, моларната им маса)

може да се установи по скоростта на седиментация (преместването от
разстоянието x1 до x2 за времеви период (t2 – t1)) чрез ултрацентрофуга при
ъглова скорост на ротора ω (брой на оборотите в секунда, умножен с 2π;
rad/s), ако е известна плътността на дисперсната фаза d (g/cm3), както и
плътността dm (g/cm3) и вискозитета η (P) на дисперсната среда по следно-
то уравнение:
x 2 2r 2  2 ( d  d m )
ln  (t 2  t1 ) (3.17)
x1 9
В това уравнение x представлява радиусът на ротация, равен на раз-

стоянието от центъра на ротора до частиците. Молната маса M (g/mol) на
85
изследваните макромолекули или частици може да се изчисли от радиуса

r (cm) като се използва числото на Авогадро (NA) при известна плътност
на дисперсната фаза d (g/cm3):
4
M  N A r 3 d (3.18)
3
При дълго време на центрофугиране се установява седиментационно

равновесие, при което молната маса на изследваните частици (макромоле-
кули) може да се изчисли от разпределението им на различно разстояние
от центъра на ротора по следното уравнение:
C 2 M 2 (d  d m )( x 22  x12 )
ln  (3.19)
C1 2 RTd
В това уравнение С1/С2 е концентрационното отношение на частиците

в две различно отдалечени от оста на въртене нива (х1 и х2), което може да
се установи чрез измерване на абсорбцията на светлина и/или индекса на
рефракция на отделните нива в кюветата.
При съвременните аналитични ултрацентрофуги получената информа-
ция от измерването на оптичните характеристики на дисперсията в хода
на центрофугирането се събира и обработва автоматично чрез компютър.
Чрез този метод се изследват разтвори на макромолекули (най-често про-
теини и други биополимери), дисперсии на наночастици, както и по-голе-
ми колоидни частици. Повече информация за метода и възможностите му
може да бъде намерена в специализираната литература (Cole et al., 2008;
Uchiyama et al., 2016; Sun et al., 2018).
4. КОЛОИДНА СТАБИЛНОСТ
4.1. Механизми на стабилизация
Под колоидна стабилност на дисперсията се разбира дълготрайно със-

тояние, при което частиците остават суспендирани в дисперсната среда,
без образуване на агрегати и седименти. Колоидната стабилност зависи
от различни фактори, най-често от вандерваалсовите сили на привличане
между частиците, отблъскване между йонните им атмосфери, солватната
86
обвивка около частиците и/или пространствено (стерично) отблъскване

между полимерни молекули от повърхността на частиците. Колоидните
частици, диспергирани в течности, могат да останат стабилни в продълже-
ние на години. Стабилни дисперсии се получават обикновено при приба-
вянето към дисперсията на вещества, означавани като колоидни стабили-
затори, включително ниски концентрации от електролити. Стабилността
на колоидните системи е от решаващо значение за многото им приложе-
ния, в т.ч. и в биомедицинските нанотехнологии. Пълното охарактеризи-
ране на дадена колоидна система следва да включва и оценка на колоид-
ната стабилност (Matusiak and Grządka, 2017).
В класическата колоидна химия колоидите се разделят на лиофобни и
лиофилни според афинитета на дисперсната фаза към дисперсната среда,
което се свързва и с тяхната стабилност. При лиофилните золове гранич-
ната повърхност на дисперсната фаза проявява значителен афинитет към
дисперсната среда и образуването на солватна обвивка от молекулите на
дисперсната среда около частиците се явява значителен фактор за стабил-
ността на золовете. При лиофобните золове дисперсната фаза не проявява
голям афинитет към дисперсната среда и основният фактор за стабилност-
та обикновено се явява наличието на заряд на колоидните частици (елек-
тростатична стабилизация), който пречи на събирането им в агрегати.
Повърхността на лиофобните частици може да се модифицира с лиофил-
ни вещества и да се подобри стабилността им в дисперсната среда. Когато
дисперсната среда е вода, лиофилните и лиофобните колоиди се означават
съответно като хидрофилни и хидрофобни. Хидрофобни колоиди са на-
пример водните дисперсии на метални наночастици, получени в отсъст-
вие на сърфактанти и полимерни колоидни стабилизатори. Тези системи
са добре изучени в теоретично отношение. Пример за хидрофилни колоиди
са водните разтвори на някои биополимери, най-вече протеини (албумин,
казеин и др.), полизахариди и други. Например размерът на една албуми-
нова молекула е от порядъка на 8,3 nm (Carter and He, 1990), какъвто е
размерът на някои малки наночастици. Частиците на хидрофилните ко-
лоиди са много добре солватирани от молекулите на дисперсната среда и
като цяло са много по-устойчиви срещу агрегация в сравнение с лиофоб-
ните колоиди. Електростатичната и стеричната стабилизация са двата ос-
новни механизма на колоидна стабилизация. Възможна е и комбинация от
двата механизма, известна като електростерична стабилизация.
87
4.1.1. Електростатична стабилизация
Електростатичната стабилизация на колоидните дисперсии се обяснява

с електростатичното отблъскване на йонните атмосфери на едноименно
заредените частици на дисперсната фаза (колоидните частици). В дейст-
вителност, отблъскването между частиците се явява като резултат от при-
покриване и деформация на дифузионните части от двойните електрични
слоеве. Пример за електростатично стабилизирани хидрозолове са водни-
те дисперсии на метални (златни, сребърни) наночастици. За електроста-
тичната стабилизация е от значение характера на двойния електричен
слой между частицата и средата. Като количествена характеристика на
електростатичната стабилност в известна степен може да служи абсо-
лютната стойност на ζ-потенциала. При абсолютни стойности на ζ-потен-
циала >30–40 mV дисперсиите обикновено са стабилни. При ζ-потенциали
<25–30 mV често започва агрегиране на частиците. При достатъчно ниска
стойност на ζ-потенциала (критичен потенциал) настъпва бърза агрегация
на частиците. Агрегация обаче може и да не настъпи дори и при много
ниски и близки до нулата ζ-потенциали в случаите, при които частиците
са стабилизирани стерично чрез полимери или повърхностно активни ве-
щества.
Количествено описание на стабилността на електростатично стабили-
зирани дисперсии се дава от теорията DLVO (съкращение от имената на
учените, допринесли за нейното развитие: Derjaguin, Landau, Verwey,
Overbeek) (Derjaguin and Landau, 1941; Verwey and Overbeek, 1948). Тео-
рията описва количествено баланса на силите на привличане (вандерваал-
сови взаимодействия) и отблъскване (електростатичното взаимодействие
между йоните от двойните електрични слоеве) между частиците. В този
смисъл колоидната стабилност се интерпретира според вида на кривите
енергия на взаимодействието-разстояние между частиците (фиг. 3.18). В
зависимост от относителните стойности на силите на привличане и от-
блъскване са възможни два общи вида на зависимостта на общата потен-
циална енергия от междучастичковото разстояние. В единия случай обща-
та потенциална енергия е с положителен максимум (преобладаващо от-
блъскване, явяващо се условие за стабилност), докато в другия случай
общата енергия е отрицателна при всякакви междучастичкови разстояния
(преобладава вандерваалсовото привличане и дисперсията е нестабилна)
(Zhang Z et al., 2015).
Електростатичната стабилизация играе важна роля и в някои случаи на
нано- и колоидни частици диспергирани в органични разтворители (De
Rooy et al., 1980; Kasseh and Keh, 1998; Hsu et al., 2005; Yordanov et al.,
88
2006; Martin et al., 2010; Rodgers et al., 2015; Damasceno and Zarbin, 2018;
Kumru et al., 2018; Nöske et al., 2019).
Фиг. 3.18. Криви на общата потенциална енергия на взаимодействието (VT) между две
частици като функция на разстоянието (x) между тях, получена при сумиране на енергията
на привличане (VА) и енергията на отблъскване (VR) в два различни случая. Условие за
стабилност се явява наличие на положителен максимум на общата енергия VT (ляво), който
е по-голям от термичната енергия (kT). При отрицателни стойности на VT системата е
нестабилна и се очаква агрегация на частиците
4.1.2. Стерична стабилизация
За стабилността на лиофилните колоиди имат значение както електро-

статичното отблъскване между частиците, така и значителната солвата-
ция, съответно солватната обвивка от молекули на дисперсната среда,
която се образува около частиците. По този начин солватната обвивка
представлява своеобразна бариера пред директния контакт и агрегацията
на частиците на дисперсната фаза. Повърхността на хидрофобните ко-
лоидни частици може да се хидрофилизира чрез подходяща модификация
или адсорбция на хидрофилни стабилизиращи вещества. Такава стабили-
зация на хидрофобните золове чрез прибавяне на хидрофилни колоиди
(обикновено, протеини) в класическите трудове по колоидна химия се
нарича „колоидна защита“. Молекулите на хидрофилния стабилизатор се
адсорбират върху повърхността на хидрофобните частици и ги предпазват
от агрегация. Частиците на така стабилизираните (защитени) колоиди
89
агрегират при много по-висока концентрация на електролит и диспер-

сиите са по-дълготрайни във времето (вж. §4.3). Пример за стабилизирана
по този начин дисперсия е коларголът, който представлява водна диспер-
сия на сребърни наночастици, стабилизирани с албуминов хидролизат.
Освен вещества с протеинова природа (албумин, казеин, желатин), като
класически стабилизатори се използват и природни субстанции с по-
сложен състав, например гума арабика – смола, произвеждана от сока, из-
вличан от два вида акация (Acacia senegal и Vachellia seyal). Гума арабика
е сложна смес от гликопротеини и полизахариди и се ползва като стабили-
затор в хранително-вкусовата промишленост, в производствата на бои,
козметика и други продукти. Гума арабика е била използвана като компо-
нент (стабилизатор) на боите, с които са изписвани египетските папируси
(Christiansen et al., 2020).
За стерична стабилизация на наночастици в биомедицинските нанотех-
нологии намират приложение различни амфифилни вещества (в т.ч. поли-
мерни), чиято адсорбция на фазовата граница предотвратява близкия кон-
такт между частиците чрез ефективно пространствено (стерично) отблъс-
кване. Особено стабилни във водни среди са частици, чиято повърхност е
модифицирана с остатъци на полиетиленгликол (PEG), т.нар. PEGилира-
ни частици. Голяма част от органичните колоидни системи за лекарствено
доставяне са стабилизирани по този начин. PEG остатъците могат да бъ-
дат ковалентно свързани с повърхността на частиците или да са част от
вещества с амфифилни молекули (Suk et al., 2016).
Веществата с амфифилни молекули са най-често органични вещества,
които се характеризират с хидрофилна и хидрофобна част на молекулите
си. Хидрофобната част на молекулата обикновено е неполярна и най-
често представлява въглеводороден остатък, докато хидрофилната част
съдържа полярни и/или йонизиращи се функционални групи, които в
повечето случаи могат да участват в образуването на водородни връзки с
водните молекули. Молекулите на тези вещества имат свойството да се
адсорбират на фазовите граници по такъв начин, че хидрофилната част на
молекулата е ориентирана към водната фаза, а хидрофобната част е ориен-
тирана към хидрофобната повърхност. По принцип, на границата между
две фази възниква междуфазово напрежение (енергия за единица площ;
J/m2), дължащо се на некомпенсирана енергия на взаимодействие на гра-
дивните частици (молекули, йони) намиращи се на повърхността на всяка
фаза в сравнение с градивните частици (молекули, йони), намиращи се в
обема на фазите. Колкото силите на взаимодействие между двете фази са
по-големи, толкова е по-малко междуфазовото напрежение. Междуфазо-
вото напрежение може да се нарече още повърхностно напрежение в
90
случаите, за които е прието понятието повърхност да се използва като

синоним на междуфазова граница. Вещества, които намаляват повърх-
ностното напрежение, са известни като повърхностно активни вещества
(ПАВ) или сърфактанти (surfactants) и представляват вещества с амфи-
филни молекули. Сърфактантите могат да стабилизират хидрофобни ко-
лоидни частици във водни дисперсии, като образуват адсорбционен слой
на границата частица/среда. Повишаването на стабилността на диспер-
сиите може да е следствие от различни фактори, като например електро-
статична стабилизация в случаите на йоногенни ПАВ, образуване на хид-
ратационен адсорбционен слой около частиците и съответно стерично
отблъскване между хидрофилните части на адсорбираните ПАВ. Една от
важните характеристики на сърфактантите е т.нар. хидрофилно-липофи-
лен баланс (hydrophilic-lipophilic balance, HLB), който според Griffin е
пропорционален на масовата част на хидрофилната част от молекулата
спрямо масата на цялата молекула, т.е. вещества с по-големи стойности
на HLB са по-хидрофилни и обратно.
Адсорбираните по повърхността на частиците молекули на ПАВ про-
менят не само стабилността на частиците, но в значителна степен опреде-
лят взаимодействието им с биологични структури. Например използване-
то на нейоногенни ПАВ (чиято хидрофилна част от молекулата най-често
представлява PEG остатък) като стабилизатори на наночастици от хидро-
фобни полимери намалява адсорбцията на плазмени протеини върху
частиците, което на свой ред определя взаимодействието на частиците с
биологични клетки.
За стабилизация на наночастици в биомедицинските нанотехнологии
намират приложение различни вещества с амфифилни молекули, като
това могат да бъдат и високомолекулни съединения. Формули на някои
по-широко използвани стабилизатори от този тип са показани на фиг.
3.19. Такива нейоногенни вещества са:
Полоксамери (poloxamers, Pluronic® и др.). Разработени през 70-те го-
дини в BASF. Амфифилни триблок съполимери, изградени от два хидро-
филни полиоксиетиленови (РЕО) блока и един относително хидрофобен
полиоксипропиленов (РРО) блок, разположен между тях (фиг. 3.19). Син-
тезирани са различни съполимери с различно съотношение на дължините
на блоковете и съответно с известна разлика в свойствата (например с
различен HLB). В биомедицинските нанотехнологии намират приложе-
ние при получаването на полимерни мицели, като стабилизатори на поли-
мерни наночастици и др.
91
Полисорбати (Polysorbates, Tween® и др.). Естери на висши мастни

киселини (олеинова, палмитинова, стеаринова, лауринова) с полиокси-
етилиран сорбитол. Сумата от броя на всички РЕО звена в молекулата е
20, разликата е в мастната киселина (фиг. 3.20). Намират приложение като
емулгатори, за солюбилизиране на някои хидрофобни лекарствени вещес-
тва, като стабилизатори на наночастици за лекарствено доставяне, прила-
гат се също в хранително-вкусовата промишленост и др.
PEGилирани липиди (PEGylated lipids). Намират приложение като ста-
билизатори на липозоми и липидни наноструктури. Обикновено съдър-
жат остатък от метокси-PEG2000 (около 45 РЕО мономерни звена), свър-
зан към „липидна“ част с два въглеводородни остатъка. Например такива
са стабилизаторите ALC-0159 и DMG-PEG2000 от съвременните иРНК
ваксини с липидни наночастици (Verbeke et al., 2021), както и стабилиза-
торът DSPE-PEG2000, използван за получаване на липозомен доксоруби-
цин (Doxil®) (Barenholz, 2012) (фиг. 3.21).
Тези стабилизатори обикновено се прибавят към изходните смеси и
участват в процеса на формирането на наноструктурите. Крайната ОН-
група от PEG-веригата обикновено e метилирана, но има комерсиално
достъпни производни на PEGилирани липиди, в чиито край има амино,
карбоксилна или друга група, позволяваща свързване с насочващи лиган-
ди (Makwana et al., 2021).
Фиг. 3.19. Обща формула на полоксамерите
Фиг. 3.20. Формули на някои полисорбати
92
Фиг. 3.21. Формули на някои PEGилирани липиди, използвани като стабилизатори на

липидни наночастици
4.2. Агрегация (коагулация)
Агрегацията на колоидните частици в една дисперсия е процес, при

който частиците взаимодействат една с друга (например в резултат на
вандерваалсови сили) и се събират в агрегати (клъстери), което води до
образуване на преципитати и разрушаване на колоидната дисперсия.
Агрегацията на хидрофобните колоиди, например при въздействие на
електролити, обикновено е необратима и се означава като коагулация (или
флокулация), а образуваната утайка – коагулат. Когато коагулация се пре-
дизвиква чрез прибавяне на определени вещества към колоидната диспер-
сия, тези вещества се означават като коагуланти или флокуланти. При
относително висока частичкова концентрация растящите агрегати могат
да се свържат, задържайки част от дисперсната среда и по този начин да
образуват колоиден гел. Обратният процес, дезинтеграцията на агрегатите
от частици, се означава като пептизация и когато е възможна обикновено
не протича спонтанно.
Дестабилизация на колоидите обикновено се наблюдава при създаване
на условия, обратни на тези, които водят до стабилизацията им. Отстра-
няването на бариерата, която възпрепятства директния контакт между
частиците, обикновено води до агрегация. Например намаляването на ζ-
93
потенциала води до дестабилизация на електростатично стабилизираните

(най-често, лиофобните) колоиди. Намаляването заряда на частиците в
комбинация с десолватация (чрез изсолване или промяна в състава на дис-
персната среда) води до дестабилизация на лиофилните колоиди. Агрега-
цията (слепването) между частиците става при взаимното им удряне една
в друга. При стабилните дисперсии действат сили на отблъскване между
частиците (електростатични, стерични), които противодействат на силите
на привличане (вандерваалсови сили) между частиците. Когато силите на
отблъскване между частиците силно намалеят, скоростта на коагулация
се повишава и се определя от честотата на сблъскванията между движе-
щите се (брауново движение) частици. Ако всеки удар между две частици
води до агрегация, такава коагулация се означава като бърза коагулация.
Когато не всички удари между частиците водят до слепване (при наличие
на сили на отблъскване, но по-слаби отколкото при стабилните диспер-
сии), е налице бавна коагулация. Характерът на коагулацията може да се
промени от бавна в бърза при промяна на някои параметри на системата
(рН, концентрация на електролити) в сравнително тесен интервал.
Скоростта на коагулация може да се дефинира като намалението на
концентрацията на колоидни частици за единица време. Тази скорост се
изменя във времето и затова се представя като диференциална скорост
(производна на концентрацията по времето). Първият кинетичен модел,
описващ скоростта на агрегацията (коагулацията) на частици, е даден от
Смолуховски (Smoluchowski, 1916). Отначало се образуват двойки от
слепени частици, които при среща с единични дават тройни, а при среща
с друга двойка частици се получават агрегати от четири частици и т.н.
Съвременно количествено описание на агрегационната кинетика може да
бъде намерено в специализираната литература (Kallay and Žalac, 2002; S.
Jungblut and Eychmüller, 2020).
При повишаване на концентрацията на електролити в дисперсията,
съответно при повишаване на йонната сила, дифузионният слой от двой-
ния електричен слой се свива и ζ-потенциалът намалява, поради което
електростатично стабилизираните хидрозолове стават нестабилни. При ζ-
потенциали по-малки от ± 25–30 mV при електростатично стабилизирани
колоиди често започва агрегация на частиците. При определена критично
ниска стойност на ζ-потенциала, започва бърза коагулация. Минималната
концентрация на даден електролит, при която започва бърза коагулация,
се означава като критична концентрация на коагулация (праг на коагу-
лация, ск). Концентрацията ск не е много ясно дефинирана, тъй като с
повишаване на електролитната концентрация става постепенен преход от
бавна в бърза коагулация. Концентрацията на частиците, както и на вече
94
присъстващ електролит в дисперсията може да се повиши и при изпаре-

ние или замразяване (кристализация) на дисперсната среда, което може да
доведе до агрегация на частиците при опити за концентриране и замразя-
ване на лиофобни колоиди.
Установено е, че коагулираща активност има този йон от електролита,
който е противоположно зареден спрямо знака на ζ-потенциала, като
коагулиращата активност нараства със заряда на йона (Schulze, 1882;
Hardy, 1900). Тази зависимост е известна като правило на Шулце–Харди
(Schulze–Hardy), според което коагулиращата способност на противойо-
ните от електролита нараства пропорционално на шестата степен на заря-
да на йона. За йони с еднакъв заряд ск може да зависи от вида на йона
поради различен афинитет към повърхността на частиците. Тъй като в
повечето случаи частиците са отрицателно заредени, става ясно, че много-
зарядните метални катиони (например Fe3+, Al3+ и др.) в тези случаи ще се
проявяват като високоефективни коагуланти. Връзката между критичната
концентрация на коагулация (ck) и заряда (z) на коагулиращия йон, може
да се изведе от DLVO теорията (Zhang Z et al., 2015; Trefalt et al., 2020) и
има следния общ вид:
const
ck  (3.20)
z6
Неутрализация на електричния заряд на заредени частици може да се

реализира чрез прилагане на външо електрично поле. Например при кон-
такт на заредени частици с противоположно заредения електрод в усло-
вията на електрофореза се наблюдава електрокоагулация на частиците.
Намаляване на адсорбцията на потенциал-определящи йони в щерновия
слой също може да доведе до намаляване на заряда на частиците, което
може да се реализира например при нагряване. Освен десорбцията на
йони, нагряването увеличава и десорбцията на молекули на разтворителя
и благоприяства десолватацията. Неутрализация на заряда може да настъ-
пи и при промяна на рН на дисперсната среда в случаите, при които заряд-
ът на частиците е обусловен от наличието на функционални групи с кисе-
линен или основен характер. Стойността на рН, при което общият заряд
на частицата е нула, се означава като изоелектрична точка. При тази стой-
ност на рН съответните колоидни частици проявяват понижена стабил-
ност. Неутрализация на зарядите и коагулация може да се предизвика и
при смесване на два колоида с противоположен заряд на частиците. По
подобен начин коагулация на заредени частици може да се предизвика и
от полиелектролити с противоположен на частиците заряд (например чрез
95
смесване на поликатионен полимер с отрицателно натоварени частици).

В този случай, освен неутрализиране на заряда, полимерните молекули на
полиелектролитите могат да се адсорбират по повърхността на повече от
една частица, например свързвайки две частици, водейки до т.нар. мостова
флокулация (bridging flocculation).
Дестабилизация на лиофилни колоиди обикновено може да се постиг-
не по няколко начина: 1) чрез изсолване с високи концентрации на елек-
тролити; 2) чрез добавяне на ацетон, алкохол или друг водоразтворим
органичен разтворител; 3) нагряване. Класическото обяснение на тези
ефекти е свързано с представата за намаляване на количеството водни мо-
лекули ангажирани в солватацията на частиците. Агрегацията на хидро-
филни колоиди при високи концентрации на електролит често се означава
като изсолване (salting-out). Различните йони имат различна изсолваща
сила и могат да бъдат подредени в редове на намаляваща изсолваща сила,
т.нар. лиотропни редове на Хофмайстер (Hofmeister, 1888), като реда на
йоните в тези редове може да зависи от природата на колоидната диспер-
сия. Изсолването на хидрофилните колоиди с високи концентрации (от
порядъка на няколко mol/L) на електролити няма общо с механизма на
коагулацията на хидрофобните колоиди, която се предизвиква от доста
по-ниски концентрации на електролит (обикновено от порядъка на някол-
ко десетки mmol/L NaCl). Коагулацията на хидрофобните колоиди с елек-
тролити обикновено е необратима, докато дестабилизирането на хидро-
филните колоиди чрез изсолване най-често е обратимо и се използва за
фракционно разделяне на протеинови смеси в биохимията (например чрез
смесване с разтвори на амониев сулфат с различни концентрации).
Ултразвуковата обработка е удобен начин за диспергиране на флоку-
лирали (агрегирали) частици. Процесът на диспергиране на флокулирали
частици и преминаването им в стабилна дисперсия се означава като пеп-
тизация и протича при наличие на вещества, наречени пептизатори (обик-
новено малки количества електролит). Пептизиращото действие на елек-
тролита се свързва с адсорбция на йоните върху повърхността на дисперс-
ната фаза, придавайки електричен заряд на частиците. Пептизация на
наночастици може да се постигне и чрез промяна в киселинността на сре-
дата, прибавяне на повърхностно активни вещества или друга промяна в
повърхностните свойства на частиците (например хидрофилизиране на
хидрофобни частици чрез въвеждане на хидрофилни функционални гру-
пи). В тези случаи ултразвуковата обработка може да ускори пептизация-
та, но сама не може да осигури стабилност на получената дисперсия. В
някои случаи и в зависимост от условията ултразвуковата обработка на
дисперсиите може да провокира агрегация на наночастиците. Например
96
такава агрегация с образуване на нишки от наночастици е наблюдавана

при златни частици в присъствие на натриев додецилсулфат или додецил-
амин (Radziuk et al., 2010).
4.3. Методи за изследване на колоидната стабилност
Известни са различни методи за директно и косвено (индиректно)

установяване на агрегати от частици в изследваната дисперсия (Matusiak
and Grządka, 2017). Наличието на агрегати от колоидни частици може да
се установи при наблюдението на дисперсиите чрез тъмнополев микро-
скоп (ултрамикроскоп или чрез траекторен анализ на наночастици), най-
вече наночастици, силно разсейващи светлина или чрез флуоресцентен
микроскоп при флуоресциращи частици – в тези случаи за наличието на
агрегати се съди по по-малката стойност на дифузионния коефициент на
агрегатите, съответно по-ниската скорост на брауновото им движение в
сравнение с неагрегиралите частици. Агрегати с микронни размери могат
директно да бъдат наблюдавани с оптични микроскопски техники. Преци-
питацията на свързани с антитела флуоресцентни наночастици в присъс-
твие на съответния антиген може да се наблюдава с флуоресцентен мик-
роскоп (Chan and Nie, 1998). Понякога за наблюдение на относително
малки агрегати от наночастици и за установяване начина на организация
на частиците в агрегата са прилагат различни електронномикроскопски
техники. При тези методи обаче дисперсиите не могат да се наблюдават в
течно състояние и винаги следва да се има предвид възможността за вто-
рично агрегиране на частиците по време на пробоподготовката за наблю-
дение, при която пробата изсъхва.
Към индиректните методи се отнасят различните методи за анализ на
пропуснатата или разсеяната от дисперсиите светлина (турбидиметрия,
нефелометрия, динамично светоразсейване, при които наличието на агре-
гати променя интензитета на разсеяната светлина) и седиментационен
анализ. Изменението интензитета на пропуснатата през дисперсията свет-
лина (светлинната трансмисия) може да бъде проследена във времето в
агрегираща дисперсия спектрофотометрично във видимата област. При
напредването на агрегацията дисперсията обикновено става по-мътна и се
повишава разсейването на светлина, т.е. интензитета на преминалата свет-
лина (трансмисията) намалява. По-конкретни данни, например за хидро-
динамичния диаметър на агрегатите, може да се получат чрез динамично
светоразсейване. Коагулацията, при която от колоидни дисперсии се по-
лучават грубо-дисперсни системи, може да бъде проследена и чрез седи-
97
ментационен анализ на получените агрегати, които под действие на грави-

тационната сила се утаяват. За тази цел могат да се използват автоматични
устройства, чрез които се проследява вертикалният профил на мътността
и/или светоразсейването на дисперсията (Matusiak and Grządka, 2017) (фиг.
3.22). По този начин обаче не могат да се изследват системи, които при
коагулацията образуват колоиден гел, в който агрегатите не преципити-
рат. За наличие на малки агрегати (от няколко наночастици) може да се
приложи и аналитично ултрацентрофугиране (агрегатите седиментират
по-бързо и по скоростта на седиментацията може да бъде определен раз-
мерът им). Агрегация на метални наночастици може да се установи също
така по промяна в абсорбцията на видима светлина – при наличие на
агрегати плазмонната абсорбционна ивица намалява интензитета си и се
появява абсорбция в по-дълговълновата част на спектъра. За изследване
на агрегацията на колоидни частици в течни среди се ползват и различни
филтрувални техники, реологични измервания и др.
Фиг. 3.22. Принцип на турбидиметрично проследяване на агрегация и седиментация чрез

вертикално сканиране на дисперсията
РЕЗЮМЕ
Оптични свойства. Дисперсиите на частици разсейват светлината поради раликата
в коефициента на пречупване на светлината между дисперсната среда и дисперсната
фаза. На основата на светоразсейването се използват различни методи за анализ, от
които може да се получи информация за размерите на частиците, относителната им
концентрация, и др. Чрез ултрамикроскоп или траекторен анализ на наночастици
може да се наблюдава директно брауновото движение на частиците и да се получи
информация за дифузионния коефициент, съответно за размера им. Чрез динамично
98
светоразсейване също могат да бъдат определени разпределения по размери. Нефе-

лометрията и турбидиметрията се използват рутинно за определяне концентрации на
частици (след съответно калибриране). Някои видове наночастици (метални, полу-
проводникови) имат характерни абсорбционни спектри. Например чрез анализ на аб-
сорбционните спектри на полупроводникови наночастици може да се получи инфор-
мация за размера и концентрацията на частиците. Флуоресцентните свойства на кван-
товите точки са в основата на диагностичните им приложения.
Електрични свойства. Електрокинетичните свойства на колоидните частици се
свързват с представата за т.нар. двоен електричен слой между частиците и дисперс-
ната среда. Според модела на Щерн, йоните с противоположен заряд, които компен-
сират повърхностния заряд на частицата, се разпределят в два слоя. Първият е с по-
малка дебелина и се разполага близо до повърхността (щернов слой), съответстващ
на здраво адсорбирани противойони. Вторият слой се състои от електростатично при-
влечени йони и е дифузен. Между щерновия и дифузионния слой се разполага тясна
област, в която се наблюдава бърза промяна в скоростите на движение на йоните и
молекулите, наречена равнина на прехлъзване. Потенциалната разлика между равни-
ната на прехлъзване и вътрешността на дисперсната среда се означава като електро-
кинетичен (дзета; ζ) потенциал. Прилагането на електрично поле към дисперсия на
частици с ζ≠0 води до електрофореза – видимо придвижване на частиците спрямо
дисперсната среда по посока на противоположно заредения електрод. Изследването
на електрофорезата с различни методи (микроелектрофореза, електрофоретично све-
торазсейване) дава данни за разпределението на частиците по ζ-потенциали.
Седиментация. Когато са поставени в центрофуга, колоидните частици започват
бавно да се утаявят (да седиментират), ако плътността им е по-голяма от плътността
на дисперсната среда. Чрез изследване скоростта на седиментация и/или седимента-
ционното равновесие чрез аналитично ултрацентрофугиране може да се получи ин-
формация за размера на частиците.
Колоидна стабилност. Колоидната стабилност е от значение за биомедицинските
приложения на наночастиците. Електростатичната и стеричната стабилизация са два-
та основни механизма на колоидна стабилизация. Електростатично са стабилизирани
повечето хидрофобни золове получени в отсъствие на колоидни стабилизатори. Ста-
билността им се обяснява с отблъскването на частиците от йонните атмосфери, които
ги обкръжават и се описва от т.нар. теория DLVO, отчитаща най-общо баланса между
силите на привличане (вандерваалсови взаимодействия) и отблъскване между части-
ците. Електростатично стабилизираните частици бързо агрегират под действието на
ниски концентрации на електролити (според правилото на Шулце–Харди). Повиша-
ването на електролитната концентрация води до намаляване на ζ-потенциала и свива-
не на двойния електричен слой. Стерично-стабилизираните частици са по-стабилни в
електролитни разтвори. Стабилността им се дължи на добре солватирани хидрофилни
остатъци по повърхността на частиците. Тази стабилизация може да се реализира чрез
химична модификация или чрез амфифилни олиго- и полимерни вещества, например
с полиетилегликол (PEG). Стабилността на частиците и съответно скоростта на агре-
гацията им се изследват с различни методи: ултрамикроскопски, седиментационни и
основани на светоразсейването.
99
Глава 4
МЕТОДИ ЗА МОРФОЛОГИЧЕН И
СТРУКТУРЕН АНАЛИЗ
Микроскопски методи (сканиращ и трансмисионен електронен микроскоп,

EDX микропробен анализатор, атомно-силов микроскоп). Спектрални ме-
тоди (инфрачервена и ЯМР спектроскопия). Дифракционни методи (рентге-
нова, електронна и неутронна дифракция). Определяне на молекулна маса
(GPC, MALDI-TOF MS). Термични методи (TG, DSC).
1. МИКРОСКОПСКИ МЕТОДИ
1.1. Сканиращ електронен микроскоп (SEM)
За формирането на образа при електронните микроскопи се използва

поток от електрони, които подобно на светлината имат вълнови свойства,
но с много по-малка дължина на вълната, например около 0,0027 nm при
ускоряващо напрежение 200 kV. Това позволява високата разделителна спо-
собност при електронните микроскопи в сравнение със светлинните. Ска-
ниращият електронен микроскоп (scanning electron microscope, SEM) е
тип електронен микроскоп, при който повърхността на обекта се наблю-
дава чрез сканиране с електронен лъч (със сечение от порядъка на 10 nm
или по-малко) (Goldstein et al., 2003). Електроните взаимодействат с ато-
мите на обекта, при което се получават сигнали, съдържащи информация
относно повърхностната топография на обекта, състава и други свойства.
В зависимост от ъгъла на падането на електронния лъч и характера на по-
върхността на обекта, част от електроните се абсорбират, разсейват или
100
Глава 4. Методи за морфологичен и структурен анализ
избиват вторични електрони от обекта. Сигналите, получени при SEM

включват вторични електрони (secondary electrons, SE), обратно-разсеяни
електрони (back-scattered electrons, BSE), характеристични рентгенови лъ-
чи, светлина (катодолуминесценция) и преминали електрони. При всички
сканиращи микроскопи има детектори за вторични електрони, но рядко
един SEM има детектори за всички възможни сигнали. При най-разпрос-
транения режим на наблюдение чрез детектиране на вторични електрони
(secondary electron imaging, SEI) могат да бъдат получени изображения на
повърхността на наблюдавания обект със сравнително висока разделител-
на способност. Обратно-разсеяните електрони (BSE) са електрони, които
са отразени от пробата чрез еластично разсейване (elastic scattering). Ин-
тензитетът на BSE-сигнала силно зависи от атомния пореден номер (Z),
поради което чрез BSE могат да се наблюдават имуно-маркери със златни
наночастици (~10 nm), които е трудно или невъзможно да се наблюдават
чрез SEI при изследване на биологични обекти (златото има много по-
голям пореден номер в сравнение с химичните елементи, обичайно съдър-
жащи се в биологичните проби и златните частици се отличават ясно в
BSE изображението). Характеристичните рентгенови лъчи се получават,
когато електронният лъч избива електрони от вътрешните електронни
слоеве, при което по-високоенергетични електрони релаксират до енерге-
тичното ниво на избитите електрони, излъчвайки енергия. Характерис-
тичните рентгенови лъчи се използват за установяването на елементния
състав на наблюдавания обект чрез електронномикроскопски микропро-
бен анализатор (EDX сонда; вж. §1.3).
На фиг. 4.1 е показана принципна схема на SEM. Работното простран-
ство е под вакуум, с цел да се минимизира разсейването на електронния
лъч от газови молекули, да се предотврати електричен разряд между ком-
понентите, намиращи се под високо напрежение, и да се избегне окисле-
ние на компонентите на електронния източник и наблюдавания обект. В
горната част на вакуумната колона се намира източникът на електрони
(например накалявана с ток волфрамова нишка). Енергията на електрон-
ния лъч е между 0,5 keV до 40 keV. Лъчът се фокусира чрез кондензорни
лещи (електромагнити) в сноп с диаметър 0,5–10 nm, след което премина-
ва през сканиращи намотки или двойка дефлекторни пластини, които
създават електромагнитно поле, отклоняващо лъча в направления на x- и
y-осите. При този процес се извършва сканиране (обхождане точка по
точка) на повърхността на обекта, при което се получава растерно изобра-
жение (съвкупност от точки, подредени в правоъгълна матрица). Увели-
чението при SEM се определя от съотношението на размерите на дисплея
и сканираната област от повърхността на обекта. Обектът е прикрепен
101
към държател, чрез който се придвижва в различни посоки посредством

система от винтове. В близост до обекта се намират различни детектори
– за вторични електрони, рентгенови лъчи и BSE-детектор.
Фиг. 4.1. Схематично устройство на SEM: 1) електронно управление; 2) вакуум помпа; 3)

дисплей; 4) вакуумна колона; 5) електронна пушка; 6) електронен лъч; 7) и 8) кондензорни
електромагнитни лещи; 9) дефлектори; 10) ваккумна камера за поставяне на изследвания
обект; 11) изследван обект; 12) държател на обекта; 13) система за управление на държа-
теля; 14) BSE-детектор; 15) детектор за вторични електрони; 16) детектор за рентгенови
лъчи (рентгенов микроанализатор)
При конвенционални наблюдения със SEM е необходимо пробите да

притежават електропроводяща повърхност, която е заземена с цел избяг-
ване натрупването на електростатичен заряд на повърхността, водещ до
артефакти в изображението. Поради тази причина непроводящите проби
се покриват с тънък слой от проводящ материал (злато, въглерод и др.)
чрез нанасяне (запрашване) под вакуум.
Обектът за изследване може да бъде подложен на елементен анализ
чрез изследване на спектъра на рентгеновото излъчване. За тази цел се
използва рентгенов микропробен анализатор, чрез който може да бъде
определен елементният състав на обекта в определена точка, в която е на-
сочен електронният лъч. При сканирането на обекта от електронния лъч
може да се направи карта на разпределението на различните химични
елементи в обекта, т.нар. мапинг (mapping) (вж. §1.3).
102
1.2. Трансмисионен електронен микроскоп (ТЕМ)
При трансмисионния електронен микроскоп (transmission electron micro-

scope, TEM) изображението се получава при преминаване на електронен
лъч през тънък (с дебелина до около 100 nm) обект (Goodhew et al., 2001,
p. 66). Електроните взаимодействат с обекта, като преминалите през обек-
та електрони образуват изображението, което се увеличава чрез електро-
магнитни лещи и се фокусира върху флуоресцентен екран, фотографски
филм или се детектира чрез CCD-камера. Пътят на електронния лъч при
ТЕМ е илюстриран схематично на фиг. 4.2.
Фиг. 4.2. Схематично устройство на ТEM (път на електронния лъч): 1) електронна пушка;
2) електронен лъч; 3), 5) и 8) апертурни регулатори; 4) кондензорни лещи; 6) държател на
изследвания обект; 7) обективни лещи; 9) междинни лещи; 10) проекторни лещи; 11)
флуоресцентен екран; 12) устройство за запис на изображението (фотографска плака или
CCD-камера); 13) бинокулярна лупа
Чрез ТЕМ може да се постигнат значително по-високи увеличения (до

около ×1 000 000 пъти) и висока разделителна способност в сравнение със
светлинните микроскопи, което е следствие от малката дължина на въл-
103
ната на електроните. При ниски увеличения контрастът на ТЕМ изобра-

жението се дължи на абсорбция на електрони от изследвания обект, която
зависи от дебелината и състава на материала.
Източникът на електрони (електронна пушка) е волфрамов филамент
или LaB6. При свързване към източник на високо напрежение (80–300 kV)
се отделят електрони чрез термионна или полева емисия. Електроните се
насочват от електромагнитни лещи, при което се образува електронен лъч
с желан размер и посока. За получаване на изображение чрез ТЕМ обик-
новено се използват три вида електромагнитни лещи – кондензорни, обек-
тивни и проекторни. Чрез кондензорните лещи се формира електронният
лъч и се насочва към обекта, а чрез обективните лещи се обработва лъчът,
който е преминал през обекта. Полученото изображение се проектира вър-
ху флуоресцентен екран или друго устройство чрез проекторните лещи.
Обикновено флуоресцентният екран е изработен от цинков сулфид и служи
за наблюдение от оператора (директно или чрез бинокулярна лупа).
Пространството, в което се формира и обработва електронният лъч при
повечето стандартни ТЕМ, се намира под ниско налягане (10−4 Pa) за пре-
дотвратяване на волтов разряд между елементите под високо напрежение
и редуциране на взаимодействието на електронния лъч с газовите молеку-
ли. Механизмите за поставяне на държателя трябва да осигуряват поддър-
жане на ниското налягане по време на работа. Колкото е по-високо работ-
ното напрежение на ТЕМ, толкова по-висок вакуум е необходим, като при
високоволтовите ТЕМ налягането е около 10−7–10−9 Pa. Държателите са
пригодени за поставяне на стандартни мрежички (grids) – фиг. 4.3.
Фиг. 4.3. Илюстрация на типична мрежичка (grid) за наблюдение с TEM
Най-използваният режим на работа с ТЕМ е наблюдението в светло

поле (bright field imaging). В този режим изображението се образува в
резултат на абсорбция на електрони от образеца, като по-дебелите участъ-
ци от пробата, както и участъци, съдържащи по-тежки елементи, изглеж-
дат по-плътни и по-тъмни. Областите, които не абсорбират електрони,
104
изглеждат светли. В режим, при който се наблюдават само сигнали от раз-

сеяни от пробата електрони, но не се наблюдава неразсеяния лъч, полето
в отсъствие на обект е тъмно. Тъмнополевият режим намира приложение
при изследване структурата на кристални обекти.
Контрастът на изображението при светлинните микроскопи може да
се засили чрез използване на багрила, които абсорбират видима светлина.
Аналогично, при ТЕМ наблюдения на биологични обекти и някои видове
наноматериали могат да бъдат използвани контрастни агенти, съдържащи
атоми на тежки елементи (осмий, олово, уран). Такива контрастни агенти
се използват за наблюдение на материали с ниска електронна плътност,
каквито са органичните наноструктури.
Съществуват редица ограничения при приложението на ТЕМ за из-
следване на различни обекти. Множество материали изискват продължи-
телна и трудоемка пробоподготовка, което силно ограничава броя на из-
следваните проби. Структурата на обекта за изследване може да бъде
променена по време на пробоподготовката. Наблюдаваната част от обекта
при високи увеличения е твърде малка, от което следва възможността
наблюдаваната част да не е характеристична за цялата проба. Също така,
съществува възможност обектът да бъде повреден от електронния лъч,
особено при изследване на органични и биологични материали.
Сканиращият трансмисионен електронен микроскоп (scanning trans-
misson electron microscope, STEM) е разновидност на ТЕМ, при който
електронният поток е фокусиран в тесен лъч, който сканира изследвания
обект и се получава растерно изображение след обработка на сигнала от
преминалите през обекта електрони (Pennycook and Nellist, 2011). Скани-
рането на обекта чрез електронния лъч позволява комбинирането на този
вид микроскопи с ренгенов микроанализатор за установяване на разпре-
делението на различни химични елементи в обекта (мапинг, mapping).
Електронна микроскопия на разломени в замразено състояние проби
(криофрактуриране). В някои случаи наностуктурите са нестабилни в су-
хо състояние или променят характеристиките си при изсушаване и не
могат да бъдат пряко наблядавани с електронен микроскоп. В тези случаи
обектът (например дисперсията) се замразява бързо при ниски температу-
ри (течен азот) в присъствие на криопротектори (вещества, предпазващи
от образуването на кристали) и замразеният обект се разломява (разцепва)
във вакуумна камера. Водата по разломната повърхност се изпарява, при
което се усилва релефът, върху който се нанася въглерод и платина. Полу-
чената метална реплика (отпечатък) се отделя чрез размразяване на про-
бата, почиства се и се наблюдава с електронен микроскоп. По този начин
105
могат да се визуализират индиректно нестабилни при изсушаване струк-

тури, като липозоми, мицели и др.
1.3. Електронномикроскопски микропробен анализатор
Енергийно-дисперсионната рентгенова спектроскопия (EDS, ЕDAX

или EDX) е аналитична техника за елементен анализ или химично охарак-
теризиране. Това е вариант на рентгено-флуоресцентния анализ, при кой-
то се анализира рентгеновото лъчение, получено в резултат на взаимо-
действие на изследвания обект с високоенергетично лъчение. Този метод
за елементен анализ е основан на фундаменталния принцип, че всеки хи-
мичен елемент притежава уникална атомна структура, позволяваща иден-
тификация на елемента по неговото характеристично рентгеново лъчение
(Goodhew et al., 2001, p. 169; Goldstein et al., 2003).
Различните видове електронни микроскопи (TEM, SEM, STEM) могат
да бъдат оборудвани с рентгенов (EDX) микропробен анализатор, чрез
който се анализира рентгеновото лъчение, получено при взаимодействие-
то на електронния лъч с изследвания обект. Електронният лъч може да
предизвика възбуждане и избиване на електрон от вътрешен електронен
слой, при което електрон от външен електронен слой преминава на вакант-
ното енергетично ниво, излъчвайки енергия в рентгеновия диапазон, съот-
ветстваща на енергетичната разлика между двете състояния. Интензите-
тът и енергията на полученото рентгеново лъчение могат да бъдат измере-
ни чрез енергийно-дисперсионен (EDX) спектрометър. Всеки импулс от
детектора се усилва и предава към компютър, чрез който се съставя хисто-
грама на разпределението на рентгеновото лъчение по енергии. Енергетич-
ният спектър на рентгеновите лъчи, получени по този начин, зависи от
строежа на електронната обвивка на атомите и е характерен за всеки хи-
мичен елемент. Това позволява определянето на елементния състав на
изследвания материал (фиг. 4.4).
При сканиращите микроскопи (SEM и STEM) може да бъде получена
карта на разпределението на различните химични елементи в изследвания
материал чрез EDX анализ на лъчението, получено от точките, през които
преминава електронния лъч при сканирането (фиг. 4.5). Процесът е известен
като мапинг (mapping). При мапинга се измерва интензитетът на определена
линия от рентгеновия спектър, характерен за даден елемент. Обикновено се
избира най-интензивната линия от спектъра на елемента, но не бива се при-
покрива с линия на друг елемент от изследвания материал. Изображението
се състои от светли точки, чиято плътност (брой точки на определена площ)
е пропорционална на концентрацията на елемента.
106
Фиг. 4.4. ТЕМ микрофотография (а) и съответния EDX спектър (б) на нанокристали от
CdSe (данните са любезно предоставени от Prof. H. Yoshimura, Meiji University, Japan)
a б
в г
Фиг. 4.5. STEM микрофотография (а) на колоидни частици от полибутилцианоакрилат и

съответните разпределения на химичните елементи кислород (б), въглерод (в) и азот (г),
получени чрез EDX мапинг (данните са любезно предоставени от Prof. H. Yoshimura и H.
Fukano, Meiji University, Japan)
При EDX анализа има няколко ограничения. Например не могат да бъдат

детектирани елементи с атомен номер по-малък от 4 (H, He, Li). Резолюцията
на детекторите е ниска и сигналите представляват не отделни линии, а пикаве
с ширина около 100–200 eV. Освен това, пиковете на много елементи се
107
припокриват, което може да затрудни анализа, ако пробата съдържа мно-

жество елементи с припокриващи се пикове. Рентгеновото лъчение от някои
атоми може да не напусне пробата или да не попадне върху детектора, което
може да понижи точността на анализа.
1.4. Атомно-силов микроскоп (AFM)
Атомно-силовият микроскоп (atomic force microscope, AFM) е вид ска-

ниращ сондов микроскоп (SPM), чрез който е възможно да се постигне
висока резолюция от порядъка на части от нанометъра (Bhushan, 2010).
Чрез AFM могат да се разкрият топографски детайли и да бъдат изслед-
вани различни физични свойства на повърхността на обекта. Повърхност-
та на образеца се сканира чрез конзола (cantilever) с острие. Когато острието
се намира в близост до повърхността на изследвания образец, силите на
отблъстване между острието и образеца предизвикват отклонение на кон-
золата, което може да бъде измерено чрез отклонението на отразен от нея
лазерен лъч (фиг. 4.6).
Фиг. 4.6. Сканиране на повърхността на образеца при AFM. Вертикалните отлонения на

конзолата се детектират чрез отклонението на отразения лазерен лъч
С AFM може да се работи в различни режими в зависимост от целта на

изследването. Най-общо режимите на работа биват статични (контактни)
и динамични (неконтактни). При контактните режими по време на скани-
рането конзолата е в контакт с образеца, следвайки контурите на повърх-
ността, които се измерват директно чрез отклонението на конзолата. При
неконтактните режими конзолата осцилира с определена външно зададе-
на честота. Характеристиките на осцилацията (амплитуда и др.) се проме-
нят вследствие на силите на взаимодействие между острието и изследва-
ната повърхност. Тези промени дават информация за характеристиките на
108
изследваната повърхност. Предимство на AFM пред електронните микро-

скопи е, че не е необходимо пробата да е под вакуум. Повечето изследва-
ния с AFM се провеждат във въздушна среда.
2. СПЕКТРАЛНИ МЕТОДИ
Спектралните методи за анализ се основават на взаимодействията

между веществото и различни електромагнитни лъчения. Най-общо спек-
троскопските данни се представят чрез спектър, който представлява запис
на интензитета на абсорбираната или излъчена от веществото енергия
като функция на честотата (или дължината на вълната), т.е. енергията на
лъчението. Принципите и приложението на различните спектрални мето-
ди може да се намери в специализираните издания по инструментални
методи за анализ. Тук ще бъдат споменати накратко само инфрачервената
(ИЧ) и ядрено-магнитната резонансна (ЯМР) спектроскопия и някои тех-
ни приложения за структурен анализ на наночастици.
2.1. Инфрачервена спектроскопия
При инфрачервената (ИЧ, IR) спектроскопия се измерва абсорбцията

на инфрачервена светлина от изследваната проба, обикновено в диапазона
от 4000 до 200 cm-1. Абсорбираното инфрачервено лъчение се свързва с
промяна във вибрационните състояния на абсорбиращото вещество, при
които се извършва промяна в диполния момент на молекулата. Вибрации-
те са такива движения на молекулата, при които относителното разполо-
жение на атомите едни спрямо други се мени във времето. Молекулните
вибрации биват основно валентни (streching), при които се изменя дължи-
ната на химичните връзки, и деформационни (bending), при които се изменят
валентните ъгли между връзките. Някои функционални групи се характе-
ризират с вибрации, които съответстват на определени характеристични
групови честоти. Поради взаимодействия на вибрациите между отделните
връзки в една молекула, като цяло, инфрачервеният спектър на едно ве-
щество е характеристичен и може да се използва за неговата еднозначна
идентификация. Особено разпространени апарати за измерване на ИЧ
спектри са спектрометрите с Фурие-трансформация (FTIR).
ИЧ спектроскопията най-често се прилага за качествено идентифици-
ране на органични съединения и функционални групи. Пробата за анализ
може да се подготви като разтвор в подходящ органичен разтворител
(който пропуска ИЧ светлина в широка област от честоти) или да се пресова
109
в таблетка от алкален халогенид (най-често KBr). Нехомогенности с мик-

ронни размери в пробата могат да доведат до разсейване на ИЧ светлината
и влошаване качеството на спектрите. ИЧ спектри могат да се снемат и
чрез отражение на ИЧ лъчи от повърхността на анализираната проба.
ИЧ спектроскопията намира приложение в нанотехнологиите най-чес-
то за доказване на определени функционални групи по характеристичните
за тях абсорбционни ивици при функционализирането на наночастици,
качествен анализ на химичния състав на частиците, степен на превръщане
на една функционална група в друга, и др. При подходяща калибровка ИЧ
спектроскопията може да се използва и за количествен анализ.
2.2. Ядрено-магнитна резонансна спектроскопия
Ядрено-магнитната резонансна (ЯМР; NMR) спектроскопия е техника

за анализ, при която се използват магнитните свойства на някои атомни
ядра и явлението ядрен магнитен резонанс и намира все по-широко
приложение при анализ на наночастици (Mayer, 2005; Agarwal et al., 2018).
Когато са поставени в магнитно поле, ЯМР активните ядра (1Н, 13С и др.)
абсорбират електромагнитно лъчение при характерна честота, като често-
тата и интензитета на сигнала са пропорционални на силата на магнитно-
то поле. Резонансната честота на дадено ядро (или група ядра) зависи от
действителното електромагнитно поле около това ядро, което се определя
от структурата на молекулата. Разликата в резонансните честоти на даде-
ното ядро по отношение на определено вещество, прието за стандарт (тет-
раметилсилан, ТМS), се означава като химично отместване.
ЯМР спектроскопията намира приложение най-вече като метод за струк-
турен анализ на органични вещества, изследване на смеси от органични
съединения, проследяване хода на химични реакции и др. За протони
интензитетът на сигнала, измерен като площ под абсорбционния пик, е
пропорционален на броя на ядрата. Това може да се използва за количест-
вено определяне в смеси, например при определяне лекарствено съдържа-
ние в наночастици (фиг. 4.7) (Yordanov, 2012).
При разновидност на метода, известна като дифузионно-подредена
ЯМР спектроскопия (DOSY, Diffusin-Ordered SpectroscopY), може да се
определи дифузионният коефициент на молекулите в изследваната проба.
Това може да се използва за изследване кинетиката на освобождаване на
лекарства от наноносители (Denkova et al., 2010). DOSY спектрите на
наноносители, натоварени с лекарствени молекули, показват две групи
сигнали – една, съответстваща на натовареното в носителя лекарство, и
110
втора – от свободните лекарствени молекули в дисперсната среда. Дифу-

зионният коефициент на свободното лекарство е по-голям от този на лекар-
ството в наноносителя (последният съответства на дифузионния коефи-
циент на носителя). За определяне профила на лекарствено освобождаване
от наноносителя се провежда серия от DOSY експерименти при различно
време. Степента на лекарствено натоварване в носителя се определя като
количеството натоварено лекарство, отнесено към общото количество
лекарство в системата, които се изчисляват от съотношението на площите
на съответните сигнали.
Фиг. 4.7. 1Н-ЯМР спектър, получен след разтваряне в деутериран ацетон на наночастици
от полибутилцианоакрилат (РВСА) натоварени с противогъбичното лекарство еконазол.
Ясно се различават сигналите от ароматните протони на еконазола и сигналите от прото-
ните на полимера. По относителния интензитет на сигналите от определени групи може
да се определи съотошението лекарство-полимер, от което да се определи лекарственото
съдържание в наночастиците (вж. Yordanov, 2012)
ЯМР спектроскопията може да намери приложение и за изследване

структурата на лекарства натоварени в наночастици (формата, под която
се намират в лекарствения носител), начина на свързването им с наноно-
сителите (Page–Clisson et al., 1998) и др. Определянето на дифузионния коефи-
циент на наночастиците чрез ЯМР (например чрез pulsed-field gradient spin-
echo, PFGSE) дава възможност за определяне размера на частиците и на
техни агрегати, свързвайки дифузионния коефициент с размера чрез уравне-
нието на Stokes–Einsten (Gomez et al., 2009).
111
3. ДИФРАКЦИОННИ МЕТОДИ
Дифракционните методи служат за охарактеризиране на подредбата на

градивните частици в твърдите материали, определяне на кристалността,
типа на кристалната структура, размера на кристалитите, параметрите на
кристалната решетка, плътност на материала и др. Дифракционните кар-
тини се получават при облъчване на кристални обекти с рентгенови лъчи,
електрони или неутрони. При всички дифракционни методи се използва
уравнението на Браг, което описва връзката между дължината на вълната
на лъчението, ъгълът, под който лъчът попада върху повърхността на
обекта, и междуплоскостното разстояние в кристалната решетка, в резул-
тат на което настъпва конструктивна интерференция (вж. §3.1).
3.1. Прахова рентгенова дифракция
Праховата рентгенова дифракция (рентгено-фазов анализ; X-ray pow-

der diffraction, XRD) е метод за структурен анализ на прахообразни проби,
при който се използват рентгенови лъчи (Guinebretière, 2007). Пробите се
поставят в дисковиден контейнер, като повърхността на пробата се нами-
ра под ъгъл θ спрямо рентгеновите лъчи, идващи от източника. В качес-
твото на източник се използва електронно-вакуумен прибор, наречен рентге-
нова тръба (често се използва рентгенова тръба с меден анод, излъчваща
лъчение с дължина на вълната 0,154 nm). Рентгеновите лъчи са с дължина
на вълната от порядъка на междуатомните разстояния и при попадането
им в проба с определена подредба на градивните частици се наблюдава
дифракция. Интензитета на дифрактиралите рентгенови лъчи се измерва
чрез подходящ детектор, разположен най-често също под ъгъл θ спрямо
повърхността на праховата проба (фиг. 4.8). Ъгълът между проекцията на
рентгеновия лъч от източника и детектора е 2θ.
Измерването на интензитета на дифрактиралите лъчи като функция на
ъгъла 2θ се извършва с инструменти, наречени прахови дифрактометри.
В получената дифрактограма се очертават ясно изразени пикове при нали-
чие на кристална подредба на градивните частици в пробата. Чрез подхо-
дяща обработка на данните от дифрактограмата може да бъде получена
информация за фазовия състав на пробата, кристалната модификация, па-
раметъра на кристалната решетка, плътността, размера на кристалитите и
др. При сравняване с бази данни от дифрактограми на материали с извест-
на структура, от положението (2θ) на пиковете може да се определи съста-
вът на прахове, съдържащи (нано)кристални фази. Всеки от пиковете мо-
же да се индексира с трицифрена комбинация, изразяваща милеровите
112
индекси (h, k, l) на набора от равнини на решетката, свързани с наличието

на съответния дифракционен пик. Примерна дифрактограма на нанокрис-
тални частици от CdS е показана на фиг. 4.9.
Фиг. 4.8. Най-често използваното относително разположение на източника, пробата и

детектора при прахов рентгено-дифракционен анализ
Ширината на дифракционните пикове може да служи като индикатор

за размера на кристалните области; по-широките пикове отговарят на по-
малки кристали в пробата. От ширината на пиковете може да се определи
размерът на кристалитите (микроскопични, дори наноразмерни кристал-
ни области) като се използва уравнението на Шерер (Scherrer):
K
D (4.1)
 cos
Тук D е средният размер на кристалните области, К е безразмерен

фактор (отчитащ формата на кристалитите; обикновено се дават стойност
за К = 0,9), λ е дължината на вълната на използваното рентгеново лъчение,
β е ширината Δ(2θ) на дифракционния пик (FWHM) в радиани (получена
след изваждане на апаратното уширение), θ е ъгълът, на който съответства
максимума на пика.
Пиковете в дифрактограмата са резултат от усилване на амплитудата
(конструктивна интерференция) на разсеяните от частиците в кристалната
решетка рентгенови лъчи. Условието за такава конструктивна интерфе-
ренция се дава от закона на Браг (Bragg) (фиг. 4.10):
2d sin   n (4.2)
113
Където n е цяло число, а d е разстоянието между дифракционните рав-

нини (междуплоскостно разстояние; interplanar distance). Междуплоскост-
ното разстояние от първи порядък (n = 1), съответстващо на пиковете (dhkl)
може да бъде изчислено от съответната стойност на ъгъла θ.
(а)
(б)
Фиг. 4.9. Рентгенова дифрактограма на нанокристален FeO(OH) (акаганеит) – нанопръчки
с дължина около 20 nm и дебелина около 5 nm. По абсцисата: (а) 2θ, или (б) d – между-
плоскостно разстояние, Å (връзката между 2θ и d се дава от закона на Bragg)
От междуплоскостните разстояния, съответстващи на пиковете в диф-

рактограмата, може да се получи информация за параметрите на елемен-
114
тарната клетка на кристалната решетка. Елементарните клетки са парале-

лепипеди с различна форма в зависимост от симетрията на структурата.
Дължината на ръбовете на елементарната клетка (a, b, c) се означават като
параметри на решетката (lattice parameters). В най-простия случай на
кубична симетрия (a = b = c) параметърът а може да се изчисли от между-
плоскостното разстояние и индексите на пиковете:
a  d hkl h 2  k 2  l 2 (4.3)
Фиг. 4.10. Схематична илюстрация на дифракця на рентгенови лъчи. Два лъча с еднаква
честота и фаза достигат и се разсейват от два различни атома от две равнини от кристален
образец. Долният лъч изминава допълнителна дължина от 2dsinθ. Усилване на амплитуда-
та (конструктивна интерференция) ще настъпи, когато тази дължина е равна на цял брой
пъти дължината на вълната (nλ)
При известни параметри на решетката би могло да се изчисли обемът

на елементарната клетка и при известни брой и вид на атомите, които я
изграждат (съответно техните маси) съществува възможност да се изчис-
ли плътността на кристалната структура. Обикновено плътностите на
материалите, определени от дифрактограмите са по-високи от плътности-
те определени експериментално за обемните материали поради наличието
на дефекти в обемните образци.
За разлика от кристалните материали, в чиито дифрактограми се на-
блюдават серии от ясно изразени дифракционни пикове, в дифрактогра-
мите на аморфните материали се наблюдава широк фонов сигнал (често
означаван като аморфно хало). В частично кристализирали материали (на-
пример някои полимери) може да се определи степента на кристалност
чрез рентгенографско изследване. На практика за определяне на редица
параметри от дифрактограмите се използват компютърни програми за ав-
томатимчна обработка на данните.
115
3.2. Електронна дифракция
С трансмисионен електронен микроскоп (ТЕМ) може да се проведе

кристалографски анализ, известен като електронна дифракция в селекти-
рана област (Selected Area Electron Diffraction, SAED), чрез която се
определя кристалната структура и веществото в определена област от
образеца (Goodhew et al., 2001, p. 40). Принципът на получаване на елек-
тронната дифрактограма е подобен на рентгеновата дифракция, но със
съществената разлика, че могат да бъдат изследвани малки области от
образеца, с размер около няколко стотин нанометра (при XRD се анали-
зират много по-големи области, до няколко сантиметра). SAЕD се означа-
ва като „селектирана“, тъй като може да се избере определена област от
образеца за получаването на дифракцонната картина чрез апертура на
пътя на електронния лъч. При структурно аморфни материали не се наб-
людава дифракционна картина (фиг. 4.11).
(a) (б)
Фиг. 4.11. (а) ТЕМ изображение и (б) електронна дифрактограма на аморфен наноразмерен
алуминиев(III) фосфат, AlPO4
При селектиране на единичен кристал за анализ се наблюдават еди-

нични точки в дифрактограмата. Най-често анализираните материали са
поликристални, съдържащи множество кристали в различна ориентация.
Електронната дифрактограма на такива материали показва пръстени и
може да се използва за идентификация на веществото, подобно на рентге-
новата дифракция (фиг. 4.12).
116
(a) (б)
Фиг. 4.12. (а) ТЕМ изображение и (б) електронна дифрактограма на кристален нанораз-
мерен железен(III) оксихидроксид, FeO(OH)
3.3. Неутронна дифракция
При изследване на материалите с неутронната дифракция се използват

неутрони с ниски енергии (≤0,025 eV), т.нар. студени и топлинни неутро-
ни, които се получават в ядрени реактори. Дължината на вълната (по Де
Бройл) на такива неутрони е λ~0,1 nm, тоест съизмерима с междуатомните
разстояния, което ги прави подходящи за дифракционни експерименти.
Наличието на магнитен момент на неутрона е в основата на магнитната
неутронна дифракция, при която се изследва микроскопичната магнитна
струкутура на материалите (Izyumov and Ozerov, 1995). Сред предимства-
та на неутронната дифракция пред ренгеновата са чувствителност към
леки атоми, по-голяма протикваща способност (възможност за анализ на
обектите в дълбочина) и липса на опасносност от йонизиращо увреждане
на обекта (Kisi and Howard, 2008).
4. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МОЛЕКУЛНА МАСА
Определянето на молекулната маса на полимери може да е рутинна

практика при анализа на лекарствени наноносители на полимерна основа.
Тези методи най-общо се разделят на абсолютни, при които директно се
определя молекулната маса (или молекулно-масовото разпределение), и
относителни, при които е необходимо предварително калибриране на
117
измерваната величина по отношение на стандарти с известна молекулна

маса. За целите на изследванията е важно и определянето на индекса на
полидисперсност (PDI = Mw/Mn), който се явява своебразна мярка за ши-
рината на молекулно-масовото разпределение. Тук ще бъдат описани са-
мо общите принципи на два метода: гел-проникващата хроматография и
MALDI-TOF мас-спектрометрията.
4.1. Гел-проникваща хроматография
Гел-проникващата хроматография (gel-permeation chromatography, GPC)

е вид хроматография, при която молекулите в анализираната проба се раз-
делят според големината им чрез пропускане през колона, изпълнена със
сфери от специален порьозен гел (вж. гел-филтруване; Гл. 2, §2.3) (Striegel
et al., 2009). Разделянето става на принципа на молекулно-ситовата хрома-
тография, като по-малките молекули от анализираната проба навлизат по-
лесно в порите и остават там за по-дълго време, което води до по-големи
времена на задържане (retention time). Съответно по-големите молекули в
по-малка степен навлизат в порите и се отмиват от колоната по-бързо.
Размерът на порите на гела могат да са различни и се подбират според
приблизително очакваното молекулно-масово разпределение на пробата.
Ако молекулите на полимера са твърде големи спрямо порите, те няма да
се задържат, а ако са твърде малки, ще се задържат напълно в гела. Ако
анализираната проба съдържа твърде различни по размери молекули,
следва да се използва комбинация от гелни сфери с различен размер на
порите за постигане на ефективно разделяне на отделни фракции. Апара-
турата е подобна на останалите автоматизирани хроматографски техники,
като вида на използваните детектори на изхода на колоната зависи от
характера на анализираната проба (фиг. 4.13). Детекторите могат най-
общо да отчитат промяна в индекса на рефракция, абсорбцията или флуо-
ресценция на светлина с определена дължина на вълната.
Фиг. 4.13. Принципна схема на GPC хроматографска апаратура
118
Гел-проникващата хроматография се използва при определянето на

относителната молекулна маса и молекулно-масовото разпределение в
анализираната проба след предварително калибриране с подходящо под-
брани стандарти (например монодисперсни образци от полистирен или
полиетиленгликол с малък индекс на полидисперсност, PDI<1,2). Чрез
определяне на времето (или обема) на задържане на монодисперсните
стандарти (например разтвори на монодисперсен полистирен в тетрахид-
рофуран или полиетиленгликол във водна среда) се построява калибро-
въчна крива, даваща зависимостта между логаритъма от молекулната ма-
са (lgM) и времето (или обема) на задържане. Чрез използване на получе-
ната калибровъчна крива за дадените условия може да бъде определена
молекулната маса на неизвестна проба полимер при същите условия. Хро-
матографската колона е поместена във въздушен термостат, който под-
държа постоянна, по-висока от стайната температура, но по-ниска от тем-
пературата на кипене на елуента. Постоянството на температурата на
колоната е от ключово значение за възпроизводимо разделяне и постоян-
ни времена на задържане.
4.2. MALDI-TOF мас-спектрометрия
Мас-спектрометрията с матрично подпомогната лазерна десорбция-

йонизация, известна като MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption-
Ionization Time-Of-Flight) често намира приложение при анализ на моле-
кулно-масовото разпределение на полимерни материали и биологични
макромолекули (Hillenkamp and Peter–Katalinic, 2007). При този вид мас-
спектрометрия макромолекулните йони се получават чрез йонизация с
матрично подпомогната лазерна десорбция. Този подход минимизира
фрагментацията на макромолекулите, която би се наблюдавала при полз-
ване на по-конвенционални йонизационни техники. Анализът с MALDI-
TOF включва следните стъпки: 1) получаване на твърд разтвор на пробата
в матрицата; 2) възбуждане на матрицата; 3) йонизация на аналита (поли-
мера); 4) определяне m/z на получените йони (фиг. 4.14).
В качеството на матрица се използват нискомолекулни летливи орга-
нични съединения, обикновено с киселинен характер (благоприятстващ
йонизирането на полимерните молекули). Приготвя се смесен разтвор на
аналита с матричното вещество обикновено в смес от разтворители и се
нанася върху метална подложка. При кристализирането на матрицата вър-
ху подложката, молекулите на аналита остават диспергирани в матрицата.
Молекулите на матрицата притежават хромофорна група определяща
силна абсорбция на светлина в УВ или ИЧ областта, така че да абсорбират
119
бързо и ефективно енергията на лазерното лъчение и лесно да преминават

в газова фаза при облъчване с лазерен импулс. За възбуждане на матрица-
та често се използва импулсен азотен лазер (с дължина на вълната 337
nm), но намират приложение и други лазери (вкл. излъчващи в ИЧ областта).
Фиг. 4.14. Принципна схема на MALDI-TOF MS анализ
След абсорбиране на енергията от лазера молекулите на матрицата

преминават в газова фаза, а заедно с тях и диспергираните в матрицата
молекули на аналита. Тъй като аналитът може да не е равномерно диспер-
гиран в матрицата, се прилага серия от множество лазерни импулси в раз-
лични области на пробата за получаване на статистически усреднен резул-
тат (диаметърът на лазерния лъч е много по-малък от пробата). Молеку-
лите на аналита могат да се йонизират чрез приемане на протон от молеку-
лите на матрицата (или друго вещество, добавено в матрицата, което лес-
но отдава протони, например трифлуороцетна киселина) или отдаване на
електрон към молекулите на матрицата (при използване на нафталенови
матрици). При този тип йонизация (MALDI) се получават предимно едно-
зарядни катиони, а за определяне отношението маса/заряд (m/z) на полу-
чените макромолекулни йони в комбинация с MALDI се използва мас-
спектрометър (MS), който анализира времето на прелитане (time-of-flight;
TOF). При този вид мас-спектрометри йоните се ускоряват в електрично
поле, при което скоростта им зависи от отношението m/z. Измерването
времето на прелитане на йоните до достигане на детектора позволява
определянето на отношението m/z. Например времето на прелитане на
еднозарядни йони ще зависи от масата им (по-тежките йони достигат по-
ниски скорости). Някои прибори са снабдени с йонен рефлектор, който
отразява йоните с магнитно поле, като по този начин се увеличава ефек-
тивно дължината на изминатия от йоните път, повишавайки резолюцията
на метода. MALDI обикновено се извършва във вакуум (<10 mTorr), но са
известни и техники за йонизация при атмосферно налягане, както и
йонизация на аерозоли.
120
Освен за определяне на молекулно-масововото разпределение на син-

тетични полимери, MALDI-TOF MS се прилага и за идентификация на
биологични макромолекули. Например чрез такъв метод са анализирани
адсорбирани върху наночастици макромолекули (Shastri et al., 2015).
5. ТЕРМИЧНИ МЕТОДИ
5.1. Термогравиметрия
Термогравиметрията (Thermogravimetric analysis, TGA) се състои в

проследяване на изменението на масата на дадена проба при повишаване
на температурата. Получените графики се означават като термограви-
метрични криви. Методът е подходящ за твърди проби, които променят
масата си вследствие на реакция, в която участва изходно вещество или
продукт в газообразно състояние. Термогравиметрията позволява да се
определя термична стабилност на материалите, процеси на дехидратация,
окисление, определяне на летливи компоненти, реакционни процеси и
състав на пробата (Haines, 1995, p. 22).
Типичната апаратура за TGA се състои от прецизна везна с контейнер
за поставяне на пробата, инсталирана в пещ с програмируем контрол на
температурата. При някои експерименти температурата може да се под-
държа постоянна и да се проследява скоростта на намаляване на масата
на пробата (статична или изотермична термогравиметрия). При квази-
статичната термогравиметрия температурата се променя стъпаловидно
през определени изотермични интервали, през които се установява пос-
тоянство на масата на пробата. При динамичната термогравиметрия тем-
пературата се променя с постоянна скорост. Данните обикновено се пред-
ставят като маса или процент от началната маса като функция на темпера-
турата или времето (т.нар. TGA крива). При анализа на данните намира
приложение и първата производна на TGA кривата. Методът е подходящ
за анализ на полимерни материали и намира приложение при разработва-
нето на полимерни наноносители за лекарства.
5.2. Диференциална сканираща калориметрия
Диференциалната сканираща калориметрия (Differential Scanning Ca-

lorimetry, DSC) е термоаналитичен метод, при който се измерва разликата
в количеството вложена топлина за поддържане на пробата и на референ-
тния материал (еталон) в изотермични условия при линейно повишаване
121
(сканиране) на температурата. Методът намира приложение за изследване

на топлини на реакции (чрез определяне на площта под кривата), фазови
преходи, термични стабилности, състав и чистота на проби, определяне
на критични температури, фазови диаграми и други. Методът намира
широко приложение при анализ на лекарствени вещества и полимерни
материали, за определяне температури на топене (Tm), кристализация (Tc)
и встъкляване (Tg). При достигане на температурата на топене се наблю-
дава ендотермичен пик, докато при кристализацията на аморфно тяло се
наблюдава екзотермичен пик в DSC кривата. Промените в топлинния
капацитет на пробата се отчита като отместване (поява на стъпка) на базо-
вата линия. Например покачване на базовата линия е типично за встъкля-
ването на полимери (при температурата Tg) (Haines, 1995, p. 63). Алтерна-
тивна на DSC техника е диференциалният термичен анализ (DTA), при
който се проследява температурната разлика между пробата и еталон като
функция от температурата. При еднакво нагряване на пробата и еталона
протичането на процеси с топлинни ефекти (фазови преходи, химични
реакции) предизвиква разлика в температурата на пробата и еталона. DSC
анализът намира приложение и във фармацевтичните нанотехнологии,
например за установяване на състоянието на активната субстанция, кога-
то е включена в полимерни наночастици (Joshi et al., 2010).
РЕЗЮМЕ
Микроскопски методи. Поради субмикронния размер на обектите в нанотехноло-
гиите намират приложение основно различните видове електронна микроскопия, а
също така и сондовите микроскопи. При сканиращия електронен микроскоп (SEM)
се наблюдава повърхността на обектите, като за тази цел обикновено е необходимо
непроводящите обекти да бъдат покрити с тънък слой метал или въглерод. При
наблюдение с трансмисионен електронен микроскоп (ТЕМ) електронният лъч пре-
минава през обектите и може да се наблюдава тяхната вътрешна структура. И при
двата вида електронна микроскопия обектите са сухи и се намират под вакуум по
време на изследването. Електронната микроскопия позволява елементен анализ на
изследваните образци чрез рентгенов микропробен анализатор. Атомно-силовият
микроскоп (AFM) е вид сондов микроскоп, чрез който повърхността на образеца се
сканира чрез острие прикрепено на конзола. Образецът не се намира под вакуум.
Спектрални методи. Широко използвани спектрални методи за структурен анализ
на наночастици са инфрачервената (ИЧ, IR) и ядрено-магнитно резонансната (ЯМР,
NMR) спектроскопия. Чрез ИЧ спектроскопията се установяват определени химични
връзки и/или функционални групи в изследваните наночастици или материали, от
които са изградени частиците. За целта пробата се суспендира в органичен разтвори-
тел или се таблетира в калиев бромид. ЯМР спектроскопията се оказва най-полезна
122
за изследване на органични (предимно полимерни) наночастици, но някои твърдотел-

ни ЯМР анализи могат да се окажат полезни и при неорганични наночастици. ЯМР
спектросокпията се прилага за определяне на включеното в органични наноносители
лекарство, за начина на свързване на лекарството с носителя, а някои дифузионни
техники позволяват проследяване на лекарствено освобождаване от наноносителя.
Дифракционни методи. Дифракционните методи за структурен анализ се основават
на дифракцията на лъчения, чиято дължина на вълната е съизмерима с разстоянията
между атомите. Получените при това дифрактограми дават информация за кристал-
ната структура на образеца, за състава на отделните кристални фази, размер на крис-
талитите, степен на кристалност и др. Най-широко приложение намира рентгеновата
дифракция на прахообразни образци (XRD). Електронни дифрактограми могат да
бъдат получени чрез трансмисионен електронен микроскоп (ТЕМ). Предимство на
електронната дифракция (SAED) е възможността да се анализират много малки и
определени области от образеца, наблюдаван чрез микроскопа. При неутронния диф-
ракционен анализ се използват нискоенергетични (студени и топлинни) неутрони,
които се получават в ядрени реактори.
Определяне на молекулна маса. Молекулно-масовото разпределение на полимери-
те, от които са изградени лекарствените наноносители е важна тяхна характеристика,
за определянето на която се прилагат основно два метода – гел-проникваща хромато-
графия (GPC) и мас-спектрометрията с матрично подпомогната лазерна десорбция-
йонизация (MALDI-TOF MS). GPC хроматографията се основава на разделяне на мо-
лекулите според големината им чрез пропускане през колона със сфери от порьозен
гел, при което по-малките молекули се задържат по-дълго време в порите, а по-голе-
мите молекули се отмиват от колоната по-бързо. При MALDI-TOF MS макромоле-
кулните йони се получават чрез йонизация при матрично подпомогната лазерна де-
сорбция, при което се минимизира фрагментацията на макромолекулите. За опреде-
ляне отношението маса/заряд (m/z) на получените макромолекулни йони се използва
мас-спектрометър, анализиращ времето на прелитане.
Термични методи. При термогравиметрията (TGA) се проследява изменението на
масата на пробата при повишаване на температурата, при което се получава инфор-
мация за термичната стабилност, процеси на дехидратация, окисление, отделяне на
летливи компоненти. При диференциалната сканираща калориметрия (DSC) се из-
мерва разликата в количеството вложена топлина за поддържане на пробата и еталона
в изотермични условия при линейно повишаване на температурата, при което се по-
лучава информация за топлини на реакции, фазови преходи и други.
123
Глава 5
ОСНОВИ НА НАНОФАРМАКОЛОГИЯТА
Предмет на нанофармакологията. Взаимодействия между наночастици и

протеини (понятие за протеинова корона, методи за изследване, значение за
наномедицината). Ендоцитоза на наночастици (ендоцитозни механизми,
вътреклетъчен трафик и екзоцитоза, значение за наномедицината). Фарма-
кокинетика на наночастиците (фармакокинетични параметри и модели, пъти-
ща на въвеждане, биоразпределение, разграждане и отделяне). Лекарствено
доставяне с наноносители (изисквания към наноносителите, целево лекар-
ствено доставяне, доставяне на антимикробни средства, доставяне на проти-
вотуморни средства и нановаксини). Лекарствено освобождаване от нано-
носители (механизми на освобождаване, освобождаване в резултат на сти-
мул, определяне профила на освобождаване и количествено описание на
освобождаването).
1. ПРЕДМЕТ НА НАНОФАРМАКОЛОГИЯТА
Нанофармакологията изучава приложението на нанотехнологиите за

разработка на наноносители за доставяне на различни биологично актив-
ни вещества (лекарства, антигени, нуклеинови киселини, хормони и др.)
и наночастици за диагностика, както и изучаване на взаимодействията на
тези нанопрепарати с живия организъм (Jain et al., 2014). Наноносителите
представляват различни наночастици или други колоидни системи (на-
пример полимерни мицели или мембранни резервоарни системи, каквито
са липозомите), изградени от биоразградими и нетоксични материали и
способни да играят ролята на вектор (преносител) за фармакологичния
агент. Прилагането на наноносители има за цел подобрение на терапев-
124
Глава 5. Основи на нанофармакологията
тичния индекс на лекарственото вещество чрез повишаване на ефектив-

ността и/или понижаване на нежеланите реакции. Това би могло да се
осъществи чрез подобряване на бионаличността, повишаване пермеаби-
литета (пропускливостта) на различни физиологични бариери по отноше-
ние на активната субстанция и доставянето до патологичната област или
мястото на действие.
За нанофармакологията имат значение взаимодействията на наноно-
сителите с протеини, ендоцитозата им от различни видове клетки и начи-
на на въвеждане в организма, като всички те определят локализацията (т.
нар. биоразпределение) на наноносителите. Елиминирането на наноноси-
телите (и/или продуктите на метаболитното им разграждане) от организ-
ма е от ключово значение за успешното им клинично приложение и осно-
вен проблем в съвременната нанофармакология. В научната литература
се усеща липса на достатъчно данни за биоразградимостта и скоростта на
елиминиране от организма за немалка част от предлаганите наноносители.
Тук разглеждаме и някои от принципите на целево доставяне на различни
фармакологични агенти (антимикробни, противотуморни средства и вак-
сини). Трябва да се има предвид, че преминаването на наночастици през
физиологични бариери (кръвно-мозъчна, плацентарна и др.) създава не
само възможности за терапевтични приложения, но следва да се разглеж-
да и от позициите на нанотоксикологията.
2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ НАНОЧАСТИЦИ И

ПРОТЕИНИ
2.1. Понятие за протеинова корона
Взаимодействието на наночастиците с протеини е от особено голям

интерес за биомедицинските нанотехнологии поради няколко причини.
Първо, наночастиците взаимодействат практически почти веднага след
въвеждането им в организма с различни вещества от биологичните теч-
ности, най-вече с различни протеини, адсорбиращи се по повърхността
им. Тези протеини формират около наночастицата т.нар. протеинова ко-
рона – сложна по състав и динамична (изменяща се във времето) про-
теинова обвивка и определят в голяма степен по-нататъшните ѝ взаимо-
действия с организма (Lynch and Dawson, 2008; Aggarwal et al., 2009;
Capjak et al., 2017). Второ, наночастиците, предназначени за диагностика
и биосензори, често се използват в среда, съдържаща протеини. В други
случаи протеиновата обвивка на частиците е в основата на биосензорното
125
им приложение. Във всички тези случаи доброто разбиране на взаимо-

действията между наночастиците и протеините е в основата на разработ-
ването на по-ефективни лекарствени наноносители и биосензорни систе-
ми за диагностика.
Взаимодействията между протеини и твърди повърхности, в т.ч. и
наночастици, са най-вече електростатични (вандерваалсови) (Rabe et al.,
2011). При контакт с кръвна плазма в протеиновата корона на практичес-
ки всички видове наночастици се установяват едни и същи кръвни плаз-
мени протеини (албумин, имуноглобулини, фибриноген, аполипопро-
теини и др.), вероятно поради това, че тези протеини се намират в отно-
сително високи концентрации в плазмата (Cedervall et al., 2007). Главните
протеинови компоненти на плазмата преобладават в началните моменти
от формирането на протеиновата корона, като с времето биват замествани
от протеини с по-ниска концентрация в плазмата, но с по-голям афинитет
към наночастиците до установяване на равновесно състояние, т.нар. ефект
на Вроман (Vroman effect) (Göppert and Müller, 2005). Също така следва
да се има предвид, че когато наночастиците се дислоцират от кръвта в
различни части на тялото (междуклетъчно пространство, вътреклетъчни
части, лимфни съдове, туморна тъкан и др.), различията в протеиновия
състав и концентрации в тези части на организма могат да окажат влияние
върху състава на протеиновата корона.
Голяма част от изследванията на взаимодействията между наночасти-
ци и протеини са насочени към различни протеини от кръвната плазма
(албумин, имуноглобулини, фибриноген, трансферин, аполипопротеини
и др.) и ефекта им върху свойствата на различни наночастици (промяна в
електрокинетичните свойства, стабилността на дисперсиите и др.). Пока-
зано е, че електричният заряд на частиците (съответно, електрокинетич-
ният им потенциал) оказва съществен ефект върху адсорбцията на проте-
ини. Относително неутралните (но стерично стабилизирани) наночастици
се отличават с относително малко количество адсорбирани протеини в
сравнение със заредените (Owens and Peppas, 2006). Положително зареде-
ните наночастици адсорбират предимно протеини с изоелектрични точки
по-малки от 5,5 (напр. албумин), докато отрицателно заредените адсорби-
рат предимно протеини с изоелектрични точки над 5,5 (напр. имуногло-
булини IgG) (Gessner et al., 2003). Трябва да се има предвид, че при
смесване на положително заредени наночастици със среда, съдържаща
протеини, зарядът им обикновено се променя в отрицателен в резултат на
адсорбция на протеиновите молекули. В биологични среди, включително
в среди за клетъчно култивиране (които съдържат разтворени протеини),
е много вероятно наночастиците да имат отрицателен ζ-потенциал.
126
Хидрофобността на частичковата повърхност оказва влияние както на

количеството, така и на вида адсорбирани протеини от кръвната плазма
(Göppert and Müller, 2005a; Cedervall et al., 2007). Хидрофобните нано-
частици адсорбират протеини относително по-бързо и в по-големи коли-
чества от хидрофилните (Owens and Peppas, 2006). Фактори като размер,
форма и морфология на частиците оказват влияние на количеството, но
не и на качествения профил (вида) на адсорбираните протеини (Cedervall
et al., 2007).
Модификацията на наночастиците с хидрофилни полимери се ползва
широко сред изследователите за намаляване адсорбцията на протеини. За
тази цел често се прилага полиетиленгликол (PEG), а съответните моди-
фицирани частици се означават като PEGилирани (PEGylated). Тези нано-
частици са в по-малка степен разпознаваеми от фагоцитите и могат да
циркулират в кръвообращението по-дълго време в сравнение със съот-
ветните немодифицирани частици и са получили жаргонното означение
„стелт“ (Gref et al., 2020; Rampado et al., 2020). Молекулните вериги на
PEG възпрепятстват адсорбцията на голямо количество протеин чрез
своята хидрофилност и стерична стабилизация на частиците. Адсорбция-
та на протеини намалява с увеличаване молекулната маса на PEG (от 2 до
20 kDa), както и с повишаване плътността на разположение на молекулни-
те PEG вериги по повърхността на наночастиците (Gref et al., 2000). PEG-
илираните наночастици се поглъщат в по-малка степен от неутрофилите
и макрофагите при по-плътно разположени PEG молекули (Gref et al.
2000) и по-голяма молекулна маса на PEG, като по този начин се увели-
чава времето на циркулация на наночастиците в кръвообращението. По
този начин PEGилираните наночастици се явяват подходящи за доставяне
на лекарства до солидни тумори чрез ефекта на повишена пропускливост
и задържане (EPR) (вж. §5.4).
2.2. Методи за изследване
При част от методите за изследване на взаимодействието между нано-

частици и протеини наночастиците се диспергират в среда, съдържаща
протеини (кръвна плазма или друга биологична течност, или изкуствено
приготвена моделна система), и след определено време частиците се раз-
делят от дисперсната среда (чрез центрофугиране, гел-филтруване, елек-
трофореза и др.) с последващо десорбиране на адсорбираните протеини и
тяхната идентификация. Идентификацията на протеините може да се
осъществи с различни методи, като мас-спектрометрия (MALDI-TOF),
127
имуноблот (известен също като western blot), аминокиселинно секвениране

(Aggarwal et al. 2009).
При други изследвания се изучават взаимодействията между нано-
частици и определен вид протеин в проста моделна система (съдържаща
само изследвания протеин, а не сложни смеси, каквито са биологичните
течности). В този случай може да се установят ефектите на различни фак-
тори върху адсорбцията на даден вид протеин. За целта се използват ня-
кои класически подходи за изследване на адсорбция, както и някои по-
съвременни и чувствителни методи за изследване на динамични и равно-
весни взаимодействия между макромолекули. Такива методи се явяват
повърхностният плазмонен резонанс (SPR) и изотермичната титрувална
калориметрия (ITC).
2.2.1. Повърхностен плазмонен резонанс (SPR)
Повърхностният плазмонен резонанс (SPR) се използва като чувстви-

телен метод за изследване на адсорбционни/десорбционни процеси и
взаимодействие между макромолекули и наночастици (Baird et al., 2002;
Kim et al., 2010; Canovi et al., 2012; Parta et al., 2016; Yordanov et al., 2016;
Chain et al., 2021) (вж. Гл. 8, §6.1). При този метод се имобилизира слой
от протеин или наночастици върху специален сензорен чип (стъклена
подложка с нанесен слой от злато с дебелина около 50 nm и покрит най-
често с ораганично вещество с карбоксилни групи, например карбокси-
метилиран декстран или бифункционални висши мастни киселини). Имо-
билизацията се осъществява чрез химично свързване (конюгиране) между
подложката и протеина (или наночастиците), притежаващи подходящи за
целта функционални групи. Чрез микрофлуидна система над сензорния
чип с имобилизирания протеин се пропуска дисперсия на наночастиците
и се измерва относителното количество адсорбирани върху протеиновия
слой частици (при другия вариант се пропуска поток от протеинов разтвор
над сензорен чип с имобилизирани върху него наночастици и се измерва
относителното количество адсорбиран върху тях протеин). Адсорбирано-
то количество вещество се определя рефрактометрично чрез измерване
изменението на индекса на рефракция в непосредствена близост до повър-
хността на сензорния чип (по същество, SPR апаратът представлява чув-
ствителен рефрактометър). Методът позволява получаване на информа-
ция относно кинетичните и термодинамичните (равновесни) константи на
взаимодействието наночастица–протеин след прилагане на подходящи
теоретични модели за интерпретиране на експерименталните данни.
128
2.2.2. Изотермична титрувална калориметрия (ITC)
Изотермичната титрувална калориметрия (Isothermic Tittation Calori-

metry, ITC) представлява калориметричен метод, при който се измерва
топлината на молекулни взаимодействия при постоянна температура.
ITC калориметърът се състои от две адиабатно изолирани клетки, за пос-
тавяне на пробата и на еталон. Клетките са снабдени с термодвойки и на-
греватели, чрез които прецизно се контролира температурата и се измер-
ват топлинните потоци. По време на анализа веществото, взаимодейства-
що с пробата, се прибавя на малки порции към пробата, при което темпе-
ратурната разлика между двете клетки се поддържа равна на нула. При
екзотермичен процес по време на титруването в клетката с пробата се
отделя топлина, което води до намаляване мощността на нагревателя на
клетката с пробата (за да остане темперурата същата, като тази на етало-
на). При ендотермичен процес мощността на нагревателя на клетката с
пробата се увеличава. Данните от анализа се представят чрез мощността,
необходима за поддържане на нулева температурна разлика между про-
бата и еталона, като функция на времето. Тази графика се състои от серия
пикове на мощността, като всеки пик съответства на порция прибавен
титрант. Интегрирането на пиковете по времето дава общото количество
обменена топлина при титруването. Обменената топлина като функция на
молното съотношение титрант–аналит дава информация за стехиометрията
на взаимодействието, енталпията на реакцията, и други термодинамични
данни. В биомедицинските нанотехнологии методът намира приложение
за изследване на взаимодействията между биологични макромолекули и
наночастици (Huang and Lau, 2016), както и за изследване на взаимодей-
ствията между лекарства и наноносители (Huang Z. et al., 2020).
2.3. Значение за наномедицината
Взаимодействието между протеини от кръвта и наночастици, които са

предназначени за инжекционно приложение, е от първостепенно значе-
ние за наномедицината. Приблизително 50 различни протеини от човешка
кръвна плазма (съдържаща повече от 3700 вида протеини) са установени
в състава на протеиновата корона на различни наночастици (Aggarwal et
al. 2009). Някои от тези протеини са опсонини (различни имуноглобули-
ни, фактори на комплемента – C1q, C3b и др.) – вещества, които улесняват
разпознаването и поглъщането (фагоцитирането) на наночастиците от
фагоцититиращите клетки (вж. §3) и по този начин оказват влияние върху
129
разпределението на наночастиците в организма, тяхната биосъвмести-

мост и съответно терапевтичния ефект. Следва да се има предвид, че
физикохимичните свойства на наночастиците, взаимодействията с про-
теини и фармакокинетиката им могат съществено да зависят от това дали
наночастиците са натоварени с лекарство (или друго вещество) или не са
(Papini et al., 2020).
Адсорбцията на протеини може да доведе до промени на ефективния
размер на наночастиците (размерът на адсорбираните протеинови моле-
кули е от порядъка на размера на най-малките наночастици, <10 nm) и на
техния ζ-потенциал. От своя страна тези промени могат да окажат ефект
върху ендоцитозата на наночастиците от различни клетки и съответно до
промяна в биоразпределението им. Адсорбцията на опсонини води до
усилена фагоцитоза и концентриране на наночастиците във фагоцитите и
като цяло в органите от ретикулоендотелната система, черния дроб, дала-
ка и др. (Owens and Peppas, 2006; Abbina et al., 2020; Papini et al., 2020). В
други случаи, например при относително здраво адсорбиран албумин, се
препятства адсорбцията на други протеини (вкл. опсонини) и може да се
счита за антиопсонин, при което се установява удължено време на цирку-
лация на частиците в кръвообращението (Ogawara et al. 2004). Установе-
но, че определени плазмени протеини могат да насочат наночастиците
към съответни рецептори. Например адсорбцията на някои аполипопро-
теини улеснява ендоцитозата на наночастиците от ендотелните клетки на
мозъчните капиляри и преминаването им през кръвно-мозъчната бариера
(Kreuter et al., 2002; Kreuter, 2012).
Адсорбцията на опсонини е нежелана в случаите на доставяне на про-
тивотуморни средства до солидни тумори, тъй като опсонизацията насоч-
ва наночастиците към фагоцитите, а не към туморната тъкан, намалявайки
времето на циркулация на наночастиците в кръвообращението (съответ-
но, намалявайки EPR ефекта; вж. §5.4). Това води до нежелано натрупване
на наночастици с токсичен товар в нормални, нецелеви тъкани и органи и
компрометиране на лечебния ефект. Понякога обаче опсонизацията е же-
лана, тъй като, усилвайки фагоцитозата, води до акумулиране на наночас-
тиците в клетките и органите на ретикулоендотелната система в случаите,
когато това е целта, например при доставяне на противомикробни агенти
до инфектирани фагоцитиращи клетки (при вътреклетъчни инфекции)
(Pinto–Alphandary et al., 1994; Briones et al., 2008), доставяне на антигени
и ваксинални компоненти до антиген-презентиращите клетки (макрофа-
ги, дендритни клетки) (Peek et al., 2008; Kheirollahpour et al., 2020), доста-
вяне на противовъзпалителни средства до неутрофилите (Wang Z. et al.,
2014; Shi and Li, 2020) и др.
130
3. ЕНДОЦИТОЗА НА НАНОЧАСТИЦИ
Терапевтичните приложения на наночастици, най-вече на наносите-

лите на биологично активни вещества, често изискват проникване в опре-
делени клетки и специфична вътреклетъчна локализация. Наночастиците
могат да попаднат във вътреклетъчното пространство чрез различни
механизми, някои от които са все още недостатъчно изучени. Ендоци-
тозата е главният мехнизъм за попадане на наночастици в живи клетки,
при който частиците се поглъщат от клетката чрез активен (използващ
енергия) процес на вгъване на клетъчната мембрана. При това от страната
на цитоплазмата се получава малка вакуола, наречена ендозома (фагозома
или фаголизозома в случая на фагоцитоза), носеща погълнатата наночас-
тица (Sahay et al. 2010; Foroozandeh and Aziz, 2018; Donahue et al., 2019).
Процесът, при който ендоцитозата на наночастица от едната страна на
функционално поляризирана клетка се последва от преминаване на ендо-
зомата към другата част на клетката и сливане с клетъчната мембрана с
отделяне съдържанието на ендозомата извън клетката (екзоцитоза), като
цяло се означава като трансцитоза (преминаване през клетката). Трансци-
тоза на наночастици се наблюдава например при ендотелните клетки,
които покриват съдовите стени откъм лумена и изграждат стените на
капилярите. Ендоцитозата на наночастици от различни клетки е главен
фактор, който определя биоразпределението им в организма след инжек-
ционно въвеждане и се определя основно от физикохимичните свойства
на частиците (Zhao et al., 2019).
3.1. Ендоцитозни механизми
Видовете ендоцитоза се класифицират според механизма на процеса и

участващите в него специфични клетъчни протеини (Sahay et al., 2010).
Според тази класификация двата основни вида ендоцитоза са фагоцитоза
и пиноцитоза, като пиноцитозата бива клатрин-зависима и клатрин-
независима (фиг. 5.1). Разграничават се няколко варианта клатрин-неза-
висима ендоцитоза – макропиноцитоза, кавеолин-медиирана ендоцитоза,
и кавеолин- и клатрин-независима ендоцитоза (зависещи от различни
други протеини, като Arf6, Cdc42, Flotilin, RhoA). Вътреклетъчният
трафик и локализация на наночастиците до голяма степен се определят от
ендоцитозния механизъм, който може да е различен при различни видове
клетки и може да зависи от повърхностната модификация и характерис-
тики на частиците.
131
Фиг. 5.1. Класификация на видовете ендоцитоза според протеините, които участват в

процеса (по Shahay et al., 2010)
При изследване механизмите на проникване на наночастици в живи

клетки, наред с методи за визуализация на отделни етапи от процеса като
трансмисионната електронна микроскопия (ТЕМ), се използват различни
химични вещества, които инхибитори на различните механизми на ендо-
цитоза и конкретният вид ендоцитоза се установява по метода на изключ-
ването. Изпозват се и други вещества в качеството на маркери, за които е
установен механизмът на ендоцитозата им от клетките и се проверява за
колокализация (намирането им в едни и същи ендозоми) на тези вещества
с изследваните наночастици. Например определени протеини, за които е
известен механизмът на ендоцитоза, се маркират с един вид флуоресцен-
тен маркер, а изследваните наночастици – с друг флуоресцентен маркер,
след което чрез конфокален микроскоп се проследява вътреклетъчното
разпределение на тези маркери. Активно проникване на наночастици в
клетките се доказва чрез третиране с натриев азид или деоксиглюкоза,
които инхибират производството на АТФ (натриевият азид инхибира
окислителното фосфорилиране, докато деоксиглюкозата инхибира глико-
лизата) и съответно индиректно инхибират процесите в клетките, които
изискват химична енергия (каквито са всички видове ендоцитоза, както и
екзоцитозата). Метил-бета-циклодекстринът свързва холестерол и по този
начин инхибиха кавеолин-медиираната ендоцитоза (кавеолите са липид-
ни рафтове, богати на холестерол). При опитите за установяване точните
механизми на ендоцитоза и за извеждане на обобщения от различни екс-
перименти обаче трябва да се имат предвид следноте неща (Sahay et al.,
2010; Rennick et al., 2021):
1. Ендоцитозните инхибитори не са строго специфични и могат да
нарушат редица други функции в изследваните клетки.
132
2. Инхибирането на един ендоцитозен механизъм може да доведе

до компенсационно стимулиране на друг механизъм.
3. Едини и същи по вид и свойства наночастици могат да бъдат
ендоцитирани чрез различни механизми от различни видове
клетки и различни клетъчни линии.
4. Ендоцитозният механизъм зависи от физикохимичните свойства
на наночастиците (размер, повърхностни свойства на частиците,
вид на адсорбираните върху тях протеини и др.).
5. Скоростта на ендоцитозата и понякога вътреклетъчният трафик
зависят от механизма на ендоцитоза.
Фагоцитозата е процес, открит още през 1882 г. от Иля Мечников,
при който фагоцитите (макрофаги и др.) поглъщат частици с размери до
около 20 µm, явявайки се част от клетъчната имунна защита от микро-
организми. Мечников е удостоен с Нобелова награда за медицина заедно
с Паул Ерлих (открива хуморалния имунитет) през 1908 г. Фагоцитозата
се осъществява от професионалните фагоцити (различни макрофаги, мо-
ноцити, неутрофилни гранулоцити, дендритни клетки, остеокласти и
еозинофили). Някои други клетки (фибробласти, епителни и ендотелни
клетки) също могат да поглъщат относително големи частици чрез напо-
добяващ фагоцитозата процес (Hillaireau and Couvreur, 2009). При фаго-
цитозата участват актин и други моторни протеини, при което се образу-
ват псевдоподи – удължения на клетъчната мемрана, обхващащи части-
цата при поглъщането. Бързото понижаване концентрацията на наночас-
тици в системното кръвообращение след интравенозно въвеждане се дъл-
жи на фагоцитозата им от фагоцитите. Като цяло, процесът протича в
следните етапи:
1) опсонизация – адсорбция на опсонини (комплементни фактори,
имуноглобулини и други протеини) върху повърхността на наночасти-
ците; опсонините са такива макромолекули, които биват разпознавани от
фагоцитните рецептори и така улесняват фагоцитозата на частиците,
2) разпознаване (чрез Fc-, комплементни и други рецептори) на опсо-
низираните наночастици от фагоцитните клетки, и
3) поглъщане на наночастицата от фагоцита чрез обгръщане с псевдо-
поди и образуване на мембранна везикула, наречена фагозома (която
може да има различни размери, в зависимост от размера на фагоцитира-
ния обект, от няколко десетки нанометра до десетки микрометра).
Макрофагите могат да погълнат и обекти, които превишават собстве-
ния им размер. Това се реализира чрез сливането на няколко макрофага в
една голяма и многоядрена клетка, наричана синцитиум.
133
Клатрин-зависима ендоцитоза (СМЕ, clathrin-mediated endocytosis) –

включва образуване на обвита от белтъка клатрин ендозома на мястото на
взаимодействие между рецептори от клетъчната мембрана и наночасти-
цата. След образуването на ендозомата клатриновата обвивка се разпада
и клатринът отново се използва за образуването на други ендозоми. Учас-
тието на клетъчни рецептори в процеса е наложило понятието рецептор-
медиирана ендоцитоза като синоним на СМЕ, но това вече се оспорва, тъй
като някои клатрин-независими ендоцитозни механизми също зависят от
специфични лиганд-рецепторни взаимодействия (Rennick et al., 2021).
Наночастиците могат да бъдат целево модифицирани с определени лиган-
ди, чрез които да бъдат целево насочени за рецептор-медиирана ендоци-
тоза (Bareford and Swaan, 2007). Клатрин-стабилизираните ендозомни
везикули са с диаметър около 100 nm и се предполага, че това е оптимал-
ният размер на наночастиците, които могат да се поместят в тях, но има
доклади, според които и по-големи частици биват поглъщани чрез СМЕ
(Rennick et al., 2021).
Макропиноцитозата протича с формиране на придвижвани чрез ак-
тин псевдоподи, които заграждат относително големи обеми извънкле-
тъчна течна среда, която се включва в състава на ендозома, наречена
макропинозома. Разновидност на този механизъм е бил наблюдаван при
макрофаги, поглъщащи някои разтворими субстанции, в т.ч. антигени
(Doodnauth et al., 2019). Чрез макропиноцитоза клетките поемат също така
разтворими протеини, които служат за източник на аминокиселини и
енергия (Rennick et al., 2021).
Кавеолин-медиираната ендоцитоза се осъществява чрез кавеолите и
белтъка кавеолин. Кавеолите са вид липидни рафтове, области от клетъч-
ната мембрана богати на холестерол, които се характеризират с присъс-
твието на мембранния протеин кавеолин и представляват колбообразни
вдлъбнатини на клетъчната мембрана към цитоплазмата (Lajoie and Nabi,
2010). Кавеолите са особено много в ендотелните клетки, където се смята,
че участват в регулацията на ендотелния транспорт на вещества и сигна-
ли. Вътрешността на кавеолите е с диаметър около 50 nm и се предполага,
че оптимално биха включили наночастици, които са с по-малък диаметър.
При попадане на наночастици в тях от кавеолите се формира ендозома
(кавеозома), която може да има неутрално рН във вътрешността си, но са
известни и примери за полимерни мицели и липозоми, попадащи чрез
кавеозомите във вторични лизозоми с кисело рН (Sahay et al., 2010). Въз
основа на по-нови проучвания обаче се поставят под въпрос някои
предишни твърденията за ролята на кавеолите в ендоцитозата на наночас-
тици (Rennick et al., 2021).
134
3.2. Вътреклетъчен трафик и екзоцитоза
Важни въпроси, които се явяват при всеки случай на ендоцитоза на

наночастици в даден вид клетки, са: каква е съдбата на тези частици в
клетката, разграждат ли се частиците в енодозомите и с каква скорост,
какво се случва с продуктите на разграждане, до какви други вътрекле-
тъчни органели могат да достигнат попадналите в клетката наночастици,
отделят ли се наночастиците от клетката чрез екзоцитоза и т.н. Тези
въпроси имат пряко отношение към въпросите на нанотоксикологията и
механизмите на оксидативния стрес в клетките, предизвикан от ендоци-
тирани наночастици (вж. Гл. 6, §3).
След ендоцитоза образуваната ендозома може да се слее с други ендо-
зоми или с лизозоми. Получената ендозома след фагоцитоза, която се
слива с лизозоми (съдържащи смилателни ензими в кисела среда; с пони-
жено рН) се нарича фаголизозома. Продуктите на разграждане от фаголи-
зозомата могат да напуснат клетката чрез екзоцитоза – сливане с клетъч-
ната мембрана и изхвърляне съдържанието на ендозомата в извънкле-
тъчното пространство. Също така възможен е транспорт на ендозомните
везикули до някои други мембранни клетъчни структури (Iversen et al.,
2011). Създадени са и наночастици, които могат да се освобождават от
ендозомите и да попадат в цитоплазмата (където отделят натовареното в
тях вещество в случай, че изпълняват роля на наноносители). Такова
„ендозомно освобождаване“ на наночастици може да се реализира по
различни механизми, които включват: набъбване на полимерни наночас-
тици (свързване на водородни катиони от киселата среда на ендозомното
съдържимо с аминогрупи от полимера и образуване на поликатион), де-
стабилизация и лизиране на ендозомната мембрана, сливане с ендозомна-
та мембрана и други (Ahmad et al., 2019; Smith et al., 2019). Някои възмож-
ни пътища за вътреклетъчен трафик на наночастици са илюстрирани на
фиг. 5.2.
Екзоцитозата е широко изследвана, но в по-малка степен от ендоци-
тозата и трудно могат да се направят обобщени изводи. Може да протече
от десетки минути до дни след първоначалната ендоцитоза и различна
част от първоначално погълнатите частици напускат клетката чрез екзо-
цитоза в зависимост от вида на клетката и характеристиките на наночас-
тиците. В отделни изследвания с различни наночастици е установено, че
скоростта на екзоцитоза е по-висока при наночастици с по-малък размер
и при нанопръчки в сравнение с наносфери (Oh and Park, 2014a). В някои
случаи бързата екзоцитоза може да е нежелана, тъй като намалява времето
135
на престой на наночастиците в ендозомите, съответно времето на дейст-

вие, ако са приложени с терапевтична цел, но от друга страна дълготрай-
ното задържане на ендоцитирани наночастици в клетките може да окаже
нежелани токсични ефекти (Sakhtianchi et al., 2013).
Фиг. 5.2. Илюстрация на някои пътища на вътреклетъчен трафик и локализация на нано-

частици след ендоцитозата им: (1) ендоцитоза на наночастицата и образуване на ендозома,
(2) екзоцитоза, (3) освобождаване на наночастицата в цитоплазмата чрез разкъсване на
ендозомната мембрана, (4) дълготрайно акумулиране на наночастици в ендозоми, (5)
локализация в други вътреклетъчни компартименти (ендоплазмен ретикулум, комплекс на
Голджи)
3.3. Значение за наномедицината
При инжекционно приложение голяма част от наночастиците попадат

чрез ендоцитоза (фагоцитоза) във фагоцитите (макрофаги, неутрофили),
както и в ендотелни клетки. Това е нежелано в случаите, при които тези
клетки не са целта, до която трябва да достигнат частиците. Например при
наночастици за целево доставяне на лекарства до тумори, поглъщането
им от фагоцитите до голяма степен компрометира това им приложение.
За да бъде намалена фагоцитозата им, такива частици често се модифици-
рат с хирофилни полимери, например PEG, което удължава циркулацията
им в системното кръвообращение. Модификацията с PEG обаче потиска
ендоцитозата на наночастици от целевите (раковите) клетки, което създа-
ва т.нар. PEG дилема (PEG dilemma). За разрешаване на тази дилема се
предлагат различни стратегии – например чрез преобръщане заряда на
частиците в патологичната среда (с по-ниско рН) в областта на тумора
(Hama et al., 2015) или чрез отделяне на PEG веригите от повърхността на
частиците в областта на тумора (Fang et al., 2017).
136
При нормални и ракови клетки са установени различни ендоцитозни

механизми, които биха могли да се използват за селективно насочване на
наночастици към такива ракови клетки. Такъв пример е използването на
някои омрежени полимерни мицели за доставяне на противоракови сред-
ства, които селективно проникват в ракови епителни клетки, но не в нор-
мални епителни клетки като резултат от различни ендоцитозни механиз-
ми (Sahay et al. 2010a). Тези мицели се поглъщат от раковите клетки чрез
ендоцитоза, каквато не се проявява от съответните нормални епителни
клетки в същата анатомична област.
Вътреклетъчното доставяне на наночастици до фагоцитите е всъщност
целта на приложението на някои нанолекарствени форми, например при
доставяне на антигени чрез наночастици (нановаксини) до макрофагите
(които са антиген-презентиращи клетки и участват в изработването на
имунния отговор) (Peek et al., 2008; Kheirollahpour et al., 2020), доставяне
на антибиотици до макрофаги, които са инфектирани с микроорганизми
(Salmonella, Micobacteria) (Couvreur et al., 1991; Pinto–Alphandary et al.,
1994; Briones et al., 2008), при доставяне на противовъзпалителни вещест-
ва до неутрофилите (Wang Z et al., 2014; Shi and Li, 2020) и др. Доставяне-
то на наноразмерен ферихидроксид до макрофагите при третиране на
желязодефицитни състояния (някои анемии) чрез лекарствени форми за
инжекционно приложение също се явява цел на терапията, при която по-
падналият във фагоцитите ферихидроксид се разтваря бавно, а отделените
ферийони се транспортират чрез кръвната плазма (свързани с трансфе-
рин) до костния мозък, където участват в образуването на хемоглобин в
предшествениците на еритроцитите (Schwenk, 2010; Fütterer et al., 2013).
При ендотелните клетки, които изпълняват своеобразни бариерни
функции (покриват стената на кръвоносните съдове откъм лумена и
изграждат стените на капилярите), може да се осъществи трансцитоза на
наночастиците – ендоцитоза от едната страна на клетката (например от
към лумена), последвана от екзоцитоза от другата страна на клетката.
Смята се, че чрез такава трансцитоза през мозъчните капиляри някои
наночастици преминават през кръвно-мозъчната бариера (Kreuter, 2012).
4. ФАРМАКОКИНЕТИКА НА НАНОЧАСТИЦИТЕ
За изясняване взаимодействието на различните нанострукутри с орга-

низма е необходимо да се изясни по какъв начин става навлизането им в
организма, разпределението в различните клетки, тъкани и органи, мета-
137
болизма и елиминирането (или задържането) им. Такива данни се полу-

чават от in vivo експерименти върху лабораторни животни и в по-късни
етапи от проучванията – при прилагане върху пациенти. Фармакокине-
тиката на наночастиците включва абсорбцията (резорбцията), разпределе-
нието, метаболизма (биотрансформацията) и излъчването (екскрецията) от
организма. Елиминирането обхваща механизмите на намаляване концен-
трацията им в организма чрез метаболизиране и екскреция. За определяне
концентрацията на наночастици в биологични среди се подбират методи
според вида на наночастиците. Ако частиците са метални или изградени
от метални оксиди, най-често се прилага метод за определяне на метала,
но често с тези методи не може да се различи включен в частиците метал
или отделен от тях. Наночастици могат да се проследяват в организма и
чрез маркиране с радиоактивни изотопи. Ако наночастиците се явяват но-
сители на лекарствени вещества, най-често се определя концентрацията,
съответно се проследява фармакокинетиката на лекарственото вещество.
Повечето конвенционални методи за определяне на лекарствени вещества
обаче не разграничават включеното вещество в наноносителя и свобод-
ното вещество в кръвната плазма.
4.1. Фармакокинетични параметри и модели
Площ под кривата (area under the curve, AUC) е площта (интегралът)
на кривата, която описва промяната в концентрацията на веществото в
кръвната плазма като функция на времето. Често се пресмята по метода
на трапеците, но се прилагат и други, по-точни методи (Purves, 1992). При
интравенозно въвеждане на препарата концентрацията му в кръвната
плазма се повишава много бързо (в рамките на секунди), след което започ-
ва да намалява с времето в резултат на процеси на преразпределение в
тъканите, метаболизиране и екскреция. При други пътища на въвеждане,
например перорален, времето (tmax) за достигане на максимална плазмена
концентрация (Cmax) е по-голямо, при което в кривата концентрация-вре-
ме се наблюдава ясен максимум. Включването на лекарствени вещества в
наночастици за интравенозно приложение променя вида на кривата и
съответно AUC за лекарственото вещество (в сравнение с невключеното
в частици вещество). Например включването на препарата 10-хидрокси-
камптотецин в полимерни (РВСА) наночастици увеличава Cmax и AUC
съответно 6,52 и 7,56 пъти (Jin et al., 2018).
Бионаличност (F) е онази част (изразена в проценти) от приложеното
вещество, която достига до системното кръвообращение. При интраве-
нозно (i.v.) приложение се приема, че F = 100%. При други, екстравазални
138
(e.v.) начини на приложение обикновено F<100% и може да се определи

чрез съпоставяне на съответните AUC и приложени дози (уравнение 5.1):
AUC e.v dosei.v.
F (%)   (5.1)
AUCi.v. dosee.v.
При сравнение на AUC за различни лекарствени форми на едно ве-
щество се определя относителната бионаличност на тестваната лекар-
ствена форма спрямо друга, приета за стандарт. Изпозването на наночас-
тици може да промени абсорбцията и съответно бионаличността на лекар-
ствените вещества. Например вграждането на лекарствени вещества в
липидни наночастици може да повиши бионаличността при перорално
приложение (Wang Y et al., 2020).
Обем на разпределение (Vd), определян като привиден, не е физиоло-
гичен обем, а обемът, който би заело веществото, ако се приеме, че кон-
центрацията му е тази, която е измерена в кръвната плазма. Веществата,
които са стабилно свързани с плазмени протеини или ограничени в рамки-
те на кръвта имат относително малки стойности на Vd (от порядъка на
няколко литра) в сравнение с вещества, които относително бързо напус-
кат кръвообращението и се локализират в различни тъкани (например
липофилни вещества, които се натрупват в мастната тъкан).
Плазмен полуживот или време на полуелиминиране (t1/2) е времето, за
което концентарцията на веществото в кръвната плазма намалява до 50%
от максималната стойност (Сmax). Времето на полуелиминиране не зависи
от приложената доза и начина на приложение. Плазменият полуживот
може да се увеличи многократно чрез включване на лекарственото ве-
щество в дългоциркулиращи наночастици за интравенозно приложение
(Abdifetah and Na–Bangchang, 2019). В тези случаи обаче веществото цир-
кулира в кръвообращението не в свободна форма, а свързано (включено)
в наноносителя.
Клирънс (Cl) е мярка за елиминирането на веществото от организма.
Включването на лекарствени вещества в наноносители за инжекционно
приложение по принцип намалява елиминирането им като възпрепятства
бъбречната филтрация и забавя метаболизирането на веществото чрез
забавеното освобождаване от наноносителя.
Трябва да се има предвид, че използването на наноносители на лекар-
ствени вещества за инжекционно приложение може да повиши плазмения
полуживот и площта под кривата, както и да забави елиминирането, но
това не означава непременно подобряване действието на веществото, тъй
139
като през повечето време то е включено в самия наноносител, т.е. не се

намира в биологично активната си свободна форма.
За количествено описание на фармакокинетиката се ползват различни по
сложност модели, които най-общо разглеждат организма като съставен от
различен брой компатименти (пространства). При еднокомпартиментния мо-
дел организмът се разглежда като един компартимент, в който се разпределя
веществото. При двукомпартиментния модел организмът се разглежда
като съставен от един централен компартимент – кръвта и периферен –
тъканите, а при още по-сложния трикомпартиментен модел освен цен-
тралния кръвен има два тъканни компартимента (съответстващи на по-
добре и на по-слабо кръвоснабдени тъкани и/или органи).
4.2. Пътища на въвеждане
Наноносителите на биологично активни вещества могат да се прилагат

в качеството им на терапевтични или диагностични агенти чрез всички
известни от класическата фармакология пътища на въвеждане – външно
върху кожата или открити лигавици (под формата на суспензии, мазила,
гелове, прахове), ентерално (чрез храносмилателната система), паренте-
рално (различни от ентералното въвеждане, най-често инжекционни пъ-
тища, инхалаторно и др.). Голяма част от експерименталните лекарствени
форми в наномедицината са на вещества с антитуморно действие и нано-
форулировки на ваксини, които предполагат в повечето случаи инжек-
ционно въвеждане. Наночастиците, предназначени за третиране на солид-
ни тумори, се въвеждат най-често интравенозно (i.v.), но понякога се
въвеждат и интраартериално (i.a.), в артерията, която захранва туморната
формация. Клиничният опит е показал, че интравенозното въвеждане на
наночастичкови дисперсии е желателно да бъде бавно, а дисперсиите на
наночастиците да са относително разредени с цел минимизиране вероят-
ността за реакция на свръхчувствителност, проявяваща се като остър рес-
пираторен синдром с белодробен оток (Merle et al., 2017). Интравенозното
въвеждане на наночастици се прилага и при доставяне на антибиотици до
инфектирани с микроорганизми клетки (например макрофаги), като в то-
зи случай намиращите се в системното кръвообращение частици биват
фагоцитирани от инфектираните клетки (Briones et al., 2008).
Интрамускулното (i.m.) и подкожното (s.c.) въвеждане на наночастици
се използва тогава, когато се цели доставяне на частиците и товара им до
лимфните възли, тъй като междуклетъчната течност от мусуклите и под-
кожието се дренира чрез лимфата и лимфните съдове до регионарните
лимфни възли. Този път за въвеждане може да се използва за доставяне
140
на ваксини, при които имунният отговор се изработва основно чрез иму-

нокомпетентните клетки в лимфните възли (Schudel et al., 2019). Методът
би могъл да се приложи и за доставяне на противоракови агенти до
лимфни метастатични огнища и други неоплазии на лимфните органи (Liu
J. et al., 2019). Трябва да се има предвид, че само по-малките наночастици,
с размери по-малки от 30–50 nm, могат да дифундират лесно през между-
клетъчните пространства, а по-големите частици в голяма степен остават
локализирани в мястото на инжектиране в свободен вид или погълнати от
тъканни макрофаги, неутрофили или дендритни клетки. Дендритните
клетки могат да фагоцитират наночастици и да ги транспортират, мигри-
райки от мястото на инжектиране до лимфните възли (Harizaj et al., 2019).
Интраперитонеалното (i.p.) въвеждане представлява инжектиране в
коремната кухина (перитонеум) и често се ползва при лабораторни екс-
перименти с мишки. При този път на въвеждане наночастиците в голяма
степен се фагоцитират от перитонеалните макрофаги. Освен това i.p. ин-
жектирането на наночастици предоставя възможност за доставяне до
медиастиналните лимфни възли (Maincent et al., 1992).
Ентерално, например перорално (p.o.), могат да бъдат въвеждани най-
различни видове наночастици, които в повечето случаи са носители на
малкоразтворими във вода вещества и следователно липидните частици
се оказват най-подходящи за тази цел. В повечето случаи този подход
улеснява резорбцията, респективно бионаличността на натовареното в
частиците вещество (Wang Y. et al., 2020). В някои случаи се установява
преминаване на наночастици през чревната лигавица, особено по-малки
частици, докато по-големи частици не преминават през лигавицата (Jani
et al., 1990). В други случаи най-често при метални наночастици, се
установява, че над 99% от перорално приложената доза остават непро-
менени при преминаването им през храносмилателния тракт (Van der
Zande et al., 2012; Hinkley et al., 2015).
4.3. Биоразпределение
Разпределението на наночастиците в различните органи и системи на

организма, т.нар. биоразпределение, най-подробно е изучено при различ-
ните пътища на инжекционно въвеждане. При подкожно, интрамускулно
и интраперитонеално инжектиране голяма част от наночастиците бива
поглъщана от тъканните макрофаги и други фагоцитиращи клетки и/или
попадат в лимфата и биват дренирани до регионалните лимфни възли
(Maincent et al., 1992; Harizaj et al., 2019; Liu J et al., 2019). Биоразпреде-
141
лението на наночастици приложени интравенозно силно зависи от физи-

кохимичните им характеристики, които на свой ред определят скоростта
на взаимодействието им с протеини и ендоцитозата им от макрофаги,
неутрофили и ендотелни клетки (Owens and Peppas, 2006; Capjak et al.,
2017). Най-общо, относително по-големи частици и/или такива с по-хид-
рофобна повърхност биват фагоцитирани бързо след въвеждането им в
системното кръвообращение, където плазменият им полуживот е отно-
сително кратък, от порядъка на няколко минути. Тези частици се локали-
зират бързо във фагоцитите и частично в ендотелните клетки, най-вече в
тъканните макрофаги на черния дроб (т.нар. купферови клетки), далака и
други органи. В другата крайност са т.нар. дългоциркулиращи наночас-
тици, чиито плазмен полуживот може да достигне десетки часове. Тези
частици са относително по-малки по размер и са с хидрофилна повърх-
ност (най-често обвити с хидрофилни полимери); известни са в научната
литература с жаргонното означение стелт-частици (Rampado et al., 2020).
Попадащите във фагоцитите частици биха били полезни при експери-
менти по доставяне на лекарствени вещества или антигени именно до тези
клетки, докато дългоциркулиращите частици биха могли да намерят при-
ложение за доставяне на лекарства до солидни тумори чрез т.нар. EPR
ефект (вж. §5.4) и/или чрез целево активно насочване и контролирано
(и/или стимулирано) освобождаване. Ако наночастиците не са дългоцир-
кулиращи, те ще бъдат погълнати от фагоцитите преди да достигнат целе-
вата тъкан или орган.
Наред с целевото разпределение на наночастиците в организма те
могат да се локализират и в нецелеви клетки, тъкани и органи, което да
доведе до нежелани ефекти. В някои органи, като черния дроб и далака,
има кръвоносни съдове с миниатюрни отвори в ендотелната стена, фене-
страции, през които е възможно да проникнат малки наночастици и това
следва да се има предвид при дизайна и приложението на такива системи
за лекарствено доставяне. Също така ендоцитозата на наночастици от ен-
дотелните клетки, които покриват стената на всички кръвоносни съдове
откъм лумена, може да се окаже нежелано. Възможностите за локализа-
ция на инжекционно (най-вече интравенозно) приложени наночастици в
костния мозък, в бъбреците и други органи също трябва да се имат пред-
вид, особено когато това не са целевите локации за доставяне на лекарст-
ва. При изследванията на биоразпределението на наночастици в организ-
ма трябва да се отчитат и евентуалните възможности тези частици да
достигат и преодоляват различни физиологични бариери, като кръвно-
мозъчна (Yokel, 2020), ендотелна (Skotland and Sandvig, 2021), плацен-
тарна (Bongaerts et al., 2020) и др.
142
4.4. Разграждане и отделяне
При приложението на наночастици за диагностични и терапевтични

цели, които предполагат въвеждането им в живия организъм, възниква
важният въпрос с тяхната разградимост и отделяне от организма, тъй като
бавноразградими и акумулиращи се в клетките и организма частици могат
потенциално да доведат до неблагоприятни последствия. Ако такива на-
ночастици са изградени от биоразградими и биоусвоими органични мате-
риали (липиди, протеини, някои полизахариди, полиаминокиселини, по-
лилактид и др.), попадайки в организма, биха могли да бъдат разградени
до нискомолекулни усвоими компоненти от клетъчни ензими (например
от лизозомните ензими след ендоцитоза). Това са и най-предпочитаните
материали за получаване на наноносители на биологично активни ве-
щества. Трябва да се има предвид обаче, че скоростта на разграждане
може съществено да се забави, ако при получаването на наноносители са
използвани агенти за химично омрежване с цел подобряване или осигуря-
ване стабилността на наноструктурата. Материали като химично омрежен
хитозан, особено под формата на наночастици, както и някои други син-
тетични полимери са все още с недостатъчно изяснено биоразграждане в
ендозомите.
Разграждането на повечето неорганични наночастици (метални, ок-
сидни, хидроксидни, изградени от малко разтворими соли) зависи от
разтворимостта им в ендозомната среда, от рН и от присъствието на хела-
тиращи агенти (органични вещества, способни да образуват разтворими
комплексни съединения с металните йони от състава на неорганичните
наночастици). Разградимостта на металните наночастици зависи от вида
им, от вида и концентрацията на окислително действащите видове (супер-
оксини йони, водороден пероксид) в ендозомите, от рН в ендозомите и др.
Отделянето на бавноразградими наночастици може да се разгледа на
две нива – на ниво клетка и елиминиране от организма. Сред клетъчните
механизми най-важен се явява активното екскретиране на съдържимото
на лизозомите/ендозомите чрез екзоцитоза (Fröhlich, 2016). Екзоцитозата
е процес, при който става сливане на ендозомната с клетъчната мембрана
и съдържимото на ендозомата се изхвърля извън клетката. Счита се, че
някои епителни клетки с транспортни и секреторни функции, както и бър-
зо делящите се клетки по-ефективно от други елиминират наночастици.
При експерименти със златни наночастици е установено, че по-малки по
размери частици биват екзоцитирани по-бързо в сравнение с по-големи
143
при еднакви други условия (Chithrani and Chan, 2007). Скоростта на екзо-
цитозата също така силно зависи от вида на клетките, съответно от кле-
тъчните линии използвани в in vitro експериментите.
Има два основни пътя на отделяне на наночастици от организма – чрез
бъбреците и чрез т.нар. хепатобилиарен път – екскреция в чревния тракт
чрез жлъчката. Полезна схема за ориентировъчна оценка на възможности-
те за отделяне на наночастици, намиращи се в системното кръвообращение,
е дадена на фиг. 5.3 (по Poon et al., 2007).
Фиг. 5.3. Схема за ориентировъчна оценка на възможностите за отделяне на наночастици

от системното кръвообращение
Чрез бъбреците могат да се отделят нискомолекулни вещества и хид-

рофилни полимери с молекулни маси до около 40 kDa (Longley et al.,
2013), както и наночастици с размери по-малки от 6 nm (Choi et al., 2007).
При попадане на бавноразградими частици в купферовите клетки могат
да се задържат относително дълго време. Чрез хепатобилиарния път могат
да бъдат елиминирани наночастици, които не са погълнати от макрофаги
и могат да преминат през ендотела на синусоидните кръвоносни съдове в
144
черния дроб. Това обикновено са относително малки частици, с размери

<100 nm, които могат да преминат през фенестрациите в синусоидалния
ендотел, въпреки че и по-големи частици преминават бавно през ендо-
телната бариера, по всяка вероятност чрез трансцитоза (Poon et al., 2019).
По-нататък наночастиците преминават чрез трансцитоза през хепатоци-
тите и попадат в жлъчните пътища, след което – в червата, и се отделят с
фецеса. При изследвания, проведени с различни по размер златни нано-
частици, въведени интравенозно в мишки е установено, че не повече от
10% от приложената доза се отделя от организма за 14-дневен период
дори за най-малките частици (4 nm), докато едва <1% от по-големите
частици (>50 nm) се отделят за същия период (Poon et al., 2019). Отделя-
нето на наночастици по хепатобилиарния път до голяма степен се възпре-
пятства от поглъщането на частиците от фагоцитите.
5. ЛЕКАРСТВЕНО ДОСТАВЯНЕ С НАНОНОСИТЕЛИ
5.1. Изисквания към наноносителите
За лекарствените форми с наноносители важат условията за безопас-

ност и регулациите, които са въведени за всички лекарствени средства
(Patra et al., 2018). При прилагането на наноносители за лекарствено
доставяне в терапевтични концентрации те не трябва да предизвикват
остра и хронична токсичност, некроза, възпаления и остри имунни реак-
ции, тромбоза, емболия, хемолиза и други нежелани ефекти. Наноноси-
телите за интравенозно приложение трябва да запазват колоидната си
стабилност в кръвта и да не образуват агрегати, които да предизвикат
емболия. При биоразграждането на носителя не трябва да се получават
продукти, които са токсични и/или трудни за елиминиране от организма.
Системите за лекарствено доставяне с наноносители могат да бъдат
съхранявани като течни дисперсии, само ако са стабилни при условията
на съхранение, частиците не агрегират и лекарственото вещество не пре-
търпява химично превръщане. В някои случаи дисперсиите могат да
бъдат съхранявани в замразено състояние в присъствие на подходящи
криопротектори. Поради химическата нестабилност на някои от компо-
нентите при дълготрайно съхранение във водна среда, често се налага
съхранение в суха форма. За тази цел се използват методи за сушене
(лиофилизация, разпрашително сушене), позволяващи запазване целостта
на носителя и биологичната активност на натовареното вещество.
145
Задължително условие за системите за инжекционно приложение е да

бъдат стерилни. Автоклавирането, както и други топлинни обработки,
често са неподходящи за стерилизиране на наноносители, тъй като тем-
пературната обработка (обикновено над 100 °C) може да доведе до деста-
билизиране на колоидното състояние на наноносителите и химично пре-
връщане (дезактивиране) на натоварените в тях биологично активни ве-
щества (лекарства). Повечето системи с наноносители могат успешно да
бъдат стерилизирани чрез облъчване с различни видове лъчения (UV
светлина, рентгенови или гама-лъчи). Някои вещества обаче се оказват
нестабилни при тези условия и могат да претърпят химично превръщане
(например фотохимично превръщане при облъчване с UV светлина или
радиолиза при облъчване с високоенергетично йонизиращо лъчение).
Дисперсии на наноразмерни системи могат да бъдат пречистени от бакте-
рии чрез филтруване през мембранни филтри с размери на порите <450
nm. Чрез тези филтри обаче не могат да бъдат отстранени по-малки
вируси и приони (вж. Гл. 2, §5).
Материалите за получаване на наноносители трябва да отговарят на
горепосочените биомедицински изисквания. Желателно е тези материали
да бъдат биосъвместими и биоразградими. Продуктите от биоразгражда-
нето им трябва да са лесно елиминируеми от организма. Скоростта на
биоразграждане на носителя следва да е съобразена с времето, необходи-
мо за доставяне на натовареното вещество до мястото на действие. Мате-
риалите за получаване на наноносители трябва да позволяват прилагането
на сравнително лесни процедури за натоварване на биологично активни
вещества, да предлагат възможности за контрол на физичните и химични-
те им свойства, лесна стерилизация, стабилност при дълготрайно съхране-
ние, възможности за получаване на сухи лекарствени форми и т.н.
Голямо значение като материали за получаване на колоидни носители
имат различни природни биополимери (главно различни протеини), липи-
ди, фосфолипиди и др. Тези материали са биоразградими и продуктите от
разграждането им са усвоими от организма. Човешкият серумен албумин,
който е главният белтъчен компонент на кръвната плазма, както и различ-
ни липиди и техни производни са особено перспективни материали за
получаване на наночастици за лекарствено доставяне.
Наред с природните материали за получаване на лекарствени носители
се използват и редица синтетични биосъвместими и биоразградими поли-
мери. Използването на синтетични полимери позволява сравнително лес-
но оптимизиране на химичните и физични свойства на носителите. Сред
най-използваните синтетични полимери за получаване на наноносители
146
са: поли(ε-капролактон) (PCL), полиалкилцианоакрилати (PACA), поли-

лактид (PLA) и поли(лактид-съ-гликолид) (PLGA). В допълнение, различ-
ни блок-съполимери, например на PLA и полиетиленгликол (PEG) или
поли(аминокиселини), могат да бъдат използвани за получаване на нано-
частици и мицеларни структури (вж. Гл. 10).
5.2. Целево лекарствено доставяне
Идеята за целево лекарствено доставяне е формулирана от германския

учен Паул Ерлих (Paul Ehrlich; 1854–1915) през XIX век (Winau et al.,
2004). Ерлих е удостоен с Нобелова награда за медицина през 1908 г. за
постижения в областта на имунологията, по-конкретно за откриване на
хуморалния имунитет (заедно с Иля Мечников, който открива фагоцито-
зата). Има също така съществени приноси в хистологията и третирането
на сифилис. Паул Ерлих популяризира концепцията за т.нар. магически
куршум – субстанция, чрез която да бъде разпознат и поразен само кон-
кретен патоген (Winau et al. 2004). Сред идеите на съвременната нано-
медицина като такъв миниатюрен „магически куршум“ може да се раз-
познае наноносител, натоварен с лекарствено вещество, който да достига
определени целеви клетки и тъкани, което многократно би повишило
ефективността на терапията (фиг. 5.4).
Фиг. 5.4. Схематична илюстрация на концепцията за „магически куршум“, която в

съвременните представи се припокрива с идеята за активно насочване
Насочването на лекарственото вещество се реализира чрез носителя,

който може да притежава афинитет към определени органи, тъкани и/или
клетки. Насочването чрез наноносители бива пасивно и активно. При
пасивното насочване, физичните и химичните свойства на носителя са
147
съобразени с физиологичните и хистологични характеристики на целева-

та част от тялото, така че да се повиши акумулирането на натоварения с
лекарство носител в тази част. Пасивното насочване зависи от различни
фактори (хидрофилност/хидрофобност на повърхността на носителя, раз-
мер на частиците, ζ-потенциал и др.) и макар да има определена селектив-
ност, липсва строга специфичност. За разлика от него активното насочва-
не се реализира чрез специфични взаимодействия между носителя и целе-
вите тъкани и/или клетки – например чрез реакции антиген–антитяло или
други специфични взаимодействия от вида рецептор–лиганд. Настоящите
усилия на учените са насочени основон към създаване на системи за
целево лекарствено доставяне, които да съчетават принципите на активно
и пасивно насочване (Attia et al., 2019).
Целевото лекарствено доставяне в идеалния случай би довело до:
– повишаване на лекарствената концентрация в мястото на действие,
например в патологично изменените клетки и тъкани;
– по-ниска лекарствената концентрация в непатологичните области;
– редуциране на нежеланите реакции;
– редуциране на ефективната лекарствена доза;
– повишаване на терапевтичния индекс.
В допълнение към гореспоменатите възможни положителни ефекти от
целевото лекарствено доставяне, използването на наноносители може да
улесни пренасянето на хидрофобни вещества с ограничена разтворимост
във вода (чрез вграждане в хидрофобното ядро на носителя), да повлияе
върху важни фармакокинетични параметри на лекарството, да предпази
нестабилни лекарствени молекули от бързо разграждане и да позволи кон-
тролирано освобождаване във времето.
Ефективното доставяне се определя не само от възможностите за ло-
кализация на наноносителя в организма, но и от скоростта на освобожда-
ване на лекарството. Особено предизвикателство представлява разработ-
ването на носители с контролирано освобождаване, особено такива, при
които освобождаването се стимулира и контролира чрез различни сти-
мули (Medeiros et al., 2011; Mi, 2020; Fang et al., 2021). При използването
на наноносители за лекарствено доставяне трябва да се има предвид и
възможността за възникване на нови странични ефекти, които не са харак-
терни за ненатовареното в носител лекарство, най-вече свързани с реак-
ции на свръхчувствителност към носителя (Merle et al., 2017) и други
нецелеви (off-target) ефекти (Liang et al., 2021).
148
5.3. Доставяне на антимикробни средства
Фагоцитите (неутрофили, моноцити, тъканни макрофаги) са ключови

компоненти на имунната система, които разпознават микроорганизми,
поглъщат ги чрез фагоцитоза и ги разрушават във фаголизозомите.
Наноносители с относително големи размери (>100 nm) и с хидрофобна
повърхност, по която лесно се адсорбират опсонини, биват фагоцитирани
от същите фагоцити и могат да бъдат използвани за доставяне на проти-
вомикробни средства до инфектирани фагоцити. Тази възможност е от
значение най-вече при третиране на вътреклетъчни патогени (Salmonella
spp., Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, и др.), които
могат да оцелеят във фаголизозомите на погълналите ги фагоцити и често
е трудно да бъдат елиминирани с конвенционални антибиотични терапии.
Вътреклетъчната локализация на тези микроорганизми ги предпазва от
въздействието на други защитни механизми на организма (антитела, ком-
плементни фактори и др.) и/или от антибиотици, които не могат да про-
никнат до фаголизозомното пространство. Активността на антибиотиците
към вътреклетъчни микроорганизми зависи от много фактори, но сред
основните проблеми е ограниченото проникване в инфектираните клетки.
Друг проблем с антибиотичното третиране на вътреклетъчните инфекции
е това, че много от тези микроорганизми се намират в „дремещо“ състоя-
ние, което спомага за тяхната нечувствителност към антибиотици. Чрез
натоварване на антибиотиците в наноносители може да се постигне подо-
брено доставяне до фаголизозомното пространство на инфектираните фа-
гоцити (Pinto–Alphandary et al., 1994, 2000; Gao et al., 2018; Vassallo et al.,
2020; Yeh et al., 2020).
Наноносителите, използвани за доставяне на лекарства до фагоцитите,
трябва да бъдат биосъвместими и биоразградими (да не се натрупват дъл-
готрайно в клетките и да не разстройват функциите им), да са достатъчно
стабилни, за да доставят лекарствения товар и да имат някои специфични
характеристики: i) веднъж в кръвния поток, те трябва да бъдат бързо опсо-
низирани, разпознати и погълнати от фагоцитите, което води до повиша-
ване концентрацията на лекарство в прицелните клетки (фагоцитите),
където се намира патогенът; ii) трябва да предотвратяват освобождава-
нето на лекарството преди достигане до фагоцитите и да позволят осво-
бождаването му във фаголизозомите; iii) доставеното до микроорганиз-
мите лекарство трябва да бъде в достатъчно висока концентрация, за да
се избегне развитието на лекарствена резистентност, като същевременно
се сведат до минимум нежеланите ефекти. Илюстрация на фагоцитозата
149
и вътреклетъчната локализация на натоварен с антибиотици наноносител

във фагоцитна клетка е показана на фиг. 5.5.
Фиг. 5.5. Илюстрация на фагоцитозата и вътреклетъчната локализация на натоварена с

антибиотик наночастица (NP) в инфектиран фагоцит: 1) фагоцитоза на наночастица, 2)
разрушаване на ендозомната мембрана и освобождаване на наночастицата в цитоплаз-
мата, 3) колокализация на наночастицата и бактерията в една фагозома, 4) екзоцитоза на
наночастицата. Възможна е и дифузия на освободен от частицата антибиотик, достигайки
до бактериите (означени с прекъсната линия)
Наноносителите могат да бъдат активно насочени към фагоцитите

чрез модифициране с лиганди, които се разпознават от рецептори на фаго-
цитите, като някои гликопротеини или полизахариди, завършващи с оста-
тъци от маноза (Patil and Deshpande, 2020). След достигане на фаголизо-
зомите лекарството може да се освободи от наноносителя по различни
механизми, в т.ч. дифузия от наноносителя или освобождаване след раз-
граждане и биоерозия на носителя, стимулирано освобождаване (индуци-
рано от промяна в рН, редокси потенциала, температурата) и др. Напри-
мер ефикасността на полимерни наночастици като носители на антибио-
тици до инфектирани макрофаги е демонтрирана още през 80-те години
на ХХ век (Fattal et al., 1989). При тези тестове са използвани натоварени
с ампицилин наночастици от поли(изохексилцианоакрилат) (PIНCA),
които са показали много по-добра ефективност в сравнение с невключен
в наночастици ампицилин при третиране на салмонелоза при мишки. Към
настоящия момент са разработени множество различни наноносители на
антибиотици (Gao et al., 2018; Vassallo et al., 2020; Yeh et al., 2020). По
отношение на нанолекарствените форми, предназначени за инжекционно
приложение, трябва да се има предвид възможността за претоварване на
фагоцитите с неразградими или бавноразградими наноносители, което
потенциално би довело до нарушаване на функциите им.
150
Наноносители също така могат да се окажат полезни при третиране на

вътреклетъчни гъбични инфекции, при които иначе са необходими отно-
сително високи дози лекарства, за да достигнат в терапевтични концен-
трации в клетките. Например разработени са някои липозомни формули-
ровки на амфотерицин Б, с цел да повишат противогъбичната активност
на фагоцитите (Vyas et al., 2000).
5.4. Доставяне на противотуморни средства
През 1986 г. е формулирана нова концепция за химиотерапия на рака

чрез използване на макромолекулни терапевтици, означавана като ефект
на повишена пропускливост и задържане (EPR, enhanced permeability and
retention) (Matsumura and Maeda, 1986), което десетилетия по-късно се
описва като едно от най-значимите постижения в областта на наномеди-
цината (Maeda, 2021). Ефектът се дължи на уникалната патологична мик-
росреда в злокачественте солидни тумори, характеризираща се със силно
пропускливи кръвоносни съдове с отвори (фенестрации) между ендотел-
ните клетки, осигуряващи туморните клетки с постоянен приток на храни-
телни вещества, както и нарушен или липсващ лимфен дренаж в сравне-
ние с нормалните тъкани. Кръвоносните съдове в нормалните тъкани са
непрекъснати и без фенестрации между ендотелните клетки (с изключе-
ние на някои съдове в далака и черния дроб), които са здраво свързани
заедно и са обвити от гладкомускулните клетки, изграждащи стената на
кръвоносния съд. Плътните контакти между ендотелните клетки не поз-
воляват на макромолекули, наночастици и по-големи структури от кръвта
да преминават свободно през съдовата стена, докато гладкомускулните
клетки могат да контролират размера на лумена на съдовете, участвайки
в контрола на кръвното налягане (фиг. 5.6).
За да се осъществи такова пасивно (за което не е нужно специфично
насочване към туморните клетки) доставяне до солидните тумори, мак-
ромолекулите следва да имат молекулна маса по-голяма от 40 kDa, която
съответства на максималната молекулна маса на макромолекула, която
може да се отделя от кръвта през бъбреците (ако веществото е с по-малка
молекулна маса се отделя относително бързо от бъбреците и напуска
кръвообращението, като по този начин няма достатъчно време, за да се
акумулира в тумора). Например албуминът (основният протеин в кръв-
ната плазма, с молекулна маса 67 kDa) лесно се концентрира в солидните
тумори чрез EPR ефект и това го прави интересен за разработка на проти-
воракови терапевтици (Kratz, 2008). Съответно EPR ефектът може да се
151
наблюдава при наночастици с размери >6 nm, които са достатъчно голе-

ми, за да не бъдат отделени от бъбреците (Choi et al., 2007). Първото ле-
карство, за което е описано акумулиране в солидни тумори чрез EPR
ефект е SMANCS (неокарциностатин, свързан със синтетичен съполимер)
(Matsumura and Maeda, 1986), за което е показана относително добра ефек-
тивност при бъбречни и чернодробни неоплазии (Maeda, 2012). Пред
ефективното използване на EPR ефекта обаче съществуват известни про-
блеми. Най-важното за неговото реализиране е колкото е възможно по-
бавна фагоцитоза на наноносителите от фагоцитите, което да позволи по-
дълго време на циркулиране в системното кръвообращение в относително
висока концентрация, за поне няколко часа. Това може да се постигне чрез
модификация на повърхността на наноносителя с хидрофилен полимер
(например PEG) или адсорбция на други антиопсонини (вещества, които
възпрепятстват адсорбцията на опсонини). Интересен пример е алтерни-
ращият съполимер поли(стирен-съ-малеинова киселина) (PSMA), образу-
ващ с албумина стабилен комплекс, подходящ за EPR-базирано насочване
към солидни тумори.
Фиг. 5.6. Схематична илюстрация на принципа на EPR ефекта, водещ до натрупване на

наночастици (NPs) в солидни тумори
Тази стратегия е използвана както при препарата SMANCS (Matsumura

and Maeda, 1986), така и при PSMA-базирани конюгати на антрациклини.
Забележителен резултат е постигнат с пирарубицин, свързан с PSMA при
in vivo експeрименти с мишки, при които е постигнато унищожение на
туморите при всички тествани животни (при доза, еквивалентна на 20
mg/kg пирарубицин) и мишките са преживели период от повече от една
152
година след третирането с най-високата тествана концентрация (еквива-

лентна на 100 mg/kg пирарубицин) (Greish et al., 2005). Подобен резултат
е постигнат и с аналогична формулировка на доксорубицин, но при 5-
кратно по-висока концентрация на лекарството (Greish et al., 2004).
Освен поглъщането на наноносителите от фагоцитите съществуват и
патофизиологични бариери, явяващи се ограничения пред реализирането
на EPR ефекта (Fang et al., 2011). Солидните тумори обикновено са хи-
поксични и могат да съдържат некротични участъци и емболизирани
кръвоносни съдове, което прави тяхната структура силно хетерогенна и
представлява сериозно ограничение за успешното доставяне на наноноси-
тели до туморите. Също така повишеното налягане на интерстициална
течност в тумора се явява силно ограничаващ фактор. Изследванията на
Maeda и съавт. показват, че тези ограничения могат поне частично да бъ-
дат преодолени чрез контролирано повишаване на системното кръвно
налягане (чрез прилагане на ангиотензин II), както и чрез прилагане на
нитроглицерин или други донори на азотен монооксид (NO; вазодилата-
тор) (Fang et al. 2011; Maeda, 2012). И в двата случая пропускливостта на
туморните кръвоносни съдове се увеличава, като по този начин се благо-
приятства натрупването на нанолекарства в тумора. За да се постигне още
по-голяма туморна акумулация, нанолекарствата могат да се приложат
чрез i.a. инжектиране в артерията, която захранва тумора (Nagamitsu et al.,
2009; Merle et al., 2017).
Сериозно усложнение по време на развитието на солидни тумори е
появата на метастази, обикновено в лимфните възли, които дренират лим-
фата от областта на тумора, както и появата на отдалечени метастази на
по-късни етапи. Това определя необходимостта от разработка на системи
за насочено доставяне на противоракови средства до метастази в лимфни-
те възли (Cai et al., 2011). По-малките наночастици (<100 nm) се предпо-
читат за ефективно насочване към лимфните възли, тъй като могат да
дифундират по-бързо през междуклетъчното пространство. Повечето от
наноносителите се улавят от фагоцитите в лимфните възли, но се предпо-
лага, че тези клетки могат да действат като своеобразни резервоари за
лекарства, откъдето освободеното лекарство да дифундира към наблизо
намиращите се ракови клетки (Miller et al., 2015).
Концепцията за активно насочване в наномедицината се основава на
идеята за прикрепване на насочващи лиганди към повърхността на нано-
носителите, като този начин им позволява да се свържат с конкретна цел
(вж. §5.2). Тази концепция също стана доста популярна при разработ-
ването на нанолекарства за третиране на солидни тумори, при която както
раковите клетки, така и туморният ендотел могат да се използват като
153
потенциални „мишени“ за прицелно насочване на наноносителите (Bazak

et al., 2014; Zhong et al., 2014). Една от стратегиите е да се увеличи вътре-
клетъчното натрупване (например чрез ендоцитоза) на нанолекарството
чрез проектиране на системи за доставяне, насочени към повърхностни
рецептори, които са свръхекспресирани в раковите клетки, като например
рецепторите за епидермален растежен фактор (EGFR), фолат, транс-
ферин, някои гликопротеини и др. Въпреки множеството положителни
резултати от in vitro опити в тази насока, възможностите за практическа
полза in vivo са ограничени, особено при спонтанно възникнали и/или
индуцирани тумори (например тези, индуцирани от канцерогени и патоге-
ни). С такива туморни модели се работи много рядко поради някои екс-
периментални трудности. Първо, раковите клетки в спонтанни или инду-
цирани тумори нерядко са доста хетерогенни и с голяма вероятност не
всички ракови клетки от дадена туморна формация свръхекспресират це-
левия рецептор (при използване на ракови клетки от клетъчни линии,
имплантираните клетки и техните потомци са по-хомогенни и нано-
лекарствата могат по-лесно да бъдат насочени). Второ, здравите клетки,
които обикновено се делят активно (като тези в костния мозък и други
бързо обновяващи се тъкани), също експресират повече от същите рецеп-
тори за растежни фактори, фолат и трансферин, подобно на раковите
клетки и нанолекарствата могат да бъдат насочени към тези здрави клет-
ки. Трето, наноносителите, чиято повърхност е модифицирана с антитела
или други насочващи лиганди, са по-лесно „разпознаваеми“ от фагоцити-
те, което би намалило техния полуживот в системното кръвообращение и
съответно може да намали тяхното ефективно натрупване в областта на
тумора. Интересен подход, който може да преодолее някои от тези про-
блеми, се явява модифицирането на повърхността на наноносителя с при-
целен лиганд и дълги PEG вериги, за да се „скрие“ лигандът и да се намали
опсонизацията, докато PEG веригите са конюгирани с наноносителя чрез
ковалентни връзки, нестабилни в кисела среда. Например тази стратегия
е използвана за разработването на „двойно насочени“ PEGилирани липо-
зоми (Sawant et al., 2006). В киселата микросреда на тумора дългите PEG
вериги на тези липозоми могат да бъдат отделени от наноносителя (липо-
зомата), което води до излагане на прицелния лиганд, който е „скрит“ в
PEG слоя. След това, лигандът взаимодейства с клетъчната мембрана на
раковата клетка и улеснява ендоцитозата на натоварения с лекарство
наноносител. Трябва да се има предвид, че понякога PEG (считан за
„златен стандарт“ при разработката на дългоциркулиращи наноносители)
може да активира комплемента (Arima et al., 2008).
154
Друга стратегия за активно насочване на нанолекарства към солидни

тумори е чрез използване на лиганди, насочени към туморния ендотел
(Sakurai et al., 2019). This стратегия се основава на това, че растежът на
тумора може да бъде инхибиран чрез предотвратяване на снабдяването му
с кръв и хранителни вещества чрез инхибиране образуването на нови
кръвоносни съдове (т.е. чрез инхибиране на ангиогенезата). Простата
емболизация на артериите, захранващи тумора, изглежда неефективна,
тъй като скоро се развиват странични кръвоносни съдове (колатерали).
По-ефективна стратегия се явява разработването на лиганд-насочени на-
ноносители, чрез които да се атакува туморния ендотел. Този подход има
някои предимства пред насочването към отделни ракови клетки: i) нано-
носителите не трябва да преминават през стените на съдовете (за да дос-
тигнат раковите клетки), ii) намален риск от развитие на лекарствена
резистентност, и iii) целевите ендотелни рецептори (VEGFR) се експре-
сират независимо от вида на тумора, което прави тази стратегия по-уни-
версална.
Доставянето на противотуморни средства до мозъка е особено пре-
дизвикателство в случаите, при които лекарствените молекули не могат
да преминат през т.нар. кръвно-мозъчна бариера. Това е физиологична
бариера, която защитава нервната тъкан от различни потенциални токси-
канти и патогени, намиращи се в кръвообращението. Селективният транс-
порт на вещества през кръвно-мозъчната бариера се контролира от ендо-
телните клетки на мозъчните капиляри, астроцитите и перицитите. Някои
наночастици могат да преминат през кръвно-мозъчната бариера и да
доставят лекарствени вещества до мозъка (Zhou et al., 2018). Вероятно
механизмът включва ендоцитоза на наночастиците от ендотелните клетки
на мозъчните капиляри чрез взаимодействие на наночастиците с аполипо-
протеинови рецептори от повърхността на клетките и последваща транс-
цитоза през тези клетки (Kreuter et al., 2002; Kreuter, 2012; Ye et al., 2013).
Известни са и някои критики към този механизъм, както и някои по-
съществени проблеми относно приложението на полимерни наночастици
като носители за доставяне на лекарства до мозъка (Olivier, 2005). Следва
да се изтъкнат два основни проблема: i) макар известна малка част от
интравенозно приложените наночастици (подходящо модифицирани за
преминаване през кръвно-мозъчната бариера) да достигат до мозъка,
основната част се концентрира във фагоцитите на черния дроб, далака и
други органи; ii) в повечето случаи не е известна съдбата на преминалите
през бариерата и доставени до мозъка наноносители и съществува въз-
можност за дълготрайно акумулиране на частици и/или продукти от
разграждането им в мозъчната тъкан. Известни са някои експериментални
155
третирания на глиобластома при плъхове с полимерни наночастици нато-

варени с цитостатик, при които е установено удължаване на преживяе-
мостта (Petri et al., 2007). Резултатите в този случай се обясняват с преми-
наване на наночастиците през кръвно-мозъчната бариера, но вероятно
част от частиците се акумулират в тумора и чрез EPR ефект.
Освен чрез целево доставяне през кръвно-мозъчната бариера (чрез ин-
травенозно въвеждане на наночастиците), друг метод за въвеждане на
наночастици в мозъка е директното им инжектиране. Тази процедура е
прилагана в клинични експерименти за третиране на глиобластома чрез
магнитна хипертермия с магнетитни наночастици (Van Landeghem et al.,
2009). Освен инвазивният характер на процедурата, основен недостатък
се явява неравномерното разпределение на частиците в туморната тъкан,
предимно в мястото на инжектирането и липсата им в останалата част.
Трансцитозата на наночастици през ендотелните клетки се наблюдава
и в други органи (не само в мозъка) и се счита като целеви механизъм за
преминаване на някои наночастици от кръвообращението в туморната
тъкан в допълнение на EPR ефекта (Liu X. et al., 2019).
5.5. Нановаксини
Ваксините са продукти, чрез които се цели създаването на активен

придобит имунитет срещу конкретно заболяване. Чуждата за организма
биологична субстанция (протеин, полизахарид и др.) във ваксината се
означава като антиген. Важно условие за един ваксинален антиген е да се
явява имуноген – способен да предизвиква имунен отговор.
В медицинската и изследователската практика намират приложение
няколко вида ваксини (според състава):
i) Живи (атенюирани) ваксини, които съдържат живи, но атенюирани
(със занижена вирулентност) микроорганизми (вируси или бактерии).
Такива са ваксините против морбили, паротит, рубеола, варицела, жълта
треска, ротавируси, голяма част от ветеринарните ваксини, БЦЖ и др. В
миналото широко са прилагани такива ваксини против вариола (едра
шарка) и полиомиелит.
ii) Токсоиди, които съдържат инактивирани бактериални токсини
(анатоксини), адсорбирани върху имунологични адюванти. Широко из-
ползвани токсоидни ваксини са тези против тетанус, дифтерия и коклюш.
При тяхното приложение се получават антитела срещу токсините на съответ-
ните микроорганизми. Тези ваксини се нуждаят от допълнителни компо-
ненти, наречени имунологични адюванти, които усилват и удължават
имунния отговор, тоест усилват имуногенността на антигените. Като
156
адюванти в класическите токсоиди се ползват частици от алуминиев

(окси)хидроксид и/или алуминиев фосфат (Hem and White, 1995). С успех
могат да се ползват и други неорганични адюванти, например калциев
фосфат (Maughan et al., 2015; Masson et al., 2017). Неорганичните адюван-
ти се прилагат под формата на колоидни гелове, съдържащи нанострукту-
ри, свързани в триизмерни мрежи и формиращи частици с микронни раз-
мери (вж. Гл. 1, фиг. 1.7). Имунологичните адюванти са от ключово зна-
чение за осигуряване на достатъчно силен и продължителен имунен отго-
вор. Адювантите имат и съществено икономическо значение, тъй като
повишаването имуногенността на антигените (способността на антигените
да предизвикват имунен отговор) позволява използването на по-малки
количества антигени. Механизмите на действие на адювантите са различ-
ни и често представляват комбинация от повече от един механизъм, при
което могат да изпълняват ролята на антигенен носител (адсорбент), да
усилват възпалителния отговор чрез активиране на инфламазомата и дру-
ги механизми (Shi et al., 2019). Адюванти се използват също така при
субединичните (молекулните), конюгираните и някои инактивирани вак-
сини. Понякога наноразмерните адюванти се оказват по-ефективни от
микроразмерните им аналози (Li X. et al., 2014).
iii) Инактивирани ваксини, които съдържат убити (инактивирани)
микроорганизми, неспособни да заразяват и да се размножават, но предиз-
викващи имунен отговор. Такива са инактивираната ваксина срещу по-
лиомиелит (IPV), противогрипните ваксини, срещу хепатит А, някои вете-
ринарни ваксини против бяс, използваната в миналото цялоклетъчна
ваксина против коклюш и др. Някои инактивирани ваксини съдържат
имунологични адюванти, например o/w емулсии от сквален (адювантите
MF59 и AS03) при някои противогрипни ваксини.
iv) Субединични (молекулни) ваксини, които съдържат фрагменти или
молекули (най-често протеини) от патогените и подходящи адюванти. Таки-
ва са ваксините против хепатит Б, човешки папиломавирус (HPV) и др.
v) Конюгирани (конюгатни) ваксини, при които подобно на субеди-
ничните се използват фрагменти от патогена, например бактериални
полизахариди. Тези фрагменти са свързани (конюгирани) с протеин (тета-
нус токсоид) за повишаване на имуногенността им и получаване на по-
силен имунен отговор. Пример за такива са пневмококовите конюгирани
ваксини и ваксините срещу Haemophilus influenzae type B.
vi) Генни ваксини (РНК или ДНК ваксини), при които се използват РНК
или ДНК, кодиращи информация за биосинтез на протеин, който био-
синтез се осъществява от трансфектираните клетки на организма, в които
е въведена ваксината (Leitner et al., 1999; Liu et al., 2016; Verbeke et al.,
157
2019). За да бъде осъществено ефективното въвеждане на гените в клет-

ките е необходим подходящ вектор (носител). Като такива вектори могат
да се използват вируси, вирусоподобни частици или наноносители (на-
пример липидни наночастици, липозоми и др.).
Механизмите на създаването на имунен отговор от страна на организ-
ма при попадането на чужд за него материал (антиген) е сложен процес,
който е описан в специализираната литература по имунология. Целевите
клетки при доставянето на ваксинални антигени адсорбирани върху адю-
ванти или наночастици са някои фагоцитиращи клетки и по-конкретно
макрофагите и дендритните клетки, които са и антиген-презентиращи
клетки (АРС) и са от ключово значение за развитие на специфичния иму-
нен отговор. Антигените (основно протеини) попадат в тези клетки чрез
фагоцитоза, след което са разграждат до отделни пептидни фрагменти и
чрез главния комплекс на тъканната съвместимост (МНС) клас II тези
пептиди се разполагат на клетъчната повърхност на АРС, където се пред-
ставят на нестимулирани Th-лимфоцити, които се активират в ефекторни
Th1 или Th2 лимфоцити (Pulendran and Ahmed, 2011; Shi et al., 2019).
При иРНК ваксините се въвежда информация за биосинтеза на про-
теинов антиген, срещу който следва да се изработи имунният отговор.
Интрамускулно въведена иРНК без носител води до трансфекция на мус-
кулните клетки (миоцити), които произвеждат целевия протеин (Wolff et
al., 1990; Iavarone et al., 2017). При иРНК ваксините с липидни наночасти-
ци обаче интрамускулното въвеждане води до относително бърза инфил-
трация на фагоцити (неутрофили, моноцити, дендритни клетки) в мястото
на въвеждане, която се дължи на използването на липидни наночастици
(Liang et al., 2017; Bettini and Locci, 2021). Това води до поглъщане на
наночастиците и експресия на целевия протеин и от моноцитите и ден-
дритните клетки в мястото на инжектирането и в дрениращите го лимфни
възли. По-нататък имунният отговор се развива в лимфните възли, които
дренират мястото на инжектиране, с участието на CD4+ T-лимфоцитите.
В състава на липидните наночастици, които се явяват носители на иРНК
във ваксините срещу SARS-Cov-2, влизат холестерол, фосфолипид, ка-
тионен липид и PEG-модифициран липид (вж. Гл. 10, §5). Връзката между
иРНК и липидните компоненти на наночастицата се осъществява чрез
електростатично взаимодействие между иРНК (полианион) и катионния
липид. PEG-модифицираният липид се явява стеричен стабилизатор на
липидните наночастици в процеса на получаването им.
158
6. ЛЕКАРСТВЕНО ОСВОБОЖДАВАНЕ ОТ
НАНОНОСИТЕЛИ
6.1. Механизми на освобождаването
Предсказването профила на лекарствено освобождаване (количество

отделено/освободено вещество като функция на времето) от наноносите-
ли е сложно, тъй като зависи от различни фактори: вида на наноносителя,
разтворимостта на натовареното вещество в материала, от който е изгра-
ден носителят, взаимодействията между натовареното вещество и носите-
ля, скоростта на ерозия и разграждане на носителя, молекулно-масовото
разпределние при полимерни носители, метода на натоварване на ве-
ществото в носителя, проникването на вода в носителя, условията (рН,
разреждане, температура, йонна сила, наличие на ензими, протеини и др.),
при които протича освобождаването, и други фактори (Wong and Choi,
2015; Ding and Li, 2017). При повечето in vitro изследвания на лекарстве-
ното освобождаване се наблюдава начален етап на бързо отделяне (озна-
чаван като „burst release“), последван от по-бавен етап, който при различ-
ните видове носители може да трае от няколко часа или дни до няколко
месеца. Отделянето на вещества, адсорбирани на повърхността на нано-
носителите, обикновено е по-бързо в сравнение с вградените във вътреш-
ността им. Когато веществото е включено във вътрешността на носителя, при
отделянето молекулите му дифундират към повърхността, откъдето се десорби-
рат (фиг. 5.7). При дифузионно-контролирано освобождаване концентра-
ционният градиент на натовареното вещество в матрицата на носителя е
движещата сила на дифузията на молекулите към външната среда.
Вътрешността на твърдите носители рядко е изцяло хомогенна, при което
скоростта на дифузия следва да зависи от локалната структура и състав на
вътрешната среда на носителя.
Освобождаването чрез ерозия и разграждане на носителя се наблюдава
при носители, изградени от биоразградими материали (синтетични био-
разградими полимери, липиди, протеини и др.). Тези материали се раз-
граждат в организма, като по този начин се премахва необходимостта от
елиминиране на носителя след освобождаването на активния агент. Пове-
чето биоразградими материали претърпяват хидролиза, при което се
получават по-малки, водоразтворими и биосъвместими молекули. Раз-
граждането може да протече сравнително равномерно в целия обем на
наноносителя или само на повърхността. Освобождаването от биораз-
159
градими наноносители често е резултат от комбинация на двата меха-

низма – дифузия и ерозия, и зависи от относителните скорости, с които
протичат тези процеси (Kamaly et al., 2016).
Фиг. 5.7. Схематична илюстрация на освобождаване от наноносители чрез: а) десорбция

на адсорбирано вещество; б) дифузия от вътрешността на носителя
Ерозията представлява физическо дезинтегриране на наноносителя и

загуба на маса в резултат на химичното му разграждане. Ерозията на водо-
неразтворими полимери започва с хидролиза, в резултат на която се про-
меня структурата на полимерната матрица, формирайки пори във вътреш-
ността на носителя. При този процес се освобождават различни продукти
(олигомери, мономери и други нискомолекулни продукти). В някои слу-
чаи процесът може да се катализира от ензими, особено при разгражда-
нето на биологични молекули. Ерозията на наноносителите бива повърх-
ностна и обемна. Когато водните молекули са ограничени до повърх-
ността на наноносителя, химичното разграждане протича само там. Ако
структурата и съставът на материала, от който е изграден носителят, е
еднаква по цялата повърхност, се очаква повърхностната ерозия да е рав-
номерна (фиг. 5.8а). Ако повърхността на носителя е хетерогенна, се на-
блюдава нехомогенна повърхностна ерозия (фиг. 5.8б). При проникване
на вода в матрицата на носителя хидролизата и съответно ерозията про-
тича в целия обем на частицата (фиг. 5.8в).
Молекулната маса и молекулно-масовото разпределение на полиме-
рите, изграждащи полимерните наноносители, са важни параметри, опре-
делящи както механичната стабилност на носителите, така и скоростта на
160
освобождаване на вещества, вградени в носители от биоразградими поли-

мери. При разграждане на полимера се образуват пори в матрицата на
носителя, посредством които се ускорява освобождаването чрез дифузия.
При по-малка молекулна маса на полимера може да се очаква, че поли-
мерните наночастици ще се дезинтегрират по-бързо и съответно ще осво-
бождават по-бързо вградените в тях лекарства.
Фиг. 5.8. Ерозия на наноносител: а) хомогенна повърхностна ерозия; б) нехомогенна

повърхностна ерозия; в) обемна ерозия
В случаите, при които натовареното вещество е свързано с носителя

чрез химична връзка, системата натоварено вещество/носител се явява
своеобразно предлекарство, при чието химично разкъсване лекарственото
веществото се отделя в активната си форма. Тези химични връзки обикно-
вено са лабилни и могат да бъдат разкъсани чрез хидролиза или редукция
в биологични среди (естерни, амидни, гликозидни, дисулфидни и др.). В
зависимост от характера на връзката между носителя и лекарството, може
да се постигне контролирано освобождаване при определени условия (рН,
редокси потенциал и др.) (Tan et al., 2021).
6.2. Освобождаване в резултат на стимул
С цел създаване на колоидни системи за контролирано освобождаване

на биологично активни вещества възниква необходимост от създаване на
161
носители, чувствителни към локални физиологични стимули, като пато-

логично асоциирани изменения в локалните стойности на рН, темпе-
ратурата и/или химичния състав на биологичната среда, или различни
външни стимули (температурни, електрически, магнитни и/или оптични)
(Torchilin, 2009; Mi, 2020; Park et al., 2020) (таблица 5.1).
В патологични области, като тумори, инфаркти, зони на възпаления,
стойностите на рН могат да са понижени (до рН~6,5) в сравнение с рН на
кръвта (~7,4). Понижените стойности на рН обикновено се свързват с
хипоксия (недостиг на кислород, при което клетките получават енергия
основно в резултат на гликолиза и редукция на пирувата до млечна кисе-
лина) и/или некроза. Във фаголизозомите стойностите на рН могат да
бъдат и по-ниски (≤5,5). Материали, чиито свойства зависят от рН, могат
да бъдат използвани като компоненти на лекарствени наноносители,
които са стабилни при физиологични стойности на рН (~7,4), но се раз-
граждат и/или изменят структурата си, освобождавайки натоварените в
тях биологично активни вещества при понижени стойности на рН в пато-
логичната зона или в клетъчните ендозоми. В това отношение се прилагат
два основни подхода за постигане на рН-чувствителност на наноносите-
лите (Karimi et al., 2016):
i) Материали, съдържащи функционални групи, които могат да се
протонират или депротонират при промяна в рН на средата. Такова про-
тониране или депротониране би могло да доведе до промяна в заряда,
конформацията на молекулите, ζ-потенциала на носителя и други ефекти,
в резултат на които носителят променя свойствата си, прониква по-лесно
в клетките, дестабилизира се, и/или освобождава по-бързо натовареното
вещество. За тази цел се използват рН-чувствителни полиелектролити,
при които измененията в рН предизвикват конформационни промени
и/или преходи от типа набъбване-свиване. Например такива са полимери
притежаващи амино групи в мономерните звена, които при протониране
водят до формиране на поликатион и набъбване на молекулите.
ii) Материали, които съдържат рН-чувствителни връзки. Такива връзки
обикновено са стабилни при рН~7,4 и претърпяват хидролиза при рН<6.
Например такива материали се използват за получаването на стерично-
стабилизирани носители с обвивка от PEG, която може да бъде премахна-
та след хидролиза на лабилна връзка между PEG молекулите и останалата
част от носителя (Zhang et al., 2004; Sawant et al., 2006). По този начин, в
патологичната област (с понижено рН) носителят се дестабилизира и се
улеснява проникването му в клетките и/или освобождаването на активна-
та субстанция.
162
Таблица 5.1. Някои стимули за контролирано освобождаването от наноносители
Стимул/изменение в: Произход
Понижено рН в патологични области; Понижени стойности на
рН
рН в лизозомите и фаголизозомите.
Окислително-
Повишена концентрация на глутатион в някои патологични
редукционен
клетки в сравнение с концентрацията му извън клетките.
потенциал (ORP)
Хипертермия в резултат на възпаление или локално загряване
Температура
чрез външно въздействие.
Външно магнитно поле с различен интензитет с цел концен-
триране на магнитни лекарствени носители в желана област.
Магнитно поле
Променливо магнитно поле за предизвикване на хипертермия
чрез локално приложени магнитни наночастици.
Разработени са различни рН-чувствителни системи за лекарствено

доставяне, като липозоми (Sawant et al., 2006), полимерни мицели (Gao et
al., 2013), полимерни наночастици (Deirram et al., 2019) и други.
Идеята за температурно чувствителни наноносители е породена от
факта, че някои патологични области в организма се характеризират с
хипертермия (повишена температура). От друга страна, съществуват раз-
лични начини за външно предизвикана хипертермия на определени части
от тялото. Възможността за използване на хипертермията като стимул за
освобождаване от наноносители е показана чрез множество примери
(Karimi et al., 2016; Kotsuchibashi, 2020). Някои синтетични и естествени
полимери се характеризират с долна критична температура на разтваряне
(lower critical solution temperature, LCST) във водна среда, сред които
особено популярни са полимерите, базирани на поли(N-изопропилакрил-
амид), PNIPAАm. При тази температура (~32 °C за PNIPAАm) настъпват
конформационни промени (преминаване от спирална в глобуларна фор-
ма) в полимерните молекули, което може да се използва за създаване на
термочувствителни системи за лекарствено доставяне на основата на
различни PNIPAAm съполимери (с LCST малко над физиологичната).
Например използвайки подобни материали, са получени термочувстви-
телни липозоми (Bi et al., 2018), полимерни мицели (Talelli and Hennink,
2011) и други видове носители.
Промени в химичния състав и окислително-редукционенния потен-
циал (ORP) на средата също могат да стимулират лекарствено осво-
бождаване от някои носители. Например известно е, че вътреклетъчната
концентрация на глутатион в ракови клетки е значително (~100 пъти) по-
163
висока от нормалната му екстрацелуларна концентрация. Тази голяма

разлика в ORP между раковите клетки и екстрацелуларната среда може да
се използва при създаването на ORP-чувствителни наноносители (Saito et
al., 2003; Raza et al., 2018). Например вещество може да бъде натоварено
в наноносител, чиято структура се поддържа от дисулфидни връзки и е
стабилна при нормална концентрация на глутатион. При висока концен-
трация на глутатион, дисулфидните връзки се редуцират, носителят се
дестабилизира и освобождава натовареното вещество.
Някои носители могат да бъдат едновременно натоварени с биологич-
но активно вещество и магнитни наночастици, като по този начин носите-
лите могат да бъдат насочени чрез външно магнитно поле към патологич-
ната област и/или да се ускори освобождаването на биологично активната
субстанция в променливо магнитно поле (El–Boubbou, 2018). За целта се
използват наночастици от железни оксиди (γ-Fe2O3 или Fe3O4) с размери
4–10 nm, които проявяват суперпарамагнитни свойства и се обозначават
като SPIONs (вж. Гл. 9). При получаване на магнитно-чувствителни наноно-
сители за лекарствено доставяне, магнитните наночастици (SPIONs) могат
да бъдат вградени в различни носители, като мицели (Cinteza et al., 2006),
липозоми (Dandamudi and Campbell, 2007), полимерни наночастици (Lu et
al., 2021), силикатни наночастици (Popova et al., 2020) и др.
6.3. Определяне профила на освобождаване
Профилът на освобождаване от натоварени с биологично активни ве-

щества наноносители представлява зависимостта на количеството (или
%) освободено от носителя вещество като функция на времето след поста-
вянето на натоварения носител в условия, при които протича освобожда-
ване. Този профил може силно да зависи от характеристиките на средата
– рН, температура, йонна сила, наличие на протеини, ензими и други
вещества. Наличието на различни ензими може да доведе до ускорена
ерозия на носителя и ускорено освобождаване. Като следствие от тези и
други ефекти in vitro освобождаването може да има малко общо с осво-
бождаването in vivo. Профилът на освобождаване in vitro се изследва при
условия, които максимално наподобяват условията, при които се очаква да
се намират натоварените носители в организма. За целта обикновено се
използват буфери (най-често фосфатни), чието рН може да варира в зави-
симост от целите на експеримента. Например във фаголизозомите на
фагоцитиращите клетки pH е ~4,5, в кръвта ~7,4, в стомаха ~2, и т.н. Тем-
пературата на средата обикновено е около средната телесна температура
164
(~300 mOs/L), което се постига чрез добавяне на NaCl с подходяща кон-

центрация. Скоростта на освобождаване може да се изследва и в кръвeн
серум (Couvreur et al., 1979), както и в различни среди, към които са
добавени протеини, ензими и други компоненти, чрез които максимално
се наподобяват условията в организма.
Данните, получени от изследване профила на освобождаване, могат да
послужат за качествена характеристика на носителя при използването му
в конкретна камбинация с дадено биологично активно вещество. Също
така профилът на освобождаване дава предства за взаимодействията меж-
ду носителя и натовареното вещество. Изследването на профила на осво-
бождаване с цел получаване на полезна информация е трудна за реали-
зиране експериментална задача поради следните причини:
i) Необходимо е реализиране на максимално добри условия за отделяне на
веществото от носителя, като например достатъчно голям обем на дис-
персната среда, но концентрацията на отделеното в средата вещество да
не бъде твърде ниска за точното ѝ определяне.
ii) Особен случай е отделянето на малкоразтворими вещества, при което
дисперсната среда лесно се насища с веществото, което се отделя от
носителя. В някои случаи е допустимо използването на солюбилизиращи
агенти, но дори при концентрации под СМС те биха могли да окажат
ефект върху освобождаването чрез повлияване омокрянето на носителя
iii) Определянето профила на освобождаване се усложнява при вещества,

които са нестабилни в дисперсната среда (например лесно хидролизират
или претърпяват друг вид химично превръщане).
iv) Отделеното вещество може да се адсорбира върху различни части от
апаратурата, с която се провежда изследването, например върху стените
на съдовете, диализните и филтърните мембрани и др.
v) Ако се установява освобождаване на <100% от натовареното вещество,
следва да се проведе експеримент за установяване локализацията на „лип-
сващото“ вещество.
vi) Проблем при всички методи за изследване на освобождаването е лип-
сата на достатъчно бързи и ефективни техники за разделяне на нано-
носителите от дисперсната среда, в която е отделено веществото. За тази
цел се прилагат различни варианти на диализа, центрофугиране и филтру-
ване, които изискват известно време.
Най-използвани методи за in vitro изследване на освобождаването от нано-
носители са (Washington, 1990; D’Souza, 2014):
1. Центрофужни и филтрувални методи. При тези методи натовареният
носител се диспергира директно в целия обем на средата, след което през
165
определени интервали от време се вземат проби, дисперсната фаза се

отделя от средата чрез центрофугиране или филтруване и се определя
концентрацията на отделеното в дисперсната среда вещество (фиг. 5.9а).
Тези методи са приложими когато дисперсната среда може да се отдели от
дисперсната фаза сравнително бъзо и лесно, което пък е трудно осъще-
ствимо при по-малки размери на носителите (<100 nm). Ако носителят
проявява магнитни свойства, за отделянето му от средата може да се из-
ползва магнитна сепарация.
2. Диализни методи. При тези методи носителят е диспергиран в малък
обем дисперсна среда, който е отделен чрез диализна мембрана от много
по-голям обем среда (фиг. 5.9б). При този процес веществото дифундира
от диализната торбичка към външната среда, където концентрацията му
се измерва периодично. И при тези методи съществуват някои проблеми.
Например дисперсията на носителя не се разрежда (което е далеч от
реалната ситуация при интравенозно приложение на лекарствената фор-
ма), а скоростоопределящият етап често е дифузията на веществото през
диализната мембрана (особено при вещества, които се освобождават срав-
нително бързо от носителя).
3. In situ методи. При тези методи натовареният носител се диспергира
директно в целия обем на средата, в която се изследва освобождаването, а
концентрацията на отделеното вещество се измерва в дисперсната среда
чрез подходящ метод, при който наличието на дисперсна фаза не пречи
на определянето: електрохимичен (Mora et al., 2009), UV спектрометричен
1986), ЯМР (Denkova et al., 2010) и др.
4. Методи с проточни клетки (Magenheim et al., 1993). При тези методи
натовареният носител се диспергира в малко количество среда и се поста-
вя във филтрувална клетка, като средата се отделя непрекъснато чрез фил-
труване, непрекъснато се следи количеството на отделеното във филтрата
вещество (обикновено чрез UV- или друг вид детектор) и едновременно
се добавя нова среда. Осигуряването на бърз поток на среда през клетката
е трудно изпълнимо, особено при филтри с малки пори. Освен това фил-
търните мембрани могат да се задръстят от частиците на носителя. Тези
методи обаче притежават редица предимства, които ги правят предпочи-
тани при изследване профила на освобождаване от наноносители. За раз-
лика от кумулативните методи, при които освободеното вещество се отде-
ля и акумулира във фиксиран обем среда, при проточните клетки не може
да се достигне насищане на дисперсната среда по отношение на вещества
с ниска разтворимост (което може да е чест проблем при кумулативните
методи).
166
Фиг. 5.9. Принципна схема за определяне скорост на освобождаване in vitro чрез: а) ди-
ректно освобождаване; б) диализен метод
6.4. Количествено описание на освобождаването
Съществуват различни модели за количествено описание на лекар-

ственото освобождаване от наноносители. Най-общо Washington (1990)
разделя тези модели на Ab initio модели, числени и емпирични. Чрез Ab
initio и числените модели се цели описание на процеса, изхождайки от
фундаменталните закони за дифузията, отчитайки размера на частиците,
дифузионни коефициенти и др. Често моделите са твърде идеализирани в
сравнение с реалните наноносители. Голяма част от моделите са разра-
ботени за описание на освобождаването от по-големи носители, след кое-
то е демонстрирана валидността им при някои микрочастици и наноно-
сители. Повече информация за тези модели може да се намери в специали-
зираната литература (Zeng and Wu, 2010; Zeng et al., 2011).
По-популярни са различни емпирични модели (Barzegar–Jalali et al.,
2008) за описание скоростта на освобождаване, като например уравнението на
Хигучи (Higuchi) (Higuchi, 1961; Paul, 2011), според което количеството
отделено вещество е пропорционално на квадратния корен от времето („the
square root law“) (уравнение 5.2).
167
Mt
k t (5.2 )
M0
Където Mt е освободеното количество вещество при време t, M0 е
общото количество натоварено вещество, k е коефициент на пропорцио-
налност. Друг често използван емпиричен модел е даден с уравнение (5.3)
(Ritger and Peppas, 1987, 1987a):
Mt
 kt n (5.3)
M0
В този модел константата n е наречена дифузионен експонент и се опре-
деля експериментално. Друг емпиричен модел описва освобождаването
като биекспоненциален процес (Washington, 1990) (уравнение 5.4):
Mt
 1   A exp  k1t   B exp  k 2 t  (5.4)
M0
В този модел, k1 и k2 са скоростните константи на двата компонента на
биекспоненциалната функция, които описват бърз и бавен процес, съот-
ветстващи на бързото освобождаване в началото, последвано от бавно ос-
вобождаване. Описанието на процеса като би- и мултиекспоненциален
трябва да се прави внимателно. Бързото освобождаване в началото често
е достатъчно бързо, че да бъде считано за отделен физичен процес. Ако
обаче е налице полидисперсна проба, която съдържа частици с различни
размери, частиците в тази проба ще освобождават натовареното в тях
вещество с различна скорост (по-малките частици бързо освобождават
натовареното вещество в началото, докато при по-големите освобождава-
нето протича по-бавно). Въпреки че в този случай моделът не предвижда
двуетапно освобождаване, полученият профил може да бъде добре описан
с биекспоненциална функция, от което може да се направи грешен извод
за наличие на двуетапен процес с две различни скоростни константи
(Washington, 1990).
РЕЗЮМЕ
Взаимодействия между наночастици и протеини. При контакт на наночастици с
биологични течности, протеини (и други вещества) от тези течности се адсорбират по
повърхостта на наночастиците и формират обвивка, означавана като протеинова
корона. От най-голямо значение е взаимодействието на наночастици с протеини от
кръвната плазма при инжекционно приложение, тъй като видът и количеството адсор-
бираните протеини определят биоразпределението на наночастиците в организма и
168
поглъщането им от различни клетки. Взаимодействието протеин–наночастица най-

често се реализира чрез електростатични сили на привличане между участъци от про-
теиновата молекула и заредени групи от повърхността на наночастицата. За изслед-
ване на това взаимодействие се прилагат различни методи, при повечето от които
адсорбираните върху частиците протеини биват десорбирани, идентифицирани и
количествено определяни. Използват се и методи, които дават информация за взаимо-
действието в реално време – например чрез техники, които са основани на повърх-
ностния плазмонен резонанс.
Ендоцитоза на наночастици. Ендоцитозата е активен (изискващ енергия) клетъчен
процес, при който наночастиците попадат във вътрешността на клетките чрез вгъване
на клетъчната мембрана и обграждане на частиците в мембранна везикула, наречена
ендозома. Такова „поглъщане“ на наночастиците може да се осъществи от различни
видове клетки чрез различни ендоцитозни механизми (фагоцитоза, клатрин-зависима
ендоцитоза, макропиноцитоза). При интравенозно приложение голяма част от нано-
частиците обикновено биват относително бързо (от минути до часове) поглъщани от
професионалните фагоцити (макрофаги, неутрофили) чрез фагоцитоза и се локализи-
рат в богати на макрофаги органи (черен дроб, далак и др.). След попадане в ендозо-
мите наночастиците могат да напуснат обратно клетката чрез екзоцитоза (сливане на
ендозомната с клетъчната мембрана), да се локализират в други субклетъчни структу-
ри, да напуснат ендозомата и да попаднат в цитоплазмата (чрез разрушаване на ендо-
зомната мембрана), да бъдат разградени в ендозомата (ако са разградими) или да се
акумулират за дълго време в клетките (ако частиците не са разградими или са бавно-
разградими). Чрез ендоцитоза наночастици могат да попаднат в различни други клет-
ки – ендотелни, епителни, туморни. Ендоцитозата се явява начин за вътреклетъчно
доставяне на биологично активни вещества, когато това е необходимо, например за
доставяне на антибиотици до инфектирани фагоцити, за доставяне на антигени до
антиген-презентиращи клетки (макрофаги, дендритни клетки), проникване на лекар-
ства в туморни клетки и др.
Фармакокинетика на наночастиците. Нанолекарствени форми могат да бъдат
въведени по различни начини в организма – орално, интравенозно, интраартериално,
интрамускулно и др. Начинът (пътят) на въвеждане и физикохимичните свойства на
наночастиците определят тяхната фармакокинетика – скорост и степен, до която дос-
тигат до системното кръвообращение, плазмен полуживот, площ под кривата, локали-
зация на наночастиците в различни клетки, тъкани и органи, скорост на метаболизи-
ране (разграждане), скорост и степен на елиминиране. Орално приложените наночас-
тици рядко преминават лигавицата, покриваща стомашно-чревния тракт и ако не са
биоразградими преминават непроменени през него. От друга страна, инжекционно
приложените наночастици най-често попадат чрез фагоцитоза в макрофаги, неутро-
фили, ендотелни клетки, дендритни клетки и др. Наночастици, които са модифици-
рани с хидрофилни полимери (например PEG) в по-малка степен и по-бавно биват
фагоцитирани, което е предпоставка за по-дълъг плазмен полуживот и площ под
кривата. Наночастици, достигнали до системното кръвообращение не могат да бъдат
отделени от бъбреците, ако размерът им е по-голям от 5–6 nm. Някои наночастици
при подходяща повърхностна модификация могат да преминават през анатомо-фи-
зиологични бариери – кръвно-мозъчна, плацентарна, ендотелна и др.
Лекарствено доставяне с наноносители. Лекарствените наноносители трябва да
бъдат нетоксични, да имат голям капацитет за натоварване на лекарствени вещества,
169
да бъдат биоразградими (особено важно условие за лекарствени форми за парентерал-

но приложение) и да не предизвикват остри реакции на свръхчувствителност. Различ-
ни наночастици имат потециал за приложение като доставящи системи за противоту-
морни препарати, антибиотици, противовъзпалителни средства, ваксини и др. Насоч-
ването на наноносителите може да бъде активно (чрез специфично разпознаващи
целта насочващи лиганди, антитела и др.) или пасивно – например, селективното
акумулиране на наночастици в солидни тумори чрез ефекта на повишена пропускли-
вост и задържане (EPR). Фагоцитозата на парентерално приложени наночастици
може да се използва за доставяне на противовъзпалителни средства до неутрофилите,
на антимикробни средства до инфектирани макрофаги или за доставяне на ваксини
до антиген-презентиращи клетки.
Лекарствено освобождаване от наноносители. Лекарственото освобождаване (от-
деляне) от натоварени с лекарства наночастици може да се осъществи чрез проста
дифузия и десорбция на лекарството от повърхността на частицата, чрез ерозия и раз-
граждане на наноносителя или контролирано, например в резултат на въздействие с
външен стимул (изменение в рН, в редоксипотенциала на средата, в температурата,
въздействие с магнитно поле, светлина и др.). Скоростта на освобождаване се измерва
чрез различни методи – диализни, освобождаване в проточни клетки, in situ измерване
на лекарствената концентрация в дисперсната среда (чрез електрохимични, ЯМР
спектроскопски и други методи) и др. За количественото описание на освобождаване-
то се прилагат различни кинетични модели, повечето от които са емпирични.
170
Глава 6
ОСНОВИ НА НАНОТОКСИКОЛОГИЯТА
Основни положения. Методи за изследване (тестове in vitro, тестове in vivo).

Цитотоксични механизми (оксидативен стрес, токсични продукти на раз-
граждане, дестабилизация на мембрани). Органна и системна токсичност
(кожна, очна, белодробна, чернодробна, жлъчна, бъбречна, гастроинтести-
нална, репродуктивна, съдова и ендотелна токсичност, невротоксичност,
имунотоксичност).
1. ОСНОВНИ ПОЛОЖЕНИЯ
Нанотоксикологията е дял от съвременната токсикология, който изу-

чава токсичността на наноматериалите (Monteiro–Riviere and Tran, 2014).
Поради много голямото съотношение повърхност/обем, относително
голямата реактивоспособност и малките им размери, позволяващи да
бъдат ендоцитирани от различни клетки и да преминават през различни
анатомо-физиологични бариери, наночастиците проявяват различен от
съответните обемни материали токсикологичен профил. Тук ще бъде
обърнато внимание на по-популярните методи за изучаване токсичността
на наночастици за биомедицинско приложение, както и някои известни
механизми на токсичност. В Гл. 7–10 са разгледани фармакологични, в
т.ч. токсикологични аспекти на полупроводникови, метални, магнитни и
някои органични (полимерни и липидни) наноструктури. При токсиколо-
гичните проучвания се прилагат най-общо два вида тестове – in vitro
(върху изолирани клетки или тъкани) и in vivo (върху животни) (вж. §2).
Тестовете in vitro („тестове в епруветка“) се провеждат върху изоли-
рани клетки или тъкани. Тестовете се провеждат в епруветки, съдове на
171
Глава 6. Основи на нанотоксикологията
Петри, колби или в микротитрационни плаки. Клетъчните култури могат

да бъдат суспензионни (свободни клетки в суспензия), монослойни (2D;
като слой от клетки, адхезирани върху дъното на съда за култивиране) или
3D култури (триизмерни, с цел да имитират тъкан). Могат да се използват
и тъканни култури. Тестовете се провеждат върху микроорганизми (най-
често, бактерии или дрожди), клетки от бозайници и човек, например вър-
ху ракови и/или имортализирани клетъчни линии, които се поддържат по-
лесно и имат неограничен репликационен потенциал.
За разлика от in vivo тестовете (върху животни), тестовете in vitro се
провеждат върху клетки и тъкани, които са изолирани от въздействието
на други клетки и системи на живия организъм като цяло (например изо-
лирани са от ендокринните и други регулационни механизми, от въздей-
ствието на имунната система и др.), което е главният недостатък на тези
методи и често получените резултати не могат да предскажат ефектите
върху целия жив организъм. Това особено много важи за тестовете на
наночастици, за които е известно, че при въвеждане в организма силно
взаимодействат с клетките на имунната система, в т.ч. различни фагоци-
ти, в които попадат и се акумулират. Най-често нежеланите реакции от
нанолекарствени форми са свързани с възпалителни реакции, реакции на
свръхчувствителност, активиране системата на комплемента и други въз-
действия с неизяснен механизъм, които не могат да бъдат адекватно пред-
видени in vitro. Тестовете in vitro обаче предлагат някои възможности за
изучаване на взаимодействието между отделните клетки и наночастици
при контролирани условия, изследване на ендоцитозата, на механизмите
на клетъчно увреждане и клетъчна смърт, причинени от наночастици,
ефектите на наночастици върху клетъчните сигнални пътища, клетъчният
метаболизъм и други процеси.
Токсикологичните проучвания се провеждат най-често варирайки два
главни фактора:
- Пътища на въвеждане (при in vivo тестовете: орално, дермално, ин-
халационно, интравенозно и други видове инжекционно въвеждане, и
т.н.). Начинът на въвеждане в организма определя в голяма степен биораз-
пределението на наночастиците в различните тъкани, органи и системи.
Акумулирането на наночастици в определени клетки и органи може да
доведе до съответна локална, а понякога и системно проявена токсичност.
Наночастиците като цяло трудно преодоляват лигавичната бариера на
храносмилателния тракт и затова пероралното им прилагане в общия слу-
чай се свързва с по-слабо изразена токсичност в сравнение с инжекцион-
ното им въвеждане. Интравенозно въведените наночастици обаче могат
при определени условия да преодолеят някои анатомо-физиологични
172
бариери (кръвно-мозъчна, плацентарна) и тази възможност следва да се

отчита при нанотоксикологичните изследвания (Jia et al., 2020). При
инжекционно прилагане наночастиците в повечето случаи се акумулират
във фагоцитите и органите богати на фагоцитиращи клетки (черен дроб,
далак и др.) и трябва да се следи за възможни възпалителни реакции,
чернодробна токсичност, имунотоксичност, реакции на свръхчувствител-
ност и др. Възможността за ендоцитоза на наночастиците от различни
клетки (не само от професионални фагоцити, но и от ендотелни, епителни
и други клетки) може да се окаже предпоставка за клетъчно увреждане
чрез оксидативен стрес, отделяне на токсични продукти от разпадане,
увреждане чрез отделяне на провъзпалителни цитокини и иницииране на
апоптоза. При попадане в системното кръвообращение, наночастиците
могат да достигнат всички тъкани и органи.
- Доза (количеството приложен препарат). За изследване ефекта на
дозата веществата се тестват за остра токсичност (при по-голяма едно-
кратна доза) и за хронична токсичност (при множество по-малки дози,
прилагани за по-дълъг период от време). Повечето препарати показват
класически дозозависим ефект – повишаване на токсичността с повиша-
ване на дозата. При in vivo експерименти често за оценка на острата ток-
сичност се ползва дозата LD50 – дозата, необходима да убие половината
от членовете на тестваната популация за определено време. По-ниска доза
LD50 се приема за индикация за по-висока токсичност и обратно. Понякога
се определят и дозите LD01, LD05, LD99 (съответстващи на смъртност 1%,
5% и 99%) и др. При опитите in vitro се тестват серии от концентрации на
изследваното вещество в средата, в която се култивират клетките, при
което се отчита жизненост на клетките (в %) след определен период от
време. С повишаване концентрацията на веществото и с удължаване вре-
мето на въздействие жизнеността на клетките намалява. При тези експе-
рименти се отчита често т.нар. инхибираща концентрация IC50 (за опреде-
лено време на въздействие), която е концентрацията, при която се устано-
вява 50% жизненост на клетките.
Други фактори, определящи резултатите от изследването, могат да бъ-
дат: изборът на моделна система (вид на клетъчната култура при опити in
vitro и вида на експерименталното животно при in vivo експерименти),
възрастта, полът и здравословното състояние на експерименталните жи-
вотни, условията на клетъчно култивиране или отглеждане на животните.
За установяване на имунотоксичност, генотоксичност, канцерогенност,
възпалителни реакции, репродуктивна токсичност и други обикновено се
прилагат допълнителни методи за изследване.
173
Токсичността на наночастиците се определя от физикохимичните им

характеристики – размер и форма на частиците, химичен състав, свойства
на повърхността на частицата, електрокинетичен потенциал, агрегацион-
но състояние и стабилност (Nel et al., 2006). Големият брой променливи
величини, от които зависи токсичността на наночастиците, прави трудно
формулирането на обобщени изводи и налага всеки един нов наномате-
риал да бъде тестван, имайки предвид всички тези променливи. Физико-
химичните характеристики на частиците пряко определят биоразпределе-
нието, разграждането и елиминирането им от организма, които на свой
ред също се свързват с токсикологичния им профил. Размерът на частици-
те може да определя не само реакционната способност на частиците, но и
възможността да бъдат ендоцитирани от различни клетки, както и да пре-
минават през различни физиологични бариери. Много наночастици обра-
зуват агломерати в биологични среди, например поради повишена йонна
сила на средата, но за съжаление това се игнорира при някои нанотоксико-
логични изследвания. Образуването на агломерати може да окаже силно
влияние върху разпределението на наночастиците в организма и токсико-
логичния им профил и следователно не става ясно дали установените
токсични ефекти или липса на токсичност при много от тези проучвания
не се дължи на образуването на агломерати.
Токсичността на наночастиците се свързва с различни механизми –
оксидативен стрес и съответните потенциални последствия (увреждане на
липиди, протеини, ДНК, генотоксичност, предизвикване на възпалителни
реакции и др.), отделяне на токсични продукти от разпада на наночасти-
ците и други въздействия на клетъчно ниво, които в крайните случаи
водят до необратими увреждания и клетъчна смърт (вж. §3). На ниво
организъм, наночастиците могат да взаимодействат с макрофагите и ком-
племента, да се наблюдават реакции на свръхчувствителност и/или други
последствия от уврежданията на клетъчно ниво, които засягат различни
органи и системи (вж. §4).
Най-общо видовете клетъчна смърт според механизма се класифици-
рат като програмирана (апоптоза, автофагия и др.) и непрограмирана
клетъчна смърт (Elbadawi and Efferth, 2020). Съществуват различни меха-
низми на клетъчна смърт, което е причина за противоречия и дебати в
областта относно класификацията им. В повечето рутинни проучвания се
търсят морфологични и молекулни белези за апоптоза, която е програми-
рана, съответно регулирана клетъчна смърт, характеризираща се със сви-
ване на клетката, кондензация на хроматина и фрагментация на ядрото и
хромозомите, активиране на протеазни ензими (каспази), които в крайна
174
сметка неселективно разграждат клетъчните протеини. За разлика от нек-

розата, която е патологична (травматична) клетъчна смърт, завършваща с
лизиране (разграждане) на клетъчната мембрана, при апоптозата се обра-
зуват клетъчни остатъци, наречени апоптотични телца, които при нормални
физиологични условия в организма биват фагоцитирани от макрофагите.
Ако липсват макрофаги, например в клетъчна култура, апоптотичните
телца в крайна сметка се лизират. Апоптоза протича също като физиоло-
гичен процес, част от нормалното развитие на организма (онтогенезата),
но може да се индуцира и от стресови фактори. Като белези на апоптоза
при изследванията за цитотоксичност се ползват ядрената фрагментация,
повишаване количеството на фосфатидилсерин от външната страна на
клетъчната мембрана, активиране на определени каспази и други (вж.
също §2.1.3 и §2.1.4). Некротичната клетъчна смърт е патологичен процес,
настъпващ в резултат на травматично клетъчно увреждане или лизиране
на клетъчната мембрана от химични агенти, например от повърхностно
активни вещества, каквито понякога се използват за стабилизиране на на-
ночастичкови диспресии. При некрозата клетъчното съдържимо се излива
в околната среда и може да попадне в системното кръвообращение, пред-
извиквайки нежелани последствия (например повишаване на серумния
калий, което може да доведе до спиране на сърдечната дейност, и др.).
2. МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ
2.1. Тестове in vitro

След синтез на нови видове наночастици, обикновено цитотоксичност-
та им се тества върху различни клетки с рутинни скринингови методи
(MTT, LDH и др.) при серия различни концентрации на наночастици и
време на въздействие (от часове до няколко дни). При тези методи се
отчита намаляването на пролиферативния потенциал, намаляването на
относителния брой живи клетки или клетъчната жизненост (viability;
виталитет) на третираните с наночастици клетки в сравнение с нетрети-
рана контрола, при което с различните методи се следи различен белег за
клетъчна жизненост, например запазване целостта и избирателната про-
пускливост на клетъчните мембрани (при LDH метода, при някои багрил-
ни техники за разграничаване на живи от мъртви клетки), активността на
някои клетъчни ензими (детектиране на редуктази при MTT метода, на
хидролази при флуоресцентното оцветяване с FDA, и др.) (Krysko et al.,
2008; Banfalvi, 2017; Zhang Q, 2019).
175
2.1.1. LDH метод
Този метод е основан на определяне на относителната активност на

ензима лактатдехидрогеназа (lactate deshydrogenase, LDH, ЛДХ), вътре-
клетъчен ензим, който се оказва извън клетката при нарушаване целостта
на клетъчната мембрана. Активността на LDH се определя спектрофото-
метрично чрез превръщането на тетразолиево съединение (iodonitrotetra-
zolium, INT) в червено формазаново багрило. В присъствие на LDH лактат
(lactate) се окислява до пируват (pyruvate), при което от никотинамид
(NAD+) се получава NADH/H+, чрез който тетразолиевата сол INT се реду-
цира до червено оцветен формазан в присъствие на катализатор (diapho-
rase) (фиг. 6.1). Полученият формазан се определя спектрофотометрично
при дължина на вълната 492 nm (Decker and Lohmann–Matthes, 1988).
Фиг. 6.1. Схема на реакциите при определянето на LDH
За определяне на цитотоксичност обикновено експериментът се про-

вежда в 96-ямкови плаки, в които клетките се инкубират за определено
време при различни концентрации от тестваните наночастици (като конт-
рола служат нетретирани клетки). Оцелелите след третирането клетки се
лизират с 0,1% TritonX-100, и освободеният при това ензим осъществява
реакцията, чийто продукт (формазановото багрило) се измерва. Абсорб-
цията на полученото багрило може да се корелира с броя на клетките (ако
176
е известен). Абсорбцията, получена от нетретираната контрола, се приема

за 100% жизненост на клетките, а процентът жизненост се определя като
отношение на абсорбцията от съответната ямка към тази на нетретираната
контрола (ямките с по-червен разтвор съответстват на по-жизнени клетки
и обратно).
2.1.2. МТТ метод
Този метод е основан на измерване активността на митохондриална

редуктаза от живи клетки. Митохондриален ензим (редуктаза), който е
активен в живите клетки, редуцира жълтото вещество МТТ (3-(4,5-di-
methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) до синьо-виолетово
багрило (formazan) (фиг. 6.2) (Mosmann, 1983).
Фиг. 6.2. Редукция на MTT до формазаново багрило
Експериментът се провежда обикновено в 96-ямкови плаки, в които

клетките се инкубират за определено време с различни концентрации от
тестваните наночастици (като контрола служат нетретирани клетки). При-
ема се, че броят на живите клетки е пропорционален на количеството на
полученото формазаново багрило. Количеството на формазана е пропор-
ционално на абсорбцията на светлина, измерена спектрофотометрично
при дължина на вълната 570 nm. Могат да се използват и други тетразо-
лиеви соли, подобни на MTT (MTS, WST-1, XTT) (Stockert et al., 2018).
2.1.3. Микроскопски методи
Различаването на живи от мъртви клетки, съответно относителния им

брой, може да се осъществи чрез директно наблюдение на клетките с
микроскоп. За целта може да се използва обикновен светлинен микроскоп
и багрила, които оцветяват по различен начин живи и мъртви клетки.
Например азо-багрилото трипаново синьо (Trypan blue), наречено така
поради токсичното си действие към трипанозоми, селективно оцветява
177
само мъртви клетки и тъкани. Живи клетки с незасегнати клетъчни мем-

брани не пропускат багрилото и не се оцветяват (Strober, 2015). С това
оцветяване обаче не може да се отличат апоптотични от некротични
клетки. Друго багрило, неутрално червено (Neutral red), се поема само от
живи клетки и се натрупва основно в лизозомите. Неутралното червено
може да се използва в комбинация с трипаново синьо за едновременно
оцветяване на живи и мъртви клетки с добър цветен контраст между тях
(Derenzis and Schechtman, 1973). Оцветяването на живи клетки с неутрал-
но червено може да се изпълни и като спектрофотометричен метод за
определяне на клетъчна жизненост, като алтернатива на MTT метода
(Borenfreund et al., 1988). Друго багрило, което подобно на трипаново
синьо багри само мъртви клетки, е еритрозин Б (Erythrosin B) (Kim S. et
al., 2016). Това червено багрило се използва също така като оцветител в
хранително-вкусовата промишленост, Е-127 (Chequer et al., 2012).
За изследване на клетъчна жизненост се използват и флуоресцентно-
микроскопски техники. Например за отличаване на живи клетки широко
се използва флуоресцеиндиацетат (FDA) – липофилно вещество, което
лесно преминава през клетъчни мембрани и е безцветно, но само в живите
клетки бива хидролизирано от естерази до флуоресцеин, който флуорес-
цира в зелено и се установява само в живите клетки (фиг. 6.3). За флуорес-
центно багрене на мъртви клетки се използват багрила, които преминават
само през перфорирани мембрани (на мъртви клетки) и се свързват с ДНК.
Например такова багрило е пропидиев йодид, което може да се ползва в
комбинация с FDA за по-добро различаване на живи от мъртви клетки
(propidium iodide, PI) (Jones and Senft, 1985).
Фиг. 6.3. Хидролиза на FDA под действие на естерази от живи клетки. Образуваният
флуоресцеин флуоресцира в зелено само в клетките с активни естерази
Чрез флуоресцентно-маркиран анексин А5 могат да бъдат различени

апоптотични клетки от други. Анексин А5 е протеин, който се свързва
специфично с фосфолипида фосфатидилсерин, който е разположен от
вътрешната страна на клетъчните мембрани при живи клетки и се появява
178
по външната част на мембраната при апоптотични клетки. Методът се

използва широко при автоматичното определяне на клетки в апоптоза
чрез поточна цитометрия (вж. §2.1.4) (Vermes et al., 1995).
Като морфологичен белег на клетки в апоптоза се приема характер-
ното фрагментиране на ядрения хроматин, което може да се визуализира
с флуоресцентен микроскоп и подходящи флуоресцентни багрила, които
се свързват с ДНК. Например такива са багрилата DAPI и различните
Hoechst багрила (Crowley et al., 2016).
При взаимодействие на различни клетки с наночастици може се на-
блюдава ендоцитоза и попадане на наночастиците в ендозомите, което е
съпроводено с относително увеличаване броя на ендозомите и лизозомите
в третираните клетки. Това може да се установи с флуоресцентни багрила,
които позволяват визуализиране на ендозоми/лизозоми, например с баг-
рилото акридин оранж (Evangelatov et al., 2016).
Морфологичните белези на клетъчното увреждане от въздействие на
наночастици може да се проследи в детайли с електронно-микроскопска
техника (ТЕМ, SEM). В тези случаи клетките се фиксират и контрастират
по подходящ начин. Наблюденията с електронен микроскоп позволява
отчитане на морфологични изменения в митохондриите, ядрата, ендо-
плазмения ретикулум и други субклетъчни структури.
2.1.4. Поточна цитометрия
Поточната цитометрия е метод за броене и разделяне на клетки според

оптичните им характеристики. При този процес се използва клетъчна
суспензия, която се подава в цитометъра и преминава под формата на
поток от капки (които в идеалния случай не съдържат повече от една клет-
ка) през лазерен лъч. При това преминаване на клетките през лазерния лъч
се анализира разсеяната от клетките светлина и флуоресценцията им, ако
са флуоресцентно-маркирани (вж. Гл. 7, §6.6). При изследванията на
клетъчна жизненост и вида клетъчна смърт, поточната цитометрия пред-
лага възможност за анализиране и разделяне (сортиране) на хиляди клет-
ки за кратко време. За маркиране на клетки в апоптоза може да се използва
флуоресцентно-маркиран анексин А5 (Vermes et al., 1995).
2.1.5. Методи за детектиране на ROS
Най-често цитотоксичността на различни наночастици се свързва с

оксидативен стрес в третираните клетки (вж. §3.1). Това обуславя значи-
179
мостта на методите за детектиране и по възможност количествено опре-

деляне на реактивни кислородни частици или видове (Reactive Oxygen
Species, ROS) в третираните с наночастици клетки в сравнение с нетрети-
раните контроли. За целта често се използват органични вещества, които
под действие на ROS се окисляват лесно и дават флуоресцентни продукти
на окисление (Wardman, 2007). Например често използваният за тази цел
хидроетидин, който под действие на супероксиден анион-радикал дава
флуоресциращ продукт – 2-хидроксиетидиева сол (Zhao et al., 2005) (фиг.
6.4). Разработени са и методи за детектиране на реактивни азотни видове
(Reactive Nitrogen Species, RNS) (Gomes et al., 2006).
Фиг. 6.4. Окисление на хидроетидин до флуоресцираща хидроксиетидиева сол под дейст-

вието на супероксиден радикал
За детектиране на оксидативен стрес в клетки под действието на нано-

частици, освен методи за детектиране на реактивните кислородни и азот-
ни видове (ROS и RNS), се прилагат и методи, при които се детектират
последствията от тяхното образуване – например пероксидация на липиди
(чрез определяне на малондиалдехид, MDA), увреждане на ДНК (кометен
анализ), промяна в съдържанието на тиоли и активността на глутатион
трансферазата (Zuberek and Grzelak, 2018). Описание на тези методи може
да се намери в специализираната литература.
2.1.6. Микробиологични методи
Антибактериалните свойства на наночастиците са интензивно разви-

ваща се област от биомедицинските нанотехнологии (Wang et al., 2017).
Ефектът може да бъде бактериостатичен, изразен като потискане на раз-
множаването, или бактерициден – с убиване на бактериите. Има различни
подходи за изследване на тези ефекти. Например към бактериалната кул-
тура се прибавя определено количество от изпитваното вещество и през
определени периоди от време се определя концентрацията на микроорга-
180
низми в пробата, в сравнение с контролна проба от нетретирани микро-

организми, поставени при същите условия. Ако след определен период
третираните бактерии все още се размножават, но със значително пони-
жена скорост спрямо контролата, изпитваното вещество има бактериоста-
тичен ефект, а ако няма развитие, ефектът е бактерициден. Тестовете се
провеждат с микробни култури, клинични изолати и микроорганизми изо-
лирани от околната среда.
За определяне на антибактералната активност на наночастици могат да
се прилагат методите за определяне на антибиотична активност. Наночас-
тиците обаче са много по-големи от антибиотичните молекули, и това
силно затруднява дифузията им в твърда или полутвърда среда, поради
което се предпочитат методи за изпитване в течни среди (суспензия). На-
пример в стерилни епруветки се приготвят серия от разтвори със спадаща
концентрация на изследваните наночастици, диспергирани в течна храни-
телна среда, след което към всяка епруветка се прибавя определено коли-
чество бактериална суспензия (инокулум) с определена концентрация на
бактериални клетки. След определен период на култивиране (>18 ч.) се
отчита относителния брой бактерии във всяка епруветка спрямо нетрети-
рана контрола (която не съдържа наночастици, но е приготвена при също-
то разраждане на бактериалната култура) (Yordanov et al., 2010a). Опреде-
ля се минималната инхибираща концентрация (minimum inhibitory con-
centration, MIC), най-ниската концентрация, която потиска бактериалния
растеж.
За определяне броя на микробните клетки в средата се прилагат раз-
лични методи – директни и индиректни. Директните методи се основават
на наблюдение и броене на клетките (живи и мъртви), например в броячни
камери. Индиректните методи са културални – с посяване в среди, при
което се отчита броят на прорасналите колонии, като по този начин се
установява броят само на живите бактерии, способни да се развиват при
дадените условия. Броят на бактериите в мътни суспунзионни култури
(при относително високи концентрации на клетките) може се измери тур-
бидиметрично или нефелометрично, съответно по оптичната плътност
или интензитета на разсеяната светлина. Този метод е предложен още
през 1907 година от Joseph McFarland и единицата за мътност на суспен-
зионна култура носи неговото име. За калибриране при тези измервания
класически се ползват като стандарти суспензии от бариев сулфат с опре-
делена концентрация (McFarland, 1907), но има и стандарти за мътност,
които съдържат латексни частици с определена големина и концентрация.
Мътността на културата се калибрира спрямо концентрацията на клетките
(клетки/мл).
181
2.2. Тестове върху животни (in vivo)
Като моделни системи при in vivo тестовете служат различни видове

лабораторни животни – мишки, плъхове, маймуни и други. Тестовете се
провеждат с достатъчно на брой животни като необходимо условие за
осигуряване статистическата значимост на резултатите. Провеждат се
тестове за остра и хронична токсичност. По време на изследването се
следи телесното тегло на животните като общ белег на токсичност (жи-
вотните, които не са добре се хранят по-малко и не наддават с темповете
на контролната група), правят се кръвни и други изследвания според
целите на експеримента. Например фармакокинетични изследвания за
плазмен полуживот и площ под кривата за лекарствени препарати в нано-
носители, скорост на елиминиране от организма (отделяне с урината и
фецеса) и други. През определен период от време или в края на изслед-
ването определен брой от опитните животни обикновено биват евтанази-
рани за хистологични изследвания и определяне акумулирането на нано-
частици в различни вътрешни органи.
Тясно свързано с токсикологичния профил на наночастиците е разпре-
делението им в раличните органи и системи след попадането им в живия
организъм. Методите за определяне на наночастиците в различни тъкани
и органи зависят от химичния състав на частиците. За наночастици,
съдържащи метали или метални йони, които не се намират в относително
големи количества в организма (злато, сребро, кадмий и др.) може да се
приложи масспектрометрия с индуктивно-свързана плазма (ICP-MS)
(Sonavane et al., 2008; Ye et al., 2012; Koyama et al., 2015), атомно-
емисионна спектроскопия (AES) (Chithrani et al. 2006) и други методи.
Тези методи за елементен анализ обаче не дават инфрмация под каква
форма е анализираният метал в изходната проба (например дали е част от
наночастиците или е продукт на тяхното разграждане). В други случаи за
изследване на биоразпределението на наночастиците в организма се при-
лагат радиоизотопни методи, при които наночастиците се бележат с ра-
диоактивни изотопи (Grislain et al., 1983; Lenaerts et al., 1984; Douglas et
al., 1986; Ghanem et al., 1993). За тъканно и органно разпределение на
наночастиците може да се приложи авторадиография, например 14С-беля-
зани полимерни наночастици (Waser et al., 1987) или сцинтиграфия за
установяване разпределението в целия организъм (Douglas et al., 1986;
Ghanem et al., 1993). Разпределението на флуоресцентни наночастици в
организма може да се проследи чрез различни флуоресцентни техники
(Kobayashi et al., 2007).
182
За оценка на ефекта на наночастиците върху преживяемостта на жи-

вотните следва да се проведат експерименти, при които се построяват
криви на преживяемостта по т.нар. метод на Каплан–Майер (Kaplan–
Meier), при който процентът на преживяемост се представя като функция
на времето (за периода от началото до края на проучването, което може
да продължи дори години) (Rich et al., 2010).
За изясняване механизмите на токсичността на наночастиците в живи
организми наред с тестовете върху изолирани клетки, се провеждат реди-
ца изследвания при третираните животни с различни методи – биохимич-
ни, имунологични, хематологични и др. Чрез биохимичните методи се
търси ефект на частиците върху метаболизма, клетъчната сигнализация и
възпалителния отговор (чрез анализ нивата на различни цитокини, ефект
върху експресията на различни протеини и др.), белези на оксидативен
стрес и др. Тъй като наночастиците, особено въведените инжекционно,
адсорбират различни опсонини и други молекули, попадат в макрофагите
и при определени условия могат да ги активират или блокират, важен етап
от токсикологичния анализ на всеки вид наночастици е проверката на
тяхната имунотоксичност и възможността да предизвикват различни
реакции на свръхчувствителност (вж. §4.9). Не бива да се пренебрегва
възможността изследваната наноформулировка да е контаминирана с
микроорганизми (нестерилна) или да съдържа примеси от вещества (на-
пример остатъци от производствения процес), които да са причина за
еветуално наблюдавани токсични ефекти. В една голяма част от научната
литература, посветена на токсикологични изследвания на експериментал-
ни наноформулировки, липсват данни за адекватна проверка на чистотата
на изследвания продукт, както и за условията и ефективността на стерили-
зацията (ако въобще такава е провеждана) при наночастици за инжек-
ционно приложение. Като се добавят и големите различия в условията на
тестване и използваните моделни системи, трудно могат да се направят
обобщени и еднозначни изводи относно токсикологичния профил на раз-
личните наночастици.
3. ЦИТОТОКСИЧНИ МЕХАНИЗМИ
3.1. Оксидативен стрес
Оксидативният стрес се счита за главен и общ за различни видове

наночастици цитотоксичен механизъм (Manke et al., 2013; Zuberek and
Grzelak, 2018; Ganguly et al., 2019), който най-общо може да се опише като
183
дисбаланс между получаването и елиминирането на реактивни кислород-

ни (ROS) и азотни видове (RNS). При продължително излагане на дейст-
вието на реактивните частици, различни клетъчни структури и биомоле-
кули (липиди, ДНК, протеини) могат да бъдат увредени, което да доведе
до нарушения в клетъчния метаболизъм и дори клетъчна смърт. Реактив-
ните кислородни видове (ROS) могат да дифундират през клетъчни мем-
брани и през вътрешността на клетката (Zuberek and Grzelak, 2018). Източ-
никът на ROS са някои оксидоредуктази (например NADPH) и процесите
в електрон-транспортната верига в митохондриите. Много от ROS части-
ците имат важна роля в нормалните физиологични процеси и клетъчната
сигнализация. Промяната в техните концентрации може да доведе до
нарушаване дейността на клетката не само чрез увреждащото действие на
излишъка ROS, но и чрез нарушаване на сигнализацията. ROS включват
супероксиден йон (O2-), хидроксилен радикал (OH∙), водороден пероксид
(H2O2), синглетен кислород (O2*) и др.
Парадигмата за оксидативния стрес като основен механизъм на цито-
токсичността на наночастиците е толкова дълбоко интегриран в наноток-
сикологията, че много изследователи не провеждат изследвания за уста-
новяване на оксидативен стрес, а правят предположения въз основа на
литературни данни, че изследваните от тях наночастици предизвикват
такъв стрес. ROS могат да бъдат детектирани директно с различни мето-
ди, основно чрез флуоресцентно измерване на окислителните продукти на
определени вещества (вж. §2.1.5), или индиректно, чрез скрининг на ген-
ната експресия.
Оксидативният стрес, предизвикан от наночастици, зависи от много
фактори – вид на частиците, повърхностна модификация, размери и др.
При един от възможните механизми за индуциране на ROS от наночас-
тици се предполага въздействие на частиците върху клетъчните сигнални
пътища (например чрез взаимодействие с мембранни протеини или ли-
пидни рафтове) (Nel et al., 2009). Има вероятност и за индиректно повлия-
ване на сигналните пътища от наночастиците чрез ROS, индуцирани от
частиците по други механизми.
Повишаването нивата на ROS най-често се свързва с проникването на
наночастиците в клетките (Ganguly et al., 2019). Ендоцитозата на нано-
частици може да активира някои клетки (макрофаги, неутрофили и др.) да
увеличат производството на ROS и RNS чрез активиране на ендозомална-
та NADPH-зависима оксидаза (фиг. 6.5). Макрофагите разпознават нано-
частиците чрез неспецифично адсорбираните върху тях опсонини (Sahay
et al., 2010). В това отношение се търси аналогия с т.нар. оксидативен или
184
респираторен взрив – явление, възникващо при фагоцитозата на микро-

организми и е част от неспецифичната защита на организма, но също така
играе роля в клетъчната сигнализация и други процеси (Karnovsky and
Badwey, 1986; Herb and Schramm, 2021).
Излишната продукция на ROS може да доведе до повишена активност
на гените, свързани с регулацията на възпалителния отговор, в това число
активация на транскрипционни фактори (като NF-κΒ и AP-1) и синтез на
цитокини (Elsaesser and Howard, 2012). Отделените цитокини се измерват
с цел предварителна оценка на провъзпалителните свойства и имуноток-
сичността на наночастиците (Elsabahy and Wooley, 2013). По-важните
биологични ефекти от индуцираните от наночастици повишени нива на
ROS са обобщени на фиг. 6.6.
Фиг. 6.5. При ендоцитоза частиците попадат в ендозомите на клетките, където NADPH-
зависима оксидаза катализира електронен трансфер от NADPH към молекулен кислород с
образуване на супероксиден йон (O2-) – прекурсор за водороден пероксид (H2O2) и други
ROS. Ендозомното пространство се обогатява на лизозомни ензими (например пептидази
и др.) от сливащи се с ендозомата лизозоми, а ендозомната среда се подкислява от водо-
родни катиони (H+), които се пренасят от цитоплазмата в ендозомата от V-ATP-аза,
намираща се в ендозомната мембрана
3.1. Токсични продукти на разграждане
Някои видове наночастици могат да окажат токсично въздействие чрез

продуктите на разграждането им. Такива могат да бъдат неорганични
наночастици, съдържащи токсични метални йони (Sabella et al., 2014; Hu
et al., 2016; Sengul and Asmatulu, 2020). Полимерни частици, които дават
185
потенциално токсични продукти при разграждане, са полиалкилциано-

акрилатните. При тяхната хидролиза се получават полицианоакрилова
киселина и съответните алкохоли. Трудно е обаче да се изяснят ефектите
на различните фактори, тъй като цитотоксичността на такива частици
зависи от вида на използваните клетъчни линии, от вида на тестовете за
определяне на цитотоксичност и други фактори (Sulheim et al., 2017).
Отделянето на разпадните продукти относително бързо и локално, до
клетъчната мембрана при адхезия на наночастиците към клетките, може
да окаже токсичен ефект от увреждане и перфорация на клетъчните
мембрани (Kante et al., 1982; Gipps et al., 1987).
Токсичните продукти на разграждане на наночастиците директно или
индиректно (например чрез повлияване продукцията на ROS, свойствата
на клетъчните мембрани и др.) оказват различни биохимични ефекти вър-
ху клетките, в т.ч. повлияване на сигналните пътища, функциите на кле-
тъчни мембрани, активността на ензими, генната експресия и други ефек-
ти, водещи като цяло до увреждане на клетъчните функции.
Фиг. 6.6. Биологични ефекти на индуцирания от наночастици оксидативен стрес
3.2. Дестабилизация на мембрани
При достатъчно висока концентрация сърфактантите, с които често са

стабилизирани наночастичковите дисперсии, могат да солюбилизират
липидите от клетъчните мембрани и да доведат до перфорация на мембра-
ните с увреждане и смърт на клетките. При по-ниска концентрация на сър-
фактант, която е недостатъчна за солюбилизация на мембраните и не се
свързва с токсични ефекти, може да се наблюдава повишен пермеабили-
тет на клетъчните мембрани за други вещества (Hodes et al., 1960). Такъв
пример може да се даде с полисорбат 80, който при нетоксични концен-
трации силно повишава вътреклетъчната концентрация и токсичността на
186
епирубицин (Yordanov et al., 2012a). При контакт на наночастици с кле-

тъчната мембрана бързо и локално отделените продукти на разпадане на
от наночастиците действат като токсиканти и водят до увреждане на клет-
ките и перфорация на мембраните (Kante et al., 1982; Gipps et al., 1987).
Мембраните структури могат да бъдат увредени и дестабилизирани
при електростатично взаимодействие с положително заредени частици
(Tatur et al., 2013). При експерименти в биологични среди реалното съще-
ствуване на положително заредени наночастици винаги трябва да се по-
твърди експериментално. Най-често положително заредените частици
адсорбират протеини (които присъстват в биологичните среди) като се
презареждат и стават с отрицателен ζ-потенциал поради формиралата се
около частиците протеинова корона (Forest and Pourchez, 2017).
4. ОРГАННА И СИСТЕМНА ТОКСИЧНОСТ
4.1. Кожна токсичност

Кожата е главна бариера между вътрешните органи и външната среда
и въпреки, че поглъщането и вдишването на наночастици е по-опасно в
сравнение с въздействието им върху кожата, информацията в научната
литература за кожната токсичност на наночастиците е относително малко.
Повечето наночастици в зависимост от свойствата си могат да имат драз-
нещо действие и да предизвикат възпалителен отговор, но са известни и
примери на наночастици с противовъзпалителен ефект (Hashempour et al.,
2019). Необходимо е по-обстойно проучване на потенциалната геноток-
сичност и канцерогенност на бионеразградими и дълготрайно провъзпа-
лително действащи частици. В повечето случаи кожата се явява ефектив-
на бариера срещу проникване на наночастици и достигането им до вът-
решни тъкани и органи. Наночастиците се локализират предимно във
фоликулите и повърхностните слоеве на епидермиса. Дълбочината на
проникването им в кожата се повишава с повишаване концентрацията на
частиците, с повишаване на хидрофобността им и с намаляване на размера
им (Labouta et al., 2011).
4.2. Очна токсичност
Като орган, намиращ се в пряк контакт с външната среда, окото е

изложено на потенциално вредни нанозамърсители от околната среда. Освен
187
това съществуват идеи и някои експериментални разработки за лекар-

ствено доставяне чрез наночастици (напр. липидни – Seyfoddin et al., 2010)
при очни болести, което допълнително налага необходимостта от задъл-
бочени проучвания на въздействието на наночастици върху очите. Въпре-
ки това такива нанотоксикологични изследвания са относително малко.
При въздействието на наночастици върху окото могат да се очакват
различни възпалителни реакции, засягащи конюнктивата (лигавицата,
покриваща предната част на очната ябълка, без роговицата, и вътрешните
повърхнини на клепачите) (Zhu et al., 2019).
4.3. Белодробна токсичност
Наночастици могат да се акумулират в белия дроб чрез вдишване или

по кръвен път след инжекционно въвеждане. Достигането на частици до
бронхиолите и алвеолите при вдишване силно зависи от размера им, като
по-големите, микронноразмерни частици обикновено се задържат в гор-
ните дихателни пътища и бронхите, а наночастиците проникват по-дълбо-
ко и могат да се акумулират в алвеолите (Carvalho et al., 2011).
Наночастиците могат да попаднат чрез ендоцитоза в белодробните
епителни клетки, фибробласти и алвеоларни макрофаги (Li et al., 2010a).
В погълналите ги клетки наночастиците могат да предизвикат оксидати-
вен стрес и отделяне на провъзпалителни цитокини, водещи до възпали-
телни реакции. В някои случаи е показано, че наночастици могат да пре-
минат през алвеоло-капилярната бариера и да бъдат установени в други
органи и тъкани в тялото (Yu et al., 2007).
Белият дроб е един от органите (наред с черния дроб, далака и др.), в
които се акумулират значителни количества наночастици след интраве-
нозно въвеждане. Например наночастици от полихексилцианоакрилат
(РНСА, използвани за експериментално лекарствено доставяне) или от
албумин биват ендоцитирани от белодробните ендотелни клетки и от
алвеоларните макрофаги след интравенозно въвеждане, където формират
микронноразмерни клъстери в ендозомите (Waser et al., 1987).
При клинични изпитвания на полимерни наночастици натоварени с
доксорубицин е установено развитие на остър респираторен дистрес син-
дром (ARDS), свързан с третирането при 24% от пациентите (вкл. 3 смърт-
ни случая), поради което проучването е било прекратено (Merle et al.,
2017). Експерименти с плъхове са потвърдили връзката между прилага-
нето на наночастиците и риска от ARDS, който се развива в рамките на 48
часа от приложението и силно зависи от приложената доза и скоростта на
188
i.v. инфузията. Може да се предположи, че ADRS в тези случаи е резултат

на реакция на свръхчувствителност.
4.4. Гастроинтестинална токсичност
Гастроинтестиналният тракт изпълнява храносмилателна функция и е

място на сложни взаимодействия между организма и чревния микробиом.
Съответно токсикологичните изследвания с наночастици следва да включ-
ват не само изучаване на въздействието им върху функците на клетките и
тъканите от храносмилателната система, но и ефектите им върху микро-
биома и някои имунни функции на червата (Bergin and Witzmann, 2013).
Малки частици (~50 nm) биха могли да попаднат чрез ендоцитоза в
чревните епителни клетки и да преминат в системното кръвообращение,
локализирайки се в различни органи и системи, за разлика от по-големи
частици (~300 nm) (Jani et al., 1990). Но в други случаи рядко се устано-
вява преминаване на наночастици през чревната лигавица. Следва да се
има предвид, че по протежение на гастроинтестиналния тракт рН на сре-
дата се изменя в големи граници, което може да повлияе стабилността и
агрегационното състояние на наночастиците, съответно възможностите
им за попадане в клетките чрез ендоцитоза. Относително ниското рН в
стомаха може да ускори разтварянето на някои наночастици (изградени
от метални оксиди или органични наночастици, съдържащи хидролизира-
щи се функционални групи) и отделянето на токсични продукти. Сребър-
ните наночастици имат бактерициден ефект и е установено, че повлияват
чревния микробиом (Dahiya et al., 2018).
4.5. Чернодробна и жлъчна токсичност
При интравенозно въвеждане голяма част от приложените наночастици се

акумулират в черния дроб, където биват фагоцитирани от чернодробни
макрофаги (купферови клетки), намиращи се по стените на т.нар. синусо-
иди (Lenaerts et al., 1984; Sadauskas et al., 2007). Чернодробните синусоиди
са тесни цепковидни съдови пространства между слоевете хепатоцити,
покрити с ендотелни клетки, където се извършва обмяната на вещества
между кръвта и хепатоцитите. Освен в купферовите клетки интравенозно
приложени наночастици се откриват и в чернодробните ендотелни клетки
(Waser et al., 1987). Наночастици, които циркулират в системното кръво-
обращение и са с достатъчно малки размери, по-малки от диаметъра на
фенестрациите в стената на синусоидните капиляри (<150–200 nm), могат
да преминат от лумена на синусоида и да взаимодействат директно с
189
хепатоцитите. Освен чрез този механизъм наночастици могат да достиг-

нат до хепатоцитите и чрез трансцитоза през ендотелните клетки (Zhang
Y.-N. et al., 2016). Чрез екзоцитоза от хепатоцитите частиците могат да
попаднат в жлъчните пътища и да бъдат елиминирани през гастроинтес-
тиналния тракт. В редки случаи наночастистици попаднат в черния дроб
и след абсорбция от гастроинтестиналния тракт (Jani et al., 1990).
В зависимост от свойствата на наночастиците около 30 до 99% от
попадналите в системното кръвообращение частици в крайна сметка се
акумулират в черния дроб (Zhang Y.-N. et al., 2016). В повечето случаи,
при които черният дроб не е целеви орган за доставяне на наночастици,
това се явява сериозен и почти непреодолим проблем. Дълготрайното
акумулиране на бавноразградими наночастици в купферовите и ендотел-
ните клетки би могло да доведе до хронично нарушение на функциите им.
При токсикологичните изследвания in vivo за чернодробна токсичност се
следят хематологични и биохимични показатели, като промени в нивата
на някои ензими (ALT, AST, ALP), холестерол, хистопатологични измене-
ния (некроза, фиброза, хиперплазия, кръвоизливи и др.) в черния дроб и
жлъчните пътища. По-рядко са докладвани явления на остра токсичност
с тежки поражения на черния дроб и жлъчните пътища (съпроводени с
некрози, кръвоизливи и др.), например след i.v. прилагане на сребърни
наночастици (10 nm) (Maglie et al., 2016). Както при всички токсикологич-
ни изследвания, не бива да се пренебрегва възможността изследваният
препарат да е контаминиран с ендотоксин или други вещества, на които
да се дължат наблюдаваните явления, а не на самите наночастици.
4.6. Невротоксичност
Известни са множество опити за доставяне на лекарствени вещества

до централната нервна система чрез наночастици, преодоляващи кръвно-
мозъчната бариера (Kreuter and Gelperina, 2008; Saraiva et al., 2016; Tosi et
al., 2020). Основните механизми, чрез които наночастици могат да достиг-
нат мозъка включват: i) от системното кръвообращение чрез трансцитоза
през мозъчните ендотелни клетки (Kreuter, 2012; Ye et al., 2013); и ii) чрез
придвижване по сензорни неврони (Lin et al., 2020). В тези случаи възник-
ва въпросът за съдбата на наночастиците след попадането им в мозъка и
за острите и хронични токсични ефекти.
Механизмите, чрез които наночастици биха могли да окажат невро-
токсично действие включват оксидативен стрес, индуциране на апоптоза,
възпалителни процеси, активиране на клетъчни сигнални пътища, про-
мяна в пропускливостта и интегритета на кръвно-мозъчната бариера,
190
активиране на невроните чрез глутамат от астроцитите, провъзпалително

активиране на микроглията и др. (Jiang and Gao, 2017; Engin and Engin,
2019). Ефектите на наночастици върху мозъка следва да се изследват
освен с хистопатологични и биохимични методи, също и с набор in vivo
тестове за установяване на аномалии в поведението, паметта, сензорни
възприятия и други (Lin et al., 2020). Необходими са по-детайлни проучва-
ния на акумулирането на различни наночастици в мозъка и най-вече на
техния метаболизъм (разграждане и елиминиране).
4.7. Бъбречна токсичност
При парентерално приложение, най-често i.v., наночастици могат да се

локализират частично в бъбреците, където често биват ендоцитирани от
мезенгиални и епителни клетки. Например нормални мезенгиални клетки
ендоцитират полимерни наночастици при опити in vitro и in vivo (при i.v.
приложение в плъхове) (Manil et al., 1994), като при тези експерименти е
показано, че мезенгиалните клетки поглъщат около пет пъти повече
наночастици от епителните. Бъбречната локализация на наночастиците
може да се окаже проблем в случаите, при които частиците са натоварени
с цитотоксични препарати. Например наблюдавана е остра бъбречна ток-
сичност при приложение на полимерни наночастици, натоварени с доксору-
бицин (Manil et al., 1995). В други случаи се предполага, че акумулирането
на наночастици в бъбреците би могло да се използва за експериментално
третиране на бъбречни заболявания (Choi et al., 2011; Huang et al., 2021).
Като цяло в литературата се съобщава за in vitro експерименти с раз-
лични видове наночастици (метални, въглеродни и др.), които могат да
окажат цитотоксични ефекти (понижена клетъчна жизненост, индукция
на оксидативен стрес, нарушения във функциите на митохондриите, цито-
скелета, клетъчната мембрана и др.), докато някои in vivo експерименти
показват нефротоксичния им потенциал, който може да се прояви като
дегенерация на тубуларните епителни клетки, откриване на клетъчни
фрагменти и протеини в тубулния лумен, ренална интерстициална фибро-
за, оток на гломерулите, пролиферация на мезенгиални клетки и други
(Iavicoli et al., 2016).
4.8. Съдова и ендотелна токсичност
Ендоцитозата на различни видове наночастици от ендотелни клетки е

показана при множество експерименти (Davda and Labhasetwar, 2002;
Simone et al., 2009; Aliyandi et al., 2020). Ендотелните клетки покриват
191
стените на кръвоносните съдове откъм лумена и изграждат кръвоносните

и лимфни капиляри. Тези клетки осъществяват ред важни функции – през
тях се осъществява обменът на хранителни вещества и метаболити между
кръвта и тъканите, участват в регулиране на кръвосъсирването чрез син-
тез на фактора на Вилебранд (Willebrand), участват във възпалителни про-
цеси и др. Ендотелните клетки образуват бариера между съдовия лумен и
околната субендотелна съединителна тъкан (която е с протромботични
свойства) и участват в контрола на кръвното налягане. При възпалителни
процеси пропускливостта на ендотелния слой се повишава, което води до
образуването на оток във възпалената тъкан. Възможните последствия от
увреждане на ендотела включват повишено кръвно налягане (в резултат
намаляване синтезата на азотен монооксид, NO), освобождаване на пато-
логични количества фактор на Вилебранд (благоприятстващ агрегацията
на тромбоцитите), както и привеждане на субендотелната съединителна
тъкан в контакт с кръвта (при нарушаване целостта на ендотела).
Погълнатите чрез ендоцитоза наночастици от системното кръвообра-
щение могат да останат в ендотелните клетки или да ги напуснат чрез
екзоцитоза. Сумарно, ендоцитозата на наночастици и последващата екзо-
цитоза от другата страна на ендотела се означава като трансцитоза и това
е основен механизъм за преминаване на наночастици през капилярната
стена (освен в случаите на фенестрирани съдове, където частиците с
достатъчно малък размер преминават и през фенестрациите) (Liu et al.,
2019). Например чрез трансцитоза през ендотелните клетки изграждащи
мозъчните капиляри наночастици могат да попаднат от кръвта в мозъка
(Kreuter, 2012; Ye et al., 2013).
Ендоцитираните от ендотелните клетки наночастици в някои случаи
могат да инициират възпалителни реакции и да нарушат функциите на
ендотела (Gojova et al., 2007; Zhu et al., 2010; Cao, 2018; Wen et al., 2019).
Това поставя въпроса за възможно системно увреждане на вътрешните
органи при инжекционно приложение на наночастици чрез нарушаване
функциите на ендотелната бариера. Например интравенозно приложени
сребърни наночастици могат да попаднат в съдовите ендотелни клетки,
индуцирайки повишени нива на ROS и понижаване експресията на кад-
херин (протеин, който участва в междуклетъчните контакти), разрушава-
не на контактите между ендотелните клетки и повишаване на съдовата
пропускливост, включително за наночастици, при което са наблюдавани
периферни възпалителни реакции в черния дроб, бъбреците и белите
дробове (Guo et al., 2016).
192
4.9. Имунотоксичност
Възможността наночастици да адсорбират опсонини и комплементни

фактори, да бъдат ендоцитирани от макрофаги и неутрофили, както и да
индуцират възпалителни реакции поставя важния въпрос за тяхната
потенциална имунотоксичност (Dobrovolskaia et al., 2009; Dobrovolskaia et
al., 2016; Petrarca et al., 2020). Голяма част (често над 80–90%) от инжек-
ционно приложените частици се ендоцитират от фагоцити (макрофаги,
неутрофили, дендритни клетки) (Zhang Y.-N. et al., 2016). Макрофагите
участват във формирането на имунния отговор, във фагоцитозата на
антигени и микроорганизми, както и в нормални физиологични процеси
и разстройството на тяхната функция от акумулирани в тях наночастици
може да има различни последствия, най-общо свързани с активиране или
супресия на функциите им (Gaspar et al., 1992; Cruz et al., 1997; Leroy et
al., 2011; Haase et al., 2011; Luo et al., 2015; Chen and Gao, 2017; Dalzon et
al., 2020; Swartzwelter et al., 2021).
Ефектът на наночастиците върху функциите на антиген-презенти-
ращите клетки (макрофаги, дендритни клетки и др.) може да бъде дозо- и
времезависим. Например изследвания на ефекта на полибутилцианоак-
рилатни наночастици върху първичния имунен отговор при мишки са
показали, че i.p. приложени частици в относително високи дози (200–400
mg/kg) няколко дни преди имунизация значително редуцират титрите на
получените антитела в серума и нямат ефект върху нивата на антителата,
ако се приложат след имунизацията (Antcheva et al., 1994). При тези експе-
рименти, по-ниски дози от наночастиците (2,5–5,0 mg/kg), приложени
преди или малко след имунизацията, оказват стимулиращо действие вър-
ху имунния отговор.
Имунотоксичността на различните видове наночастици като цяло се
дължи на относително неспецифични взаимодействия с компонентите на
хуморалния и клетъчния имунитет, в резултат на което се наблюдава
имуносупресия или възпалителни реакции (Dobrovolskaia et al., 2016).
Счита се, че основен механизъм на провъзпалителното действие на много
видове наночастици се явява оксидативният стрес (вж. §3.1). При това,
получените ROS биха могли да стимулират експресията на гени, свързани
с възпалителния отговор, определени транскрипционни фактори (NF-κΒ,
AP-1) и съответни цитокини (Heng et al., 2011; Elsaesser and Howard, 2012).
Отделените при това цитокини често се измерват като белег за потен-
циална имунотоксичност (Elsabahy and Wooley, 2013). Във всички случаи
обаче, при които се изследва имунотоксичността на наночастици, трябва
193
да се има предвид потенциалната възможност за контаминация на изслед-

ваната формулировка с ендотоксин и/или други ксенобиотици, които
допринасят за цитотоксичността и имунотоксичността, а не само нано-
частиците (Smulders et al., 2012).
Нежелан ефект при инжекционно приложени наночастици може да се
окаже т.нар. CARPA синдром (complement-activated related pseudoallergy):
комплекс от постинфузионни реакции на свръхчувствителност, които не
са IgE-медиирана алергия и се означават понякога като „псевдоалергия“
(Szebeni, 2005, 2014, 2015; Szebeni et al., 2012). Наблюдаван е при някои
клинични проучвания на липозомен доксорубицин, мицеларни форми на
някои цитостатици и др. Патогенезата му се свързва с активиране на
комплемента, водещо до отделяне на вазоактивни медиатори (хистамин,
PAF, левкотриени) от мастни клетки, базофили и макрофаги. Например
полимерни наночастици могат да взаимодействат със системата на ком-
племента (Peracchia, 1997), което силно зависи от повърхностните им
характеристики (Bertholon et al., 2006; Hamad et al., 2010; Coty et al., 2017).
Интересен момент е установената възможност за активиране на компле-
мента от наноструктури, модифицирани с полиетиленгликол (Arima et al.,
2008; Kozma et al., 2019). Някои наночастици могат директно да активират
NLRP3 инфламазомата, при което се секретира IL-1β (ключов провъз-
палителен цитокин) (Sun et al., 2013). Зависимият от дозата и времето на
инфузия остър респираторен дистрес синдром (ARDS), наблюдаван при
хора и плъхове по време на проучвания на доксорубицин натоварен в
полимерни наночастици, вероятно се дължи на вроден имунен отговор
(Merle et al., 2017), но не е ясно дали включва активиране на комплемента,
на макрофагите или други механизми. В по-редки случаи са докладвани
остри възпалителни реакции с тежки системни прояви (системно възпале-
ние, нарушена съдова хомеостаза, тромбози) (Nemmar et al., 2014). Може
да се очаква, че симптомите на системно остро възпаление е по-вероятно
да се проявят при относително по-високи дози наночастици, които по-
бързо достигат системното кръвообращение.
Счита се, че при използването на наночастици като ваксинални адю-
ванти умерен провъзпалителен ефект е необходим за улесняване на целе-
вия имунен отговор (Dobrovolskaia et al., 2016). Същият ефект обаче се
явява и причина за потенциални нежелани реакции, което налага необ-
ходимостта имунотоксичността на наноадювантите да се балансира така, че
да се постигне желан стимулиращ ефект и минимум нежелани реакции
(вж. Гл. 5, §5.5).
194
4.10. Репродуктивна токсичност
Наред с възможностите за преодоляване на физиологични бариери

като кръвно-мозъчната някои наночастици могат да преодолеят и други
бариери, като кръвно-тестикуларната, плацентарната и епителната, при
което да се акумулират в репродуктивните тъкани и плода (Huang et al.,
2015; Brohi et al., 2017; Wang et al., 2018; Xu et al., 2020). Акумулирането
на наночастици в репродуктивните тъкани би могло да увреди клетките на
Сертоли (Sertoli), клетките на Лайдиг (Leydig), сперматозоидите, разви-
тието на фоликулите и др. Голяма част от наличните данни от in vitro и in
vivo експерименти върху репродуктивната токсичност са за метални или
метал-съдържащи наночастици.
Преминаването на наночастици през плацентарната бариера по време
на бременност в някои случаи води до увреждания (Takeda et al., 2009;
Huang et al., 2015; Campagnolo et al., 2017). Трябва да се има предвид, че
прекомерна имунна стимулация или възпалителен процес в организма по
време на бременност се свързва с ефекти върху имунологичния профил
(Mandal et al., 2013) и психическия и/или неврологичния статус на поколе-
нието (Winter et al., 2009; Soumiya et al., 2011; Allswede et al., 2020).
РЕЗЮМЕ
Основни положения. Нанотоксикологията изучава токсичността на наноматериа-
лите, която в общия случай е различна от тази на съответните обемни материали
поради много малкия размер на наноструктурите, съответно голямото съотношение
повърхност/обем, висока реактивоспособност, възможност да проникват в различни
клетки (основно чрез ендоцитоза) и да преодоляват анатомо-физиологични бариери.
В общия случай, подобно на други субстанции, токсичността на наноматериалите
зависи от дозата, начина на въвеждане в организма, времето на въздействие, избора
на моделна система и метод за отчитане на ефектите от токсичното въздействие. Голе-
мият брой променливи величини, от които зависи токсичността на наночастиците,
прави трудно формулирането на обобщени изводи.
Методи за изследване. В нанотоксикологията намират приложение различни in vitro
и in vivo методи за изследване. In vitro тестовете се прилагат върху изолирани клетки
или тъкани, култивирани в съответни среди с определен състав, изолирани от въздей-
ствието на други клетки, органи и системи. Тези тестове позволяват да се изследват
ефектите на наноструктурите върху различни видове клетки и да се проучат резулта-
тите от въздействието им на клетъчно ниво в контролирани условия. Главен недоста-
тък се явява именно изолираността на клетките в културалната среда от цялостното
въздействие на живия организъм, поради което резултатите от такива тестове често
се поставят в рамките на много условия. In vivo тестовете се провеждат върху животни
и дават по-реална оценка на токсикологичния профил на изследваната субстанция.
195
Разпределението на наночастиците в различни клетки, органи и системи след въвеж-

дането им в живия организъм зависи от физикохимичните свойства на частиците и
взаимодействието им с биологичните макромолекули, както и от начина на въвежда-
нето им. Разпределението на наночастиците в организма е в тясна връзка с токсико-
логичния им профил.
Цитотоксични механизми. Счита се, че основният цитотоксичен механизъм на
повечето наноматериали е оксидативен стрес на клетъчно ниво и последствията от
него. Подобно на някои други токсиканти, попадането на наночастици в клетките се
свързва с повишени нива на реактивни кислородни и азотни видове, изменена генна
експресия, клетъчна сигнализация, нарушение функциите на различни мембранни
структури и други увреждания. В някои случаи е възможно получаване на токсични
разпадни продукти от разграждането на наноструктурите, водещи до съответни био-
химични ефекти, дестабилизация на мембрани и др.
Органна и системна токсичност. Малкият размер на наночастиците позволява да
бъдат ендоцитирани от различни видове клетки – макрофаги, неутрофили, епителни,
ендотелни и други. В повечето случаи кожата представлява ефективна бариера срещу
проникването на наночастици в организма. Рядко наночастици преминават и през
чревната лигавица. При инжекционно въвеждане, достигайки системното кръвообра-
щение, могат да попаднат в различни органи и системи, където чрез оксидативен
стрес или други механизми да инициират възпалителни реакции, водещи до различни
увреждания. Малките размери на наночастиците позволяват преминаването им през
различни биологични бариери – кръвно-мозъчна, кръвно-тестикуларна, плацентарна.
Ендоцитираните от ендотелните клетки наночастици в някои случаи могат да индуци-
рат възпалителни реакции и да нарушат функциите на ендотела и/или да преминат
през ендотелната стена на капилярите чрез трансцитоза. Голяма част от инжекционно
приложените наночастици се акумулират в макрофагите, което може да има различни
последствия, най-общо свързани с активиране или супресия на функциите им. Отде-
лените след въздействие с наночастици цитокини често се измерват като белег за
потенциалната им имунотоксичност. Наблюдаван нежелан ефект при инжекционно
приложение на наночастици е т.нар. CARPA синдром: комплекс от постинфузионни
реакции на свръхчувствителност, които не са IgE-медиирана алергия и се означават
като „псевдоалергия“, свързвана с активиране на комплемента. В редки случаи са
наблюдавани по-тежки реакции, например ARDS.
196
ЧАСТ II
НАНОЧАСТИЦИ ЗА БИОМЕДИЦИНАТА
197
Глава 7
ПОЛУПРОВОДНИКОВИ НАНОЧАСТИЦИ
Видове квантови точки. Оптични свойства (квантово ограничение, абсорб-

ция на светлина, флуоресценция). Методи за получаване (синтези с горещо
инжектиране, синтези във водна среда, микроемулсионен синтез, биосинте-
зи). Повърхностна модификация. Биоконюгация. Биомедицински приложе-
ния (имунофлуоресцентни анализи, FRET биосензори, проследяване на марки-
рани клетки, маркиране на наноносители, изследване на фагоцитозата, при-
ложения в поточната цитометрия, приложения в геномния анализ, приложе-
ния in vivo). Фармакологични аспекти.
1. ВИДОВЕ КВАНТОВИ ТОЧКИ
Полупроводниковите наночастици или квантови точки (Quantum Dots,

QDs) са наноразмерни монокристални частици (нанокристали) с размери
от 2 до около 10 nm, които са изградени от един или повече полупровод-
никови материали. Тук ще бъдат разгледани свойствата, методите за син-
тез, функционализиране и някои биомедицински приложения на сферо-
идните QDs, известни още като колоидни QDs (фиг. 7.1). Открити са през
1981 г. по време на разработване на материали за фотохимично разлагане
на вода (Kalyanasundaram et al., 1981) и проявяват уникални свойства,
които не са характерни за макроскопския материал, включително размер-
зависими абсорбция и флуоресценция на светлина. Физиката на полупро-
водниците обяснява размерната зависимост на тези свойства чрез т.нар.
ефект на квантово ограничение на екситона (Gaponenko, 2005; Alivisatos
et al., 1988). Съществуват и по-съвременни, квантово-химични подходи за
описание на тези свойства на квантовите точки (Inerbaev et al., 2009). С
намаляване размера на нанокристалите се увеличава забранената зона и
намалява дължината на вълната на абсорбираната и излъчената чрез флуо-
ресценция светлина. Следователно контролирането на размера на QDs
198
Глава 7. Полупроводникови наночастици
позволява контрол върху оптичните им свойства и е особено важно за ус-

пешното им приложение.
Квантови точки могат да бъдат получени от различни типове полупро-
водникови материали. Най-голяма популярност и приложение обаче са
придобили QDs от полупроводникови материали тип AIIBVI и AIIIBV:
· AIIBVI: CdSe, CdS, CdTe, ZnS, ZnSe.
· AIIIBV: GaN, GaAs, GaP, InAs, InP.
Голяма част от класическите QDs, намерили приложение като флуо-
ресцентни биомаркери са Cd-съдържащи. Токсичността на кадмиевите
съединения обаче е сериозна бариера пред по-широкото приложение на
тези наноматериали при изследването на живи клетки и при in vivo при-
ложения. При по-нетоксичните Zn-съдържащи QDs флуоресценцията
обаче е предимно в ултравиолетовата област (Pradhan et al., 2004). С цел
да се получат сравнително нетоксични QDs за по-широко приложение в
биологичните изследвания, са разработени квантови точки от типа ядро/
обвивка, като обвивката е от по-широкозонен и по-нетоксичен полупро-
водник (в сравнение с ядрото), например CdSe/ZnS (Dabbousi et al., 1997),
както и Cd-несъдържащи QDs със задоволителни оптични свойства, като
например от GaInP2 (Micic et al., 1995) и CuInSe2 (McHugh et al., 2019).
(а) (б)
Фиг. 7.1. (а) CdSe QDs синтезирани от кадмиев стеарат и трибутилфосфинселенид при 250 °C в
течен парафин и триоктилфосфиноксид (ТОРО); маркерът на снимката представлява 50 nm.
(б) Схематично представяне на QD-нанокристал от CdSe обвит с ТОРО
Полупроводниковите наночастици от типа ядро@обвивка (core-shell)

могат да бъдат изградени от два или повече полупроводника. Ядрото на
такива QDs обикновено е от по-теснозонен полупроводник (с по-малка
големина на забранената зона), като например CdSe или CdTe, и обвивка
от по-широкозонен полупроводник, като ZnS или CdS (Dabbousi et al.,
1997) с цел запазване на квантовото ограничение на екситона в ядрото на
199
наночастицата. Важно условие при получаването на такива QDs е близка-

та кристална структура на материалите, изграждащи ядрото и обвивката,
което осигурява стабилност и по-бездефектно изграждане на обвивката.
Наночастиците от типа ядро@обвивка се характеризират с по-стабилна
флуоресценция при облъчване с ултравиолетова светлина (устойчивост
към фотоокислителни процеси). Именно такъв тип QDs намират практи-
ческо приложение като флуоресцентни биомаркери в имунофлуоресцент-
ната диагностика и различни научни изследвания.
Колоидните квантови точки винаги притежават обвивка от органични
вещества, които обикновено са компоненти на средата, в която са получе-
ни нанокристалите (фиг. 7.2).
(а) (б)
Фиг. 7.2. (а) Схематично представяне на QD от типа ядро@обвивка CdSe@ZnS, обвит с
органична обвивка от триоктилфосфиноксид (ТОРО). (б) Схематично представяне на QD-
нанокристал от CdTe, обвит с органична обвивка от тиогликолова киселина
Когато QDs са получени в среда от неполярни органични разтворите-

ли, органичната обвивка е хидрофобна, състояща се от някои компоненти
на средата, като висши мастни киселини, амини, триалкилфосфиноксиди
и др. При синтезите на QDs във водни среди, органичната обвивка е от
хидрофилни вещества, като меркаптокарбоксилни киселини и полимери.
2.1. Квантово ограничение

Според зонната теория на твърдото тяло при възбуждане на електрон
в обемните полупроводници електронът преминава от валентната зона в
зоната на проводимост, при което във валентната зона остава положите-
лен заряд („липса на електрон“), наричан „дупка“. Възбуденият електрон,
200
който е в зоната на проводимост, взаимодейства с дупката от валентната

зона чрез електростатично привличане, при което се формира екситон
(свързана двойка електрон-дупка). В квантовата механика електроните и
дупките се описват от вълнови функции и съответни разпределителни
функции. Екситонът може да се придвижва през кристалната решетка,
при което разстоянието между електрона и дупката съответства на т.нар.
радиус на Бор (Bohr) (Poole and Owens, 2003). Такъв тип двойка електрон-
дупка е наречен екситон на Mott–Wannier. Друг тип екситон, наречен екси-
тон на Frenkel, е подобен на възбуденото състояние в атом или молекула, харак-
теризиращо се със сравнително дълго време на живот. Такъв екситон е
също мобилен и може да се придвижва през кристалната решетка чрез
трансфер на енергия между съседни атоми и молекули. Почти всички ек-
ситони, наблюдавани в неорганичните полупроводници и съответните
наноразмерни структури, са екситони на Mott–Wannier.
В екситона електронът и дупката се характеризират с ефективни маси,
които са по-малки от масата на свободния електрон. Радиусът на екситона
е съизмерим с размерите на типичните QDs (няколко нанометра). При по-
малки по размери QD-нанокристали се увеличава силата на взаимодей-
ствието между електрона и дупката. Това води до т.нар. синьо отместване
(отместване към по-високи енергии) на абсорбцията на светлина с намаля-
ването размера на QDs. Друго следствие от квантовото ограничение е поя-
вата при стайна температура на екситонов пик в абсорбционния спектър,
който обкновено се наблюдава при обемните полупроводници при ниски
температури.
2.2. Абсорбция на светлина
Най-съществената разлика на QDs в сравнение със съответните обем-

ни материали е в оптичните им свойства. Създадени са някои прости мо-
дели за описание на енергетичните нива в QDs, при които непрекъснатите
електронни зони, характерни за обемните полупроводници, при QDs се
превръщат в серии от дискретни молекулни орбитали. Типични абсорб-
ционни и флуоресцентни спектри на QDs от CdSe са показани на фиг. 7.3.
Абсорбционните спектри на QDs при стайна температура не са дис-
кретни, а се състоят от абсорбционни ивици, чиято ширина се явява след-
ствие от термично (хомогенно) и нехомогенно уширяване. Нехомогенно-
то уширяване на абсорбционните ивици е следствие от полидисперсност-
та на QDs (пробите съдържат различни по размери QDs) (Alivisatos et al.,
1988). На всеки радиус съответства определена честота на абсорбираната
светлина. Съвременните методи за синтез на колоидни QDs позволяват
201
получаването на относително монодисперсни по размер частици с въз-

можност за контрол върху средния размер и съответно върху оптичните
свойства (фиг. 7.4).
0.7 80
0.6 70
60
0.5
флуоресценция
абсорбция
50
0.4
40
0.3
30
0.2
20
0.1 10
0 0
460 560 660 760
Фиг. 7.3. Типичен абсорбционен и флуоресцентен спектри на QDs от CdSe със среден диа-
метър 4,5 nm. QDs са синтезирани в течен парафин при 250 °C
Екситоновата абсорбционна ивица е най-нискоенергетичната в спек-

търа и съответства на HOMO-LUMO прехода при молекулните спектри.
В абсорбционния спектър се забелязват и други ивици, съответстващи на
по-високоенергетични преходи. Дължината на вълната на екситоновия
абсорбционен максимум зависи от размера на QDs. Средният радиус на
QDs (R) може да бъде теоретично изчислен от енергията на абсорбцион-
ния максимум (E) съгласно уравнение (7.1) (Yoffe, 1993).
h2  1 1  1.79e 2
E ( R)  E g      0,248 E Ry (7.1)
8R 2  me mh   R
Параметрите в това уравнение са: R – радиус на QD-нанокристала (m);

Eg – големина на забранената зона на обемния материал (J); me – ефектив-
на маса на електрона (kg); mh – ефективна маса на дупката (kg); m0 =
9,10.10-31 kg е масата на свободния електрон; h е константата на Planck
(6,6.10-34 Js);  – диелектричната константа на полупроводника; e –
зарядът на електрона (1,602.10-19 C); ERy – енергията на Rydberg. Това
уравнение не дава точни стойности на енергията, особено за много малки
202
QDs, като изчислената стойност е по-голяма от експериментално опреде-

лената. По-добро описание на експерименталните данни се получава от
модела на отслабеното квантово ограничение, в който е въведен параме-
тър, съответстващ на разстоянието, на което екситонът прониква в обвив-
ката на наночастицата (Dushkin et al., 2005).
0.3
2.4 nm
2.7 nm
абсорбция, a.u.
0.2 3.3 nm
3.8 nm
4.6 nm
0.1
0
360 460 560 660 760 860
Фиг. 7.4. Абсорбционни спектри на CdSe QDs с различни размери
За практически цели средният размер на QDs може да бъде изчислен

от дължината на вълната на абсорбционния максимум, използвайки ем-
пирични полиномни зависимости, изведени експериментално (Yu et al.,
2003). При извеждането им размерите на различни QDs са измерени чрез
високоразделителен електронен микроскоп (HR-TEM) и е направена ко-
релация със съответните им абсорбционни спектри. На фиг. 7.5 са пред-
ставени графично тези зависимости за случаите на QDs от CdS, CdSe и
CdTe. Същите автори предлагат и емпирични уравнения за изчисление на
екстинкционния коефициент и молната концентрация на наночастици
(брой частици, изразен в молове, на един литър дисперсия) от CdX (X =
S, Se, Te). Eкстинкционният коефициент зависи силно от размера на QDs
(Yu et al., 2003).
При QDs от типа ядро@обвивка ширината на забранената зона, респек-
тивно дължините на вълните на абсорбциония и флуоресцентния макси-
муми, зависят както от размерите на ядрото, така и от дебелината на об-
вивката. При увеличаване дебелината на обвивката тези максимуми се
изместват към по-дълги вълни (вж. §3.1; фиг. 7.10).
203
800
700
600
500
400 CdTe
CdSe
300
CdS
200
0 2 4 6 8 10
диаметър, nm
Фиг. 7.5. Зависимост на дължината на вълната на абсорбционния максимум от диаметъра

на QDs от CdTe, CdSe и CdS. Графиките са получени на базата на емпиричните уравнения
на Yu et al. (2003)
2.3. Флуоресценция
Флуоресценцията на QDs, също както абсорбцията на светлина, за-
виси от големината на забранената зона, съответно от размера им (фиг.
7.6). След възбуждането на електрон (при поглъщане на светлина) част от
енергията му се превръща в топлина и при релаксацията му до основно
състояние се излъчва светлина с по-голяма дължина на вълната (по-малка
енергия) от тази на погълнатата светлина, т.нар. нормална (band-edge)
флуоресценция (фиг. 7.3). Стоксовото отместване (Stokes shift; разликата
в дъжините на вълните на максимумите на флуоресцентната и абсорб-
ционната ивици) при нормалната флуоресценция е около 20–30 nm. За
QDs е характерен широк абсорбционен спектър, но същевременно тясна
и симетрична флуоресцентна ивица (с полуширина около 25–35 nm). В
зависимост от размера на частиците и природата на материала, изграждащ
QDs, абсорбция и флуоресценция могат да се наблюдават в широк диапа-
зон, от ултравиолетовата (UV) до близката инфрачервена (NIR) област.
При QDs може да се наблюдава и флуоресценция, която е резултат от
излъчвателна релаксация на електрон от енергетични нива, съответства-
щи на повърхностни дефекти в QD-нанокристала. Дефектите в QDs обик-
новено водят до поява на енергетични нива в забранената зона, на които
могат да попаднат възбудени електрони. Излъчвателната релаксация на
204
електрони, намиращи се на такива нива, макар и реализираща се с ниска

вероятност, се означава като емисия от дефекти (trap-state emission). Вре-
мето на живот на възбудения електрон в такова енергетично състояние е
значително по-дълго (с около три порядъка), отколкото на електрон в ек-
ситона (Wand and Herron, 1991).
(а)
(б)
Фиг. 7.6. (а) Флуоресцентни спектри на CdSe QDs с различни размери (с увеличаване раз-
мера на частиците, флуоресцентният пик се измества към по-дълги вълни); (б) Фотография
на дисперсии на CdSe QDs с различни размери (колбите от ляво надясно съдържат нано-
частици с увеличаващ се размер), флуоресциращи при облъчване с UV светлина (365 nm)
Уникалните оптични свойства на QDs в някои случаи ги правят пред-

почитани флуорофори в сравнение с органичните флуоресцентни багри-
ла, флуоресцентните протеини и лантанидните комплекси. Тези свойства
включват ширината на спектъра на възбуждане, ширината на спектъра на
емисия, стабилността на флуоресценцията и времето за релаксация на
възбуденото състояние. Органичните флуоресцентни багрила обикновено
205
притежават тесен спектър на възбуждане, което изисква възбуждане със свет-

лина с точно определена дължина на вълната, която е различна за различ-
ните багрила. QDs притежават широк спектър на възбуждане, позволяващ
възбуждане със светлина в широк интервал от дължини на вълните – вж.
за сравнение спектрите на Родамин 6G и CdSe QDs на фиг. 7.7. Това
свойство може да се използва за едновременно възбуждане на флуорес-
ценция от различни по големина (съответно с различен цвят на излъчвана-
та светлина) QDs, използвайки една дължина на вълната на възбуждащата
светлина. Флуоресцентните спектри на QDs могат да се контролират чрез
размера на QDs и техния състав, както и чрез състава и свойствата на об-
вивката на QDs (в случая на нанокристали от типа ядро@обвивка). Ши-
роките спектри на възбуждане и тесните спектри на емисия са важна пред-
поставка за приложение на QDs за многоцветно флуоресцентно маркира-
не на гени, протеини и други биологични молекули (Han et al., 2001).
Стабилността на флуоресценцията във времето (устойчивостта към
фотоокисление и други фотохимични процеси, водещи до намаляване и
изчезване на флуоресценцията) е важно условие в повечето случаи на при-
ложение на флуоресцентни материали. В това отношение QDs притежават
значително предимство. Повечето органични флуоресцентни багрила гу-
бят флуоресценцията си след няколкоминутно облъчване с възбуждаща
UV светлина, докато при същите условия QDs не променят интензитета
на флуоресценция в продължение на часове (Dubertret et al., 2002). Напри-
мер CdSe@ZnS QDs, модифицирани с дихидролипоева киселина (DHLA),
не променят интензитета на флуоресценцията си дори след 14 часа облъч-
ване и са почти 100 пъти по-стабилни и 20 пъти по-ярки от Rhodamine 6G
(Chan and Nie, 1998). Тези особености на QDs могат да се използват за
дълготрайно флуоресцентно маркиране и други приложения, при които
фоточувствителността на класическите флуорофори представлява огра-
ничение.
Относителният флуоресцентен квантов добив (QY) на QDs е величина,
която се определя спрямо флуорофор, който се приема за стандарт (напри-
мер Rhodamine 6G) при определена концентрация, разтворител и темпе-
ратура, чрез използване на данни от флуоресцентните и абсорбционните
спектри (уравнение 7.2) (Donega et al., 2003).
 1  TST   X 
QY    QYST (7.2)
 1  TX   ST 
206
1.5
Rhodamine 6G
1.2
абсорбция (au)
0.9
QDs
0.6
0.3
0.0
90
80
флуоресценция (au)
70
60 Rhodamine 6G
50
40 QDs
30
20
10
0
400 500 600 700
Фиг. 7.7. Абсорбционни и флуоресцентни спектри на Rhodamine 6G и CdSe QDs (синтези-

рани в течен парафин при 250 °C; среден диаметър 3,0 nm). Абсорбционният спектър на
QDs е широк, което позволява възбуждане на флуоресценция чрез облъчване с всякаква
светлина, чиято дължина на вълната е по-малка от 530 nm. Флуоресцентният спектър на
QDs е почти симетричен и по-тесен от този на Rhodamine 6G
В това уравнение, TST и TX са съответно оптичните пропускливости

(трансмисията) на разтворите на стандарта и изследваната проба при една
и съща дължина на вълната, а QYST е квантовият добив на стандарта при
същите условия. X и ST съответстват на общата излъчена светлина от
пробата и стандарта, съответно. Те се определят от площта на съответните
флуоресцентни спектри.
Скоростта на флуоресцентното излъчване при QDs е по-ниска в срав-
нение с тази при органичните флуорофори. Бързата флуоресценция при
органичните флуорофори (~5 ns) е подобна на фоновата флуоресценция
на естествени компоненти на наблюдаваните биологични обекти. QDs
207
обаче излъчват флуоресцентната светлина по-бавно (30–100 ns) при същи-

те условия. Това може да се използва за различаване на флуоресценцията
от маркираните с QDs биологични обекти от бързата фонова флуорес-
ценция чрез подходяща (time-resolved) техника (Grecco et al., 2004; Pinaud et
al., 2006).
Най-често флуоресцентният квантов добив е нисък в резултат на по-
върхностни дефекти в нанокристалите, на които съответстват енергетич-
ни нива в забранената зона (trap states), служещи като „капани“ (traps) за
залавяне на фотогенерираните заряди. Възбудени електрони, които попа-
дат на такива нива, могат да релаксират до основно състояние безизлъч-
вателно или излъчвайки светлина (т.нар. „trap-state“ флуоресценция) с по-
голяма дължина на вълната от тази на „band-gap“ флуоресценцията. В
множеството от случаите тези повърхностни дефекти са нежелани и се
търсят начини за тяхното недопускане, отстраняване или пасивиране.
Част от начините за решаване на проблема включват пасивиране със сил-
но координиращи лиганди, отстраняване чрез фотохимично ецване –
разграждане на дефектния повърхностен слой или изграждане на обвивка
от втори полупроводник (Jing et al., 2016).
3. МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ
3.1. Синтези с „горещо инжектиране“
Синтезите на QDs при високи температури в подходящи органични

разтворители са известни като методи с „горещо инжектиране“ („hot-
injection“). При първите варианти на тези синтези са използвани органо-
метални прекурсори (диметилкадмий, диетилцинк и др.) и координиращи раз-
творители, като триоктилфосфиноксид (TOPO) и алифатни амини (доде-
циламин, хексадециламин и др.) (Murray et al., 1993). Координиращите
разтворители могат да образуват координационни връзки с металните
атоми (йони) от повърхността на нанокристалите, като по този начин ги
стабилизират и оказват влияние върху растежа им. Органометалните пре-
курсори при синтезите на Cd-съдържащите QDs са заместени от по-неток-
сични и лесни за употреба прекурсори, като Cd(II)-соли на висши мастни
и фосфонови киселини (Peng and Peng, 2001; Yu and Peng, 2002). Употре-
бяват се некоординиращи разтворители, като 1-октадецен и течен пара-
фин. Особено евтин и практичен метод е синтезът на Cd-съдържащи QDs в
течен парафин (Yordanov et al., 2005), който е използван за системни изслед-
вания на QD-нанокристалния растеж и изучаване на ефектите на различни
208
фактори върху този процес (Yordanov et al., 2008). В тези случаи като хал-
когенидни (S, Se, Te) прекурсори се ползват триалкилфосфинови халко-
гениди. Синтезите се провеждат в инертна атмосфера за предотвратяване
окислението на органичните разтворители и прекурсорите при високите
температури (200–320 °C). Сред продуктите на реакцията между триал-
килфосфин халкогенидите и металните карбоксилати са установени съот-
ветните триалкилфосфиноксиди и киселинни анхидриди (Liu et al., 2007)
(фиг. 7.8).
Методите с „горещо инжектиране“ позволяват контролиране размера
на получаващите се QDs чрез различни параметри, като температурата,
молното съотношение на прекурсорите и съставът на реакционната среда.
QDs с различни размери могат да бъдат получени чрез вземане на проби
от реакционната среда и бързото им охлаждане до ниска температура по
време на нанокристалния растеж или чрез бързо охлаждане на цялата
реакционна смес при достигане на желания размер на QDs. Схемата за
провеждане синтеза на CdSe QDs в течен парафин е показана на фиг. 7.9.
Синтезът обикновено се провежда в тригърла реакционна колба с обратен
хладник, магнитна бъркалка и термоконтролер при 200–250 °C и под арго-
нова атмосфера.
Фиг. 7.8. Взаимодействие на триалкилфосфин халкогениди с метални соли на мастни и

фосфонови киселини, при което се получават нанокристали от метални халкогениди (МХ),
съответните фосфиноксиди и анхидриди
Изследването на QD-нанокристалния растеж се осъществява рутинно

чрез проследяване на измененията в абсорбционните спектри на QDs,
като в повечето случаи на синтез по методите с „горещо инжектиране“ са
установени четири етапа на процеса според изменението на концентра-
цията на нанокристалите: (i) зародишообразуване и нарастване на общия
брой на нанокристалите в реакционната смес; (ii) намаляване броя на на-
нокристалите в резултат на процеси на ранно зреене (Bullen and Mulvaney,
209
2004); (iii) установяване на постоянна концентрация на нанокристалите;

(iv) понижаване концентрацията на нанокристали вследствие на оствалдо-
во (Ostwald) зреене (обмен на материал в посока от по-малките към по-
големите нанокристали).
CdSe QDs могат да бъдат обвити с обвивка от втори полупроводник,
като ZnS или CdS. QDs от типа ядро@обвивка притежават по-висок флуо-
ресцентен квантов добив и са с по-стабилна флуоресценция в сравнение с
QDs без обвивка от по-широкозонен полупроводник (нанокристали от тип
„ядро“). Например обвиването на QDs от CdSe с обвивка от CdS повишава
флуоресцентния квантов добив от 25 на 65%. При това нанокристалите от
типа ядро@обвивка абсорбират и флуоресцират светлина с по-ниска енер-
гия в сравнение с изходните „ядра“. Този процес може да се извърши чрез
плавно повишаване на температурата на реакционна смес, съдържаща
ядрата и прекурсорите за изграждане на обвивката (Yordanov et al., 2008a)
– фиг. 7.10. Плавното повишаване на температурата осигурява контроли-
рано изграждане на обвивката чрез достигане на пресищането, необходи-
мо за отлагане на CdS върху частиците от CdSe без да се образуват нови
отделни частици от CdS.
(а) (б)
Фиг. 7.9. (а) Схема за синтез на QDs от CdSe в течен парафин по метода с „горещо
инжектиране“ и (б) съответната апаратура за синтез
210
Фиг. 7.10. Схема за синтез на QDs от типа ядро@обвивка CdSe@CdS в течен парафин чрез
плавно повишаване на температурата. При изграждането на обвивката се наблюдава от-
местване на абсорбционния спектър към по-ниски енергии
Синтези при високи температури в органични разтворители се ползват

и за получаване на QDs, които не съдържат кадмий, например QDs от
Ag2S (Xu et al., 2016) и CuInSe2 (McHugh et al., 2019). Наночастици от Ag2S
могат да се получат при пиролизата на един прекурсор – сребърен диетил-
дитиокарбамат при температури около 200 °C в система от смесени раз-
творители – олеинова киселина, октадецен и октадециламин (Du et al.,
2010). За по-лесно контролиране размера на частиците е предложен метод
с получаване на зародиши и контролиран растеж до получаване на QDs с
желан размер. При този метод сребърен ацетат се разтваря в смес от ми-
ристинова киселина, октиламин и октадецен, след което при дадена тем-
пература се инжектира прекурсорът за сяра – бис(триметилсилил)сулфид
(хексаметилдисилатиан) (Jiang et al., 2012). Така се получават малки QDs,
които могат да бъдат подложени на допълнително израстване във втори
етап, при който в толуенова дисперсия на малки частици се добавят раз-
твори на сребърен олеат и сяра. Подобна методика е използвана и за полу-
чаване на NIR флуоресцентни QDs от Ag2Se (Zhu et al., 2013). Лиганди,
слабо взаимодействащи с Ag(I), не са подходящи за получаване на QDs,
докато лиганди като 1-октантиол водят до висока термична стабилност на
Ag(I)-тиоловия комплекс и предотвратяване редукцията на Ag(I) до Ag(0)
211
при високата температура. При инжектиране на триоктилфосфинселенид

(TOPSe), образуването на по-здравата връзка Ag-Se води до получаване
на Ag2Se. Известни са и солвотермални методи за получаване на Ag2Se
QDs (Dong et al., 2013).
Чрез „горещо инжектиране“ в органични разтворители се получават и
QDs от CuInS2 и CuInSe2. Наночастиците от CuInSe2 се получават в смес
от меден(I) йодид и индиев(III)ацетат в октадецен и присъствие на доде-
кантиол (като координиращ лиганд), към която се инжектира при 175 °C
селенов прекурсор (разтвор на селен в олеиламин и додекантиол) и рас-
тежът на частиците се провежда при 200 °C (McHugh et al., 2019). По подо-
бен начин се получават и наночастици от CuInS2, при което се изхожда от
разтвор на InCl3 и CuCl в октадецен в присъствие на триоктилфосфин
(TOP) и олеиламин, а като прекурсор за сяра се инжектира при 190 °C цин-
ков бис(N-хексилдитиокарбамат) (Pons et al., 2010).
QDs от AIIIBV полупроводници, като InP, GaР, и GaInP2, също се полу-
чават чрез „горещо инжектиране“ в смеси от триоктилфосфиноксид
(ТОРО) и триоктилфосфин (ТОР), но синтезите са относително сложни,
провеждат се при температури от 270–320 °C, използвайки InCl3, GaCl3 и
трис(триметилсилил)фосфин P(SiMe3)3 като прекурсор за фосфор (Micic
et al., 1995).
3.2. Синтези във водна среда
Синтезите на QDs във водна среда се провеждат като наноутаечни

(преципитационни) реакции, използвайки водни разтвори на йоногенни
вещества (соли) в присъствие на стабилизиращи агенти с цел контро-
лиране на процеса, ограничаване растежа на частиците до наноразмери и
осигуряване на колоидната стабилност. Принципно всяка една химична
реакция, водеща до получаване на малко разтворим продукт, може да се
използва за получаване на наночастици от този продукт след избор на
подходящ стабилизиращ агент и условия на провеждане – съотношения
на реагентите, концентрации, температура. QDs са изградени от хидро-
фобни материали и синтезите им във водни среди следва да се провеждат
в присъствието на хидрофилни стабилизиращи агенти, които образуват
координативни връзки с металните йони от повърхността на частиците,
поради което тези стабилизиращи агенти се означават като координиращи
лиганди. Като такива лиганди най-често и с най-голям успех се използват
меркаптокарбоксилни киселини, които представляват бифункционални
съединения, съдържащи тиолова (SH) група и карбоксилна (СООН) група
(тиогликолова, меркаптопропионова, дихидролипоева и други киселини),
212
а също и глутатион (съдържащ SH-група, карбоксилни и амино групи).

Голямо е разнообразието на водоразтворимите лиганди с потенциал за
контролиране растежа и стабилизиране на ODs във водни среди, в това
число различни биологични макромолекули, като протеини и нуклеинови
киселини (Jing et al., 2016). Примери за често използвани нискомолекулни
водоразтворими тиол-съдържащи стабилизиращи агенти са илюстрирани
на фиг. 7.11.
Фиг. 7.11. Структурни формули на някои хидрофилни лиганди, използавни за получаване

на вододиспергируеми QDs
Чрез тиоловите групи молекулите на тези координиращи лиганди се

свързват с метални атоми/йони от повърхността на QDs. Така модифи-
цираните нанокристали са диспергируеми във водни среди и могат да
бъдат свързани чрез карбоксилната група от лиганда с различни биоло-
гични макромолекули (чрез карбодиимидна реакция). Макромолекулните
стабилизиращи агенти, като нуклеинови киселини и протеини, също
могат да участват в постсинтетични реакции за допълнителна функциона-
лизация. Това е значимо предимство на синтезите във водна среда, тъй
като така получените частици директно се използват за конюгиране с био-
молекули. При наночастици, които са синтезирани във висококипящи
органични разтворители, модифицирането с меркаптокарбоксилни кисе-
лини се осъществява след изолиране на частиците, пречистване и послед-
ващ лиганден обмен (Chan and Nie, 1998).
За успешен синтез е необходимо балансиране на силата на свързване на
лиганда с металния катион. Твърде силно свързване с металните йони ще
възпрепятства реакцията им със съответните противойони за получаване на
полупроводниковия материал, докато твърде слабо свързване ще доведе до
213
ниска колоидна стабилност на частиците и неконтролируем растеж. Подхо-

дящото по сила свързване следва до осигури контролирано получаване на
малко разтворимите във вода полупроводникови кристали с наноразмери.
На фиг. 7.12 е илюстриран процесът на получаване на тиогликолат-
модифицирани наночастици от CdTe във водна среда. Прекурсорът за
телур е воден разтвор на NaHTe, който е особено чувствителен към кисло-
род от въздуха и приготвянето му се осъществява в аргонова атмосфера.
Поради същата причина синтезът се провежда под аргон. Кадмиевият пре-
курсор представлява алкален воден разтвор на тиогликолатен комплекс
на водоразтворима кадмиева сол (например Cd(ClO4)2). След смесването
на прекурсорите, реакционната смес се нагрява при 90 °C за няколко часа
до получаване на QDs (Yordanov et al., 2010).
(а) (б)
Фиг. 7.12. (а) Схема за синтез на вододиспергируеми QDs от CdTe, модифицирани с тио-
гликолова киселина (TGA) и (б) съответната апаратура за синтез
Във водна среда могат са се осъществят и синтези на QDs от тип

ядро@обвивка чрез последователно отлагане на слоеве от втори полупро-
водник, като са спазват условия за избягване на хомогенно зародишо-
образуване (образуване на отделни наночастици от материала, от който
трябва да се изгради обвивката) (Zhang Y. et al., 2009). Известни са и други
подходи за получаване на QDs от тип ядро@обвивка във водна среда,
основани на разпадане на тиоловия лиганд (например отделяне на S2- при
разпадане на тиолите за изграждане на обвивка от CdS върху CdTe QDs),
обмяна на катиони от повърхността на нанокристалите (при получаване
214
на QDs с общ анион в ядрото и обвивката) (Jing et al., 2016), използване

на бифункционални линкери, свързващи от една страна Cd(II) от повърх-
ността на ядрото от CdSe и от друга – Zn(II) от изграждащата се обвивка
от ZnS (Singh et al., 2010a).
Разработени са и синтези на вододиспергируеми квантови точки от
сребърни халкогениди. Вододиспергируеми Ag2S QDs обвити с 3-мер-
каптопропанова киселина могат да бъдат получени чрез синтез в етилен-
гликол, а размерът им може да се контролира чрез реакционното време
(Jiang et al., 2012а). Получени са и Ag2S QDs с използване на говежди
серумен албумин в качеството на стабилизатор (Wang and Yan, 2013).
Като стабилизатори при синтези във водна среда на Ag2Se QDs е използ-
ван и полидентатният полимер поли(акрилова киселина)-графт-меркап-
тоетиламин (PAA-g-MEA) (Tan et al., 2014). Разработен е и метод, основан
на подмяна на катиони във водна среда за получаване на Ag2Te QDs с
контролирани оптични свойства (Chen et al., 2013). Методът е основан на
синтез на CdTe QDs, които след това реагират със сребърни Ag+ йони и се
трансформират в Ag2Te QDs, като е възможно и последващо изграждане
на обвивка от ZnS чрез реакция между цинков ацетат и тиокарбамид.
3.3. Микроемулсионен синтез
Използването на микроемулсиите като матрица за синтез на нано-

частици се основава на това, че микроемулсионните капчици с размери
<50 nm могат да служат като своеобразни нанореактори, в чието ограни-
чено пространство могат да протичат преципитационни и кондензацион-
ни реакции (Kanwar et al., 2019). Получаването на QDs чрез микроемул-
сионен синтез се осъществява по следния начин. Изхожда се от мицеларен
разтвор на подходящ сърфактант в неполярен органичен разтворител.
Този разтвор съдържа обърнати мицели, които в случая представляват
глобуларни агрегати от сърфактантни молекули, ориентирани с хидро-
фобните си краища към дисперсната среда (органичния разтворител), а с
хидрофилните – към ядрото на мицела (фиг. 7.13).
При класическия вариант на микроемулсионен синтез на QDs като
сърфактант се използва натриев бис(2-етилхексил) сулфосукцинат (AOT),
разтворен в хептан (Lianos and Thomas, 1987). При солюбилизирането на
вода или водни разтвори в този мицеларен разтвор се получава микро-
емулсия от тип вода в масло (w/o) (фиг. 7.14).
При първия етап от получаването на QDs чрез микроемулсионен
синтез се приготват две w/o микроемулсии, съдържащи водни разтвори
на подходящи соли. Например за получаването на нанокристали от CdS
215
се използват прекурсорни микроемулсии, които в микроемулсионните

капки съдържат разтвори на Cd(NO3)2 и Na2S. При втория етап двете
прекурсорни микроемулсии се смесват, при което протичат процеси на
обмен на йони между микроемулсионните капки и образуване на QDs
(фиг. 7.15). Размерът на получените нанокристали се определя от коли-
чеството прекурсорни соли в микроемулсионните капки.
(а) (б)
Фиг. 7.13. (а) Химична структура на молекулата на AOT. (б) Схематична илюстрация на
обърнат мицел от амфифилни молекули в неполярен органичен разтворител (молекулите
на сърфактанта са представени схематично с хидрофилен и хидрофобен край)
воден разтвор, мицеларен разтвор воден разтвор,

съдържащ М2+ на АОТ в хептан съдържащ Х2-
микроемулсия, микроемулсия,
съдържаща М2+ съдържаща Х2-
Нанокристали
от МХ
Фиг. 7.14. Синтез на нанокристали от MX (CdS, ZnS) по микроемулсионния метод
Някои разновидности на метода позволяват получаване на квантови

точки от типа ядро@обвивка (Saran and Bellare, 2010), както и получаване
на QDs обвити със силициев диоксид (Darbandi et al., 2005).
Микроемулсионният метод има ограничено приложение поради ред
недостатъци – трудно изолиране и пречистване на нанокристалите от
216
реакционната смес, малки добиви при същевременно използване на голе-

ми количества органичен разтворител и сърфактант, широко разпределе-
ние по размери на получените нанокристали и нисък флуоресцентен кван-
тов добив.
Фиг. 7.15. Схематична илюстрация на микроемулсионна капка с водно ядро, в която се

осъществява образуването на QD-нанокристал
Разнообразни биологични продукти и организми са използвани за био-

синтези на квантови точки, включително бактерии, дрожди и растителни
екстракти (Jacob et al., 2016; Alvand et al., 2019). Биосинтезите на квантови
точки са известни от 1989 г., когато са получени CdS QDs в дрождите
Candida glabrata и Schizosaccharomyces pombe по време на култивирането
им в присъствие на кадмиеви соли (Dameron et al., 1989a). Установено е,
че зародишообразуването на QDs в клетките сe определя от някои къси
хелатиращи пептиди, съдържащи глутамин и цистеин. Този механизъм се
потвърждава от наблюдението, че дрождите изложени на въздействие на
кадмиеви соли, синтезират хелатиращи пептиди (Dameron et al., 1989a,b).
При образуването на комплекс между тези пептиди и кадмиевите йони
следва повишаване на вътреклетъчните нива на сулфидни йони и образу-
ване на CdS нанокристали във вакуолите. За синтез на QDs освен дрожди
могат да се използват и бактерии (Hosseini and Sarvi, 2015). Бактериите
могат да синтезират сулфидни наночастици директно от метални и сул-
фидни йони или от сулфати, които биват редуцирани до сулфиди от бакте-
риални ензими (редуктази). Наночастиците могат да се получават вътре-
клетъчно, когато реагентите имат възможност да проникват в клетките,
или извън клетките, например когато клетките синтезират ензими или
други вещества в околната среда, които подпомагат формирането на нано-
217
частици. От технологична гледна точка екстрацелуларното (извън клет-

ките) образуване на наночастици е по-целесъобразно, тъй като се спестя-
ват технологични операции по разрушаване и извличане на наночастици-
те от клетките, които са сред проблемите (наред с трудното контролиране
на морфологията и разпределението по размери) при тези методи за полу-
чаване на QDs. За получаване на QDs са използвани и растителни екс-
тракти (Alvand et al., 2019). Също така трябва да се отбележи, че синтезът
на флуоресцентни QDs в бактерии е използван успешно за флуоресцент-
ното маркиране на бактериите и проследяването на фагоцитозата им от
макрофаги (Lin et al., 2020).
4. ПОВЪРХНОСТНА МОДИФИКАЦИЯ
Приложението на QDs за научни и диагностични цели и конкретно
като флуоресцентни биомаркери изисква QDs с хидрофилна обвивка,
които да са диспергируеми във водни среди. Квантовите точки, които са
получени в органични разтворители, са покрити с хидрофобни съедине-
ния, което ги прави недиспергируеми във водна среда. В тези случаи
хидрофобните съединения от повърхността на QDs се заместват с хидро-
филни чрез лиганден обмен (със или без последваща силанизация) или
нанокристалите се вграждат в мицели и така се солюбилизират във водна
среда. По-директен подход са синтезите във водни среди, при които QDs
се получават директно в присъствието на веществата, носещи целевите
функционални групи. Синтезите във водна среда предлагат възможност
за получаване на QDs обвити с биологични макромолекули (протеини и
нуклеинови киселини).
Квантовите точки, получени по методите с горещо инжектиране, са
обвити с хидрофобни лиганди, като триоктилфосфиноксид (TOPO), три-
октилфосфин (TOP), тетрадецилфосфонова киселина (TDPA) или с оста-
тъци от различни дълговерижни мастни киселини (лаурилова, стеаринова,
олеинова, и др.). Тези хидрофобни лиганди могат да бъдат заменени с
водоразтворими бифункционални молекули, при които единият край е
свързан с повърхността на QD-нанокристала, а другият е хидрофилен и
може да бъде конюгиран с биологични молекули (фиг. 7.16).
Такива бифункционални молекули са различни меркаптокарбоксилни
киселини (HS-(CH2)n-COOH, n=1–15) (Chan et al., 2002), 2-аминоетан-
тиол, дитиотреитол, дихидролипоева киселина и др. Тиогликоловата ки-
селина (TGA) е била използвана при получаването на първите QDs за
биомаркери (Chan and Nie, 1998). След това дихидролипоевата киселина
218
(DHLA) е използвана по-често, поради това че е по-малко токсична и

придава по-голяма стабилност на QDs във водни дисперсии (Mattoussi et
al., 2000).
Фиг. 7.16. Схема на лиганден обмен на повърхността на QDs, при което хидрофилни тиол-
съдържащи лиганди заместват триоктилфосфиноксид (ТОРО)
В повечето случаи лигандният обмен води до значително намаляване

на флуоресцентния квантов добив. За минимизиране на този ефект обик-
новено на хидрофилизация чрез лиганден обмен се подлагат QDs от типа
ядро@обвивка. Недостатък на хидрофилните тиолови лиганди (като напр.
меркаптокарбоксилните киселини) е това, че могат лесно да бъдат окис-
лени до продукти, които се отделят от повърхността на QDs и това води
до дестабилизиране на дисперсията и образуване на агрегати.
Хидрофобни квантови точки могат да бъдат солюбилизирани във водна
среда чрез вграждане в хидрофобната вътрешност на мицели. Нормалните
мицели във водна среда представляват агрегати от амфифилни молекули,
които са ориентирани с хидрофилните си краища към водната среда, а
хидрофобните им краища формират хидрофобното ядро на мицела, в кое-
то могат да бъдат вградени хидрофобни наночастици (фиг. 7.17). За целта
се използват фосфолипиди (включително и полиетоксилирани фосфоли-
пиди), които могат да образуват нормални (о/w) мицели във водна среда
(Dubertret et al., 2002). Други амфифилни вещества, като някои видове
сърфактанти (Li et al., 2007), също могат да се използват за получаване на
вградени в мицели QDs.
За трансфер на хидрофобни QDs във водна среда могат да се използват
и амфифилни блок-съполимери, които във водна среда образуват поли-
мерни мицели (Gao et al., 2004). Хидрофобните сегменти от молекулите
на съполимера се ориентират към хидрофобната повърхност на QD-
219
нанокристала, а хидрофилните сегменти – към водната среда. Използва-

нето на амфифилни съполимери за трансфер на хидрофобни QDs във
водни среди има някои предимства пред лигандния обмен, а именно:
– Няма директно взаимодействие между атомите от повърхността на
QDs и солюбилизиращия агент, което запазва до голяма степен флуо-
ресцентния квантов добив на изходните QDs.
– Големият брой хидрофобни странични вериги на полимера засилва
взаимодействието между полимера и повърхността на QDs, образу-
вайки по-стабилни структури в сравнение с използването на ниско-
молекулни сърфактанти.
– Съществуват подходящи амфифилни съполимери, които притежават
карбоксилни (–СООН) или амино групи (–NH2), които позволяват
свързване с биологични молекули.
Фиг. 7.17. Схематично представяне на хидрофобен QD-нанокристал от CdSe, вграден в

хидрофобното ядро на мицел
Други, сравнително големи органични молекули, като например амфи-

филни дендримери (Zhang C. et al., 2002) и амфифилен полиетиленимин
със силно разклонени вериги (Nann, 2005), също са прилагани за получа-
ване на стабилни вододиспергируеми QDs.
Флуоресцентните QDs могат да бъдат обвити със слой от органосили-
циеви съединения или силициев диоксид с цел стабилизиране във водни
среди със запазване на флуоресценцията и понижаване на токсичността
(Bruchez et al., 1998). Органосилициеви вещества, съдържащи функцио-
нални групи като –NH2 или –SH, могат да бъдат вградени в обвивката на
QDs, като по този начин предлагат възможност за свързването на QDs с
други молекули. Процедурата за силанизиране включва замяна на хидро-
фобните органични остатъци от повърхността на QDs с меркаптопропил-
трис(метокси)силан (MPS). Чрез тиоловата група молекулите на MPS се
свързват с повърхността на наночастиците, а метоксисилановите групи
220
(Si–OCH3) хидролизират до силанолни (Si–OH) и след кондензация и отде-

ляне на вода образуват силоксанови връзки. Следва добавяне на различни
силанови прекурсори, съдържащи –SH, и –NH2 групи. Тези молекули се
свързват със силоксановата обвивка, а излишъкът от силанолни групи се
превръща в метоксисиланови с цел блокиране на допълнителното раз-
растване на силоксановата обвивка (фиг. 7.18). При въвеждане на меркап-
тосилановите (MPS) молекули в първия етап на процеса, повърхността на
QDs се променя като следствие от взаимодействието с тиоловите групи
(което по същество представлява лиганден обмен). Това обикновено води
до намаляване на флуоресцентния квантов добив. Друг недостатък на тази
процедура е това, че трябва да се провежда в разредени дисперсии (с цел
минимизиране агрегирането на QDs), което е ограничение за получаване-
то на големи количества силанизирани QDs. В някои случаи е установено,
че флуоресценцията на силанизираните QDs е по-стабилна тази на някои
органични флуорофори (Gerion et al., 2001).
Фиг. 7.18. Схема на силанизирането на QDs с MPS
Флуоресцентни QDs могат да бъдат обвити със силициев диоксид чрез

контролирана хидролиза и кондензация от натриев метасиликат (Wolcott
et al., 2006). QDs с такива обвивки притежават повишена стабилност на
флуоресценцията в биологични буферни системи (като TRIS и PBS) и
могат да бъдат допълнително функционализирани с полиетиленгликол и
221
вещества с тиолова група, позволяваща свързване с антитела и/или други

молекули. Обвити със силициев диоксид квантови точки могат да бъдат
получени и чрез микроемулсионен синтез (Darbandi et al., 2005).
5. БИОКОНЮГАЦИЯ
Вододиспергируемите QDs често притежават в обвивката си карбок-
силни, амино или тиолови групи. Някои популярни реакции за биоконю-
гация на карбоксилирани QDs (имащи –СООН групи по повърхността си)
QDs са представени схематично на фиг. 7.19.
Фиг. 7.19. Схематично представяне на реакции за биоконюгация на карбоксилирани QDs
Такива QDs могат да бъдат свързани с протеини (или други молекули,

съдържащи амино групи) чрез реакция с 1-етил-3-(3-диметиламинопро-
пил)-карбодиимид (EDC), известна като EDC-куплиране. При карбоди-
имидното куплиране се образува амид в резултат на взаимодействие на
активирани карбоксилни киселини или фосфати с амини. Например кар-
бодиимидна реакция е използвана при конюгирането на обвити с тиогли-
колова киселина (TGA) QDs с трансферин и имуноглобулин (IgG) (Chan
and Nie, 1998). Реакцията с карбодиимид широко се използва за конюги-
ране на карбоксилирани QDs с различни протеини (включително антите-
ла) или с нискомолекулни съединения, съдържащи амино групи.
222
Антитела могат да се свържат с карбоксилирани QDs и посредством

стрептавидин (или авидин) и биотинилирани антитела (Mason et al., 2005).
За подобни цели е прилаган и специален адаптерен протеин, който е елек-
тростатично адсорбиран върху QDs (Goldman et al., 2002).
Модифицирани с тиолови групи QDs могат да бъдат конюгирани с
протеини (както и с всякакви други молекули, съдържащи амино групи),
използвайки подходящи линкерни молекули (Wolcott et al., 2006) (фиг.
7.20). В първия етап линкерната молекула реагира с амина, при което се
получава амидно производно, което във втория етап реагира с тиоловите
групи от QDs.
Фиг. 7.20. Конюгиране на модифицирани с тиолови групи QDs с молекули, съдържащи

амино групи чрез 3-сулфо-N-хидроксисукцинимид на 4-(N-малеимидометил)циклохек-
сан-1-карбоксилна киселина
Трябва да се отбележи, че взаимодействията стрептавидин–биотин и

авидин–биотин широко са използвани за конюгиране на QDs с различни
биологични молекули и лиганди (Zhou and Ghosh, 2006). Повечето от QDs,
използвани в имунофлуоресцентни анализи, са модифицирани със стреп-
тавидин за свързване с различни биотинилирани лиганди и антитела.
Взаимодействията авидин–биотин и стрептавидин–биотин са сред най-
силните нековалентни специфични взаимодействия между протеин и ли-
ганд. Свързването между биотина и авидина протича бързо и веднъж
протекло не се повлиява значително от pH (в интервала от 2 до 13), тем-
пературата, наличие на органични разтворители и други денатуриращи
агенти. Стрептавидинът е биотин-свързващ протеин с молекулна маса ~60
223
кDa и се състои от 4 субединици. Всяка субединица може да свърже по

една биотинова молекула. Стрептавидинът съдържа 32 лизинови остатъка
и може да се конюгира с различни карбоксилни киселини и карбоксилира-
ни QDs чрез EDC-куплиране. Биотинът е природен витамин с молекулна
маса 244 Da, който може да бъде конюгиран с протеини чрез хидрофобни
или хидрофилни линкерни молекули с различна дължина. Биотинилирани
антитела се използват като първични антитела при индиректни имуно-
флуоресцентни методи, при които във втория етап се прибавят стрептави-
дин-модифицирани QDs.
На фиг. 7.21 са илюстрирани схематично някои реакции за биоконю-
гация на модифицирани с амино групи QDs (амино-QDs).
Фиг. 7.21. Схематично представяне на реакциите при конюгиране на модифицирани с

амино групи QDs с SH-съединения (горе) и получаване на биотинилирани QDs (долу)
Реакцията на амино-QDs с N-(β-малеимидопропилоксил)сукциними-

ден естер се използва за конюгиране с лиганди, притежаващи тиолова (SH)
група. Например лигандът Deltorphin-II е бил конюгиран с амино-QDs,
при което е наблюдавано разпределението на δ-опиоидните рецептори в
живи клетки (Zhou et al., 2007).
Амино-QDs могат да бъдат конюгирани с олигонуклеотиди за прило-
жения в геномния анализ (Schroedter and Weller, 2002). В първия етап на
този процес 5’-фосфатният край на олигонуклеотида се активира с EDC,
след което при реакция с имидазол се получава реактивно фосфоримида-
золидно производно. Полученото производно реагира с амино-QDs, при
което се получава съответният фосфорамиден конюгат. Същата стратегия
224
може да се приложи и за други наночастици модифицирани с амино групи

(вж. Гл. 1, фиг. 1.6).
Амино-QDs могат да бъдат конюгирани с биотин (Bruchez et al., 1998)
и получените биотинилирани QDs да бъдат свързани със стрептавидин-
конюгирани молекули.
6. БИОМЕДИЦИНСКИ ПРИЛОЖЕНИЯ
6.1. Имунофлуоресцентни анализи
Имунофлуоресцентните методи за детектиране се основават на реак-

ции, при които антигените или антителата са конюгирани с флуорофори,
които при облъчване с ултравиолетова светлина флуоресцират в различен
цвят (фиг. 7.22).
Фиг. 7.22 Методи (директен и индиректен) за имунофлуоресцентна детекция
225
При всички имунофлуоресцинтни анализи се цели получаване на

комплекс антиген–антитяло, който най-често се визуализира чрез флуо-
ресцентен микроскоп. В процеса на изпълнението им се налага промиване
за отстраняване на несвързаните с антигена маркирани антитела. Имуно-
флуоресцентните методи имат два варианта:
1. Директен (пряк) метод. Често се използва за доказване на микробни
антигени. Изисква наличието на специфични антитела, маркирани с
флуорофори, при което образуваните антиген–антитяло комплекси
флуоресцират в съответния цвят.
2. Индиректен (непряк) метод. При този вариант има два етапа. В първия
етап се осъществява свързването на антигена с немаркирано антитяло.
Във втория етап се прибавя конюгирано с флуорофор анти-гамаглобу-
линово антитяло, при което се формира комплекс антиген–антитяло-
антиантитяло. Предимство на метода е, че се използва само един мар-
киран компонент.
Възможностите за приложение на QDs за имунофлуоресцентен анализ
е демонстрирано при първите им биологични приложения през 1998 г.
чрез конюгиране на модифицирани с тиогликолова киселина QDs с
имуноглобулин (IgG) посредством EDC-куплиране (Chan and Nie, 1998).
Наблюдавана е аглутинация на QDs, конюгирани с човешки IgG, в при-
съствие на съответни антитела. Това поставя началото на следващи разра-
ботки на нови имунофлуоресцентни маркери, базирани на QDs (Zhou and
Ghosh, 2006). Стрептавидин-модифицираните QDs са сред най-подходя-
щите за получаване на имунофлуоресцентни маркери, защото могат лесно
да бъдат свързани с различни биотинилирани антитела.
Флуоресцентните QDs могат да се използват като маркери при визуа-
лизацията на различни рецептори, намиращи се на повърхността на кле-
тъчната мембрана. Например QDs, модифицирани със съответни анти-
тела, са използвани за маркиране на индивидуални глицинови рецептори
и проследяване на латералното им движение в мембраните на живи невро-
ни (Dahan et al., 2003). Тези изследвания са от особено значение за разби-
рането процесите на развитие на синапсите между нервните клетки. Друг
тип важни мембранни рецептори в клетките, които са наблюдавани чрез
маркиране с флуоресцентни QDs, са т.нар. G-протеин свързани рецептори
(GPCRs) (Zhou et al., 2007). Рецепторите от този тип представляват голямо
и разнородно семейство протеини, които вземат участие в превръщането
на външни стимули във вътреклетъчни сигнали. Голяма част от фарма-
цевтичните агенти осъществяват своето действие чрез взаимодействие с
GPCRs, което обуславя необходимостта от разработване на методи за
визуализация и проследяване на тези рецептори.
226
При използването на QDs за специфично детектиране на дадена моле-

кула освен антитела могат да се използват и други молекули, които се
свързват специфично с целевата молекула. Например флуоресцентни QDs,
конюгирани с протеина анексин А5, са използвани за детектиране на
апоптоза (Gac et al., 2006). За тази цел стрептавидин-модифицирани QDs
са конюгирани с биотинилиран анексин. Протеинът анексин специфично
разпознава и се свързва с фосфатидилсерин, намиращ се на външната
страна на мембраната на апоптотични клетки. Използването на QDs със
стабилна флуоресценция позволява продължително проследяване на про-
мените, протичащи в мембраната на апоптотичните клетки. Изследването
на молекулните процеси, протичащи по време на апоптоза, има голямо
значение за разбиране на програмираната клетъчна смърт, която обик-
новено е потисната в раковите клетки.
Флуоресцентните QDs, конюгирани с различни антитела и други на-
сочващи лиганди, са използвани като маркери на ракови клетки. Напри-
мер QDs са използвани за маркиране на рецептора за епидермален расте-
жен фактор (EGFR) (Nida et al., 2005). Този рецептор е свръхекспресиран
в повечето ракови клетки. Синтезирани са и конюгати на QDs с лектин за
идентифициране на някои видове левкемични клетки (Zhelev et al., 2005).
Някои лектини проявяват висок афинитет към определени левкемични
клетъчни линии, но имат нисък афинитет към нормалните лимфоцити.
Установено е, че лектин-модифицираните QDs притежават по-добри ка-
чества като флуоресцентни маркери (по-стабилна и ярка флуоресценция)
в сравнение с лектини, маркирани с органични флуорофори (например
FITC-лектинови конюгати). Създадени са и флуоресцентни маркери за
ракови клетки, експресиращи фолатен рецептор (Pan end Feng, 2009). За
модифицирането на QDs е използван полилактид, модифициран с вита-
мин Е. Получените наночастици са допълнително модифицирани с фолат,
като по този начин се осигурява селективното им свързване с фолатния
рецептор от повърхността на клетките.
6.2. FRET биосензори
Флуоресцентно-резонансният енергетичен пренос (Fluorescence Reso-

nance Energy Transfer, FRET) представлява пренос на енергия от донор
към акцептор, който се осъществява при достатъчно малко разстояние
между тях (фиг. 7.23). В резултат на този енергетичен пренос интензите-
тът на флуоресценцията на донора се понижава. Установено е, че различ-
ни органични багрила, както и златни наночастици, могат да бъдат
227
акцептори на енергия от QDs, при което се явяват гасители на флуорес-

ценцията им в случай, че се намират близо до QDs и между тях се
осъществява FRET (Chang et al., 2005).
Фиг. 7.23. Схема на FRET-базирана система за определяне на протеиназна активност.

Органичното багрило играе ролята на акцептор. При разкъсване на пептидния линкер под
действие на протеазата, флуоресценцията на QD-нанокристала се повишава
Разработени са FRET-базирани системи с QDs за изследване на ензим-

на активност. Например разработен е FRET-базиран тест за определяне на
колагеназна активност в разтвор (Shi et al., 2006). В този случай, родамин-
маркирани и пептид-модифицирани QDs от CdSe@ZnS са използвани за
изследване на протеолитичната активност на екстрацелуларните матрикс-
ни металопротеинази (MMPs) при нормални и ракови клетки. Метало-
протеиназната активност е значително повишена при раковите клетки в
сравнение с нормалните. Чрез FRET-базирания тест в рамките на 15 мину-
ти е възможно различаването на клетките, продуциращи наднормени ко-
личества металопротеинази.
6.3. Проследяване на маркирани клетки
Проследяването на клетките по време на ембриогенезата е от изклю-

чително значение за разбирането процеса на формиране на многоклетъч-
ния организъм от оплодената яйцеклетка. Такова проследяване на клет-
ките е възможно чрез маркирането им с подходящи маркери. Важно усло-
вие при използването на флуорофори като маркери е да притежават
стабилна във времето флуоресценция, което да позволява дълготрайно
наблюдение на маркираните клетки. В това отношение флуоресцентните
QDs имат предимство пред органичните флуорофори. Флуоресцентни
228
QDs са били вградени във фосфолипидни мицели и инжектирани в еди-

нични бластомерни клетки от развиващ се зародиш на Xenopus (вид жаба)
(Dubertret et al., 2002). При тези изследвания е установено, че използва-
ните за целта вградени в мицели QDs притежават стабилна флуоресцен-
ция в клетките, не агрегират и могат да се използват за маркиране на раз-
лични клетки в развиващия се ембрион. При концентрации, необходими
за флуоресцентната визуализация на клетката (2.109 QDs клетка), QDs не
проявяват наблюдаема при тези опити токсичност, но при концентрации
по-високи от 5.109 QDs/клетка се наблюдават изменения в клетките. QDs
остават ограничени само в клетката, в която са инжектирани и в съответ-
ните дъщерни клетки, получени от нея. Наблюдаван е интересен ефект на
концентриране на QDs в клетъчните ядра на определен етап от развитието
на ембриона. Такова маркиране на индивидуални ембрионални клетки с
флуоресцентни QDs позволява проследяване на клетките и скоростта на
миграцията им в развиващия се зародиш.
6.4. Маркиране на наноносители
QDs са били използвани и като флуоресцентни маркери за колоидни

лекарствени наноносители. Маркираните наноносители могат успешно да
бъдат визуализирани с флуоресцентен микроскоп и проследени в хода на
взаимодействието им с живи клетки и тъкани, което е от значение за раз-
биране механизмите на тяхното взаимодействие с клетките. Например
CdSe QDs са били вградени в липозоми (Feng et al., 2005) и полилактидни
(PLA) колоидни частици (Nehilla et al., 2008). Обвити с полилактид QDs
притежават стабилна флуоресценция във водни дисперсии.
6.5. Изследване на фагоцитозата
Флуоресценцията на QDs позволява директно наблюдение на фаго-

цитозата им от различни клетки с флуоресцентен микроскоп, както и ко-
личествен анализ на този процес чрез поточна цитометрия (вж. §6.6).
Например бактерии Staphylococcus aureus са били маркирани с CdSe QDs
(директно получени чрез биосинтез в бактериалните клетки), което позво-
лява изследването на фагоцитозата на маркираните бактерии от ТНР-1
клетки (човешка моноцитна клетъчна линия) (Lin et al., 2020).
229
6.6. Приложения в поточната цитометрия
QDs могат да бъдат използвани като флуоресцентни маркери при

различни анализи с поточна цитометрия. Това е лазерен метод за броене
и сортиране на отделни флуоресцентно-маркирани клетки. Методът се
състои в суспендиране на клетките в поток от течност и пропускането им
през лазерен лъч, при което нужната информация се получава след елек-
тронна обработка на сигналите, получени от флуоресцентни детектори и
детектори на преминалата през клетките светлина. За приложението на
метода е необходимо изследваните клетки да са единични, в суспензия и
да не образуват агрегати (например проби от кръвни клетки са особено
удобни за този тип анализи и методът намира клинично приложение в
хематологията). Клетките се маркират чрез флуоресцентно-маркирани
антитела или други молекули, които се свързват със специфичен рецептор
от повърхността на клетката. Квантовите точки имат предимство пред
органичните флуорофори, тъй като имат по-тесни емисионни ивици,
което позволява анализирането на повече целеви клетъчни рецептори в
хода на един анализ без да се припокриват флуоресцентните спектри на
отделните маркери. За успешното ползване на различни флуорофори апа-
ратите са оборудвани с няколко различни лазера (с различни дължини на
вълната за възбуждане на флуорофорите) и различни флуоресцентни де-
тектори (за едновременно измерване на различни по цвят флуоресцентни
сигнали). Данните от анализа се предствят като хистограми или двумерни
графики (а понякога и тримерни).
Освен за броене на клетки с различни характеристики, методът поз-
волява комбиниране с устройство за сортиране на хетерогенна клетъчна
популация и разделно събиране на клетки, маркирани с определен флуо-
рофор. В този вариант методът е популярен като FACS (Fluorescence-
Activated Cell Sorting). Принципът е илюстриран на фиг. 7.24. Клетъчната
суспензия се въвежда в средата на бърз поток от течност и чрез вибриращ
механизъм потокът се разделя на отделни капки, при което параметрите
трябва да са така подбрани, че да има ниска вероятност за попадане на
повече от една клетка в капка. Потокът, малко преди разпадането си на
капки, преминава през лазерния лъч и системата от флуоресцентни детек-
тори за получаване на нужната информация, а на мястото на разделяне на
потока на капки е поставен пръстен, чрез който на отделни групи от капки
се придава положителен или отрицателен електричен заряд в зависимост
от това какви клетки се съдържат в капките (информация за което се
получава от флуоресцентната анализираща система).
230
Заредените капки преминават последователно през електрически

дефлектор (създаващ електрическо поле с високо напрежение), който от-
клонява капките в различна посока, позволяващо отделното им събиране
в различни контейнери и съответно сортиране на съдържащите се в кап-
ките клетки. Квантовите точки може да заместят успешно органичните
флуорофори в поточната цитометрия, например при маркиране на Т-
клетъчни рецептори (Chattopadhyay et al., 2010), изследвания на фагоцито-
зата (Pleskova et al., 2019; Lin et al., 2020) и др.
Фиг. 7.24. Принципна схема на FACS поточен цитометър
231
6.7. Приложения в геномния анализ
QDs могат да бъдат използвани като флуоресцентни маркери при

флуоресцентни хибридизационни техники за откриване на определени
нуклеотидни последователности в геномиката (Banerjee et al., 2016). Това
може да се реализира чрез използване на QDs конюгати с нуклеотиди като
компоненти на FRET биосензори или на FISH хибридизационни техники.
Три варианта за FRET биосензорно детектиране на хибридизация между
комплементарни нуклеотидни последователности чрез QD и органичен
флуорофор са илюстрирани на фиг. 7.25.
Фиг. 7.25. Варианти за FRET биосензорно детектиране на хибридизация между компле-

ментарни нуклеотидни последователности (означени с вълнообразна линия) чрез QD и
органичен флуорофор (dye): i) QD-нуклеотиден конюгат реагира с маркиран с багрило
аналит, при което се реализира FRET; ii) свързани с един и същ нуклеотид QD и багрило
реагират с аналит, при което се реализира пространствено сближаване на QD с багрилото
и реализиране на FRET; iii) комплекс между комплементарно свързани нуклеотиди
маркирани съответно с QD и багрило (между които е реализиран FRET) реагира с аналит,
който измества маркирания с багрило нуклеотид от комплекса и преустановява FRET
При достатъчно разстояние между QD и флуорофора, FRET не се реа-

лизира и флуоресцира само QD. При протичане на хибридизационната
реакция между комплементарните нуклеотидни последователности, мо-
лекулата на багрилото и QD се намират достатъчно близо за реализиране
на FRET, при което флуоресценцията на QD намалява (QD се явява донор)
и се увеличава тази на багрилото (което се явява акцептор).
232
QD-нуклеотидните конюгати намират сензорно приложение и във

флуоресцентната in situ хибридизация (FISH) (Bentolila, 2010). Целта на
FISH е да се установи положението на специфични нуклеотидни после-
дователности в метафазните хромозоми чрез хибридизация между целе-
вите последователности и комплементарен на тях нуклеотид, свързан с
QD. Маркираният с QD нуклеотид се инкубира с клетките, фиксирани в
метафазна фаза на делене, с цел реализиране на хибридизацията с целевия
ген, след което клетките се промиват и оцветяват с DAPI (синьо флуорес-
центно багрило за оцветяване на хромозомите) и следва наблюдение с
флуоресцентен микроскоп. FISH техниката с използване на QD-ДНК
конюгати се характеризира с по-голяма чувствителност и съотношение
сигнал/шум в сравнение с използването на органични флуорофори. QD-
ДНК конюгати се използват и за детектиране на определени нуклеотидни
последователности чрез РНК (Liang et al., 2005). За тази цел ДНК после-
дователностите първо се хибридизират с биотинилирани РНК, които се
свързват комплементарно с целевите участъци. След това се прибавят
свързани със стрептавидин QDs, които се залавят към РНК чрез реакцията
стрептавидин–биотин. След промиване на несвързаните QDs по наличие-
то и интензитета на флуоресценцията се прави оценка за наличието на
търсената нуклеотидна последователност.
QDs могат да се използват за диагностика и чрез свързване с нуклео-
тидни аптамери (Jo and Ban, 2016). Тези аптамери представляват синте-
тични олигонуклеотиди, които се свързват специфично с определени це-
леви молекули, макромолекули (например протеини) от значение за диаг-
ностиката. Известни са и пептидни аптамери – синтетични пептиди или
протеини, които могат да заместят функцията на антителата в имунодиаг-
ностиката. Аптамери, които се свързват специфично с целеви молекули,
се намират експериментално чрез селектиране измежду голям брой синте-
тични олигонуклеотиди с произволни нуклеотидни последователности.
6.8. Приложения in vivo
От научната литература са известни някои опити за използване на QDs

за in vivo наблюдение на тумори (Chen et al., 2012) и маркиране на лимфни
съдове (Kobayashi et al., 2007). Активното насочване на QDs за маркиране
на туморните клеки може да се осъществи например чрез модификация
на квантовите точки с фолиева киселина (фолат), която се свързва с фола-
тен рецептор, за който е известно, че е експресиран в относително по-
голямо количество на повърхността на делящи се клетки, каквито са и
раковите. Едновременното използване на различни QDs за многоцветна
233
визуализация на различни лимфни потоци би могло за послужи за

предсказване пътищата на метастазиране на ракови клетки в лимфните
възли. Такива изследвания имат предимно фундаментално значение, но
не и перспектива за in vivo диагностика. Като цяло възможностите за in
vivo приложения на QDs (особено съдържащите кадмий) са ограничени от
потенциалната им токсичност. Тук трябва да се има предвид токсичност-
та, произлизаща както от наноразмерите им и възможността да бъдат ен-
доцитирани от различни видове клетки и да причинят оксидативен стрес
в тези клетки, така и възможността да попаднат за дълго време в клетките
на ретикулоендотелната система (Hardman, 2006). С още по-силни огра-
ничения в това отношение са Cd-съдържащите QDs и някои от повърх-
ностните лиганди, с които са стабилизирани, които могат да бъдат ток-
сични както за определени клетки и тъкани, така и за живия организъм
като цяло. Поради същите причини използването на QDs като вектори за
лекарствено доставяне и генна трансфекция също е ограничено.
В последно време опитите за in vivo приложения на QDs отново пре-
дизвикват интерес във връзка с разработването на нови състави, които
изключват кадмий. В това отношение са интересни Ag2S QDs, въпреки
ниските флуоресцентни квантови добиви и дълговълновата флуоресцен-
ция, намираща се в близката инфрачервена област (NIR) (Javidi et al., 2017).
Други квантови точки, които се предлагат като алтернатива на Cd-
съдържащите, са CuInS2/ZnS QDs. Такива QDs са използвани за наблю-
дение на регионални лимфни възли in vivo в мишки, при което е устано-
вена около 10 пъти по-ниска остра токсичност на тези наночастици в срав-
нение с CdTeSe/CdZnS QDs (Pons et al., 2010). Квантови точки от CuInSe2
дори се предлагат за флуоресцентна (NIR) маркировка, чрез която да се
кодира информация за ваксиналния статус на индивида (McHugh et al.,
2019). Предлага се квантовите точки, вградени в РММА микросфери, да
се инжектират интрадермално заедно с ваксината чрез биоразградими
микроигли, при което се получава антителен отговор от ваксинацията, а
флуоресцентната маркировка е установима до 9 месеца след инжектирането.
7. ФАРМАКОЛОГИЧНИ АСПЕКТИ
Цялостна и сравнителна оценка на цитотоксичността на QDs е сложна
поради голямото разнообразие от различни QDs с различни видове ста-
билизиращи агенти. Физикохимичните характеристики на QDs са факто-
ри, определящи токсичността: размер и състав на частиците, електричен
заряд, концентрация, биоактивност на стабилизиращия агент, стабилност към
234
окисление и фотохимично разпадане (Hardman, 2006). Установено е, че

цитотоксичността и субклетъчната локализация на CdTe QDs зависи не
само от концентрацията, времето на въздействие, но и от размера и обвив-
ката на частиците (Lovric et al., 2005). Цитотоксичността е по-голяма при
по-малките и положително заредени QDs (2,2±0,1 nm) в сравнение с по-
големите QDs (5,2±0,1 nm) при същите условия. Също така при тези екс-
перименти е установено, че по-малките частици се локализират в ядрата
на клетките, докато по-големите остават в цитоплазмата (в ендозомите). Ци-
топлазмена локализация е установена и при свързване на по-малките частици
със серумен албумин, което също е съпроводено с намаляване на токсичност-
та. Клетъчната токсичност се проявява морфологично с кондензация на
хроматина, подобно на това при апоптоза. Механизмите на цитотоксичност
вероятно са комбинация от:
i) Отделяне на свободни Cd(II) йони (при Cd-съдържащите QDs), които
могат да се свържат и инактивират важни тиол-съдържащи ензими (в
митохондриите). Отделянето на свободни Cd(II) може да се ускори при
фото- или друг тип окисление на обвивката и/или халкогенидните компо-
ненти на QDs (Derfus et al., 2004).
ii) Образуване на реактивни свободни радикали, които могат да до-
ведат до увреждания на клетъчната мембрана и на вътреклетъчните струк-
тури (различни органели) и оксидативен стрес (Li et al., 2009). Оксидатив-
ният стрес се счита за един от механизмите, чрез които QDs увреждат
митохондриите (Li et al., 2011).
Цитотоксичността на QDs се определя и от природата на материала, с
който са обвити (Hoshino et al., 2004; Lovric et al., 2005). Поради тази
причина QDs, използвани за диагностични цели (in vitro) и биологични
изследвания, трябва да бъдат добре пречистени от излишъка свободен
повърхностен лиганд. Такова пречистване обаче невинаги е напълно въз-
можно, особено в случаите на установяване на равновесие – премахването
на несвързания лиганд би довело до десорбция на свързания лиганд и
дестабилизация на частиците. В някои публикации се докладва, че из-
следваните QDs са „нетоксични“, но такива изводи следва да се приемат
условно, тъй като често в такива доклади цитотоксичността на QDs е
тествана при относително ниски концентрации и кратки времена на ин-
кубиране на клетките с QDs (≤ 2 часа). Някои видове QDs, като InP/ZnS
(Li L. et al., 2020), Ag2S (Javidi et al., 2017) и CuInS2/ZnS (Pons et al., 2010)
се с по-ниска токсичност от Cd-съдържащите.
Изследванията върху токсикокинетиката (абсорбцията, органното и
тъканно разпределение, бионаличността, метаболизма и отделянето им от
организма) на QDs показват голяма зависимост от физикохимичните
235
свойства на наночастиците, подобно на цитотоксичността им. При i.v.

инжектиране QDs бързо се разпределят до всички органи и части на
организма, където могат да попаднат чрез ендоцитоза в различни клетки,
като най-вече се концентрират във фагоцитите на ретикулоендотелната
система, в черния дроб, далака, белия дроб, бъбреците. Експерименти in
vitro показват възможността различни видове клетки да поглъщат QDs
неспецифично чрез ендоцитоза: неутрофилни гранулоцити (Pleskova et
al., 2019), моноцити и дендритни клетки (Zhang L. et al., 2011), микроглия
(Zhang M. et al., 2019), HeLa клетки, хепатоцити, EL-4 клетки, туморни
клетки, ембрионални клетки и др. (Wu et al., 2013). Освен неспецифична
ендоцитоза, наблюдавани са и случаи на рецептор-медиирана ендоцитоза
на QDs от различни клетки в случаи, при които QDs са модифицирани с
определени протеини или други лиганди, свързаващи се специфично със
съответни клетъчни рецептори. Например CdSe@ZnS QDs, модифицирани
с епидермален растежен фактор (EGF), взаимодействат с EGF рецептора
(намиращ се на клетъчната повърхност) с последваща ендоцитоза при
овариални клетки от китайски хамстер (Lidke et al. 2004).
Това, че е наблюдавана неспецифична ендоцитоза на QDs от различни
видове клетки, поставя сериозен въпрос относно последиците от систем-
ното им приложение. Известни са in vivo изследвания на острата токсич-
ност, главно в гризачи, при които наблюдението е продължило около ме-
сец (в редки случаи по-дълго време). Възможни хронични ефекти, които
се появяват след по-дълъго време от приложението на дозата (например в
резултат на дълготрайно акумулиране на QDs в различни клетки), вклю-
чително потенциална канцерогенност, не са проучвани. Клетки, съдържа-
щи ендоцитирани CdSe@ZnS QDs са установени в бъбреците, белия дроб
и най-много в черния дроб и далака на мишки 7 дни след инжектирането
им (Hoshino et al., 2004).
Концентрацията на QDs в различните органи и тъкани се измерва най-
често чрез масспектрометрия с индуктивно свързана плазма (ICP-MS),
при което се измерва концентрацията на някой от елементите, изгражда-
щи QDs, който при нормални условия се намира в ниски концентрации в
изследвания организъм (например кадмий, селен, сребро, индий и др.). За
проследяване на органното разпределение на QDs се използва и флуорес-
ценцията на частиците (Gao et al., 2004), особено тази на NIR QDs, в която
област биологичните тъкани са относително по-„прозрачни“ (Jiang et al.,
2012a). Трябва да се отбележи обаче, че флуоресценцията на QDs обикно-
вено намалява след попадането им в живи клетки, вероятно в резултат на
окислителни процеси, като създават дефекти по повърхността на нано-
кристалите, водещи да намаляване на флуоресцентния квантов добив
236
(Gao et al., 2004). Използван е и микро-РЕТ за проследяване на биоразпре-

делението в организма (в различните органи) на маркирани с 64Cu QDs –
чрез лиганд, който от една страна е свързан ковалентно с QDs, а от друга
образува комплекс с 64Cu(II) (Schipper et al., 2007).
Ефектът на модификацията на QDs с вещества с различен електричен
заряд (положителни, отрицателни и неутрални) върху биоразпределение-
то и токсичните ефекти in vivo на CdSe@ZnS QDs са изучени при мишки
(Tang et al., 2013). Катионните QDs предимно се акумулират в белия дроб
(вероятно поради образуване на агрегати с противоположно заредените
плазмени протеини, които агрегати се задържат във фините капиляри на
белия дроб), докато PEGилираните (неутрални) QDs се акумулират основ-
но в черния дроб. При по-високи дози катионните QDs водят дори до
остро тежко състояние в резултат на белодробна емболия. Уврежданията,
предизвикани от неутралните (PEGилираните) QDs върху черния дроб,
далака, бъбреците и белия дроб, са били най-малки. Както и при други
видове наночастици, модифицираните с PEG QDs се фагоцитират в по-
малка степен. Колкото е по-дълга PEG веригата, толкова по-малко биват
фагоцитирани и имат по-дълъг плазмен полуживот (Ballou et al., 2004).
Например модифицираните с mPEG-750 QDs се изчистват от системното
кръвообращение един час след инжектирането, докато модифицираните с
mPEG-5000 QDs остават в системната циркулация за поне 3 часа. След
период от 133 дни все още е наблюдавана флуоресценцията от QDs, лока-
лизирани в лимфните възли и костния мозък. Удължаване на плазмения
полуживот е наблюдавано и при InAs@ZnS QDs модифицирани с по-
дълги PEG вериги (Choi et al., 2009). По отношение на метаболитните
превръщания и отделянето на QDs от клетките и организма има по-малко
изследвания. Изследван е ефектът на размера на QDs върху отделянето им
чрез бъбреците при гризачи след i.v. приложение (Choi et al., 2007). При
тези проучвания е установено, че цвитерйонни или неутрални органични
обвивки на QDs намаляват адсорбцията на плазмени протеини, които
иначе водят до увеличаване на хидродинамичния диаметър на частиците
>15 nm и възпрепятстват бъбречната филтрация и отделяне на частиците
с урината. Квантовите точки с хидродинамичен диаметър <5,5 nm се отде-
лят ефективно с урината. С увеличаване на хидродинамичния диаметър
от 4,4 до 8,7 nm (който става по-голям от порите в ендотела на бъбречните
гломерули, ~5 nm) се увеличава и плазмения полуживот на частиците от
48 min до 20 h (около 25 пъти). Подобни резултати с увеличаване на плаз-
мения полуживот при модификация на QDs с PEG (и отделяне чрез бъбре-
ците само на най-малките QDs) са получени и при други проучвания
(Shipper et al., 2009).
237
При изследване на токсикокинетиката на обвити с PEG Ag2Se QDs е

установено, че след i.v. приложение при мишки се акумулират в черния
дроб и далака, но се трансформират бързо, за около 1 денонощие (Tang et
al., 2016). Интересното е, че среброто, отделено от частиците, се отделя
чрез урината и изпражненията, но селенът не се отделя значимо.
След i.v. приложение InP@ZnS QDs бързо се локализират във всички
главни органи, най-вече в черния дроб и далака (индикация за попадане в
макрофагите) и за изследвания период от 28 дни остават локализирани в
тези органи (Li L. et al., 2020). Повърхностната модификация и дозата
имат съществен ефект върху токсичността на InP@ZnS QDs in vivo.
Интраперитонеалното (i.p.) приложение на QDs също води до локали-
зацията им в черния дроб, далака, белия дроб и бъбреците, но не и в
мозъка и сърцето (Haque et al., 2013). Използваните в тези експерименти
модифицирани с меркаптопропионова киселина CdSe@CdS QDs са дове-
ли до значимо повишаване нивата на лактатдехидрогеназа (LDH), NADP
оксидазата и интерлевкин-6 (проинфламаторен маркер) в кръвната плаз-
ма, черния дроб и далака.
За разлика от докладите за отделяне на QDs от организма, известни са
и доклади за дълготрайно персистиране на QDs в организма на мишки в
продължение на 2 години след инжектирането (Fitzpatrick et al., 2009).
След такова дълготрайно персистиране на QDs в тъканите е установено и
синьо отместване (към по-късите вълни) на флуоресцентния пик, което
свидетелства за постепенно разрушаване и намаляване размера на QDs in
vivo и бавно отделяне на Cd(II).
Известни са експерименти с мишки, при които е установено, че QDs
от CdSe@ZnS нарушават зреенето на ооцита, редуцират експресията на
хормоналните рецептори и намаляват in vitro фертилизационния потен-
циал (Xu et al., 2016a). Въпреки че не e установено преминаване на CdSe
и CdSe@ZnS QDs през плацентарната бариера, тези наночастици проявяват
увреждащо плацентата действие, което води до малформации на фетуса.
Тези ефекти са по-слабо изразени при частиците с обвивка от ZnS (Zhang
W. et al., 2016). Съдържанието на Cd в плацентата и матката при третиране
с Cd-съдържащи QDs е значително по-високо в сравнение с третиране при
същите условия с CdCl2, което е индикация, че наноразмерът на QDs е от
значение за попадането и акумулирането им в тези тъкани.
Токсикокинетиката на капсулирани във фосфолипидни мицели CdSe-
CdS-ZnS QDs е изследвана при примати (rhesus macaques) (Ye et al., 2012).
След i.v. инжектиране на 25 mg/kg QDs е проследено поведението на
маймуните, направени са хистологични, химични, кръвни и биохимични
анализи, при което за период от 90 дни не са установени патологични
238
отклонения в тези параметри. Биоразпределението на QDs е изследвано

чрез ICP-MS, при което е намерено, че след период от 90 дни почти цялата
първоначална доза кадмий е локализирана в черния дроб, далака и бъбре-
ците, докато нивата в останалите органи са доста по-ниски. Тези резулта-
ти показват, че повечето от i.v. инжектираните QDs в примати се локали-
зират в макрофагите на ретикулоендотелната система без да се отделят
чрез бъбреците и фецеса, което повдига сериозни въпроси относно дълго-
трайните им ефекти.
РЕЗЮМЕ
Оптични свойства. Квантовите точки (QDs) представляват нанокристали с размери
около 2–10 nm, които са изградени от един или повече полупроводникови материали
(предимно полупроводници от типа AIIBVI и AIIIBV). Характерни за QDs са размерно-
зависимите абсорбционни и флуоресцентни спектри - при намаляване размера на
нанокристалите се увеличава ширината на забранената зона и съответно намалява
дължината на вълната на абсорбираната и излъчената светлина. Широкият спектър на
възбуждане при QDs позволява възбуждане със светлина с дължина на вълната, която
е по-малка от тази, съответстващ ана абсорбционния максимум. Нанокристалите от
типа ядро@обвивка притежават по-интензивна и стабилна флуоресценция в сравнение
с тези, изградени от един полупроводник. Обикновено флуоресценцията на QDs е по-
стабилна в сравнение с повечето органични флуорофори.
Методи за получаване. Флуоресцентни QDs се получават с добри добиви чрез син-
тези в органични разтворители по метода на „горещо инжектиране“, като получените
QDs са хидрофобни и е необходима допълнителна обработка за солюбилизацията им
във водни среди. Вододиспергируеми QDs могат да се синтезират директно във водна
среда, при което се използват хидрофилни стабилизиращи агенти (водоразтворими
съединения с тиолови групи, амфифилни полимери и др.). При микроемулсионния
метод за получаване на QDs се използват w/o микроемулсии, съдържащи разтвори на
прекурсорните соли.
Функционализиране и биоконюгация. QDs могат да бъдат солюбилизирани във
водна среда чрез вграждане в мицели или чрез лиганден обмен, при който хидро-
филни лиганди изместват хидрофобните органични субстанции от повърхността на
QDs. Като хидрофилни лиганди обикновено се използват бифункционални съедине-
ния, съдържащи от една страна тиолови групи, чрез които се свързват с повърхността
на нанокристалите, и от друга страна – функционални групи (карбоксилни, амино
групи и др.), чрез които могат да бъдат конюгирани с биологични молекули. За пости-
гане на по-голяма стабилност QDs могат да бъдат обвити с органосилициеви съедине-
ния или силициев диоксид. Такива обвивки позволяват функционализиране на нано-
кристалите с различни функционални групи. Известни са методи за конюгиране на
функционализирани QDs с биологични молекули, например с антитела, чрез EDC
куплиране, електростатично взаимодействие, чрез стрептавидин–биотин и др.
Биомедицински приложения. QDs намират приложение като флуоресцентни мар-
кери на антитела и други биологични молекули. Те са особено полезни в случаите, в
239
които е необходима стабилна флуоресценция за дълготрайно наблюдение на марки-

раните обекти. Флуоресцентните QDs се използват като компоненти на FRET-бази-
рани биосензори, като маркери за антитела при имунофлуоресцентната диагностика
и детектиране на различни повърхностни клетъчни рецептори, за изследване на клет-
ки, маркиране на колоидни лекарствени носители, като флуоресцентни маркери при
анализи с поточна цитометрия и др. При тези изследвания следва да се имат предвид
възможни токсични ефекти на QDs върху живи клетки и организми. За тази цел се
разработват QDs, изградени от по-малко токсични материали.
Токсичност. Токсичността на QDs както върху клетъчни линии (in vitro), така и в
животни (in vivo) силно варира и зависи от физикохимичните свойства на частиците
и използваните вещества за обвиване и повърхностна модификация. Поради малките
си размери QDs биват ендоцитирани от различни видове клетки, а не само от профе-
сионалните фагоцити. При i.v. инжектиране в опитни животни частиците относител-
но бързо се локализират в органите на ретикулоендотелната система, във фагоцитите
в черния дроб, далака, белия дроб, бъбреците. При опити с маймуни е установено, че
CdSe-CdS-ZnS QDs почти не се отделят от организма за период от три месеца. При
мишки е установено негативно влияние на CdSe QDs върху фертилитета и увреж-
дания на плацентата, придружени с малформации на фетуса. Като по-нетоксични
аналози на Cd-съдържащите QDs се предлагат наночастици от Ag2S, CuInS2 и други,
флуоресциращи в близката инфрачервена (NIR) област.
240
Глава 8
МЕТАЛНИ НАНОЧАСТИЦИ
Видове метални наночастици. Исторически бележки. Оптични свойства,

(повърхностен плазмонен резонанс). Методи за получаване (дисперсионно-
кондензационни методи, редукция на метални соли и биосинтези). Моди-
фикация и биоконюгация. Биомедицински приложения (в имунодиагности-
ката, генетичните анализи, фототермична терапия, FRET сензори, носители
на ДНК, лекарства и ваксини, имуномодулаторни свойства, антибактериал-
ни свойства на наносребро). Фармакологични аспекти.
1. ВИДОВЕ МЕТАЛНИ НАНОЧАСТИЦИ
Метални наночастици могат да бъдат получени от различни метали, но

най-популярни и лесни за получаване, съхранение и приложение са нано-
частиците от относително инертни (благородни) метали, които са устой-
чиви в присъствие на вода и кислород – злато, платина, сребро и др. Нано-
частици от метали с по-силно изразени редукционни свойства са неста-
билни и реагират с вода и кислород от въздуха с образуване на съответни
оксиди и хидроксиди. Такива реактивоспособни наночастици се получа-
ват и съхраняват в силно редукционна среда и под инертна атмосфера и
не са подходящи за биомедицински приложения. Поради тези причини в
настоящето изложение ще бъдат разгледани предимно златни (Au NPs) и
сребърни наночастици (Ag NPs). Златните и сребърните наночастици в
литературата (особено в по-старата) често се означават като колоидно зла-
то, съответно колоидно сребро. В почти всички случаи колоидното злато,
което е описано в по-старите литературни източници, се състои от нано-
размерни (<100 nm) частици. До голяма степен това се отнася и за колоид-
ното сребро (Nowack et al., 2011).
241
Глава 8. Метални наночастици
2. ИСТОРИЧЕСКИ БЕЛЕЖКИ
Наночастици от злато, сребро и мед могат да бъдат намерени в кера-

мики и стъкла от древността (Sciau, 2012). Наночастиците в тези материа-
ли най-вероятно са получени при редукция на метални соли, смесени с
останалите компоненти при процеса на получаване на стъклата и керами-
ките. Известен керамичен артефакт е Ликурговата чаша (The Lycurgus
cup), която съдържа Au NPs и изменя цвета си в зависимост от положе-
нието на светлинния източник (Freestone et al., 2007).
Различни състави, получени от златни соли, са били изпробвани в те-
рапията още от Paracelsus и са били популярни през Средновековието
(Dykman and Khlebtsov, 2019). През 1618 г. лекарят и философ Francisci
Anthonii публикува първата известна към момента книга (на латински), в
която се дават сведения за получаването и медицинското приложение на
колоидно злато (Anthonii, 1618). Известни са и други подобни трактати от
XVII и XVIII век (Culpepper, 1656; Kunckels, 1676; Helcher, 1712). Още
Kunckels (преди M. Faraday) предполага, че розовият цвят на златните
дисперсии се дължи на много малки и невидими с око метални частици
(Daniel and Astruc, 2004). Медицинските златни препарати от тази епоха
са били за перорално приложение – „злато за пиене“ (aurum potabile).
През XIX век (1842 г.) John Herschel открива фотографски процес,
означаван като хризотип (chrysotype), при който изображението се запис-
ва на хартия чрез колоидно злато (Ware, 2006). При този процес хартията
се обработва с амониев ферицитрат и Fe(III) се редуцира до Fe(II) от
цитратния йон при осветяване. Следва обработка с Na[AuCl4], при която
Fe(II) редуцира Au(III) до Au(0) в предварително осветените области от
хартията, където се отлагат Au NPs с розово-червен цвят.
Първите документирани системни научни проучвания върху химично-
то получаване на Au NPs (колоидно злато) са публикувани през 50-те го-
дини на XIX век от Michael Faraday (Faraday, 1857). В първите си експе-
рименти Фарадей използва фосфор за редукцията на разтвор на златен(III)
хлорид. Колоидно злато на Фарадей, получено преди повече от 150 годи-
ни, се съхранява до днес и все още е стабилно (Tweney, 2006). Известни
учени като Richard Zsigmondy (откривател на ултрамикроскопа), Theodor
Svedberg (откривател на ултрацентрофугирането) и Gustav Mie (разрабо-
тил теорията за абсорбция и разсейване на светлина от сферични частици)
са проявявали интерес към получаването и свойствата на колоидното зла-
то. От тогава до днес са проведени многобройни проучвания върху раз-
лични методи за получаване, стабилизация и приложения на златните
колоиди (Hayat, 1989).
242
В началото на ХХ век отново се възражда интересът към възможни

медицински приложения на колоидното злато. В първите десетилетия на
века са докладвани експерименти с използване на метални колоиди за тре-
тиране на ракови образувания (Fleisher and Loeb, 1914). Във фармаколо-
гиите от първата половина на ХХ век (след 1925 г.) се споменава т.нар.
хризотерапия (от гръцки, χρῡσός "злато"), състояща се в серийно инжек-
тиране на златни золове против туберкулоза, сифилис и ревматоиден арт-
рит. В тези трудове се предполага, че инжекционно приложените златни
препарати имат по-скоро имуномодулаторен (а не толкова антимикробен)
ефект (Алексиев и Николов, Фармакотерапия, 1949 г., с. 317). От тогава е
описана и реакция на вродения имунитет с повишаване на телесната тем-
пература, т.нар. колоидоклазичен шок, наблюдаван при i.v. приложение
на колодни препарати.
Колоидното сребро също има дълга история в медицинската практика
(Nowack et al., 2011). Пример за сребърен колоид с дългогодишно прило-
жение е препаратът коларгол (Collargol), разработен през 1897 г., който
съдържа Ag NPs с размери около 15 nm (Jimenez–Lamana et al., 2014) и се
използва до днес за третиране на някои бактериални инфекции под фор-
мата на капки за външно приложение (в миналото е бил прилаган и инжек-
ционно – интравенозно, за предизвикване на т.нар. колоидален шок в ин-
фектирания организъм). Инжекционното приложение на подобни продук-
ти може да създаде имунен отговор към протеиновия компонент и реак-
ция на свръхчувствителност при повторно приложение, поради което не
се практикува. В литературата се намират различни процедури за полу-
чаване на колоидно сребро за медицински цели, но най-разпространената
формулировка съдържа 70% Ag и 30% албуминов хидролизат. В смес с
вода и свинска мас колоидно сребро е ползвано и под формата на унгвент
(Алексиев и Николов, Фармакотерапия, 1949 г., стр. 316). В миналото са
произвеждани и други колоидни формулировки на среброто за медицин-
ски цели. В повечето случаи не е ясно в каква степен препаратите са
съдържали колоиден метал и/или колоиден сребърен(I) оксид.
Металните наночастици имат характерни оптични свойства – абсор-

бират светлина от видимия спектър, в резултат на което дисперсиите им
са оцветени в различни цветове в зависимост от вида на метала, размера
и формата на частиците, и диелектричната константа на средата. Напри-
мер дисперсиите на сребърни наносфери са жълти до жълто-кафяви, а
243
тези на златни наносфери са розови до рубиненочервени (по-концентри-

раните дисперсии са по-интензивно оцветени). Оптичните свойства на
металните колоиди са изучавани още с първите системни проучвания,
проведени от M. Faraday след 1856 г. (Faraday, 1857).
Според съвременните разбирания тези оптични свойства могат да
бъдат обяснени чрез взаимодействието между светлината (разглеждана
като електромагнитната вълна) и проводящите електрони („електронен
газ“) от повърхността на металните частици. Светлината предизвиква пе-
риодично преразпределение на плътността на проводящите електрони
спрямо металните атоми и йони в металната наночастица, съответно пе-
риодична индуцирана диполна поляризация, протичаща в синхрон с елек-
трическото поле на светлината (фиг. 8.1). При съвпадане на честотата на
електромагнитната вълна (светлината) с определени честоти, характерни
за наночастиците, настъпва резонанс (т.нар. повърхностен плазмонен ре-
зонанс), съответстващ на максимум в абсорбционния спектър.
За описание на експерименталния абсорбционен спектър сe прилагат
теорията на Mie (Mie, 1908) и други теоретични модели (Kelly et al., 2003).
Абсорбционният спектър на металните наночастици отчита както абсорб-
цията, така и разсейването на светлина от частиците. Във видимата област
обикновено се наблюдава един ясно изразен максимум при металните на-
носфери, положението (λmax) на който зависи както от вида на метала
(~400–450 nm при сребърни и ~515–580 nm при златни наносфери), така
и от размера – с увеличаване на размера максимумът се отмества към по-
дълги вълни (Link and El–Sayed, 1999). Предложен е и метод за определяне
размера и концентрацията на златни наносфери от UV-vis абсорбционния
спектър (Haiss et al., 2007). При златните нанопръчки се наблюдават два
максимума в спектъра, свързани с плазмонен резонанс при напречна и при
надлъжна поляризация. Ивицата с максимум при около 520 nm съответст-
ва на плазмонен резонанс при напречна поляризация и е по-слабо интен-
зивна от другата, по-дълговълнова ивица (с λmax между 600–1200 nm,
зависещ от съотношението дължина/дебелина на нанопръчките) (Wang et
al., 2015). При всички тези процеси погълнатата от частиците светлинна
енергия се трансформира в топлина.
Когато металните наночастици агрегират, например в разтвори с висо-
ка концентрация на електролити или под действието на други дестабили-
зиращи фактори, абсорбционният спекър се променя – плазмонната аб-
сорбционна ивица силно намалява интензитета си и дори напълно изчезва
при образуване на големи агрегати (фиг. 8.2). Това явление е наблюдавано
и описано още от Faraday (1857) при Au NPs. Например промяната в цвета
244
на златните дисперсии от червени в сини при сближаване на наночас-

тиците се използва в имунологични и хибридизационни ДНК анализи
(Larguinho and Baptista, 2012). При агрегацията на наночастиците могат да
се образуват глобуларни или линейни (подредени в нишки частици) агре-
гати в зависимост от условията. Формирането на агрегати оказва различен
ефект върху вида на абсорбционните спектри (Chegel et al., 2012). Промя-
ната в оптичните свойства на металните наночастици се обяснява с вза-
имодействието на плазмоните между наночастици в близък контакт (Su et
al., 2003).
Фиг. 8.1. Схема на взаимодействието на светлина (електрическото поле на електромагнит-

ната вълна) с метални наночастици, при което се индуцира дипол, синфазно трептящ с
електрическото поле
Фиг. 8.2. Абсорбционни спектри на Ag NPs, преди и след агрегация в 30 mM NaCl
245
Подобно на някои органични багрила металните наночастици могат да

приемат енергия от флуорофори и да се явяват гасители на тяхната
флуоресценция, което се прилага при конструиране на FRET-сензорни
системи, например в комбинация с полупроводникови наночастици (Pons
et al., 2007) (за FRET-сензори вж. също Гл. 7).
4. ПОЛУЧАВАНЕ
4.1. Дисперсионно-кондензационни методи
4.1.1. Електрическо разпрашаване по Бредиг (Bredig)
През 1898 г. Георг Бредиг (G. Bredig) въвежда метода на електрическо

разпрашаване за получаване на метални (злато, сребро, платина) хид-
розоли (Bredig, 1898). При този метод в чиста охладена вода се потапят
два електрода от съответния метал на разстояние около 1 mm един от
друг. При подаване на постоянно напрежение (30–110V) и краткотрайно
допиране и отдалечаване на електродите под водата се създава електри-
чески разряд при ток около 5–10 А (фиг. 8.3). Част от метала се изпарява
под действие на голямата топлина, отделяща се от волтовата дъга, след
което металните атоми кондензират в студената вода до получаване на
метални наночастици. Следи от метални хидроксиди (например калиева
основа) или хлориди имат стабилизиращо действие (без тях обикновено
се получават синьо-виолетови золове, докато в присъствие на следи от
КОН се получават пурпурно червени золове). Този метод е неподходящ
за получаване на метални органозоли, тъй като се наблюдава значително
овъгляване на органичната дисперсна среда от високата температура на
електрическия разряд и примесване на получения колоид с въглерод. При
този метод дисперсната среда се нагрява силно, което налага поставянето
ѝ в охлаждащ съд с лед. Удобна модификация за получаване на метални
колоиди по метода на Бредиг е дадена от Никола Коларов (Неорганична
химия, 1970 г., с. 534). При това видоизменение единият електрод е свър-
зан с електромагнит, захранван с променлив ток, при което електродът е
в непрекъснато трептене спрямо другия и по този начин се поддържа
постоянно действаща електрическа искра.
Предимствата на този тип методи в сравнение с химичната редукция на
метални соли включват отсъствие на онечиствания от остатъчни реагенти
и продукти на реакцията, най-вече по повърхността на металните частици.
Получените наночастици при използвания постоянен ток обаче са твърде
246
полидисперсни (с широко разпределение по размери). Теодор Сведберг

(T. Svedberg) дава решение на този проблем, като модифицира метода
чрез използване на високочестотен променлив ток. Методът на Бредиг е
приложим само за получаване на колоиди от метали, които не реагират с
водата при тези условия – злато, сребро, платина. При използване на елек-
троди от метали, които са по-силни редуктори, металът се окислява и във
водна среда се получават колоиди от съответните хидроксиди.
Фиг. 8.3. Схема на метода на Бредиг (Bredig) за получаване на метални колоиди
4.1.2. Електрическо разпрашаване по Сведберг (Svedberg)
Сведберг модифицира метода на Бредиг, което позволява получаване

на различни метални (включително от реактивни метали като натрий)
золове в различни органични дисперсни среди (Svedberg, 1905; 1906). При
този метод се използват неразпрашаеми електроди (железни или алуми-
ниеви), потопени в суспензия на метала (например гранули от метал или
нарязана на парчета метална тел, потопени в течността), от който следва
да се получи съответния органозол. Сведберг използва променлив ток с
висока честота от искров генератор (румкорфова спирала) с паралелно
включен на електродите кондензатор, при което успява да получи редица
нови органозоли на множество различни метали с добра възпроизводи-
мост.
4.1.3. Лазерно разпрашаване
При метода на лазерното разпрашаване пластинка от благороден

метал, потопена в течна дисперсна среда, се облъчва с импулсен лазер,
при което част от метала се изпарява от абсорбираната лазерна енергия и
247
металните атоми кондензират в течната среда с образуване на наночас-

тици (Mansoureh and Parisa, 2018) (фиг. 8.4).
Фиг. 8.4. Схема на метода на лазерно разпрашаване за получаване на метални колоиди
Методът може да се приложи във водни и органични разтворители, в

присъствие или отсъствие на колоидни стабилизатори. Интерес предста-
вляват механизмите на колоидна стабилност в отсъствие на стабилизато-
ри (Palazzo et al., 2017). Отсъствието на стабилизатори прави такива
наночастици подходящи за лесна модификация с различни вещества.
4.2. Редукция на метални соли
Чрез редукция на метални соли най-вероятно са били получени нано-

частиците от злато, сребро и мед, които са намерени в керамики и стъкла
от древността (Sciau, 2012). Редукцията на метални соли е сред първите
методи за получаване на метални колоиди, които са описани още в сред-
новековните трактати, а по-късно и в научната литература. Такъв е и мето-
дът, по който са получени златните золове на Фарадей, някои от които са
съхранени до днес – чрез контролирана редукция на златен(III) хлорид с
фосфор (Faraday, 1857). През десетилетията след опитите на Фарадей са
приложени най-различни редуктори, колоидни стабилизатори и условия
за редукция на метални соли при получаване на метални наночастици. Тук
ще бъдат кратко описани само няколко от широко използваните методи
за получаване на Au NPs. С известна оптимизация същите методи могат
да се приложат и за получаване на Ag NPs. В повечето случаи като метал-
ни прекурсори за сребро и злато се използват добре известни соли, съот-
ветно сребърен нитрат и тетрахлорозлатна(III) киселина (или нейни соли).
Редукция с формалдехид. Редукцията на H[AuCl4] с формалдехид за
получаване на златни золове e интензивно изучавана още в началото на
ХХ век от Р. Зигмонди (Zsigmondy, 1898; 1906). При този метод към кипя-
ща дестилирана вода се прибавят разтвори на H[AuCl4] и калиев карбонат
248
до леко алкална реакция на средата, след което при кипене на разтвора се

прибавя разтвор на разреден формалдехид (НСНО). Златните наночасти-
ци (10–40 nm) се образуват още в първите секунди до около минута след
прибавянето на формалдехида и са стабилни във времето при съхранение.
Редукцията с формалдехид е използвана и за контролирано израстване на
златни частици от предварително синтезирани златни зародиши, означа-
вани като „ядра“ (Zsigmondy, 1906). В този случай „ядрата“ служат като
центрове, зародиши, около които се отлага металът при редукцията, по-
добно на процесите при кристализация. При по-висока концентрация на
зародишите в крайна сметка ще се формират частици с по-малък краен
размер при едно и също количество златен прекурсор, отколкото при из-
ползване на зародиши с по-ниска концентрация.
Сребърните йони също могат да бъдат редуцирани от формалдехид (и
други алдехиди) до метално сребро. Реакцията на сребърно-амонячния
хидроксид (реактив на Толенс) с алдехиди до получаване на „сребърно
огледало“ се използва в класическия органичен анализ:
2[Ag(NH3)2]+ + 2OH- + R–CHO 2Ag + R–COONH4 + 3NH3 + H2O
Zsigmondy и Lottermoser (Zsigmondy, 1906a) са използвали такава реак-

ция за изграждане на обвивка от сребро върху „ядра“ от злато, т.е. за полу-
чаване на колоидни частици от типа ядро@обвивка. Използването на фор-
малдехид като редуктор намира приложение и в съвременни доклади
върху получаването на златно-сребърни NPs (Norris et al., 2010).
Редукция с водороден пероксид. Редукцията на H[AuCl4] с Н2О2 е
предложена като метод за получаване на златни золове през 1899 г.
(Stoeckl and Vanino, 1899). В първите години на XX век са тествани мно-
жество редуктори за получаване на златни золове, но в системните проуч-
вания от това време са предпочетени най-вече формалдехид или водоро-
ден пероксид. Част от проведените в началото на ХХ век експерименти
по получаване на златни золове чрез редукция на H[AuCl4] с Н2О2 са
описани в трудовете на Сведберг (Svedberg, 1921). Процесът протича
съгласно следното уравнение и подобно на други случаи, растежът на
частиците може да се реализира върху предварително формирани заро-
диши:
2H[AuCl4] + 3H2O2 + 8KOH  2Au + 3O2 + 8KCl + 8H2O
249
Методът е приложим и за Ag NPs, при което се провежда в амонячно-

алкална среда (рН 10–12) и присъствие на полимерен стабилизатор, на-
пример поливинилпиролидон (Nishimoto et al., 2018):
[Ag(NH3)2]NO3 + 1/2H2O2 + OH-  Ag + 1/2O2 + H2O + 2NH3 + NO3-
Редукция с цитрат. Редукцията на златни и сребърни соли с натриев

цитрат е сред най-популярните методи за получаване на съответните ме-
тални наночастици, включително и като експериментално упражнение за
учебни цели (McFarland et al., 2004). Методът е описан и изучен подробно
от John Turkevich и съавт. (1951), основавайки се на по-ранни експери-
менти (Hauser and Lynn, 1940). При „стандартния“ синтез воден разтвор
на H[AuCl4] (95 ml, съдържащ 5 mg Au) при кипене се смесва с 5 ml 1%
разтвор на тринатриев цитрат при добро разбъркване. За период от около
5 мин се наблюдава бледо сиво-синьо оцветяване, което с времето преми-
нава в тъмно винено червено. При това се получанат сфероидни Au нано-
частици с диаметър ~20 nm. Механизмът на реакцията предполага образу-
ване на комплекс между цитратния йон и Au(III), в рамките на който се
извършва редокси-процес с получаване на хлориден комплекс на Au(I) и
дикарбоксиацетон (фиг. 8.5) (Ojea–Jiménez et al., 2010).
Фиг. 8.5. Механизъм на редукцията на тетрахлороаурат(III) с цитрат и последващо диспро-

порциониране на получения дихлороаурат(I) (по Ojea–Jiménez et al., 2010)
Хлоридният комплекс на Au(I) диспропорционира, а дикарбоксиаце-

тонът при температурата на синтеза (~100 °C) се разпада чрез декарбок-
силиране (Leng et al., 2015). Реакцията може да се осъществи и при стайна
температура, но при внесени предварително получени златни зародиши,
които започват да нарастват (Leng et al., 2015).
250
При нагряване цитратът може да редуцира и сребърни йони с образу-

ване на Ag наночастици (Lee and Meisel, 1982). При подобна процедура в
наши опити се получават ~50 nm-ови Ag наночастици (фиг. 8.6).
Методът на Turkevich е бил модифициран в различна степен през десе-
тилетията – изучавани са подробно ефектите на температурата, рН, съот-
ношенията и концентрациите на реагентите, както и вариант с обратно
смесване на реагентите (разтвор на металната сол се прибавя към кипящ
разтвор на тринатриев цитрат). Чрез промяна в тези параметри са били
получени различни по размер наночастици (Dong et al., 2020).
Редукция с натриев борхидрид. Сведения за получаване на златни и
Ag NPs чрез редукция на метални соли с натриев борхидрид (NaBH4) се
откриват в научната литература още от края на 70-те години на ХХ в.
(Creighton et al., 1979). Чрез този метод се получават жълти сребърни зо-
лове (λmax ~400 nm) при бързо смесване на 1 mM AgNO3 (1,0 ml) с излишък
от охладен с лед 2 mM NaBH4 разтвор (3 ml). Червен златен зол (λmax ~525
nm) се получава аналогично от 2,5 mМ K[AuCl4] (1,0 ml) и 1 mM NaBH4
(3,0 ml). За маркиране на авидин и фрагменти от антитела са използвани
Au NPs с размери около 4 nm, получени при редукция на неутрален 0,01%
разтвор на H[AuCl4] с NaBH4 при бързо разбъркване (Tschopp et al., 1982).
Подобен е и методът, предложен от Matthew Martin и съавт., при който се
използват H[AuCl4] и алкализиран водeн разтвор на NaBH4 (Martin et al.,
2010). Тази реакция протича според следното сумарно уравнение:
4H[AuCl4]+3NaBH4+13NaOH  4Au+3H3BO3+6H2+4H2O+16NaCl
Аналогично протича и редукцията на соли на Ag(I) (Song et al., 2009):
2AgNO3 + 2NaBH4 + 6H2O  2Ag + 2H3BO3 + 7H2 + 2NaNO3
Редукция на H[AuCl4] с NaBH4 се използва също така и при метода на

Brust–Schiffrin за получаването на малки (1–6 nm) и хидрофобни Au NPs
(Brust et al., 1994). При този метод се използват хидрофобни тиоли (доде-
кантиол) за стабилизиране на частиците в органичен разтворител (толу-
ен), а реагентите се пренасят от водната в органичната фаза чрез тетра-
октиламониев бромид.
Редукция с други редуктори. През дългата история (повече от 120
години) на получаване и изследване на сребърни и златни золове са
тествани почти всички възможни редуктори при различни условия. Сред
тях като най-популярни естесвено са се наложили относително простите
методи, с евтини и достъпни реагенти. Редукцията на водни разтвори на
251
[AuCl4]– с бял фосфор (разтворен в малко етер) е бил използван дълго вре-
ме след Faraday (1857) – вариантът на този метод, описан от Faulk и Taylor
(1971), основно за получаване на колоидно злато за имунологични изслед-
вания. Чрез този метод се получават вододиспергируеми наночастици с
достатъчно малък размер, около 3 nm (Romano et al., 1974), които са под-
ходящи за маркиране на биологични молекули (антитела и др.). Метални
наночастици могат да се получат от съответните метални соли и чрез дру-
ги редуктори – хидрохинони, редуциращи захари, калаен(II) хлорид, и др.
(Iravani et al., 2014; Herizchi et al., 2016).
(а) (б) (в)
Фиг. 8.6. а) Дисперсия, б) ТЕМ изображениe, и в) абсорбционeн спектър на Ag NPs,

получени чрез редукция на воден разтвор на сребърен нитрат с тринатриев цитрат
Известни са биосинтези на метални наночастици с използване на суро-

вини с растителен и животински произход, както и синтези с участие на
микроорганизми (Das et al., 2017). При методи, използващи растителни
екстракти, металните йони биват редуцирани до елементен метал от ре-
дукционно действащи вещества в екстрактите, като част от веществата в
растителните екстракти действат и като стабилизатори, ограничаващи
растежа на частиците до наноразмери. Тези методи са подходящи за полу-
чаване на наночастици от злато и сребро поради достатъчно високите ре-
доксипотенциали на тези метали. Сериозен проблем в тази област е кон-
тролирането на формата и размерите на получаващите се частици, които
зависят от концентрацията на екстракта, концентрацията на металната сол
252
и температурата. Често синтезите се провеждат при стайна температура и

промяна в температурата води до частици с различна морфология.
Първите получени чрез бактерии 5–25 nm-ови октаедрични Au NPs са
наблюдавани в клетъчната стена на Bacillus subtilis (Beveridge and Murray,
1980). За получаване на метални наночастици са използвани и цианобак-
терии, при които частиците се отделят в културалната среда (Brayner et
al., 2007). Безклетъчни екстракти също са използвани за синтез на метални
наночастици. Например от безклетъчен екстракт от Rhodopseudomonas
capsulata са получени Au NPs със сфероидна или нишковидна форма в
зависимост от концентрацията на използваната златна сол (He et al., 2008).
За получаване на Ag NPs е използвана бактериална биомаса, при което
по повърхността на бактериалните клетки се адсорбира сребърно амоня-
чен комплекс, [Ag(NH3)2]+, който се редуцира до Ag NPs при нагряване до
60 °C (Zhang H. et al. 2005). Известни са и примери, при които бактерии
отделят в културалната среда вещества, чрез които може да се осъществи
синтез на Ag NPs в отсъствие на самите бактерии. Например показано е,
че Ag NPs могат да се синтезират в супернатант от Escherichia coli, при
което размерът на частиците може да се контролира чрез различни пара-
метри, като концентрацията на използвания AgNO3, температурата и рН
(Gurunathan et al., 2009). Интересна бактерия (Morganella sp.), която е
силно резистентна към действието на сребърни йони и способна да синте-
зира Ag NPs е била изолирана от храносмилателната система на насекоми
(Parikh et al., 2008).
Някои гъби също отделят в културалната среда редукционно действа-
щи вещества и стабилизиращи агенти, които могат да се ползват за полу-
чаване на метални наночастици. Например гъбата Fusarium oxysporum
отделя протеини и редукционно действащи вещества в околната среда,
които в присъствие на [AuCl4]– йони водят до получаване на сфероидни
Au NPs с размери около 20–40 nm (Mukherjee et al, 2002). Екстрацелулар-
ните синтези на метални наночастици са с голямо предимство пред интра-
целуларните, тъй като не е нужно да се разрушават клетките, за да се из-
вличат наночастиците. При екстрацелуларните методи е достатъчно да се
използва културалната среда и метална сол, при което микроорганизмите
се отделят с просто филтруване.
За разлика от някои висококачествени QDs, които се получават в

органични разтворители и е нужна хидрофилизацията им за приложения
253
в биомедицината, металните наночастици могат да се получат във водни

среди, при което са готови за последваща функционализация и биоконю-
гация. За множество аналитични цели се изисква здраво свързване между
частицата и молекулите от нейната повърхност. При функционализира-
нето на Au NPs почти изключително се използват вещества, съдържащи
тиолова група (–SH) – тиол-съдържащи макромолекули, но най-често раз-
лични нискомолекулни съединения, чрез които се осъществява свързва-
нето на частицата с биомолекули (Chen et al., 2017). Счита се, че ковалент-
ната химичната връзка между сярата и златото, на която се основава
свързването на наночастиците с тези молекули, се осъществява между
тиолатен анион (получаващ се след депротонирането на тиоловата група)
и Au(I) от повърхността на златната наночастица (фиг. 8.7) (Häkkinen,
2012). Връзката Au–S е по-здрава от взаимодействието на други видове
лиганди със златната повърхност, което е причина тиолите да изместват
тези лиганди и да са предпочитани за получаването на стабилни функ-
ционализирани наночастици.
Най-често се използват наночастици, получени чрез редукция с цит-
рат, борхидрид или получени чрез лазерно разпрашаване във вода. Такива
частици лесно се модифицират с различни лиганди, предимно съдържащи
тиолови групи и биомолекули, тъй като повърхността им е относително
свободна от здраво свързани лиганти. Например цитратът от повърхност-
та на наночастиците лесно се измества от тиолови лиганди или макромо-
лекули, което често е съпроводено с повишаване на колоидната стабил-
ност: цитрат-стабилизираните частици са нестабилни при прибавяне на
силен електролит и коагулират, докато адсорбцията на протеин по по-
върхността им води до повишаване на колоидната им стабилност. В кла-
сическата колоидна химия тези полимери (желатин, албумин, казеин,
нишесте, декстрин, гума арабика, агар-агар и др.), които повишават ста-
билността на неорганичните (в т.ч. металните) золове, се означават като
„защитни колоиди“. Тези вещества се различават по силата на стабили-
зиращата (защитната) си способност. Тази способност още в класическите
проучвания от началото на ХХ век Zsigmondy определя чрез дефиниране-
то на т.нар. „златно число“, което дава най-малкото количество стабили-
зиращо вещество (в mg), което възпрепятства коагулацията на 10 ml стан-
дартен златен зол при прибавяне на 1 ml 10% NaCl (цветът на златния зол
при коагулацията преминава от тъмночервен във виолетов). Протеините
са сред най-ефективните „защитни колоиди“, което се дължи на относи-
телно силното им адсорбиране върху повърхността на златните частици.
Тази адсорбция се използва и за свързване на златни частици с антитела.
254
Фиг. 8.7. Схематично представяне на свързване на тиолатни лиганди към Au(I) от повърх-
ността на златна наночастица
Още при първите експерименти за използване на златни наночастици

като маркери за антитела и протеини се прилага просто смесване при
стайна температура на златния зол (λmax = 510 nm), получен чрез редукция
с бял фосфор или цитрат, и протеинов разтвор (или антисерум), при което
протеините се адсорбират по повърхността на наночастиците (Faulk and
Taylor, 1971; Roth et al., 1978). Важно условие е антисерумът да бъде
диализиран, тъй като серумните електролити предизвикват агрегация на
златните частици преди да са се адсорбирали протеините. Ефективността
на адсорбцията се проверява чрез своеобразен стрес тест чрез прибавяне
на силен електролит в серия различни концентрации до установяване на
концентрационния праг, при който золът коагулира. Този метод за коню-
гация на наночастици с антитела е относително прост и не изисква пред-
варително функционализиране на наночастиците, но има и някои недоста-
тъци, например антителата не са свързани ковалентно и могат да се десор-
бират, особено лесно в биолгични течности, в които се съдържат други
макромолекули, изместващи антителата от повърхността на частиците.
Към настоящия момент по-често се използва свързване на антителата
с функционализирани (най-често с карбоксилни групи) наночастици. За
тази цел, наночастиците се обвиват с хидрофилни бифункционални лин-
керни молекули (съдържащи тиолова и карбоксилна групи) (Zhang et al.,
2020). Модификацията може да се осъществи с относително прости мер-
каптокарбоксилни киселини, но по-често с дихидролипоева киселина или
нейни производни. Основната причина е, че двете тиолови групи в моле-
кулата на дихидролипоевата киселина осъществяват по-здрава връзка с по-
върхността на частицата. Някои производни на дихидролипоевата кисели-
на съдържат PEG вериги, осигуряващи хидрофилност и гъвкавост на мо-
лекулата в качеството ѝ на линкер (свързващо звено) между наночастица-
та и антитялото (фиг. 8.8).
255
Фиг. 8.8. Структури на някои тиол-съдържащи реагенти за повърхностна модификция на

Au NPs с цел въвеждане на: а) карбоксилна група (необходима за конюгация с антитела
чрез карбодиимидна реакция); б) алкинова тройна връзка и в) азидна група (необходими
за конюгиране чрез клик-реакции с образуване на триазолов пръстен)
Конюгирането на антитялото с карбоксилната група от този линкер се

реализира чрез карбодиимидна реакция с получаване на реактивно карбо-
диимидно производно, което със сулфо-N-хидроксисукцинимид (сулфо-
NHS) дава N-хидроксисукцинимиден естер, реагиращ при стайна темпе-
ратура количествено с амино група от антитялото с получаване на амидна
връзка (Jazayeri et al., 2016). Друг вариант за конюгиране на Au NPs с ан-
титела е използването на модифицирани със стрептавидин частици и био-
тинилирани антитела, при което връзката се реализира чрез относително
силното взаимодействие между стрептавидин и биотин (Jazayeri et al.,
2016). Наночастиците могат да бъдат конюгирани с Fab фрагменти вместо
с антитела – това са нискомолекулни участъци от антитела, чрез които се
свързват целевите антигени (Richards et al., 2017).
При конюгиранто на наночастиците с различни молекули намира при-
ложение и клик-реакция между органични азиди и алкини (получава се
1,2,3-триазолов пръстен) – циклоприсъединяване по Huisgen (Huisgen,
1961; Kolb et al., 2001) (фиг. 8.9). За тази цел златните наночастици се
модифицират с подходящи тиол съдържащи лиганди, които от една стра-
на се свързват с наночастицата (чрез тиоловата група), а от друга – носят
съответната функционална група (азид или алкин) за участие в клик-реак-
цията (фиг. 8.8).
Тази реакция се катализира от Cu(I). Трябва да се отбележи, че въз
основа на тази реакция е разработен метод за детектиране на Cu(II), при
който Cu(II) йоните от пробата се редуцират с натриев аскорбат и полу-
ченият Cu(I) катализира циклоприсъединителната реакция между азиди и
256
алкинови лиганди от функционализирани златни частици. Реакцията води

до агрегация на частиците и визуално установима промяна на цвета на
дисперсията (Zhou et al., 2008).
Фиг. 8.9. Реакция на циклоприсъединяване мужду алкини и органични азиди
Златните наночастици, използвани при тестовете за фототермична

терапия, които се прилагат венозно, са модифицирани с PEG (Vines et al.,
2019). При тази модификация на частиците се използва продуктът на реак-
цията между 2-иминотиолан и амино-PEG (фиг. 8.10). Целта на модифи-
кацията е да се получат наночастици с висока колоидна стабилност, слабо
адсорбират опсонини, циркулират дълго време в кръвообращението и се
акумулират в солидни тумори чрез EPR ефекта.
Фиг. 8.10. Реакция на 2-иминотиолан (хидрохлорид) с вещества, съдържащи амино група

(R = PEG, пептид и др.), при което се получава продукт с тиолова група
За аналитични приложения на Au NPs в геномиката е необходимо да

бъдат конюгирани с олигонуклеотиди. За тази цел олигонуклеотидите
следва да бъдат модифицирани с тиол-съдържащи вещества (въведената
тиолова група да служи за свързване на олигонуклеотида с повърхността
на частицата). Могат да се модифицират хидроксилните групи от захарид-
ния остатък в 5`- или 3`-края на нуклеотидната верига. Пример за такъв
модификатор на 5`-края е (S-тритил-6-меркаптохексил)-[(2-цианоетил)-
(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит, което реагира с 5`-хидроксилната
група и след последващо окисление и депротекция (сваляне на тритилната
група) се получава тиол-модифициран олигонуклеотид (фиг. 8.11).
Ag NPs също могат да се модифицират с антитела, макар и това да се
налага в практиката доста по-рядко в сравнение с приложенията на Au
NPs. За тази цел могат да се използват тиол съдържащи линкери, напри-
257
мер меркаптопропанова киселина с последваща конюгация между кар-

боксилната група и антитялото чрез карбодиимидна реакция (Zhu and Lee,
2017). Линкери с аминогрупи също могат да се използват – например
меламин, който се адсорбира върху сребърната наночастица и може да се
конюгира с антитялото чрез карбодиимидна реакция (Awan et al., 2020).
Фиг. 8.11. Реакции при модификация на 5`–ОН групата в дезоксинулеотид за въвеждане

на тиолова група, позволяваща свързване със златна наночастица (Tr = тритил)
258
6.1. Приложения в имунодиагностиката
Използването на Au NPs като маркери за антитела при изследвания с

електронен микроскоп започва през 70-те години на ХХ век (Faulk and
Taylor, 1971; Romano et al., 1974; Roth et al., 1978). За тези приложения се
използват малки частици, с диаметър от няколко до 30–40 nm. Тези части-
ци пропускат в малка степен електроните от електронния лъч на микро-
скопа и изглеждат тъмни (електронно-плътни) на фона на изображението
и по този начин може да се локализира положението на маркираното с тях
антитяло, съответно молекулите и обектите, с които се е свързало анти-
тялото. Тъй като клетките при електронно-микроскопския анализ са фик-
сирани и пермеабилизирани (нарушена е целостта на мембраните и голе-
ми молекули, като антитела и наночастици, могат да проникнат във вът-
решността на фиксираната клетка), по този начин могат да се маркират и
вътреклетъчни структури. За тази цел антитялото може да се свърже с
наночастиците чрез адсорбция или ковалентно (например чрез карбоди-
имидна реакция с наночастици, чиято повърхност е модифицирана с кар-
боксилни групи). Детектирането на антигена се реализира чрез директно
свързване с маркираното антитяло или по-често – индиректно, при което
антигенът се свързва с антитяло (първично антитяло), след което това ан-
титяло се свързва с второ, маркирано антитяло. Вместо второ маркирано
антитяло може да се използва маркиран протеин А (рА), който разпознава
и се свързва към Fc-края на първичното антитяло (Roth et al., 1978). Освен
за антитела, златните наночастици могат да се използват като маркери за
Fab-фрагменти (Richards et al., 2017). Маркираните със Au NPs антитела мо-
гат да се наблюдават и с атомно-силов микроскоп, AFM (Soman et al., 2008).
Маркираните със Au NPs антитела могат да се детектират и по силното
светоразсейване и да бъдат локализирани в биологични обекти чрез свет-
линен микроскоп в режим на тъмно поле (El–Sayed et al., 2005). В този
случай обектът се осветява напречно със силна светлина, така че само раз-
сеяната от обекта светлина попада в зрителното поле. Областите от обек-
та, в които се намира търсеният антиген (свързан с маркираното с Au NP
антитяло), изглеждат светли от разсеяната светлина.
Au NPs успешно са използвани за усилване на сигнала при детектиране
на взаимодействието между вещества чрез повърхностен плазмонен резо-
нанс (SPR). Тази техника се основава на измерването на изменението в
рефракционния индекс в близост до тънък метален (обикновено златен)
филм в резултат на изменение на количеството вещество – например в
259
резултат на адсорбиращи се макромолекули. Металният филм, нанесен

върху стъклена подложка и модифициран с определени функционални
групи (например карбоксилни), чрез които могат да бъдат имобилизирани
различни вещества, се нарича биосензорен чип. За количествена оценка
на взаимодействията, едното от взаимодействащите вещества се имоби-
лизира върху повърхността на биосензорния чип, а другото се пропуска в
поток над чипа през микрофлуидна система (фиг. 8.12). Взаимодействие-
то се наблюдава в реално време по изменението на рефракционния ин-
декс, което е резултат от изменението в масата близо до повърхността на
сензорния чип при адсорбцията или десорбцията. Изменението в рефрак-
ционния индекс в близост до металния филм повлиява повърхностния
плазмон във филма, възникващ при облъчването му със светлина под
определен ъгъл спрямо металната повърхност, в резултат на което се из-
меня интензитетът на отразената от филма светлина (измерен чрез пре-
цизна оптична система).
Фиг. 8.12. Принцип на SPR за изследване на взаимодействия между макромолекули
Чрез подходящо подбран набор от условия на експериментите, мето-

дът позволява определяне на кинетични и термодинамични характерис-
тики на взаимодействието. За подобрение чувствителността на метода,
изследваното вещество, протичащо в микрофлуидната система, се свър-
зва директно или индиректно (чрез антитяло) със златна наночастица,
чиято относително много по-голяма маса (спрямо тази на аналита) оказва
по-голям ефект върху рефракционния индекс и следователно води до по-
голям сигнал. Au NPs могат да бъдат конюгирани с антитела, при което
адсорбцията на такива антитела в близост до металната повърхност на
сензорния чип ще бъде детектирана при много по-ниски концентрации
(поради по-голямата маса на конюгата антитяло–наночастица). Маркира-
ни със Au NPs антитела могат да участват във формиране на антиген–
260
антитяло комплекс от тип „сандвич“ (фиг. 8.13). Вместо антитела могат

да бъдат използвани аптамери. Например демонстрирано е, че използва-
нето на Au NPs може многократно да повиши чувствителността на SPR-
базиран метод за определяне на IgE (Kim et al., 2010). За тази цел са из-
ползвани два варианта на експерименталната постановка, при което се
формират комплекси от тип „сандвич“ с IgE: (i) на повърхността на био-
сензорния чип се имобилизират анти-IgE антитела, с които се свърват из-
следваните IgE, след което тези IgE се разпознават от IgE-специфични
аптамери, конюгирани със Au NPs; (ii) на повърхността на чипа се имоби-
лизират анти-IgE апотамери, с които се свърват изследваните IgE, след
което IgE се разпознават от анти-IgE антитела конюгирани със Au NPs. И
при двата варианта IgE могат да бъдат определени при фемтомолни кон-
центрации.
Фиг. 8.13. Използване на Au NPs за детектиране на антигени чрез SPR анализ. Антигенът
може да се детектира чрез вторично антитяло, което е директно конюгирано с наночастица
(ляво) или чрез биотинилирано вторично антитяло, което се свързва със стрептавидин-
модифицирана наночастица (дясно)
Широко диагностично приложение златните наночастици намериха

чрез различните касетъчни тестове за бързо откриване на антигени и анти-
тела – основно в тестове за бременност (за откриване на човешкия хорион
гонадотропин, hCG) (Cole, 2015), както и в тестовете за бързо откриване
на антитела (IgM и IgG) при инфекциозни болести, в това число и COVID-
19 (Li Z. et al., 2020). Всички тези тестове работят на принципа на имуно-
хроматографския метод, който включва реакции между антиген и съот-
ветни антитела от биологични течности (кръв, урина) върху нитроцелу-
лозна подложка, по която се придвижва капилярен поток от изследваната
биологична течност (понякога разредена с подходящ буфер).
261
При касетъчния тест за бременност нитроцелулозната мембрана е пос-

тавена в пласмасова капсула, в която има отвор за накапване на урина (в
която се търси хормонът hCG) и отвор за отчитане на резултата. Тестът
работи по следния начин. При накапване на урината, тя се смесва с анти-
hCG антитяло, конюгирано със Au NPs. Ако в пробата присъства hCG
(при бременност), той се свързва с антитялото и полученият комплекс се
придвижва с капилярния поток, достигайки тест линията, където върху
нитроцелулозната подложка са имобилизирани анти-hCG антитела. Тези
антитела се свързват с комплекса от hCG и маркираното антитяло, при
което се образува комплекс от тип „сандвич“, който се задържа върху
тест-линията. Маркираното със Au NPs антитяло от така образувания ком-
плекс придава червен цвят на тест-линията при положителен резултат. Из-
лишъкът от несвързано с антигена (hCG) маркирано антитяло продължава
да се движи с капилярния поток, достигайки контролната линия, където
се свързва с имобилизирано анти-IgG антитяло. При това свързване кон-
тролната линия също се оцветява в червено (фиг. 8.14). Ако контролната
линия не се оцвети, тестът се счита за невалиден. На този принцип работят
тестове за най-различни антигени, вкл. вирусни (Kim et al., 2016), и др.
Фиг. 8.14. Принцип на имунохроматографски антигенен тест
Чрез имунохроматографски тестове с латерален поток могат да се от-

криват антитела (IgM, IgG) срещу инфекциозни причинители в биологич-
ни течности (кръв, плазма, серум) по следния начин (Li Z. et al., 2020).
Анти-човешки IgG и анти-човешки IgM антитела се имобилизират върху
съответните тестови линии от нитроцелулозната мембрана, а вирусният
антиген се конюгира със Au NPs. Ако изследваната проба съдържа анти-
тела срещу вирусния антиген, те се свързват с маркирания с наночастици
антиген и полученият комплекс се придвижва с капилярния поток до тест-
262
линиите с имобилизирани анти-човешки антитела с получаване на съот-

ветните оцветени линии (фиг. 8.15).
Тестовете за антитела също съдържат контролна линия, която показва
правилното придвижване на потока и запазената активност на биологич-
ните молекули. Контролната линия съдържа имобилизирани антитела,
които следва да се свързват с маркирано антитяло, преминаващо от нача-
лото на капилярния поток през тестовите линии, достигайки контролната
линия, разположена след тестовите линии в хода на капилярния поток.
Фиг. 8.15. Принцип на имунохроматографски тест за антитела
Характерен за златните наночастици феномен e промяната в цвета на

дисперсията при агрегиране на частиците. Тази промяна е в резултат на
спрягане на повърхностните плазмони на близко разположените частици
(Su et al., 2003). Цветът на дисперсиите на златни наносфери се променя
от типичния за тях червен в синьо-виолетов. Това свойство се използва за
визуално (колориметрично) детектиране на образуването на комплекс
антитяло–антигенен в имунологичните анализи (Yuan et al., 2011; Vilela et
al., 2012). При тези реакции се използват маркирани със златни частици
антитела или аптамери, които се свързват селективно с търсения антиген
или протеин и образуват агломерати, в които частиците се доближават
достатъчно близо, за да се установи промяна на цвета от червен в син (фиг.
8.16). При класическите имунологични методи, основани на агрегация и
въведени през 50-те години на ХХ в., се използват антитела, имобилизи-
рани върху полимерни микросфери (латексни частици), които при свър-
зване с антигена агрегират и се установява визуално измерим резултат
(Singer and Plotz, 1956). При методите, основаващи се на агрегация на Au
NPs, образуващите се агрегати са твърде малки за директна визуализация,
263
но белегът, свидетелстващ за настъпилата агрегация, се явява промяната

в цвета на дисперсията.
Фиг. 8.16. Принцип на колориметричен имунологичен тест за детектиране на антигени

чрез Au NPs модифицирани с антитела. Агрегацията при формиране на комплекса анти-
ген–антитяло води до промяна в цвета на дисперсията от червен в син
Използвайки същия принцип (промяна на цвета при агрегация), злат-

ните наночастици могат да намерят приложение в най-различни колори-
метрични тестове, при които частиците биват модифицирани с един от
взаимодействащите компоненти, образувайки агрегати в присъствие на
другия компонент (Vilela et al., 2012). Такъв е и принципът на ДНК-хибри-
дизационните колориметрични тестове (вж. §6.2). Въпреки че сребърните
наночастици са използвани по-рядко от златните в разработването на този
тип колориметрични тестове, известни са работи, основани на промяната
в цвета на дисперсиите от жълт в кафяв, съответсващи на диспергирани и
агрегирани Ag NPs. Такива тестове са разработени за откриване на раз-
лични органични и неорганични аналити (Vilela et al., 2012). Модифици-
рани с антитела Ag NPs са използвани и за електрохимично детектиране
на антигени (Awan et al., 2020). В този случай се използва въглероден
електрод, върху който се имобилизират антитела, свързващи целевия ан-
тиген, след което антигенът се свързва с модифицираните с антитела нано-
частици. Това свързване води до измерими промени в електрохимичните свой-
ства на електродната повърхност.
6.2. Приложения в генетичните анализи
Известни са възможности за приложения на златните наночастици в

генетичните изследвания като индикатори на хибридизация – свързване
264
на комплементарни участъци от ДНК, при което частиците агрегират и се

променя цветът на дисперсията (подобно на колориметричните антигенни
тестове описани в §6.1). Например разработен е такъв колориметричен
метод, при който не е необходимо ковалентно свързване между ДНК и
златните частици, хибридизацията протича лесно в разтвор за по-малко от
1 минута (Li and Rothberg, 2004). Прието е, че отрицателните заряди от
ДНК (при физиологични условия ДНК е под формата на полианион) се
отблъскват електростатично от отрицателно заредената повърхност на
златните частици, което прави неспецифичната адсорбция на ДНК върху
такива частици практически пренебрежима. Установено е обаче, че едно-
верижна ДНК (single-stranded DNA; ss-DNA) се адсорбира силно върху
цитрат-стабилизирани Au NPs, а скоростта на адсорбцията зависи от дъл-
жината на ДНК веригата и от температурата. Предполага се, че при тази
адсорбция ssDNA се ориентира с нуклеотидните си бази към повърхност-
та на наночастицата, а фосфатните групи са ориентирани към дисперсната
среда. Адсорбцията на такава ДНК дори повишава стабилността на нано-
частиците, като предотвратява агрегацията им в солеви разтвори. При на-
личие на комплементарна ДНК в изследваната проба настъпва хибриди-
зация с едноверижната ДНК от така модифицираните частици, които след
настъпилата хибридизация са вече нестабилни в солеви разтвори и агреги-
рат с промяна на цвета в син (Li and Rothberg, 2004) (фиг. 8.17).
Фиг. 8.17. Принцип на колориметричен тест за детектиране на комплементарна ДНК чрез

хибридизация с използване на Au NPs, модифицирани с едноверижна ДНК. Агрегацията
на частиците при протичане на хибридизацията в солеви разтвори води до промяна в цвета
на дисперсията от червен в син
Ако изследваната проба (например продукт на PCR амплификация) не

съдържа целеви нуклеотидни последователности, които да са комплемен-
тарни на едноверижната ДНК, която е адсорбирана върху наночастиците,
265
хибридизация не настъпва и частиците остават стабилни в солевия раз-

твор (цветът на дисперсията остава червен). Методът е приложен при
клинични проби за откриване на единични нуклеотидни полиморфизми
(SNPs; заместване на единичен нуклеотид на специфична позиция в гено-
ма), асоциирани с наследствена сърдечна аритмия (синдром на удължения
QT-интервал). Предимство на тази процедура се явява липсата на необхо-
димост от гел-електрофореза и сложни процедури (секвениране и др.) и
се реализира за по-малко от 10 минути (Li and Rothberg, 2004).
Установяването на образувани агрегати от Au NPs в резултат на ДНК
хибридизация може да се реализира и чрез високочувствителен метод на
основата на светоразсейване (Du et al., 2006). Този подход се оказва в
няколко порядъка по-чувствителен от колориметричното детектиране на
хибридизацията.
6.3. Фототермична терапия
При фототермичната терапия светлинна енергия се превръща в топ-

линна с цел топлинно унищожение на ракови клетки. При използване на
златни наноструктури за трансформиране на светлинната енергия в топлин-
на, терапията се означава като плазмонна фототермична терапия (РРТТ;
Plasmonic PhotoThermal Therapy) (Ali et al., 2019). Златните наносфери
абсорбират светлина във видимата област (510–550 nm), но такава свет-
лина слабо прониква в биологичните тъкани, поради което при РРТТ се
използват златни нанопръчки или обвити със златна обвивка наносфери
от силициев диоксид (nanoshells), които имат плазмонна абсорбционна
ивица при λ>700 nm. Светлина с дължина на вълната 750–1000 nm про-
никва в по-голяма степен в биологичните тъкани и именно такава се
използва при РРТТ. В сравнение с органични багрила, златните нано-
структури са по-ефективни, тъй като абсорбират ~105 пъти повече светли-
на в сравнение с повечето органични багрила (Jain et al., 2006) и не пре-
търпяват фотохимично превръщане при продължително облъчване. Ако
такива златни наноструктури се локализират в близост до или във вътреш-
ността на ракови клетки и бъдат облъчени с лазер с подходяща дължина
на вълната, светлинната енергия се трансформира в топлинна и локално
температурата се повишава над 42 °C, причинявайки смърт на клетките.
Съобщава се, че клетките умират главно по пътя на апоптозата при темпе-
ратура около 44 °C и чрез некроза при температури >46 °C (Samali et al.,
1999). Параметрите при PPTT могат да бъдат подбрани така, че да се
постигне апоптоза – при относително по-ниски концентрации на Au NPs,
266
по-малка мощност на лазера и/или време на облъчване (при по-интензив-

на РРТТ настъпва предимно некротична смърт на клетките). Хистопато-
логични изследвания показват, че при РРТТ се наблюдават и изменения в
кръвоносните съдове (Ali et al., 2019).
Основно предизвикателство пред успешното прилагане на РРТТ е селек-
тивното локализиране на наночастиците в областта на туморната форма-
ция и равномерното им разпределение в нея с цел да достигнат до всички
ракови клетки. При експериментите се прилагат два основни подхода –
директно интратуморно инжектиране на наночастиците или интравеноз-
но инжектиране на дългоциркулиращи наночастици, при което за тумор-
ната им локализация се разчита на EPR ефекта или друг вид насочване.
При клинични проучвания са тествани за РРТТ приложение обвити със
златна обвивка наносфери (150 nm) от силициев диоксид, стабилизирани
с PEG (AuroLase®) (ClinicalTrials.gov; NCT01679470; NCT00848042;
NCT02680535). При тези проучвания наночастиците се прилагат венозно
(i.v.) и се очаква акумулирането им в солидни тумори на принципа на EPR
ефекта, при което частиците проникват през фенестрираните кръвоносни
съдове в тумора. Преди клиничните проучвания тази терапия е прилагана
с известен успех при кучета и котки (Abdoon et al., 2016).
PPTT е силно ограничена терапия до потенциално приложение при
солидни локализирани тумори и практически неефктивна за делокализи-
рани и силно метастазирали неопластични процеси. Също така PPTT е по-
лесно приложима терапия при тумори, намиращи се по-близо до повърх-
ността на тялото (на кожата, на гърдата, главата и шията), но при използ-
ване на оптични влакна за доставяне на лазерната светлина до по-дълбоко
разположени тъкани, възможностите могат да бъдат разширени (Ali et al.,
2019). Към момента РРТТ има редица ограничения, които най-общо могат
да се обобщят по следния начин: i) наличие на все още неясни моменти
от токсикокинетиката, биоразградимостта и дълготрайните негативни
ефекти от инжекционно приложените на златните наноструктури и нано-
сферите от силициев диоксид (които са основата на Au nanoshells); ii) от-
носно ефективността на терапията, различни доклади съобщават различ-
ни резултати, получени при различни условия – липсва стандартизация и
условия за сравнянане ефективността на различните протоколи за трети-
ране (различни дози на златните наноструктури, различна мощност на
използваните лазери и дозиране на светлинното лъчение); iii) ниска селек-
тивност при акумулирането на наночастиците в областта на туморите (из-
ползване на наночастици с пасивно насочване или нееднородност на
солидните тумори, която компрометира EPR ефекта) може да доведе до
267
увреждане на здрави клетки и тъкани, в които има локализирани нано-

частици и/или до пропускане на ракови клетки, до които не са достигнали
наночастиците; iv) физични ограничения, като дълбоко разположени или
трудно достъпни тъкани, при които не може да се приложи ефективно
лазерно облъчване; v) златните (както и други) наночастици могат да ин-
дуцират повишена пропускливост на ендотела (NanoEL ефект), което мо-
же да повиши акумулирането на наночастици в солидни тумори, но може
и да се яви предпоставка за токсични ефекти на наночастиците (Setyawati
et al., 2017).
6.4. FRET сензори
Златните наночастици се явяват акцептори на енергия, съответно гаси-

тели на флуоресценцията при близко пространствено разположение спря-
мо QDs (Pons et al., 2007) или органични флуоресцентни багрила (Lee et
al., 2010). Близкото разположение между наночастиците и багрилото (или
QDs) се реализира чрез свързването им посредством линкерна молекула
(олигозахарид, пептид и др.). Когато тази линкерна молекула се разкъса
от даден ензим, молекулите на флуоресцентното багрило се отдалечават
пространствено от наночастиците, енергийният трансфер (FRET) между
тях вече не може да се осъществи и флуоресценцията на багрилото се уве-
личава. Например в качеството на FRET-базиран сензор за хепараназа е
била разработена система, състояща се от хепарин, модифициран с NIR
флуоресцентно багрило и с въведена тиолова група в края на хепариновата
молекула, чрез която се осъществява връзка със златна наночастица (Lee
et al., 2010) (фиг. 8.18). В рамките на тази система се осъществява FRET и
златната частица се явява гасител на флуоресценцията на багрилото, но
при наличие на ензим, който хидролизира гликозидните връзки в молеку-
лата на хепарина, флуоресценцията се появява и се явява индикатор за
ензимната активност. Хепаринът представлява сулфатиран глюкозамин-
гликан, съдържащ редуващи се остатъци от глюкуронова (и/или идуроно-
ва) киселина и глюкозамин. Крайният глюкозаминов остатък предоставя
алдехидна група, която може да образува имин при кондензация с пър-
вичен амин (цистамин), който след това да бъде редуциран (NaBH3CN),
като по този начин е реализирано въвеждането на тиолова група в края на
хепариновата молекула. От друга страна, карбоксилната група от глюку-
роновия (или идуроновия) остатък може да се конюгира чрез карбоди-
имидна реакция с флуоресцентно багрило, съдържащо амино група.
268
Фиг. 8.18. Принцип на FRET сензор за детектиране на ензим, хидролизиращ хепарин
6.5. Носители на лекарства, ДНК и ваксини
Златните наночастици могат да се ползват като преносители на лекар-

ствени молекули, протеини, олигонуклеотиди, ваксинални антигени и др.,
а скоростта на освобождаването им да се контролира чрез външен стимул
(светлина) (Kong et al., 2017). Създадени са различни конюгати между
лекарствени молекули и Au NPs, основно с потенциално приложение в
противораковата терапия. Приложенията на златните наночастици като
лекарствени носители обаче са силно ограничени поради бавното им раз-
граждане в макрофагите и дълготрайното им акумулиране в ендоцити-
ралите ги клетки (основно в органите на ретикулоендотелната система).
Едва 4% от приложената доза 5 nm-ови златни частици биват разградени
in vitro в клетъчна среда в присъствие на нестимулирани макрофаги за
период от 1 седмица; разграждането на по-големи частици (50 nm) e 4–6
пъти още по-бавно при същите условия (Carlander et al., 2019). От тази
гледна точка, по-перспективни изглеждат потенциалните приложения на
златните наноносители в случаите, при които не се налага периодичното
им и дълготрайно приложение.
За доставка на ДНК или РНК златните наночастици могат да се моди-
фицират с положително заредени при физиологични условия субстанции,
269
чрез които се осъществява електростатична адсорбция на олигонуклеоти-

дите (полианиони при тези условия). Например Au NPs, модифицирани с
нискомолекулен полиетиленимин (PEI, 800 Da), ефективно защитават
адсорбираната върху тях плазмидна ДНК и осъществяват трансфекция на
клетки in vitro (Hu et al., 2010).
Обикновено са необходими относително малки количества наночасти-
ци (в т.ч. и златни) при използването им в качеството на ваксинални адю-
ванти. Показано е, че Au NPs могат да бъдат успешно използвани като
ваксинални адюванти, които усилват имунния отговор чрез активиране на
различни цитокинови пътища в зависимост от размера и формата на час-
тиците (Niikura et al., 2013). Наносфери с диаметър 40 nm са се оказали
по-ефективни в това отношение в сравнение с други по форма частици
(нанокубове и нанопръчки) или по-малки наносфери (20 nm).
6.6. Имуномодулаторна активност
Приложението на златни препарати в медицината от началото на ХХ

в. се означава в литературата като хризотерапия. Златни соли, например
тиолови комплекси на злато(I), са прилагани при третиране на туберку-
лоза и ревматоиден артрит (Eisler, 2003). През 40-те години на ХХ век в
България се e прилагал препаратът Immunochrysin, който е съдържал ко-
лоидно злато (0,01 g), магнезий (0,025 g) и манган (0,002 g) в 2 cm3 5%
желатинов разтвор като мускулни инжекции при туберкулоза и някои
автоимунни заболявания, като псориазис, ревматоиден артрит, лупус и др.
(Алексиев и Николов, Фармакология, 1949 г.). Авторите (Алексиев и
Николов) са предполагали, че колоидното злато упражнява „олигодина-
мично действие“, изразяващо се в повлияване функциите на ретикуло-
ендотелната система (макрофагите и съдовия ендотел). За подобни цели в
България се е прилагал и препаратът Calcichrysin, съдържащ колоидно
злато (0,005 g) и калциев глюконат (0,40 g) в 1% желатин (5 cm3) за
мускулни инжекции. В редки случаи в миналото, когато са били инжек-
ционно прилагани подобни препарати, е наблюдавано постоянно оцветя-
ване (зеленикаво-синьо до индигово синьо) на кожата от попаднали в нея
златни частици, известно като хризодерма (Schamberg, 1928).
В по-съвременни проучвания ефектът на Au NPs при експерименален
артрит е изследван след интраартикуларно приложение (инжектиране в
ставната капсула), при което е отчетено известно намаляване на възпали-
телния процес в зависимост от размера на частиците (Kirdaite et al., 2019).
При този начин на приложение е установено акумулиране на частиците в
лизозомите на синовиалните фибробласти чрез ендоцитоза и проява на
270
антиоксидантен ефект. В други експерименти е показано, че третирането

на макрофаг-подобни клетки in vitro със Au NPs намалява фагоцитната им
активност (Bancos et al., 2015).
6.7. Антибактериални свойства на наносребро
Наноразмерно сребро под формата на колоидно сребро се е ползвало в

медицината като антибактериално средство отпреди повече от 100 години
(Nowack et al., 2011). През 1889 г. Mathew Carey Lea (американски химик)
докладва синтез на цитрат-стабилизиран сребърен колоид, за който по-
късни проучвания установяват, че е съдържал наночастици със среден
диаметър около 7–9 nm (Frens and Overbeek, 1969; Vorobyev et al, 2019).
Стабилизацията на сребърен колоид с протеини е описано в началото на
ХХ век (Paal, 1902), като първият такъв сребърно-колоиден продукт за
медицинско приложение, известен като коларгол (Collargol), е разработен
през 1897 г. и подобен продукт с това име се ползва и до днес. Наночасти-
ците в съвременния коларгол са със среден диаметър ~15 nm (Jimenez–
Lamana et al., 2014). Други сребърни нанопрепарати са получени, патен-
товани и прилагани в продължение на десетилетия. Дългата история на
получаването и използването на колоидното наносребро е довела до на-
трупване на много знания и изследователски опит през последното столе-
тие, въпреки че едва в последните десетилетия е въведена „нано“ терми-
нологията. Тази промяна в терминологията не би трябвало да създава
впечатление, че наносреброто е „нов“ материал.
Коларголът съдържа 70% колоидно сребро и 30% протеинови вещес-
тва (хидролизат от яйчен албумин) като защитен колоид. Предствлява
тъмни, синьочерни люспи с метален блясък, които при разтваряне във
вода дават колоидна дисперсия. Получената дисперсия (0,5–3%) намира
приложение като антисептично средство (капки за нос и др.). В миналото
е бил широко прилаган като бактерицидно средство, особено преди от-
криването на антибиотиците. Докъм средата на миналия век се е ползвал
под формата на мази (1,0–1,5%) или разтвори (1–2%) за лечение на рани,
вътрешно при хроничен гастрит и стомашна язва и дори под формата на
венозни инжекции при инфекциозни болести (Schlce and Zweifel, 1924).
Вътрешното приемане на колоидно сребро и сребърни съединения про-
дължително време и в относитено по-големи дози може да доведе до хро-
нично отравяне, известно като аргирия (Wadhera and Fung, 2005). Арги-
рията видимо се проявява с постоянно синьо-сиво оцветяване на кожата.
Приемането на сребърни препарати през устата може да окаже ефект и
върху нормалната чревна флора (Dahiya et al., 2018).
271
Взаимодействията между наночастиците и биологичните среди, в кои-

то тези частици попадат (клетъчна култура, кръв и др.) предшестват след-
ващите процеси на ендоцитоза, биоразпределение, метаболизъм, разграж-
дане и различните биологични и токсични ефекти, произлизащи от тези
процеси. Присъствието на електролити в биологичните среди може да
предизвика агрегация на метални наночастици, които не са достатъчно
стабилни. Агрегацията на такива наночастици може да повлияе прониква-
нето им в различни клетки чрез ендоцитоза, биоразпределението и ток-
сичността им. Взаимодействието на наночастиците с протеините от био-
логичните течности променя свойствата им – протеините се адсорбират
по повърхността на частиците за по-малко от 5 минути и увеличават хид-
родинамичния им диаметър. Адсорбцията на отрицателно заредени про-
теинови молекули върху положително заредени Au NPs може да доведе
до преобръщане заряда на частиците в отрицателен (Alkilany and Murphy,
2010). Това означава, че наночастици, които при получаването си са има-
ли положителен заряд, в биологична среда може да придобият отрица-
телен заряд. Възможността за такова преобръщане на заряда на частиците
в резултат на взаимодействието им с протеини следва винаги да се има
предвид при тълкуването на резултати от изследвания на токсичността и
биологичните ефекти. Преди да се правят изводи за биологичните ефекти
на положително заредени наночастици, трябва да се провери дали части-
ците са все още положително заредени и дали не са агрегирали след смес-
ването им с изследваната биологична среда.
Изследвания на взаимодействията между цитрат-стабилизирани Au
NPs и различни протеини от човешки кръвен серум са показали, че про-
теините, които се намират в по-високи концентрации в серума (например
албумин), първи биват адсорбирани върху повърхността на наночасти-
ците, като след това биват постепенно измествани от протеини с по-голям
афинитет към частиците, но с по-ниска концентрация в серума (например
фибриноген) (Zhang X. et al., 2018). Протеините с малък афинитет към
частиците (например хемоглобин) не могат да изместят протеините с по-
голям афинитет. Скоростта на този динамичен процес на протеинов обмен
в хода на образуването на протеиновата корона около частицата се опре-
деля от разликата в афинитетите на протеините към наночастиците – кол-
кото тази разлика е по-голяма, толкова по-бързо протича обменът.
Поради наноразмерите си металните наночастици прониквнат в раз-
лични клетки чрез ендоцитоза. Визуализирането на попадналите в клет-
ките наночастици може да се осъществи чрез различни методи. Златните
272
частици изглеждат електронно плътни на ТЕМ изображенията, което ги

прави лесно различими от клетъчните компоненти. За визуализирането на
проникналите в клетките Au NPs се прилага също тъмнополев микроскоп
(El–Sayed et al., 2005). Количественото определяне на метални наночас-
тици може да се постигне чрез количествен анализ на съответния метал в
изследваните тъкани и органи чрез ICP-MS, но този метод е деструктивен
и не дава информация за конкретното локализиране на частиците в клет-
ките. Проникването на Au NPs в клетките е важно за приложенията им
като носители на лекарства и гени за вътреклетъчно доставяне. Наночас-
тиците попадат в клетките чрез ендоцитоза и се акумулират в ендозомни
везикули, при което частици с размери около 50 nm биват ендоцитирани
най-бързо в сравнение с по-големи и по-малки от тях частици (Chithrani
et al. 2006). Например цитрат-стабилизирани 16 nm-ови златни частици се
локализират в ендозомите на HeLa клетки за около 2 часа (Nativo et al,
2008). При модификация с клетъчно-проникващи пептиди (СРР) същите
наночастици са намерени свободни в цитоплазмата, което предполага или
директното им преминаване през клетъчната мембрана или освобождава-
нето им от ендозомите. Много малки частици, например Au55 клъстери с
диаметър от 1,4 nm, могат да проникнат в клетките и дори в клетъчното
ядро, свързвайки се с ДНК (Tsoli et al., 2005). Поради това тези клъстери са
се оказали с много висока цитотоксичност.
Метални наночастици проникват чрез ендоцитоза в различни клетки,
но от гледна точка на приложенията, предполагащи инжекционното им
въвеждане, голямо значение има локализацията им във фагоцитите и
ентотелните клетки, както и по-нататъшната им съдба в тези клетки и
съответните биологични ефекти. Установено е, че само 4% от 5 nm-ови
Au NPs се разграждат in vitro в клетъчна среда в присъствие на нестиму-
лирани макрофаги за 1 седмица; разграждането на по-големи частици (50
nm) e 4–6 пъти по-бавно при същите условия (Carlander et al., 2019). Час-
тичното разграждане на частиците се обяснява с окислителното действие
на реактивни кислородни видове (ROS) и хелатиращия ефект на биоло-
гичните макромолекули по отношение на получаващите се Au(III) йони.
Ефектът на акумулираните в макрофагите наночастици върху функцията
на тези клетки не е еднозначно установен и вероятно зависи от различни
фактори (най-вече от наличието на ендотоксиново онечистване), тъй като
съществуват разнопосочни резултати (Leroy et al., 2011). Известни са
проучвания, при които не е установен ефект на Au NPs върху клетъчния
цикъл, продукцията на цитокини и някои повърхностни маркери, но е
наблюдавано потискане на фагоцитозата, особено от по-малките (10 nm)
наночастици (Bancos et al., 2015). По-нови проучвания не установяват
273
значим активиращ ефект на златни частици върху човешки моноцити

(Swartzwelter et al., 2021). Изследвания с различни по размери (от 12 до 60
nm) PEG- и овалбумин-модифицирани Au NPs върху миши макрофаги
показват, че модифицираните с овалбумин частици и частиците с по-мал-
ки размери водят до възпалителна активация на макрофагите след ендо-
цитоза за разлика от по-големите и модифицираните с PEG частици (Chen
and Gao, 2017). Ендоцитирани наночастици могат да напуснат макро-
фагите чрез екзоцитоза, която зависи в голяма степен от повърхностната
им модификация (Oh and Park, 2014).
Сребърните наночастици са като цяло по-реактивни от златните, отде-
лят сребърни йони в биологични среди и се оказват с по-голяма цитоток-
сичност по отношение на човешки макрофаги (Haase et al., 2011). При
изследване на ефектите от дългосрочно (20 дни) третиране на миши
макрофаги с полимер (PVP)-модифицирани Ag NPs (с хидродинамичен
диаметър около 100 nm) е установено намаляване на редуцирания глута-
тион, понижена фагоцитна активност и понижен отговор на макрофагите
към липополизахарид (Dalzon et al., 2020). Тези ефекти са по-силно изра-
зени при дългосрочно (20 дни) третиране с по-ниска доза частици, откол-
кото при краткосрочно (24 ч.) третиране с висока доза. Предполага се, че
такъв тип хронична токсичност по отношение на макрофагите е в осно-
вата на хроничната токсичност на наносребро, наблюдавана при някои in
vivo експерименти (De Jong et al., 2013). За разлика от златните частици,
при сребърните по-често е наблюдавано възпалително активиране на
макрофагите с отделяне на провъзпалителни цитокини, което се приписва
на получаващото се Ag(I) при окислителното им разграждане в ендозо-
мите (Park et al., 2010).
В биологични среди среброто от сребърните наночастици участва в
различни биохимични трансформации (Liu et al., 2012). Попадналите в
ендозомите или в храносмилателната система наночастици се окисляват
и отделеното Ag(I) може да се свърже с различни протеини и вещества с
тиолови групи, в това число металотионеин (Jimenez–Lamana et al., 2014).
Свързаното в комплекси Ag(I) може да претърпи фоторедукция (в изло-
жените на слънце участъци на кожата) до получаване на вторични (раз-
лични от първоначално приложените) Ag NPs. Също така, Ag(I) може да
реагира със сулфиди и селениди до получаване на частици от сребърен
сулфид и селенид в различни тъкани (Liu et al., 2012). Вторичните Ag NPs
на свой ред могат да се преобразуват в частици от сребърен сулфид/селе-
нид след окисление и свързване със сулфиди и/или селениди.
Ендоцитозата на метални наночастици от ендотелните клетки и ендо-
телната токсичност също трябва да се имат предвид при инжекционното
274
приложение на такива нанопрепарати. Изследване на ендоцитозата на Au

NPs, модифицирани с различни вещества (PEG, полиетиленимин, липоева
киселина), са показали, че адсорбцията на протеини върху такива частици
определя стабилността им и намалява значимо ендоцитозата им от човеш-
ки ендотелни клетки in vitro (Chandran et al., 2017). Също така при опити
in vitro е установено, че Au NPs (10–30 nm) нарушават плътния контакт и
индуцират микронноразмерни отвори между ендотелните клетки. Този
ефект е известен като ендотелна пропускливост, индуцирана от наночас-
тици („nanoparticle induced endothelial leakiness“, NanoEL) (Setyawati et al.,
2017). Различни видове ендотелни клетки (изолирани от кожа, от млечна
жлеза или от пъпна връв) се характеризират с различна пропускливост на
ендотелните контакти и съответно проявяват различен NanoEL ефект.
Някои учени предлагат този ефект да се използва за пренасяне на лекарст-
ва и наночастици през ендотелните бариери (например в солидни тумори,
в които липсва ясно изразен EPR ефект), но не бива да се забравя за въз-
можните неблагоприятни последствия от нарушаването целостта и/или
функциите на нормалния ендотел в различни органи. Установено е, че
токсикологичният профил на Au NPs върху човешки мозъчни ендотелни
клетки зависи от размера на частиците, от формата им и от веществото, с
което е модифицирана повърхността на наночастиците (Enea et al., 2019).
При тези in vitro експерименти е установено, че наночастиците попадат в
ендотелните клетки и оказват цитотоксичен ефект, което поставя въпроса
за дълготрайни ефекти върху функционалното състояние на мозъчния ен-
дотел и пропускливостта на кръвно-мозъчната бариера. В зависимост от
вида на повърхностната им модификация някои златни и Ag NPs могат да
преминат през кръвно-мозъчната бариера и да предизвикат невротоксич-
ни ефекти с увреждане на мозъка (Flora, 2017; Strużyńska, 2017).
Попадането на метални наночастици в клетките може да доведе до
различни ефекти, като оксидативен стрес, отделяне на различни цитокини
(често провъзпалителни), увреждане на липиди, протеини и ДНК (гено-
токсичност) и смърт на клетките (Jia et al., 2017). Установено е, че цитрат-
стабилизирани Au NPs (13 nm) катализират разпадането на различни S-
нитрозо адукти от кръвен серум с отделяне на азотен оксид (NO) (Jia et
al., 2009). Полученият NO може да реагира с реактивни кислородни видо-
ве (ROS) до получаване на други реактивни азотни видове (RNS), които
могат да увредят биологични молекули (липиди, протеини, ДНК) посред-
ством окислителни реакции, а отговорите на клетките на такива уврежда-
ния варират от промени в клетъчната сигнализация до клетъчна смърт
чрез некроза или апоптоза. Оксидативен стрес, предизвикан от Au NPs, е
установен при in vitro опити с фибробласти (Li et al., 2010), както и при in
275
vivo експерименти с плъхове (Lopez–Chaves et al., 2018). Предполага се, че

наблюдаваната автофагия при клетъчни нарушения в резултат от трети-
ране със Au NPs се явява защитна реакция срещу оксидативния стрес (Li
et al., 2010). Оксидативен стрес е установен и при третиране на клетки и
животни със Ag NPs, което се свързва с генотоксичност, установена при
някои експерименти (Rodriguez–Garraus et al., 2020).
Тестовете за in vitro цитотоксичност в кожни клетки (кератиноцити)
показват, че резултатите силно зависят от това, дали за теста се използва
монослойна (2D) или триизмерна (3D) клетъчна култура (Chen et al.,
2019). Сребърните наночастици проникват в много по-малка степен във
вътрешността на триизмерния клетъчен епидермален модел в сравнение с
монослойната култура и съответно се отчита много по-слаба цитотоксич-
ност. Цитотоксичността на сребърните наночастици (14 nm) при тези екс-
перименти е съпроводена с повишени нива на реактивни кислородни
видове (ROS), малондиалдехид (MDA), IL-1α, IL-6, и IL-8, както и зани-
жени нива на супероксид дисмутазата (SOD). При сравнителен анализ на
цитотоксичността и метаболитните ефекти на сребърни и Au NPs (с
еднакви размери, ~20 nm) върху кожни фибробласти е установено, че
сребърните частици са по-цитотоксични от златните при същите условия.
Тази разлика се свързва с различните метаболитни ефекти, които тези час-
тици предизвикват в клетките – при третиране със Au NPs е установено
повишаване на нивата на глутатион, което предполага включване на
защитен механизъм срещу оксидативен стрес, докато при третиране със
Ag NPs е установено повишаване на лимонената киселина и инхибиране
синтеза на малат. Предполага се, че инхибирането малатния синтез пони-
жава скоростта на цитратния цикъл и съответно намалява продукцията на
АТФ, като по този начин води до цитотоксичност (Huang Y et al., 2020).
Пероралното (p.o.) въвеждане на цитрат-стабилизирани златни части-
ци (13 nm) при дози >1,1 mg/kg води до значимо увреждане на гастро-
интестиналния тракт и намаляване на телесното тегло (забележимо след
4-тия ден на третиране) (Zhang X.D. et al., 2010). Много често слабо стаби-
лизираните (например с цитрат) златни частици агрегират при контакт с
биологични среди, което явление често се пренебрегва при интерпрета-
цията на резултатите от изследванията. След перорално приложение таки-
ва наночастици агрегират в храносмилателния тракт, особено в киселата
среда в стомаха, достигайки чревната лигавица под формата на агрегати.
Стабилизирани с PEG наночастици при тези условия са значително по-
стабилни от обвитите само с цитрат (Hinkley et al., 2015). Обвитите с цит-
рат, както и частиците модифицирани с РEG, преминават в много малка
степен през чревната лигавица (под 1% от приложената доза), като над
276
99% от частиците остават непроменени в лумена на храносмилателния

тракт, голяма част от които се отделят с фецеса, а друга част се задържа
известно време в червата. Малката част абсорбирани през червата нано-
частици се локализират предимно в черния дроб в първите 12 часа след
въвеждането им. Златните наночастици могат да преминат през чревната
лигавица чрез процес, означаван като „персорбция“, пасивно преминава-
не на мястото на умиращи ентероцити в тънкото черво (Hillyer and
Albrecht, 2001). Умирането и подновяването на ентероцити с нови клетки
е част от нормалната физиология на чревния епител. Броят на наночасти-
ците в областта на разрушаващите се ентероцити зависи силно от размера,
като по-малките частици (<10 nm) се намират в по-големи количества и
преминаването им през тази бариера е по-вероятно. Не е установено
включването на наночастици в ендозомни везикули. Също така при тези
експерименти не е установено преминаването на по-големи частици (>50
nm) през чревния епител и те са намерени само в чревния лумен. Следва
да се отбележи, че когато наночастиците се приемат през устата, има въз-
можност да бъдат обвити с протеинова корона и съответно стабилизирани
от протеини, намиращи се в слюнката (Hillyer and Albrecht, 2001). Адсорб-
цията на макромолекули от слюнка може да се избегне при директно
въвеждане в хранопровода или с гастрална сонда.
При перорално (р.о.) приложение на Ag NPs (<20 nm) повече от 99%
от приложената доза е открита във фецеса, което показва, че подобно на
Au NPs, много малка част от среброто се абсорбира през чревната лига-
вица (Van der Zande et al., 2012). Абсорбираното сребро е намерено в
почти всички вътрешни органи, най-много в черния дроб и далака и коли-
чеството му корелира с концентрацията на сребърни йони (Ag+) в изпол-
званите в експеримента формулировки. Това е индикация, че среброто се
абсорбира през чревната лигавица по-скоро под формата на йони, откол-
кото като наночастици. При тези експерименти е установено, че намере-
ното в органите сребро се елиминира след около 8 седмици, но не и сре-
брото, акумулирано в мозъка и тестисите. В друго изследване с перорално
приложен коларгол в плъхове е установено, че абсорбираното през чер-
вата сребро се локализира основно в черния дроб и бъбречния кортекс
(Jimenez–Lamana et al., 2014). Показано е, че в цитозола на бъбречните
клетки Ag(I) е в комплекс с металотионеин, докато в черния дроб повече-
то е свързано с високомолекулни (25–70 kDa) протеини. Тези резултати
показват присъствие на Ag(I) в тъкани и клетки, което е получено при
окисление на сребърните наночастици в биологичната среда и свързване-
то му в комплекси (Liu et al., 2012). Съобщава се, че перорален прием на
277
колоидно сребро (не само на разтворими сребърни съединения) в относи-

телно високи дози също може да доведе до системна аргирия (Wadhera and
Fung, 2005).
При интраперитонелано (i.p.) приложение на Au NPs в плъхове е уста-
новена локализация в различни органи в зависимост от размера на части-
ците (Lopez–Chaves et al., 2018): по-малките частици (10 nm) се локали-
зират най-вече в червата и по-малко в далака, черния дроб и бъбреците, а
по-големите (60 nm) предимно в далака. При тези проучвания е установе-
но, че наночастиците предизвикват оксидативен стрес в клетките, съпро-
воден с увреждания на липиди, протеини и ДНК, като тези eфекти са най-
силно изразени при най-малките тествани частици (10 nm). Обвити със
серумен албумин Ag NPs (2–3 nm), приложени i.p. в плъхове са открити в
далака, черния дроб, сърцето, бъбреците и в други органи през първите
24–96 часа; най-вече в черния дроб и по-малко в далака на 168-я час от
приложението (Garza–Ocaňas et al., 2010). Високи дози (300 mg/kg) Ag
NPs (60–80 nm), приложени i.p. в плъхове, повлияват морфологията на
сперматозоидите и намаляват виталитета на спермата (Fathi et al., 2019).
Чернодробна и бъбречна токсичност, както и левкоцитоза, са наблюдава-
ни при i.p. приложение на Ag NPs (20–60 nm) в много високи дози (2000
mg/kg) (Sarhan and Hussein, 2014).
При интравенозно (i.v.) приложение в множество експерименти е по-
казано, че по-голямата част от приложените наночастици (обикновено
>50%) относително бързо (в рамките на часове) се акумулира в черния
дроб и далака (De Jong et al., 2008; Sadauskas et al., 2009; Khlebtsov and
Dykman, 2011; Takeuchi et al., 2017; Yang L et al., 2017). Разпределението
на частиците в различните органи показва известна зависимост от размера
им, като по-малките (~10 nm) частици се разпределят в повече органи в
сравнение с по-големите, които се концентрират в голяма степен в черния
дроб и далака (De Jong, 2008). Особен проблем представлява изключител-
но бавното елиминиране и дълготрайно акумулиране на златните нано-
частици в клетките и органите. Например след i.v. инжектиране на Au NPs
(40 nm) в мишки повече от 60% от приложената доза е открита в черния
дроб един ден след приложението (Sadauskas et al., 2009). Попадайки ос-
новно в купферовите клетки, количеството на Au NPs в черния дроб като
цяло намалява само до 91% от началното им количество след период от 6
месеца. През този период броят на купферовите клетки, които съдържат
Au NPs, намалява, като частиците се концентрират в по-големи агрегати
в ендозомите на по-малък брой клетки. Акумулирането на Au NPs в
278
клетките се свързва с оксидативен стрес и съответно с потенциална кле-

тъчна и органна токсичност (Khlebtsov and Dykman, 2011; De Jong et al.,
2013; Yang L et al., 2017; Jia et al., 2017).
Интравенозното приложение на Ag NPs също води до акумулиране в
клетките, съответно в органите на ретикулоендотелната система – в
макрофагите на черния дроб, далака и други органи (Dziendzikowska et al.,
2012; Yang L et al., 2017; Xu et al., 2020). Клетъчната и органна токсичност
на Ag NPs се свързва с вътреклетъчното им акумулиране и оксидативен
стрес (De Jong et al., 2013; Ferdous and Nemmar, 2020; Xu et al., 2020).
Въпреки големия брой научни публикации за биоразпределението,
фармакокинетиката и токсичността на златни и сребърни наночастици,
все още няма ясен отговор на това какви са дългосрочните (>2 месеца)
ефекти на попадналите вътре в тялото метални наночастици. Множество
публикации показват акумулиране на инжекционно приложени наночас-
тици в черния дроб, далака и във фагоцитиращи клетки без значима
токсичност в относително краткотрайни проучвания (<1 месец). Важни са
въпросите за стабилността на металните частици в различни биологични
среди, в кръвния поток, във вътрешността на клетките, какви са дълго-
трайните им ефекти върху кръвоносните съдове и ендотела. Основна при-
чина за някои противоречиви резултати в различни доклади и за трудност-
та при намиране на ясни отговори е липсата на стандартизирани моделни
системи, стандартни условия на тестване и стандартни наночастичкови
образци, спрямо които да се сравняват резултатите от различни опити.
Повечето от публикуваните данни са от експерименти, които са проведе-
ни с различни наночастици (с различни физикохимични характеристики),
в различни in vitro или in vivo моделни системи, при различни условия,
което силно затруднява извеждането на обобщени изводи и сравнението
на едни резултати с други.
РЕЗЮМЕ
Оптични свойства. Металните наночастици се характеризират с абсорбция на свет-
лина от видимия спектър, в резултат на което дисперсиите им са оцветени в различни
цветове в зависимост от вида на метала, размера, формата на частиците и диелек-
тричната константа на средата. Според съвременните разбирания тези оптични
свойства могат да бъдат обяснени чрез взаимодействието между светлината (разглеж-
дана като електромагнитната вълна) и проводящите електрони от повърхността на
металните наночастици. При съвпадане на честотата на светлината с определени
честоти, характерни за съответните наночастици, настъпва резонанс (повърхностен
279
плазмонен резонанс), съответстващ на максимум в абсорбционния спектър. Диспер-

сиите на златни наносфери обикновено са червено оцветени, докато тези на сребърни
наночастици – в жълто до тъмно кафяво. Металните наночастици силно разсейват
светлината и могат да бъдат лесно наблюдавани (като точкови светлинни източници)
с ултрамикроскоп.
Методи за получаване. Метални наночастици могат да бъдат получени чрез редук-
ция на метални соли (обикновено в присъствие на подходящи колоидни стабилиза-
тори) с различни редуктори - алдехиди, натриев цитрат, натриев борхидрид и други.
Използват се и физични методи, като класическото електрическо разпрашаване по
Бредиг или по-съвременният метод на лазерно разпрашаване. Известни са и биосин-
тетични методи, при които в качеството на редуктори и стабилизатори се използват
растителни извлеци, продукти от микроорганизми и други.
Функционализиране и биоконюгация. За функционализирането на златни частици
почти изключително се използват вещества, съдържащи тиолова група (–SH), чрез
които се осъществява свързването на частицата с биомолекули. За диагностични
приложения най-често златните частици биват конюгирани с антитела, което може да
се осъществи чрез адсорбция на антитялото, но по-често се прилага ковалентно свър-
зване чрез карбодиимидна или клик-реакции.
Приложения в диагностиката. Златните наночастици се използвт от десетилетия
като маркери на антитела в биологичните изследвания с трансмисионен електронен
микроскоп. Благодарение на големия екстинкционен коефициент, златните наночас-
тици се използват широко като маркери на антитела в диагностични имунохромато-
графски тестове за откриване на антигени или антитела. Силното светоразсейване,
което е характерно за златните и сребърни наночастици, ги прави подходящи маркери
за антитела, видими с тъмнополев микроскоп. Характерното изменение в цвета на
дисперсията (от червен в син) при агрегация на златни наносфери се използва за
аналитично-диагностични цели в геномиката, имунологията и други сфери.
Приложения в терапията. Известни са разработки по няколко различни потен-
циални терапевтични приложения на златните наночастици, като фототермична тера-
пия (при която лазерна светлина се трансформира в топлина) и използването им като
носители на ДНК, лекарства и ваксини. Известно е и имуномодулаторно действие на
златните наночастици. Известни са класически антибактериални сребърни препарати
(например коларгол), съдържащи сребърни наночастици.
Фармакологични аспекти. Наночастиците от злато и сребро могат да проникват в
различни клетки (епителни, ендотелни, макрофаги и други) чрез ендоцитоза, като се
акумулират предимно във фагоцитиращите клетки на далака и черния дроб след ин-
жекционно приложение. Златните частици са бавно разградими и остават включени
в ендозомите на клетките в продължение на месеци. Сребърните наночастици са по-
лесно окисляеми и разградими, но често и по-токсични от златните. Механизмите на
цитотоксичност се свързват с оксидативен стрес и могат да засегнат различни клетки,
органи и системи в зависимост от вида, дозата и начина на приложение на частиците.
280
Глава 9
МАГНИТНИ НАНОЧАСТИЦИ
Видове магнитни наночастици. Магнитни свойства (суперпарамагнетизъм).

Методи за получаване (утаечни, методи с термично разпадане, пиролизни,
хидротермални, микроемулсионни, сонохимични, зол-гелни методи, био-
синтези). Модификация и биоконюгация. Биомедицински приложения (кон-
трастни агенти за MRI, изобразяване с магнитни наночастици, магнитна
биосепарация, приложения в геномиката, имунодиагностика, имобилизира-
не на ензими, магнитна хипертермия, доставяне на лекарства и ДНК, трети-
ране на желязодефицитна анемия, имуномодулаторна активност. Фармако-
логични аспекти.
1. ВИДОВЕ МАГНИТНИ НАНОЧАСТИЦИ
Магнитните наночастици могат да бъдат класифицирани според със-

тава на: изградени от преходни или редкоземни метали (Fe, Co, Ni, Gd, и
др.), метални сплави (Fe-Co, Fe-Ni, Fe-Ni-Mn, Fe-Pt, и др.) и метални
оксиди (γ-Fe2O3, Fe3O4= FeO.Fe2O3, CoO.Fe2O3, MgO.Fe2O3, MnO.Fe2O3 и
др.) Измежду всички оксиди на желязото, само два имат феримагнитни
свойства – магхемит (γ-Fe2O3) и магнетит (Fe3O4). Желязото е необходим
за живота елемент и желязо-оксидните наночастици имат най-голям по-
тенциал за биомедицински (включително in vivo) приложения, поради
което тези частици ще бъдат разгледани в тази глава.
2. МАГНИТНИ СВОЙСТВА
Всеки материал проявява отговор по отношение на приложено външно

магнитно поле, като въз основа на този отговор материалите биват: i)
парамагнитни, ii) диамагнитни, iii) феромагнитни, iv) феримагнитни, v)
281
Глава 9. Магнитни наночастици
антиферомагнитни. Парамагнитните и диамагнитните материали биват

много слабо привлечени или съответно отблъснати от външно магнитно
поле. Величината магнитна възприемчивост често се използва за опреде-
ляне на категорията, в която попадат материалите според магнитните им
свойства. Магнитната възприемчивост характеризира степента на намаг-
нитване на материалите под действието на магнитно поле, означава се с
χm (понякога като χv) и е безразмерна величина. При диамагнитните
материали χm има отрицателна стойност и не зависи от температурата, до-
като при парамагнитните материали χm е положителна и намалява с уве-
личаване на температурата. При диамагнитните и парамагнитните мате-
риали χm при стайна температура често е <10−4 и поради тази причина
пара- и диамагнитните материали често биват наричани немагнитни пора-
ди практическата липса на постоянна магнетизация в отсъствие на външ-
но магнитно поле. За феро-, фери- и антиферомагнитните материали χm
има в порядъци по-голяма стойност, достигайки до 106.
Магнетизмът произхожда основно от спина на електроните в атомите.
Спинът на електроните е квантово-механична характеристика, която е в
основата на магнитния момент на електрона. При парамагнитните мате-
риали несдвоените спинове в атомите и йоните се ориентират паралелно
на приложеното външно магнитно поле. При феромагнитните материали
обаче се наблюдава допълнително спонтанно ориентиране на магнитните
моменти, което води до спонтанна магнетизация дори при отсъствие на
външно магнитно поле.
При феромагнитните материали всички магнитни моменти са еднопо-
сочни, което води до спонтанна магнетизация на материала (фиг. 9.1). При
феримагнитните материали част от магнитните моменти са противопо-
ложно ориентирани, но са с по-малък принос и материалите също се ха-
рактеризират със спонтанна магнетизация. При антиферомагнитните ма-
териали всички моменти се компенсират напълно поради ориентацията
им и тези материали нямат спонтанна магнетизация.
Даден образец от феромагнитен материал би следвало да има силно
магнитно поле, тъй като магнитните моменти са паралелно ориентирани,
но някои феромагнитни материали, като например желязо и други, често
са в немагнетизирано състояние. Причината за това е, че обемният (макро-
скопичен) феромагнитен материал се състои от малки региони, наречени
магнитни домени. В рамките на всеки домен спиновете са подредени, но
ако материалът като цяло е ненамагнетизиран, това е в резултат на хаотич-
но ориентираните спинове на отделните домени и сумарно нулиране на
магнитното поле.
282
a б в
Фиг. 9.1. Схематично представяне на ориентацията на магнитните моменти в някои

магнитни материали: а) феромагнитни; б) антиферомагнитни; в) феримагнитни
При намаляване размера на частицата от мултидоменна структура час-

тицата става съизмерима с размера на магнитните домени и по същество
става еднодоменна. В достатъчно малки наночастици (50–100 nm) магне-
тизацията може произволно да обръща посоката си под влияние на темпе-
ратурата. Времето между две обръщания се нарича време за релаксация
на Неел (Néel). Ако времето за измерване на магнетизацията е повече от
времето за релаксация, измерената магнетизация е нула и се означава като
суперпарамагнитно състояние. Във външно магнитно поле суперпара-
магнитните наночастици се намагнитват, но са с много по-голяма магнит-
на възприемчивост от тази на парамагнитните вещества. Когато наночас-
тиците са изградени от феримагнитни железни оксиди, такива частици в
литературата се означават като SPIONs (SuperParamagnetic Iron Oxide
Nanoparticles). Общ вид на кривата на магнетизация при суперпарамаг-
нитни наночастици е показана на фиг. 9.2.
Частен случай на магнетизъм се наблюдава в случаите, при които су-
перпарамагнитни наночастици образуват по-големи клъстери. В отсъс-
твие на външно магнитно поле, клъстерите проявяват суперпарамагнитни
свойства без остатъчна магнетизация, но при експозиция на външно маг-
нитно поле, в зависимост от силата на взаимодействие на частиците от
клъстера, възниква колективен магнетизъм и клъстерите проявяват фери-
магнитен характер с измерим хистерезис, наричан суперферимагнетизъм
(Dutz, 2016).
Повърхностната модификация на наночастиците може да окаже значи-
телен ефект върху магнитните им свойства, като например да доведе до
намаляване на магнетизацията. От практическа гледна точка следва да се
следят измененията в магнитните свойства на всеки етап от модификация-
та им при разработка на магнитни наночастици за биомедицината. Неви-
наги има ясна корелация между повърхностната модификация и ефектите
върху магнитните свойства (Lu et al., 2007).
283
Фиг. 9.2. Общ вид на крива на магнетизация при суперпарамагнитни наночастици (H –

сила на външното магнитно поле; М – магнетизация на наночастиците)
3. МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ
3.1. Утаечни методи
Утаечните методи са класическите, най-старите и често използвани

методи за получаване на магнетитни (Fe3O4) наночастици. За тази цел се
приготвя смесен воден разтвор, съдържащ соли на Fe(II) и Fe(III), от който
чрез съутаяване с основа (например амоняк) се получава магнетит в инерт-
на атмосфера при стайна или по-висока температура:
Fe2+ + 2Fe3++ 8OH– → Fe(OH)2 + 2Fe(OH)3 → Fe3O4 + 4H2O
Този метод е докладван през 1980 г. (Khalafalla and Reimers, 1980;

Massart, 1980) и понякога се нарича метод на Масарт (Massart’s method).
Поради простото му изпълнение и възможността да се получават големи
количества наночастици, методът в различни варианти често се прилага
за получаване на магнетитни наночастици за биомедицината. Пълното
утаяване протича при рН между 8 и 14, а разпределението по размери и
морфологията на получените наночастици зависят от природата (хлори-
ди, сулфати, нитрати, и др.) и концентрациите на използваните железни
соли, рН, температурата, йонната сила на средата, скоростите на разбър-
кване и на прибавяне на алкалния разтвор (Wu et al. 2008). В повечето
случаи съутаяването се провежда при температури >60 °C, тъй като при
по-ниски температури се утаява основно ферихидроксид. Ако не се рабо-
284
ти в отсъствие на кислород, трябва да се използва излишък от Fe(II) спря-

мо стехиометричното съотношение Fe(III)/Fe(II) 2:1 (например 1,5:1), тъй
като в хода на процеса част от Fe(II) се окислява до Fe(III). Ако се използ-
ва стехиометричното съотношение 2:1, в резултат на окисление ще се по-
лучи излишък от Fe(III), който влошава качествата на наночастиците.
Главното предимство на метода е възможността за получаване на големи
количества наночастици, поради което се използва и като основен индус-
триален метод за получаване на килограмови количества наночастици от
железни оксиди. Сериозно ограничение обаче се явява широкото разпре-
деление по размери на получените частици, както и трудният контрол
върху формата и кристалността им. Широкото разпределение по размери
се явява резултат на едновременното протичане на фазите на зародишо-
образуване и на растеж на частиците, което понякога налага допълнител-
но разделяне на получените частици по размери. Този проблем в известна
степен може да бъде решен чрез използване на колоидни стабилизатори
(поливинилов алкохол, натриев цитрат и др.) (Wu et al., 2008).
3.2. Термично разпадане
Тези синтези се провеждат при висока температура с термично разпа-

дане на прекурсора, което само по себе си или в комбинация с други
реакции води до получаване на целевия продукт. Високотемпературното
разпадане на прекурсори като Fe(cup)3 (cup = N-нитрозофенилхидроксил-
амин), Fe(acac)3 (acac = ацетилацетонат), или Fe(CO)5 и последващо кон-
тролирано окисление води до получаване на монодисперсни наночастици
от γ-Fe2O3, но при прецизно контролиране на окислението могат да се
получат и висококачествени наночастици от магнетит (Wu et al., 2008).
Монодисперсни наночастици от Fe3O4 са получени успешно чрез високо-
температурно разпадане на Fe(acac)3 в среда от фенилов етер, 1,2-хексаде-
кандиол, олеинова киселина и олеиламин (Sun and Zeng, 2002).
3.3. Пиролизни методи
Пиролизните методи се основават на високотемпературно разпадане

на прекурсора, което обаче се провежда в присъствие на кислород и орга-
ничният компонент изгаря, поради което тези методи са приложими за
получаване на магхемит (γ-Fe2O3). При варианта спрей-пиролиза се при-
готвя разтвор на прекурсора, който се разпръсква под формата на аерозол
при висока температура в подходящ реактор (Gonzalez–Carreno et al.,
1993). При лазерната пиролиза газообразни прекурсори се облъчват с
285
лазер (CO2), който инициира и поддържа химичната реакция. По този

метод могат да се получат наночастици от магхемит чрез пиролиза на
Fe(CO)5 (Veintemillas–Verdaguer et al., 2004).
3.4. Хидротермални методи
Хидротермалните реакции се провеждат във водна среда в автоклави

или подобни на тях реактори за работа под високо налягане и темпера-
тура. При тези условия водата участва в реакциите, хидролизата е уско-
рена от високата температура, разтворимостта на прекурсорите е по-висо-
ка и като цяло се ускорява образуването на оксидни наночастици с висока
кристалност. Прекурсорите се смесват във водна среда подобно на съ-
утаителния метод и след това се поставят в автоклав за няколко часа при
температури около 150–200 °C. В други случаи се използва само Fe(II) сол
и окислители, които частично окисляват Fe(II) до Fe(III) с последващо
образуване на магнетит. Например магнетитни Fe3O4 наночастици с висо-
ка кристалност са получени след утаяване на Fe(OH)2 в присъствие на
хидразин (диамин) хидрат в автоклав (Wang et al., 2003). При тази реакция
във водна среда хидразинът се проявява като окислител и се редуцира до
амоняк. Основният проблем при тези методи е дългото реакционно време,
което в някои случаи може да се съкрати, а кристалността на частиците да
се повиши чрез комбинация с микровълново нагряване (Komarneni and
Katsuki, 2002).
3.5. Микроемулсионен метод
Синтезът на магнитни наночастици в мицели, които осигуряват огра-

ничена среда за растеж на наночастици, не е принципно по-различен от
микроемулсионния синтез на полупроводникови наночастици (вж. Гл. 7,
§3.3). Например съутаяването по Масарт (Massart) може да се проведе,
като отделните изходни разтвори се приготвят под формата на микро-
емулсии преди смесването (Chin and Yaacob, 2007). Частиците, получени
чрез този микроемулсионен метод, имат почти същия размер, но са с по-
голяма магнетизация.
3.6. Сонохимични методи
Ефектът на ултразвука върху химичните реакции произлиза от кави-

тацията, тоест от образуването, нарастването и имплозията на мехурчета
286
в течна среда, в които локално се изменят рязко налягането и температу-

рата. Магнетитни наночастици с размери около 10 nm са били получени
сонохимично при обработка с ултразвук на воден разтвор на Fe(II) ацетат
под аргонова атмосфера (Vijayakumar et al., 2000). В този случай се пред-
полага, че под действие на ултразвука протича хомолитично разкъсване
на връзки във водната молекула и образуване на водороден пероксид от
рекомбинацията на получените хидроксилни радикали, който се явява
окислител и частично окислява Fe(II) до Fe(III), необходим за получаване
на магнетита. Изследван е и ефектът на ултразвук по време на съутаяване
на магнетит от смесен разтвор на Fe(II) и Fe(III) с амоняк и е установено,
че прилагането на ултразвук води до получаване на наночастици с по-
голяма кристалност и магнетизация (Kim et al., 2005).
3.7. Зол-гелни методи
Зол-гелните методи са подходящи за получаване на различни нано-

размерни метални оксиди. Основават се на хидролиза и кондензация на
молекулни прекурсори в разтвор, при което се получава зол от нанораз-
мерни частици. Допълнителни кондензационни процеси водят до полу-
чаване на триизмерна мрежа от частици, съответстваща на състоянието
гел. За получаване на кристално състояние обикновено е необходимо
допълнително нагряване. Магнетитни наночастици успешно са били по-
лучени чрез зол-гелен метод в комбинация с нагряване и използване на
Fe(III) нитрат и етиленгликол при температури 200–400 °C, при което е
установено, че температурата оказва ефект върху размера на получаващи-
те се частици (Xu et al., 2007).
Най-добре известни са примерите за биосинтез на магнетитни нано-

частици от магнетотактичните бактерии, които обитават седиментите на
водни басейни (Magnetospirillum gryphiswaldense, Magnetospirillum mag-
netotacticum, Magnetobacterium bavaricum). Тези бактерии притежават
специализирани органели, наречени магнетозоми, в които се образуват
нанокристали от магнетит чрез осигуряване на необходимите за тази цел
условия – контрол върху концентрацията на железни йони, рН и редокси-
потенциала. Магнетитните частици се подреждат във верига, образувайки
нишки, чрез които бактерията се ориентира под действието на земното
магнитно поле подобно на стрелка на компас (Faivre and Schüler, 2008). За
биосинтез на магнетитни наночастици се използват различни Fe(III)-
287
редуциращи бактерии след оптимизация на условията (температура, рН,

концентрация на прекурсора и време на инкубация) (Kim and Roh, 2018).
Докладвани са и различни биосинтези на магнетитни наночастици с
използване на растителни тъкани, екстракти и други растителни суровини
(Iravani, 2019). Наночастиците, получени чрез биосинтези с участие на
бактерии, обикновено не намират in vivo приложения в биомедицината,
тъй като са обвити с бактериални протеини (които са причина за имунен
отговор от страна на организма).
Функционализирането на магнитните наночастици се осъществява

чрез повърхностна модификация с различни нискомолекулни органични
вещества, органични полимери, неорганични обвивки (силициев диоксид,
метали, други оксиди). Тези вещества стабилизират частиците във водни
среди, повишават биосъвместимостта им и предоставят различни функ-
ционални групи, чрез които частиците могат да се свържат с антитела и
различни лиганди за нуждите на биомедицината.
Един от вариантите за повърхностна модификация с органични веще-
ства (както нискомолекулни, така и полимери) е те да бъдат прибавени
директно в реакционната среда по време на получаване на частиците.
Например така е осъществена модификация с аминокиселини, лимонена
киселина (цитрат), циклодекстрин и др. (Wu et al., 2008). Нискомолекул-
ните вещества обаче не придават достатъчно добра колоидна стабилност
на частиците и при изменения в рН или температурата често се образуват
агрегати. По същия начин чрез прибавяне на полимери към реакционната
среда са получени и магнитни наночастици, модифицирани с полимери.
Например декстран-модифицирани частици са получени чрез добавяне на
декстран (или негови производни) при получаването на магнетитни нано-
частици чрез съутаяване (Berry et al., 2003; Mouaziz et al., 2009).
Лигандният обмен е добре известен подход за функционализиране на
наночастици, при който се добавя излишък от лиганд към дисперсията на
наночастици и добавеният лиганд замества този, който първоначално е
свързан с повърхността на частиците. Например олеиновата киселина,
която често се използва като стабилизиращ лиганд при синтеза на магне-
титни наночастици, може да бъде заменена с хидрофилни лиганди, носе-
щи хидроксилни или карбоксилни групи (Lattuada and Hatton, 2007).
За модификация на магнитните наночастици са използвани различни
полимери: природни (декстран, скорбяла, казеин, албумин, желатин, алгинат,
288
хитозан) и синтетични (полиетиленгликол, поливинилпиролидон, поли-

(млечна-съ-гликолова киселина), поли(винилов алкохол) и др.). Сред тях
особен интерес представляват PEG и различни PEGилирани полимери
(PEG-модифицирана скорбяла), както и декстран, респ. модифицирани
декстрани (карбоксиметилиран, амино-декстран) (Datfar et al., 2019). Най-
проучени са наночастици, модифицирани с декстрани и техни производни
във връзка с потенциала за приложения в магнитно-резонансната диагнос-
тика (MRI) (Tassa et al., 2011).
Модификацията на повърхността на оксидни (вкл. магнетитни) нано-
частици може да се реализира и чрез силани, които след хидролиза обра-
зуват силанолни хидроксилни групи, кондензиращи с хидроксилните гру-
пи от повърхността на частиците (Campo et al., 2005). Например за тази
цел често се ползва (3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS), при кое-
то се получават частици с амино групи (фиг. 9.3). Чрез диалдехидни лин-
кери (например глутаров алдехид) такива наночастици могат да се свър-
жат с други молекули, съдържащи амино групи (протеини, амино-функ-
ционализирани олигонуклеотиди и др.) (Can et al., 2009).
Фиг. 9.3. Схематично представяне на модифицирането на повърхността на оксидна нано-

частица (NP) с (3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS)
В допълнение към стандартно използваните синтетични и биополи-

мери, внимание се отделя и на полимери, които променят свойствата си
(например промяна в степента на набъбване) при промяна в някои пара-
метри на средата, като температура, рН, йонна сила, редоксипотенциал и
др. Сред тези стимули най-изучавани са възможностите за модификации
с полимери, отговарящи на промени в рН и температурата (Medeiros et al.,
2011). Примери за полимери, отговарящи на промени в рН, са например
289
поли(акрилова киселина) и поли[2-(диизопропиламино)етилметакрилат], а

полимери, които отговарят на промени в температурата, са поли(N-изопропил-
акриламид) и поли(N-винилкапролактам). Проблемът с биоразградимостта на
част от тези полимери все още не е решен.
Функционализирани с амино групи магнитни наночастици най-често
се използват в различни биомедицински експерименти. Освен чрез горе-
описания начин за модификация с APTMS, такива частици могат да бъдат
получени и чрез модификация с амино-декстран. За тази цел има две въз-
можности: i) директен подход, чрез модификация на частиците с амино
производно на декстрана (Mouaziz et al., 2009), и ii) чрез аминиране на
частици, които са модифицирани с омрежен (чрез епихлорохидрин) декс-
тран (така наречените наночастици от тип CLIO – cros-linked iron oxide)
(Wunderbaldinger et al., 2002). Омрежването на декстрана, обвиващ нано-
частиците, с епихлорохидрин и получаването на CLIO наночастици се
реализира чрез реакции, подобни на тези при получаване на епоксидните
смоли – взаимодействие на хидросилните групи от декстрана с оксирано-
вия пръстен на епихлорохидрина. При такова омрежване могат да взаимо-
действат различни хидроксилни групи от гликозидните остатъци в една
или различни декстранови молекули, като една от възможностите е
илюстрирана на фиг. 9.4.
Фиг. 9.4. Омрежване на декстранови молекули чрез епихлорохидрин
При взаимодействие на този омрежен декстран с амоняк се въвеждат

амино групи в молекулата, а при взаимодействие с хлороцетна киселина
се получава карбоксиметилиран декстран с карбоксилни функционални
290
групи (фиг. 9.5). Аминодекстран за модификация на магнитни наночасти-

ци може да се синтезира и чрез окисление на декстран до диалдехидно
производно с калиев перйодат, последваща кондензация с хексаметилен-
диамин и редукция на полученото дииминово производно с натриев бор-
хидрид (фиг. 9.6). Такъв амино-декстран се използва като стабилизатор
при получаването на магнетитни наночастици чрез съутаяване от разтвор
на феро- и ферихлорид с амоняк (Mouaziz et al., 2009).
Фиг. 9.5. Аминиране и карбоксиметилиране на декстрановата обвивка на наночастици
Амино групите от повърхността на наночастиците могат да реагират с

циклични киселинни анхидриди (например янтарен анхидрид), при което
се получават частици с карбоксилни групи по повърхността си (McCarthy
and Weissleder, 2008) или да бъдат използвани в различни реакции на ко-
нюгиране с други молекули за целите на дадено биомедицинско приложе-
ние (Tassa et al., 2011). Някои реакции за биоконюгация на такива частици
са илюстрирани на фиг. 9.7. Важни са реакциите с различни N-сукцин-
имидилови естери, при което се получават различни производни в зависи-
мост от вида на естера. Например реакция с N-сукцинимидил-3-(2-пири-
дилдитио)пропионат (SPDP) дава възможност за конюгация с тиол-съдър-
жащи вещества (Tassa et al., 2011), а реакция с N-сукцинимидил-4-пен-
тиноат за получаване на наночастици за последващо участие в клик-реак-
ции с азидни производни (Nahrendorf et al., 2010). Наночастици с карбок-
силни групи също могат да се използват в клик-реакции, като за целта
биват конюгирани с подходящи амино-алкини или амино-азиди (Tassa et
al., 2011). Някои от възможностите за използване на магнитни наночас-
тици в клик-реакции са обобщени на фиг. 9.8.
291
Фиг. 9.6. Синтез на амино-декстран за функционализиране на наночастици
Фиг. 9.7. Реакции на конюгиране на различни молекули и наночастици с амино групи
292
Фиг. 9.8. Възможности за модифициране на наночастици за използване в клик-реакции
5.1. Контрастни агенти за MRI
Магнитно-резонансната томография (magnetic resonance imaging, MRI)
е метод за образна диагностика на базата на ядрения магнитен резонанс
(ЯМР). Методът се основава на магнитните свойства на атомните ядра на
водорода (протони) и дава като резултат пространственото разпределение
на тези ядра в изследвания обект. Магнитните моменти на протоните в
отсъствие на външно магнитно поле са хаотично ориентирани. Когато
протоните се поставят в силно статично магнитно поле (Н0), протоните в
основно енергетично състояние се ориентират според посоката на Н0, а
тези в по-високо енергетично състояние се ориентират в противоположна
посока. За целта се използват силни магнити, осигуряващи хомогенно
магнитно поле (~1,5 T). При прилагане на второ магнитно поле (Н1, про-
менливо, в радиочестотния спектър, чиято честота се определя от изслед-
вания химичен елемент и Н0), което е перпендикулярно на Н0, магнитните
моменти на протоните се преориентират (т.нар. индуцирана поляриза-
ция), при което се поглъща енергия. При изключване на радиочестотния
импулс моментите на протоните отново се ориентират спрямо Н0 чрез
процеси, означавани като релаксации, които се характеризират с релакса-
ционни времена Т, при което се излъчва радиочестотна енергия, улавяна
от сензорите на скенера (фиг. 9.9). От значение са следните независими
една от друга релаксации:
i) спин-решетъчна (longitudal, надлъжна, по посоката на Н0, при коя-
то енергията се отдава на околната среда) с време Т1;
293
ii) спин-спинова (transversal, напречна на Н0, при която енергията се

отдава на съседни спинове) с време Т2.
Релаксационните времена Т са равни на половината от времето, необ-
ходимо за възстановяване на равновесието. Времето на релаксация зависи
от средата и природата на молекулите. Ориентацията на протони в маг-
нитното поле може да се контролира чрез добавяне на допълнителни маг-
нитни полета (от въртящи се бобини, създаващи градиент на магнитното
поле), при което се получава информация за пространственото разполо-
жение на протоните, респ. томографското изображение. При получаване-
то на томографското изображение се прилагат импулсни последовател-
ности, които са компютърни програми, контролиращи високочестотния
импулс (Н1) и формите на магнитния градиент, които определят как се
появява изображението и изгледа на различните тъкани. Изображенията
биват T1-претеглени, T2-претеглени или претеглени по плътността на про-
тона. За повече подробности по физиката, на която се осоновава метода –
вж. Brown and Semelka, 2003.
Фиг. 9.9. Опростена илюстрация на принципа на ЯМР: а) В силно постоянно магнитно

поле Н0 протоните прецесират около ос, която е паралелна на магнитното поле; б) При
прилагане на радиочестотно поле (Н1) с честота, която съвпада с резонансната честота на
протона (определена от ларморовото уравнение) и перпендикулярно на полето Н0, нетният
магнитен момент на протоните по оста „z“ (паралелна на Н0; надлъжна магнетизация)
става нула (в резултат на обръщане на спина на част от протоните) и е налице само напреч-
на магнетизация, която е резултат от синхронизация на прецесията на протоните; в) След
прекратяване на радиочестотното поле Н1, прецесията на протоните се десинхронизира
(Т2-релаксация), напречната магнетизация изчезва, а протоните от високоенергетично
спиново състояние се връщат в основно състояние с излъчване на енергия (RF). При това
надлъжната магнетизация от нула започва да нараства до достигане на равновесната си
стойност (Т1-релаксация). Т1- и Т2-релаксациите протичат паралелно и независимо, като в
повечето случаи (но не по принцип) Т1>T2
Взаимодействие между магнитния момент на протоните и магнитните

полета на несдвоени електрони (от радикали, йони на преходни метали и
294
др.) може да доведе до по-ефективна релаксация, респективно намаляване

времената на релаксация. Като контрастни агенти при ЯМР томографията
се използват широко хелати на Gd(III). Гадолиниевият йон притежава
седем несдвоени електрона (максималният брой несдвоени електронни
спинове, които са възможни да притежава един атом/йон). Гадолиниевите
комплекси значимо намаляват T1, при което областите с локализация на
тези контрастни агенти изглеждат ярки в T1-претеглените изображения.
Суперпарамагнитните наночастици (SPIONs) също взаимодействат с
магнитния момент на протоните и могат да се прилагат като контрастни
агенти в ЯМР томографията, при което значимо намаляват релаксацион-
ното време Т2 и водят до появвяване на по-тъмни области в Т2-претегле-
ните изображения. SPIONs с размери на магнетитното ядро <4 nm (озна-
чавани като „ultrasmall superparamagnetic iron oxide“, USPIO наночастици;
хидродинамичният диаметър на такива частици е около 20–30 nm) могат
да намалят Т1 времената на релаксация и съответно да бъдат локализира-
ни на T1-претеглените изображения (Dadfar et al., 2019).
Като почти всички наночастици инжектираните венозно SPIONs се
поглъщат от фагоцитите, в т.ч. макрофагите в черния дроб, далака, лимф-
ните възли, костния мозък (общо означавани като мононуклеарна фаго-
цитна система, MPS) и локализацията им в тези части на тялото може да
се използва за контрастирането им при ЯМР томография (Reimer and
Balzer, 2003). Например туморните формации обикновено се характери-
зират с по-малка степен на поглъщане на SPIONs от макрофаги в сравнение
с нормалната чернодробна тъкан (поради по-малкото количество макро-
фаги в неопластичната тъкан). За тази цел особено подходящи се явяват
наночастиците с хидродинамичен диаметър 50–150 nm, тъй като бързо и
в голяма степен се акумулират в макрофагите. Почти всички лицензирани
за клинина употреба SPIONs препарати (предимно наночастици с обвивка
на декстранова основа) са изтеглени от употреба по различни причини.
Някои нискомолекулни гадолиниеви комплекси показват по-малка степен
на задържане в организма в сравнение с наночастиците и по-кратко време
за i.v. въвеждане (Thian et al., 2013). Магнетитни нанопрепарати са пред-
ложени и за орално приложение като контрастни агенти при MRI изслед-
вания на гастроинтестиналния тракт (Achiam et al., 2009).
Магнетитни наночастици с хидродинамичен диаметър от порядъка на
20–30 nm се означават в литературата като USPIONs (ultra-small superpara-
magnetic iron oxide nanoparticles) (Engberink et al., 2007; Neuwelt et al.,
2009). Когато такива наночастици се инжектират венозно, циркулират в
кръвообращението относително по-дълго време (за разлика от по-голе-
мите частици, които по-бързо попадат в макрофагите), откъдето попадат
295
частично в тъканите и от там – в макрофагите на дрениращите ги лимфни

възли. Нормалните лимфни възли, в които потокът на лимфата не е нару-
шен и в които има функциониращи макрофаги се характеризират с намаля-
ване на сигнала в Т2-претеглените изображения при прилагане на USPIONs
(нормалните лимфни възли изглеждат тъмни на изображенията). Лимф-
ните възли, които са засегнати от метастази, не задържат наночастици в
голяма степен поради по-малкото количество макрофаги и понижената им
функционалност и не изглеждат тъмни в Т2-претеглените изображения
(необходими са около 24–36 часа за акумулиране на наночастиците в нор-
мални лимфните възли).
5.2. Изобразяване с магнитни наночастици (MPI)
Изобразяването с магнитни наночастици (Magnetic Particle Imaing, MPI)

е относително нова томографска техника, която директно детектира су-
перпарамагнитни наночастици, за разлика от ЯМР томографията, при
която се установява изменението в Т2-релаксацията на протоните под
влияние на наночастиците. При MPI се използват два вида магнитни поле-
та – статично (‘selection field’, SF) и променливо (‘drive field’, DF). Ста-
тичното поле се получава чрез комбинация от постоянни магнити и елек-
тромагнити, при което в изследвания обект се получава една точка в
пространството, в която това поле се нулира (field-free point, FFP), докато
във всички останали точки статичното поле не е нула. В областта на FFP
ориентацията на магнитния момент на наночастиците може да се повлияе
от приложено променливо поле DF, докато във всички останали точки
магнитният момент на частиците е ориентиран спрямо статичното поле
SF. Реориентацията на магнитните моменти на частиците, намиращи се в
или около FFP, индуцира сигнал в приемната бобина, който е пропорцио-
нален на концентрацията на наночастици в тази област. Чрез преминаване
на FFP в растер през обема (сканиране) на изследвания обект се събират
данни за пространственото разположение и относителна концентрация на
наночастиците в него (Weizenecker et al., 2009). Тъй като в живите обекти
обикновено липсват естествени суперпарамагнитни наночастици, сигнал
се получава само от тези, които са въведени в обекта (няма фонов сигнал).
Липсата на фонов сигнал е предимство, но в известна степен и недостатък,
който налага използването на MPI в комбинация с други методи за образ-
на диагностика (CT или MRI), данните от които се наслагват върху изо-
бражението от MPI с цел установяване на анатомичната област с локали-
зирани наночастици.
296
5.3. Магнитна биосепарация
Магнитните свойства на SPIONs частиците ги правят подходящи за

приложение в т.нар. магнитно активирано клетъчно сортиране (MACS,
magnetic activated cell sorting), при което се изолират определени клетки
от биологични клетъчни суспензии. При този метод магнитните наночас-
тистици се конюгират с антитела, които свързват определени антигени от
клетъчната мембрана на целевите клетки (Miltenyi et al., 1990). При при-
лагане на магнитно поле, целевите клетки (свързани с наночастиците чрез
антителата) биват разделени от всички други (несвързани) клетки (фиг.
9.10). При положителна селекция се изолират клетките, експресиращи
целевия антиген – това са клетките, които се задържат в магнитната коло-
на и след премахването на магнитното поле биват елуирани в отделен съд.
По този начин могат да се изолират определен тип клетки от смес с други
клетки. При отрицателна селекция се използват магнитни частици, моди-
фицирани с антитяло, което се свързва с клетъчни рецептори върху по-
върхността на клетки, които не са от интерес. При разделянето в колоната
се задържат клетките, които са нежелани, а се елуират желаните, не-
маркирани с наночастици клетки. Разделянето най-често се осъществява
в пласмасова колона, запълнена с матрица от феромагнитен материал (на-
пример стоманени влакна или сфери, покрити с полимерен лак, предпаз-
ващ от корозия и от директен контакт с клетки). Разстоянието между ком-
понентите на матрицата в колоната е достатъчно голямо (~200 µm), че да
осигури свободно преминаване на клетките от суспензията, която подле-
жи на разделяне. Когато колоната се постави в магнито поле (сепаратор,
който представлява силен постоянен магнит), компонентите на матрицата
в колоната се намагнитват, като по този начин се осигурява силно магнит-
но поле вътре в колоната и в непосредствена близост с магнитно-маркира-
ните клетки, което е необходимо за ефективното им разделяне.
МACS методът намира приложение в изследванията на рака, при сор-
тиране на бели кръвни клетки, стволови клетки и др. (Plouffe et al., 2015).
Използва се и за изолиране на определени бактерии от смеси (Safarik et
al., 1995), както и при асистирана репродукция за отделяне на увредени
сперматозоиди в стадий на апоптоза от нормалните (Zhang H. et al., 2018).
В последния случай се ползват магнитни наночастици модифицирани с
анексин А5 (Annexin V), за които е известно, че се свързва специфично с
повърхността на клетки в апоптоза. Магнитната сепарация е също част от
методи за изолиране на ДНК, ензими и др.
297
Фиг. 9.10. Разделяне на клетки чрез MACS: а) схема на колона за разделяне; б) положи-
телна и отрицателна селекция на клетки при MACS
5.4. Приложения в геномиката
Фрагменти от ДНК/РНК могат да бъдат свързани с магнитни наночас-

тици чрез ковалентно свързване с функционални групи от повърхността
на частиците или просто чрез електростатична адсорбция на отрицателно
заредените олигонуклеотиди върху наночастици с катионни обвивки (на-
пример частици обвити с полиетиленимин, PEI). Магнитни наночастици
са използвани като маркери за олигонуклеотиди, при което количеството
на магнитно маркирания олигонуклеотид може да бъде измерено чрез
магниторезистивен сензор (GMR, giant magneto-resistance) (фиг. 9.11).
GMR сензорите представляват мултислойни (дебелина на слоевете до
няколко нанометра) структури от проводящи редуващи се феромагнитни
и немагнитни материали. В отсъствие на магнитно поле съпротивлението
на сензора е голямо, което намалява при наличие на магнитно поле. При
тези експерименти са използвани модифицирани със стрептавидин маг-
нитни микросфери за детектиране на свързани с биотин едноверижни
ДНК фрагменти след хибридизация с комплементарни на тях фрагменти,
които са предварително имобилизирани на повърхността на сензора. Този
подход дава възможност за детектиране на ДНК при концентрации ~16
pg/mL (Schotter et al., 2004).
Магнитните микросфери се състоят от суперпарамагнитни частици
диспергирани в полимерна матрица, от която са формирани композитни
полимерни микросфери с различен размер, най-често субмикронен (0,3–
0,8 µm), като разпределението по размери обикновено е доста широко.
298
Тези магнитни маркери са суперпарамагнитни (магнетизацията им в от-

съствие на магнитно поле е нула), т.е. трябва да бъдат поставени във
външно магнитно поле (магнетизиращо поле), за да бъдат детектирани от
GMR-сензора. Тъй като сензорът отговаря на магнитни полета, които съв-
падат с равнината му, магнетизиращото поле се прилага перпендикулярно
на равнината на сензора.
Фиг. 9.11. Детектиране на ДНК чрез магнитен маркер: а) GMR сензорът е покрит с тънки
слоеве от SiO2 и полимер, чрез който се имобилизират фрагменти от ДНК (сонди), които
са комплементарни на целевата ДНК; б) ДНК в анализираната проба се биотинилира и
привежда в контакт със сензорната повърхност, при което се осъществява хибридизация
между ДНК сондата и целевата ДНК, която се търси в пробата; в) свързване на стрепта-
видин-модифицирани магнитни частици с биотинилираните ДНК фрагменти
Освен за магнитно детектиране на хибридизация, магнитните нано-

частици могат да се използват за магнитно разделяне и изолиране на ДНК
от еукариотни клетки и бактерии на основата на адсорбция на ДНК върху
наночастиците при определени условия (Niemirowicz et al., 2012).
Магнитни наночастици са били използвани и за магнитно разделяне на
продуктите от PCR амплификация на ДНК чрез първоначална конюгация
на праймерите с магнитните частици (Jangpatarapongsa et al., 2011).
5.5. Имунодиагностика
Маркирането на антитела с магнитни наночастици също е изследвано

за потенциално приложение в имунодиагностиката. Част от имуноанали-
зите са принципно еквивалентни на имунофлуоресцентните, но в този
случай се измерват величини, свързани с магнитните свойства на наночас-
тиците. За целта се ползват различни устройства – ЯМР релаксометри,
299
GMR сензори или други видове магнитометри. При друга част от методи-
те магнитните наночастици (често вградени в полимерни микросфери) се
ползват за магнитна сепарация на комплексите антиген–антитяло. Напри-
мер свързани с наночастици антитела срещу вирусни антигени образуват
агрегати при взаимодействие със съответните антигени, което води до
измерими изменения в релаксационното време Т2 на протоните в околната
среда при измерване с ЯМР релаксометър (Perez et al., 2002).
При друг вид имуноанализ детектирането на магнитните наночастици
свързани с антитела се осъществява чрез GMR сензор (Rife et al., 2003),
подобно на използването на наночастици като магнитни маркери на ДНК
(Schotter et al., 2004). Друг пример е метод за определяне на С-реактивен
протеин (CRP) в кръв, използващ моноклонално анти-CRP антитяло, свър-
зано с магнитни наночастици, и поликлонално анти-CRP антитяло свърза-
но с микросфери от силициев диоксид (Ibraimi et al., 2006). В присъствие
на CRP се получава комплекс между CRP, магнитните наночастици и
микросферите, който седиментира лесно и се измерва магнитната възпри-
емчивост на седимента (несвързаните в комплекса магнитни наночастици
остават диспергирани). Свързани с антитела магнитни частици са изпол-
звани и за определяне на вируси (Rettcher et al., 2015).
Магнитни полимерни микросфери, модифицирани с антитела и съдър-
жащи суперпарамагнитни наночастици, са използвани за разделяне и
определяне на различни антигени в комбинация с флуоресцентни поли-
мерни микросфери (Kim and Park, 2005). При този анализ магнитните и
полимерните микросфери се модифицират с антитела и в присъствие на
съответния антиген микросферите от двата вида се свързват с антигена,
след което чрез микрофлуидна система и постоянен магнит получените
агрегати се разделят от останалите компоненти на сместа, а флуоресцен-
цията на микросферите служи за визуализация на процеса.
5.6. Имобилизиране на ензими
Магнитни наночастици, вградени в микрочастици (от полимерни, си-

ликатни или други материали), могат да се използвт за имобилизиране на
ензими (и други видове катализатори) върху тях. Тези своеобразни носи-
тели на катализатори могат да се отделят от реакционната смес чрез маг-
нитна сепарация и да се използват в нов реакционен цикъл. Обвиването
на магнитните наночастици с полимерна или силикатна обвивка или
вграждането им в микросфери се предпочита пред използването на необ-
вити наночастици. Необвитите частици могат да образуват агрегати, да
300
имат променящи се в зависимост от средата магнитни свойства и да тър-

пят разграждане в някои среди, вкл. биологични (Yang et al., 2004).
Имобилизацията на ензимите върху магнитните частици обикновено
се осъществява чрез ковалентно свързване. При обичайните процедури
ензимните молекули се ориентират по различен начин спрямо повърх-
ността на частицата, като понякога може да се запречи активният център
на ензима и/или да се промени конформацията на молекулата, в резултат
на което имобилизираният ензим се оказва с понижена активеност. За
решаването на този проблем се прилагат различни подходи за целенасо-
чено свързване на частиците с определена част от ензимната молекула,
при което не се засяга активният център. Такова свързване може да се
реализира чрез специфично модифициране на ензимната молекула с
функционална група, която не се среща естествено в протеините (азидна,
алкинова и др.) (Shemsi et al., 2019).
5.7. Магнитна хипертермия
При магнитната хипертермия магнитни частици се поставят в промен-

ливо магнитно поле, което предизвиква движение на частиците (от пре-
ориентирането им спрямо изменящата се посока на променливото външно
магнитно поле) и като следствие от това – локално повишване на темпе-
ратурата. Този хипертермичен ефект (ефект с повишаване на температу-
рата) може да доведе до повишаване на локалната температура >42 °C и
до увреждане на биологични клетки и тъкани в близост до наночастиците,
заради което е предложен за използване в противотуморната терапия за
термично увреждане на раковите клетки (Hedayatnasab et al., 2017). Често
интравенозното приложение на наночастиците не води до достатъчно
високото им акумулиране в тумора и съответно хипертермичният ефект
не е достатъчен за унищожаване на клетките, поради което наночастиците
се инжектират директно в тумора. Но дори това се оказва недостатъчно,
защото инжектираните наночастици се разпределят неравномерно в тумо-
рната тъкан и не достигат до всички ракови клетки, особено в перифе-
рията на тумора. Има клиничен опит със SPIONs формулировка, в която
наночастиците са обвити с аминосилан и имат хидродинамичен диаметър
около 12–15 nm, при хипертермична терапия с които е наблюдавано пови-
шаване на преживяемостта при пациенти с глиобластома (van Landeghem
et al., 2009; Maier–Hauff et al., 2011). Сред недостатъците на тази терапия
са необходимостта от премахване на всякакви метални обекти в областта
на главата, включително зъбни пломби, както и ограничението пред из-
ползването на ЯМР томография за образна диагностика при пациенти с
301
такава терапия (поради артефактите в изображението, причинени от висо-

ката концентрация на наночастици в тумора). В тези случаи за образна
диагностика се използва компютърна томография (СТ).
5.8. Доставяне на ДНК
Магнитни наночастици са успешно използвани и като вектори за

трансфекция на клетки. За тази цел са подходящи положително заредени
частици, например обвити с полиетиленимин, при което ДНК (предста-
вляваща полианион) се адсорбира върху частиците чрез електростатично
взаимодействие. Чрез такива наночастици успешно е доставена ДНК в
клетки от различни линии (Bi et al., 2020). Прилагането на постоянно
магнитно поле от силен магнит намиращ се под съда за клетъчно култи-
виране привлича наночастиците, които се концентрират върху клетките в
рамките на минути, улеснявайки трансфекцията. Този процес се означава
в литературата като магнетофекция (magnetofection) (Scherer et al., 2002).
Суперпарамагнитни наночастици са предложени и като носители на ДНК
ваксини (Al–Deen et al., 2014).
5.9. Доставяне на лекарства
Насоченото доставяне на лекарства до солидни тумори чрез интраве-

нозно приложени магнитни наночастици се основава на използване на
насочващо външно магнитно поле в областта на тумора, където след аку-
мулиране на наночастиците може да се индуцира хипертермичен ефект
чрез променливо магнитно поле и/или локално отделяне на свързаното с
наночастиците лекарствено вещество (в т.ч. ДНК, различни химиотера-
певтици, радионуклиди и др.) (Vangijzegem et al., 2018).
Експериментите по магнитно лекарствено насочване са дали противо-
речиви резултати, като понякога е наблюдаван минимален ефект, който
се свързва с твърде малките размери на използваните магнитни частици.
По-добри резултати са получени с нанокапсули (с размери около 200 nm),
с включени в тях по-голямо количество магнитни частици (Al–Jamal et al.,
2016). Известно е клинично проучване с магнитен наноносител на доксо-
рубицин (MTC-DOX), което обаче не е дало убедителен резултат и е пре-
кратено още във фаза II/III (Koda et al., 2002). Главен недостатък на този
подход е необходимостта от прецизно прилагане на много силно магнит-
но поле, особено в случаите на необходимост от акумулиране на частици-
те в дълбоко разположени тъкани.
302
5.10. Третиране на желязодефицитна анемия
Освен за диагностични цели, желязосъдържащите магнитни наночас-

тици са използвани и за третиране на желязодефицитна анемия, например
при абсолютен железен дефицит (силно намалени или липсващи железни
резерви) в пациенти с хронична бъбречна недостатъчност (chronic kidney
disease, CKD), при които е прилаган ferumoxytol. Този препарат съдържа
суперпарамагнитни желязосъдържащи наночастици с обвивка от карбок-
симетилиран декстран (730 kD) и размер на частиците около 30 nm. Пре-
паратът е бил първоначално регистриран като контрастен агент за ЯМР
томография (MRI), а след това (2009 г.) за третиране на железен дефицит
(Schwenk, 2010). Интравенозното прилагане на препарата ferumoxytol во-
ди до концентриране на частиците в макрофагите, последвано от разграж-
дането им и транспортиране на отделеното желязо (чрез трансферин) до
различни железни депа в организма, както и до костния мозък, където
участва в еритропоезата (образуване на еритроцити с хемоглобин).
Към момента обаче приложение като средства за третиране на железен
дефицит имат препарати на основата на железен(III) оксихидроксид. Тези
препарати съдържат наноразмерни частици от Fe(O)OH. Някои от тях са
предназначени за инжекционно приложение (Zou et al., 2017), но има и за
перорално приложение (Geisser, 2007). Съществуват и други желязосъ-
държащи препарати за перорален прием, в състава на които влизат же-
лезен(II) сулфат, говежди хемоглобин и др.
5.11. Имуномодулаторна активност
Показвана е способността желязосъдържащи наночастици да оказват

имуномодулаторен ефект чрез повлияване поляризацията на макрофаги-
те, в които тези частици попадат чрез фагоцитоза след инжекционно при-
ложение. Макрофагите могат да съществуват в различно функционално
състояние, при което двата крайни (поляризирани) фенотипа се означават
като: M1 макрофаги с проинфламаторна и антитуморна активност; и М2
макрофаги с анти-инфламаторна и протуморна активност (Hu et al., 2019).
M1 макрофагите играят ключова роля във възпалителния отговор чрез
проинфламаторната (стимулираща възпалението) си функция, произвеж-
дайки високи нива на проинфламаторни цитокини (TNF-α, IL-23, IL-1b,
IL-12), реактивни кислородни видове, циклооксигеназа COX-2, и др. M2
макрофагите секретират цитокини като IL-4, IL-10, IL-13, VEGFs, TGF-β
с противовъзпалителен ефект. Голяма част от макрофагите в туморите,
303
т.нар. тумор-асоциирани макрофаги (ТАМ), са от фенотип М2, поддър-

жащи туморния растеж чрез отделяне на растежни фактори. В този сми-
съл, пре-програмирането на ТАМ (от М2 в М1) се явява обещаваща тера-
певтична стратегия. Установено е, че ТАМ от тип М2 могат да се транс-
формират в тип М1 под въздействие на SPIONs (ferucarbotran) (Laskar et
al., 2013). Препаратът ferumoxytol проявява същия ефект, който води до
инхибиране на туморния растеж in vivo (Zanganeh et al., 2016). Червени
кръвни клетки и хемоглобин от микрокръвоизливи в солидни тумори
също водят до фенотипна трансформация на ТАМ към макрофаги от тип
М1 (Costa da Silva et al., 2017).
Фармакокинетиката на SPIONs частиците е относително добре проуче-

на в сравнение с други видове наночастици във връзка с опитите за кли-
нични приложения като контрастни агенти и за магнитна хипертермична
терапия. Фармакологичната активност на магнитните наночастици до
голяма степен зависи от характера на веществата, с които е модифицирана
повърхността им, както и при всички видове наночастици.
След инжекционно въвеждане, наночастиците веднага взаимодействат
с протеините от кръвната плазма или междуклетъчната течност. Форми-
раната протеинова корона до голяма степен определя фармакокинетич-
ните характеристики на частиците. Установено е, че частици с обвивка от
декстран адсорбират в по-голяма степен фибриноген, IgG и някои други
протеини от кръвната плазма (Thode et al., 1998). От друга страна, магнит-
ни наночастици с адсорбиран фибриноген и поставени в статично магнит-
но поле при концентрации около 0,01 vol% (in vitro) лесно се подреждат
и образуват нишки, които са успоредни на магнитното поле, а след из-
ключване на полето нишките образуват относително големи сфероидни
агрегати (Bychkova et al., 2010).
След интравенозно въвеждане на обвити с карбоксилиран декстран
магнитни наночастици при мишки, частиците бързо се разпределят в цир-
кулиращата кръв и се поглъщат в голяма степен от макрофагите в черния
дроб, далака, костния мозък, както и от някои други видове клетки, на-
пример ендотелни (Estevanato et al., 2012). При тези изследвания е уста-
новено, че наночастиците достигат максимална концентрация в черния
дроб и далака около 1–2 часа след интравенозното им приложение, след
което концентрацията им в тези органи започва да се понижава с времето
304
(t1/2 = 70±10 часа в черния дроб, и t1/2 = 32±7 часа в далака). Електронно-
микроскопски снимки показват наличие на клъстери от наночастици в
черния дроб до 3 месеца и до 6 месеца в далака. Около 1 час след интраве-
нозното въвеждане на частиците се наблюдават клъстери от наночастици,
хомогенно разпределени в черния дроб, като повечето от клъстерите са
концентрирани в макрофагите (купферовите клетки), но има известна
част попаднали в ендотелните клетки на чернодробните капиляри. В инва-
гинациите на макрофагите и в ранните ендозоми са наблюдавани малък
брой наночастици, докато в по-късните фагозоми (отдалечени от клетъч-
ната мембрана) се съдържат по-големи клъстери от частици, което пред-
полага сливане на няколко фагозоми в една по-голяма фаголизозома. Сре-
дата във фаголизозомата (ниско рН, наличие на различни ензими и окис-
лително-действащи частици) благоприятства отделянето на декстранова-
та обвивка и агрегацията на частиците, в резултат на което се наблюдава
формирането на по-големи клъстери. Освен професионалните фагоцити,
магнитни наночастици могат да бъдат ендоцитирани и от други видове
клетки – туморни, ендотелни и епителни (Hӓfeli et al., 2009). Показано е,
че ракови клетки от уротелиален карцином ендоцитират наночастици
предимно чрез макропиноцитоза в сравнение със съответните нормални
епителни клетки (Lojk et al., 2018). Ендоцитозата на частиците определя
тяхното биоразпределение след въвеждането им в организма. Освен от
повърхностните характеристики на частиците, ендоцитозата и съответно
биоразпределението им зависят от техния размер. Изследване на биораз-
пределението на карбоксилирани магнитни частици, приложени интра-
венозно в мишки, са показали, че частици с хидродинамични диаметри от
10 до 40 nm се акумулират основно в черния дроб и далака в първия ден
след инжектирането им (Yang et al., 2015). Най-малките частици (10 nm)
са показали най-голямо натрупване в черния дроб, докато най-големите
(40 nm) – основно в далака. Елиминирането на частиците се осъществява
главно чрез разграждането им в ендозомите, което протича с различна
скорост в различните клетки и води до свързване на отделеното желязо с
различни протеини за последващ транспорт и/или съхранение.
Желязото от попадналите в клетките желязосъдържащи наночастици
може да остане включено в клетките или да ги напусне чрез транспортния
мембранен протеин феропортин и чрез трансферина от кръвната плазма
(свързано като Fe(III)) да се достави до клетките в организма, които прите-
жават трансферинови рецептори. Чрез този механизъм част от желязото
от тези наночастици се включва в новосинтезирания хемоглобин и на това
е основано приложението на препарати като ferumoxytol за третиране на
305
желязодефицитна анемия (Schwenk et al., 2010). Проучвания на метабо-

лизма на магнетитни наночастици, маркирани с изотопа 59Fe и приложени
интравенозно при плъхове показват, че разграждането на частиците за-
почва в черния дроб след първоначалното им акумулиране там (Weissleder
et al., 1989).
Съществуват научни доклади с противоречиви изводи относно ток-
сичността на различни магнитни наночастици (Yang et al., 2015; Malhotra
et al., 2020). Известна част от тези противоречия са резултат от различните
експериментални модели, използвани различни наночастици, различни
условия, различни клетъчни линии и лабораторни животни при експери-
ментите и данните в повечето случаи са несъпоставими. Най-важният
въпрос е как различните клетки в организма се справят с натоварването
от ендоцитирани и дълготрайно (в продължение на месеци) акумулирани
бавноразградими наночастици в ендозомите, както и потенциалните въз-
можности за оксидативен стрес, хронично възпаление и увреждане на
протеини, мембрани и ДНК (Lévy et al., 2010). Остават неизяснени проти-
воречивите данни относно някои токсикологични аспекти на тези нано-
частици. Следва да се отбележи, че към настоящия момент почти всички
първоначално одобрени препарати на основата на магнетитни наночас-
тици в качеството им на MRI контрастни агенти са изведени от клинична
употреба по различни причини.
РЕЗЮМЕ
Магнитни свойства. Магнитните наночастици са суперпарамагнитни – притежават
относително голяма магнетизация само в присъствие на външно магнитно поле, а в
отсъствие на такова измерима магнетизация липсва. Най-популярни в биомедицин-
ските изследвания са магнитните наночастици от желязосъдържащи оксиди (магне-
тит и магхемит), означавани като SPIONs (SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticles).
Методи за получаване. Магнетитни наночастици се получават най-често по класи-
ческия метод на съутаяване с основи от смесени разтвори на соли на Fe(II) и Fe(III).
Известни са и методи с термично разпадане на различни Fe-прекурсори, пиролизни
методи, сонохимични, хидротермални, микроемулсионни, биосинтетични и др.
Функционализиране и биоконюгация. Магнетитните наночастици могат да бъдат
модифицирани с различни природни и синтетични полимери, както и с различни нис-
комолекулни вещества, носещи разнообразни функционални групи. Практическо
приложение са намерили частиците с обвивки на основата на декстран – такива са
били повечето магнетитни препарати одобрени като MRI контрастни агенти. При маг-
нитната хипертермична терапия на тумори са ползвани магнетитни наночастици
модифицирани с аминосилан, докато частиците за магнитна биосепарация се обвиват
306
или вграждат в синтетични полимери. Конюгирането на наночастиците с биомоле-

кули се осъществява най-често чрез ковалентно свързване с карбоксилни или амино
групи от повърхността на модифицирани частици.
Биомедицински приложения. Магнитните наночастици се изучават като възможни
контрастни агенти в ЯМР томографията (MRI), тъй като намаляват времената на
релаксация на протоните в магнитно поле. Това приложение се отнася за изследвания
на черния дроб, далака, лимфни възли и други области на повишена локализация на
наночастиците след интравенозно въвеждане. Към настоящия момент почти всички
първоначално одобрени за клинична употреба препарати са изведени от употреба.
Друго приложение е използването на наночастиците за магнитно разделяне (сепара-
ция) на биологични обекти – клетки, ензими и др. За тази цел частиците се обвиват в
защитен слой или се вграждат в полимерни микросфери и се свързват с антитела, раз-
познаващи съответния обект за разделяне. Имобилизирането на ензими върху магнит-
ни наночастици позволява магнитно разделяне на ензима от реакционната среда след
приключване на дадена ензимна реакция и повторното му използване в друга реакция.
Магнитни наночастици с обвивка от аминосилан са изпробвани при клинични проуч-
вания за третиране на солидни тумори (основно глиобластома) чрез магнитна хипер-
термия, при която наночастиците се инжектират в тумора с последващо третиране с
променливо магнитно поле. Движението на частиците в променливото магнитно поле
води до нагряване на околната среда и термична деструкция на раковите клетки в
близост до частиците. Този терапевтичен метод обаче има ограничени възможности
поради трудностите за доставяне на частиците до всички ракови клетки в тумора.
Магнитните наночастици са намерили приложение и като магнитни маркери за коли-
чествено определяне на антитела и нуклеинови киселини чрез чувствителни магнито-
метрични прибори. Както и други наночастици, магнитните могат да се използват
като носители на лекарствени вещества или ДНК при трансфекция на клетки. Поради
съдържанието на желязо, някои магнетитни прeпарати (ferumoxytol) са прилагани за
третиране на желязодефицитна анемия. Интересни са опитите за промяна на функ-
ционалната поляризация на макрофаги от тип М2 в М1, което би могло да е от значе-
ние за противотуморния имунитет.
Фармакологични аспекти. Интравенозно приложените магнетитни наночастици
като MRI контрастни агенти (най-често с обвивка от модифициран декстран) бързо
се акумулират предимно в макрофагите на ретикулоендотелната система – в черния
дроб, далака, лимфни възли, костен мозък, и съответно, служат най-вече за контрасти-
ране именно на тези органи. Включените в ендозомите на клетките наночастици се
разграждат (понякога твърде бавно – наночастици могат да се открият в клетките
дори 6 месеца след приложението им) с отделяне на съдържащото се в тях желязо,
което се свързва с различни протеини за транспорт и съхранение. Част от отделеното
желязо може да се транспортира до клетките предшественици на еритроцитите и да
се включи в състава на образуващия се в тях хемоглобин. Възможното дълготрайно
акумулиране в макрофагите и повлияването на поляризацията им към тип М1 (про-
възпалителен) поставя важни въпроси относно възможни хронични ефекти.
307
Глава 10
ОРГАНИЧНИ НАНОНОСИТЕЛИ
Полимерни наночастици (видове наночастици и полимери, методи за полу-

чаване, фармакологични аспекти). Полимерни мицели (видове полимерни
мицели и използвани полимери, методи за получаване, приложения и фар-
макологични аспекти). Протеинови наночастици (използвани протеини,
методи за получаване, приложения и фармакологични аспекти). Липозоми
(видове липозоми и фосфолипиди, методи за получаване, приложения и
фармакологични аспекти). Липидни наночастици (видове липиди и нано-
частици, методи за получаване, приложения и фармакологични аспекти).
1. ПОЛИМЕРНИ НАНОЧАСТИЦИ
1.1. Видове наночастици и полимери

Полимерните наночастици за приложения в наномедицината (най-вече
за доставяне на лекарства) обикновено са сферични колоидни частици с
размери от 50 до 500 nm. Понятията „наночастици“ и „нанокапсули“ се
употребяват за първи път в полимерната химия още през 70-те години на
ХХ в. (Birrenbach and Speiser, 1976; Couvreur et al., 1977; Marty et al., 1978).
Тези наночастици са били предназначени основно за инжекционно прило-
жение, като имунологични адюванти, лизозомотропни (насочени към ли-
зозомите) лекарствени носители и др. Първите такива частици са били от
неразградими материали – полиметилметакрилат (РММА), полистирен
(PS) и др., след което постепенно се налагат изисквания за биосъвмести-
мост и биоразградимост на използваните полимерни материали, най-вече
предназначените за инжекционно приложение, а също така се разработват
различни подходи за функционализиране на полимерните наночастици
(Nicolas et al., 2013).
308
Глава 10. Органични наноносители
Полимерните наночастици могат да бъдат класифицирани според раз-

лични белези – струкура, състав, физикохимични или биологични свойст-
ва. Според структурата се различават следните видове полимерни нано-
частици (фиг. 10.1):
i) полимерни наносфери – наноразмерни сферични частици с относи-
телно хомогенна структура, с равномерно разпределение на полимерните
молекули по повърхността и във вътрешността на частицата. Обикновено
са изградени от относително хидрофобни полимери и е нужно стабилизи-
рането на водните им дисперсии със сърфактанти или други колоидни ста-
билизатори.
ii) полимерни наночастици от тип ядро/обвивка – наночастици, изгра-
дени от амфифилни, но с ограничена водоразтворимост съполимери или
от поне два относително различни по свойства полимера, при което по-
хидрофобният материал формира вътрешната част на частицата (означа-
вана като „ядро“), а по-хидрофилният формира повърхностния слой (оз-
начаван като „обвивка“). Близки по структура са полимерните мицели,
които са изградени от амфифилни съполимери, но са с по-малки размери
(<100 nm) и се характеризират с СМС (критична концентрация на мицело-
образуване).
iii) полимерни нанокапсули – наночастици с течно ядро (водно или
маслено), обвито с полимерна обвивка. Полимерната обвивка може да е
хидрофобна и да е нужно добавянето на сърфактанти за постигане на ко-
лоидна стабилизация на дисперсиите. Получават се чрез емулсионно-
базирани техники, нанопреципитация и др. (Erdoğar et al., 2018).
iv) нанокомпозитни частици – полимерни наносфери, в чиято вътреш-
ност са вградени неорганични наночастици. Например могат да бъдат
вградени магнитни наночастици (Lu et al., 2021).
За получаването на полимерни наночастици за приложение като ле-
карство доставящи системи за инжекционно приложение (например за
потенциално приложение в онкологията) се предпочитат нискотоксични,
биосъвместими и биоразградими синтетични полимери (фиг. 10.2):
1) Различни полиестери, например поли(млечна киселина) (PLA) и
съполимери на млечната и гликоловата киселина (PLGA), както и техни
блок-съполимери с метокси-PEG (mPEG) за получаване на частици с
обвивка от mPEG по повърхността (Mir et al., 2017). Друг полиестер, от
който сe получават наночастици, е поли(ε-капролактон) (PCL), включи-
телно негови блок-съполимери с PEG (Grossen et al., 2017). Биоразграж-
дането на тези материали протича с хидролиза на естерните връзки в
полимерната верига и образуване на нискомолекулни продукти (лактат,
гликолат и др.), които лесно се елиминират и/или метаболизират.
309
2) Хомо- и съполимери на алкилцианоакрилати (PACA) (Yordanov,

2019). Тези полимери също се разграждат до водоразтворими продукти –
нискомолекулни алкохоли и полицианоакрилова киселина. За лекарстве-
но доставяне се предпочитат PACA материали с молекулна маса до около
10–15 kDa, които се разграждат до по-лесно елиминируеми водоразтвори-
ми продукти.
Фиг. 10.1. Схематично представяне на основни видове полимерни наночастици: а) нано-

сфери; б) наночастици от тип ядро/обвивка, в) нанокапсули, г) нанокомпозитни частици
3) Полиамиди, предимно хомополимери на аминокиселини, които

могат да бъдат разградени в организма до съответните мономери. Напри-
мер поли(L-лизин) (PLL), чиито амино групи при физиологични условия
са частично протонирани и молекулата се явява поликатион. Има два ва-
рианта за свързване на лизина – чрез α- или чрез ε-амино групата, съот-
ветно две форми PLL. Намира приложение при получаване на полиелек-
тролитни комплекси с полианиони (например с нуклеинови киселини) за
включването им в полимерни мицели и наночастици (Zheng et al., 2021).
4) Полиетиленгликол (PEG) с молекулна маса не повече от 20–30 kDa,
за да бъде елиминируем чрез бъбреците. Използва се като част (блок) от
съполимери (PEG-PLGA, PEG-PLA, PEG-PLL и др.) или за модификация
на наночастици с хидрофилни PEG вериги по повърхността. Такива нано-
частици са относително стабилни в биологични среди, адсорбират по-
малко количество опсонини и имат по-дълго време на живот в системното
кръвообращение. Означават се като PEGилирани наночастици и „стелт“
310
частици (Gref et al., 2000; Suk et al., 2016; Grossen et al., 2017; Fang et al.,
2017). Крайната хидроксилна група може да е метилирана, което се указва
с означението mPEG (метокси-PEG) или може да е заменена с амино гру-
па, чрез която се осъществява връзка с насочващ лиганд, багрило или
друго вещество (Nicolas et al., 2013).
5) Полимери, отговарящи на външен стимул – такива, които претър-
пяват конформационни промени, водещи до промяна в свойствата им
(например промяна в разтворимостта) в резултат на изменения в темпе-
ратурата, рН, йонната сила, окислително-редукционния потенциал на
средата и др. (Torchilin, 2009; Mi, 2020; Fang et al., 2021).
Фиг. 10.2. Формули на някои по-често употребявани в наномедицината синтетични поли-

мери за получаване на наночастици: полиестери (PLA, PLGA, PGA и PCL), полиамиди
(например α-PLL) и полиалкилцианоакрилати (РАСА; R = алкил). Използват се и техни
блок-съполимери с mPEG и PEG модифициран с насочващи лиганди
1.2. Методи за получаване
Полимерните наночастици обикновено се получават чрез два основни

вида методи (Rao and Geckeler, 2011):
i) методи, при които се използват предварително синтезирани поли-
мери (разпрашително сушене, наноутаяване, емулгиране с изпарение на
разтворителя и др.);
ii) методи, при които полимерът се получава при формирането на
наночастиците чрез различни полимеризационни техники.
311
Физикохимичните свойства на наночастиците могат да бъдат контро-

лирани чрез модифициране на полимерите преди или след формирането
на наночастиците. Лекарствени вещества могат да бъдат натоварени в
частиците по време на получаването им или чрез сорбция в предварително
получени частици. Натоварените вещества могат да бъдат освободени от
наночастиците чрез дифузия и десорбция, като освобождаването може да
бъде ускорено от биоразграждането на полимерния носител в биологична
среда (под действие на ензими и др.). Степента на лекарствено натовар-
ване, както и профилът му на освобождаване от полимерни наночастици
зависят от вида на полимера и неговите физикохимични свойства, приро-
дата на взаимодействията полимер–лекарство, размера и порьозността на
частиците, скоростта на биоразграждане на носителя (полимера) и др.
Полимерите, които се използват за получаване на наночастици, могат
да бъдат предварително синтезирани по различни методи според естест-
вото на конкретния полимер. Например полиестери могат да бъдат полу-
чени чрез полимеризация с отваряне на пръстена на съответните лактиди
(димерни циклични естери) (фиг. 10.3).
Фиг. 10.3. Полимеризационни процеси за получаване на полиестери (PLA, PLGA и PCL)
В тези случаи в единия край на полимерната верига остава свободна

карбоксилна група, чрез която (след съответно активиране с карбодиимид
и NHS) полимерът може да се модифицира с PEG и/или насочаващ лиганд
(Nicolas et al., 2013; Grossen et al., 2017). Използването на предварително
синтезирани полимери за получаване на наночастици има предимството,
312
че характеристиките на полимерите могат да бъдат предварително зададе-

ни и не зависят от условията за получаване на наночастиците. Такива ме-
тоди за получаване на наночастици се основават най-вече на процеси, при
които не протичат химични реакции, като наноутаяване (нанопреципита-
ция), диализен метод за смяна на разтворители, емулгиране с изпарение
на разтворителя, разпрашително сушене и др. По същество това са физич-
ни кондензационни методи (вж. Гл. 2, §1.1.1).
При наноутаяването разтвор на полимера в разтворител А се смесва
с разтворител Б. Разтворител Б е смесващ се с разтворител А. Полимерът
е разтворим в разтворител А, но е с ограничена разтворимост или нераз-
творим в разтворител Б. Методът намира приложение за получаване на
полимерни наночастици от хидрофобни или амфифилни полимери, но се
прилага и за получаване на други органични наноносители, като полимер-
ни мицели и липидни наночастици. При този вариант се използва разтвор
на хидрофобен или амфифилен полимер в органичен разтворител (ацетон,
алкохол, тетрахидрофуран), който се прибавя към водна среда. При из-
ползване на хидрофобни полимери е необходимо водната фаза да съдържа
подходящ колоиден стабилизатор, който да осигури стабилност на дис-
персията (при получаване на наночастици от амфифилни полимери това
обикновено не е необходимо). Формирането на дисперсната фаза се дъл-
жи на промяна в солватната обвивка около молекулите на полимера, от
който се получава дисперсната фаза (частиците). При тези промени става
енергетично по-изгодно молекулите на полимера да формират отделна
фаза (Lepeltier et al., 2014). Методът е удобен за включване на относител-
но хидрофобни лекарствени вещества във вътрешната хидрофобна част
на полимерните частици. В тези случаи лекарственото вещество се раз-
тваря заедно с полимера в органичния разтворител. Възможно е да се
включат по-хидрофилни вещества, разтворими във водната фаза, но в тези
случаи степента на натоварване обикновено е по-ниска.
Смяна на разтворители може да се осъществи и чрез диализа. Такъв
вариант на метода може да се използва при получаване на полимерни
мицели и наночастици (Zhang C. et al., 2012). В диализна мембрана се
поставя разтвор, например на полимер (с достатъчно голяма молекулна
маса, за да не дифундира през порите на мембраната) във водоразтворим
органичен разтворител и се поставя във вода, при което молекулите на
двата разтворителя дифундират през мембраната. Тъй като количеството
на органичния разтворител е многократно по-малко (поне 100 пъти) от
водата, в затвореното от диализната мембрана пространство органичният
разтворител практически се заменя с вода и в зависимост от свойствата на
313
полимера се образуват мицели или наночастици (La et al., 1996; Rao and
Geckeler, 2011).
Методът на емулгиране с последващо изпарение на разтворителя е
друг вариант на замяна на разтворител, при който полимерът се разтваря
предварително в несмесващ се с вода органичен разтворител и разтворът
се емулгира във водна среда. При изпарение на органичния разтворител
от емулсионните капки молекулите на полимера образуват наночастици
(Hoa et al., 2012).
Полимеризационни методи – при тези методи полимеризацията и фор-
мирането на наночастиците протичат едновременно в реакционния съд.
От тези процеси тук ще бъдат разгледани по-подробно полимеризацион-
ните методи за получаване на наночастици от полиалкилцианоакрилати
(РАСА) (Yordanov, 2012a). Алкилцианоакрилатните мономери са силно
реактивни поради комбинацията от две електронно-акцепторни групи
(карбонилна и нитрилна), свързани към един и същ въглероден атом, во-
деща до силна поляризация на връзката С=С. В повечето от докладите по
получаване на РАСА наночастици полимеризацията се провежда във вод-
на среда, където хидроксидният йон е инициатор на реакцията (Behan and
Birkinshaw, 2000) (фиг. 10.4). За контрол на процеса се добавят киселини
за намаляване концентрацията на хидроксидните йони. Ако съединение с
нуклеофилни групи (например лекарството, което трябва да бъде натова-
рено в частиците) е разтворено в средата, то може да атакува молекулата
на мономера, което също води до иницииране на полимеризация (Page–
Clisson et al., 1998). В този случай лекарствените молекули се свързват
ковалентно с полимерната верига.
Получаването на PACA наносфери с емулсионна полимеризация във
водна среда обикновено се провежда при рН~3 в присъствие на колоиден
стабилизатор (полоксамер 188, полисорбат 80 и др.). Полимеризацията
протича по анионен механизъм, но формирането на наночастиците е сло-
жен процес (Behan et al., 2001). Различни фактори, като рН на средата,
наличието на инхибитори в мономера, концентрацията на мономер, вида
на колоидния стабилизатор, вида на лекарственото вещество и неговата
концентрация, могат да окажат влияние върху молекулната маса на обра-
зувания полимер и размера на получените наночастици. В повечето слу-
чаи молекулната маса съответства на олигомерни продукти и е по-малка
от 10 kDa (Bootz et al., 2005). Получават се сферични частици с размери
от 100 до 300 nm (според условията, при които се провежда полимериза-
цията) (фиг. 10.5). Лекарства, които повлияват негативно полимериза-
ционния процес и/или могат да инициират полимеризация (например
лекарствени молекули, които съдържат амино или други нуклеофилни
314
групи), биха могли алтернативно да бъдат натоварени в наночастици чрез

наноутаяване (нанопреципитация).
Фиг. 10.4. Механизъм на полимеризацията при получаване на PACA наночастици
Наночастици от PEG-съполимери (например PEG-PACA, PEG-PLGA

и др.) се получават най-често чрез наноутаяване от предварително полу-
чени полимери. Наночастици от PEG-PACA обаче могат да бъдат получе-
ни и чрез полимеризация на алкилцианоакрилати в кисела среда (рН~1) в
присъствие на PEG, при което полимеризацията се инициира от хидрок-
силните групи в края на PEG молекулите и протича по цвитерйонен меха-
низъм (Peracchia, et al., 1997a). При тези реакции се получават амфифилни
блок-съполимери, чиито PEG-блокове образуват вериги, ориентирани
към водната фаза, като осигуряват хидрофилна повърхност и стерично
стабилизиране на наночастиците.
(а) (б)
Фиг. 10.5. Наночастици от полибутилцианоакрилат (РВСА), получени чрез: а) емулсионна
полимеризация; б) наноутаяване (нанопреципитация). И в двата случая е използван полок-
самер 188 като стабилизатор (SEM микрофотографии; Yordanov, 2012a)
315
Междуфазова полимеризация е използвана за получаване на нанокап-

сули и хибридни (органично-неорганични) композитни наночастици на
базата на PACA. Полимеризацията се осъществява на границата между
две фази. Нанокапсули, съдържащи маслено ядро (в което може да бъде
разтворено хидрофобно лекарствено вещество), могат да бъдат получени
чрез прибавяне на ацетонов разтвор на мономер и подходящо масло към
воден разтвор на колоиден стабилизатор при интензивно разбъркване,
при което се формират наноемулсионни капчици и полимеризацията за-
почва от фазовата граница (инициирана от хидроксидни аниони от вод-
ната фаза) (Gallardo et al., 1993). За успешното приготвяне на нанокапсули
е важно полимерът да е неразтворим в органичното масло. Чрез подобен
процес са получени и PEGилирани PBCA нанокапсули (Zhang Y. et al.,
2008). При тези процеси се получават и наносфери, което изисква опти-
мизиране на съотношението разтворител–масло за свеждане до минимум
образуването на наносфери. Междуфазовата полимеризация се прилага и
за получаване на композитни наночастици, които съдържат вградени в тях
неорганични наночастици със специфични свойства, например магнитни
наночастици (Arias et al., 2001).
1.3. Фармакологични аспекти
Според повърхностните си свойства свързването с протеини и лока-

лизацията в организма след интравенозно приложение се различават три
основни типа полимерни наночастици (Aggarwal et al., 2009). Частиците
от първия тип са относително хидрофобни, съставени от неразтворими
във вода полимери и стабилизирани с амфифилни съединения във водни
дисперсии. Такива наночастици лесно адсорбират плазмени опсонини от
кръвта и бързо се улавят от фагоцитите, което определя относително
краткия им полуживот в кръвообращението и бързото им акумулиране в
черния дроб, далака, белите дробове и други тъкани, където се намират
макрофаги. От хронологична гледна точка това е първото поколение
полимерни наночастици с идея за приложение в онкологията. Улавянето
им от фагоцитите обаче е сериозна бариера пред такова приложение, но
имат потенциал за приложение при доставяне на антибиотици до инфек-
тирани фагоцити (вж. Гл. 5, §5.3). Вторият тип наночастици са с хидро-
филна повърхност (обикновено PEGилирани), която осигурява стабил-
ност на частиците във водна среда и намаляване на опсонизацията им.
Такива наночастици адсорбират малко количество опсонини от кръвната
плазма, в по-малка степен се поглъщат от фагоцитите и са с удължен плаз-
316
мен полуживот. Тези частици имат потенциал за приложение в онколо-

гията, за насочване на противоракови лекарства към солидни тумори чрез
EPR ефекта (вж. Гл. 5, §5.4). Третият тип частици съчетават свойствата на
втория тип с допълнително модифицирана повърхност със специфично
насочващи лиганди, което ги прави потенциални лекарствени носители за
таргетна (целева) терапия.
Клинични проучвания с хора са достигнали няколко формулировки на
полимерни наночастици, натоварени с противотуморни средства. Раз-
работките на лекарство-доставящи системи за онкологията на основата на
РАСА наночастици започва още в края на 70-те и началото на 80-те годи-
ни на ХХ в. Първото клинико-фармакологично проучване на натоварени
с доксорубицин наночастици от поли(изохексилцианоакрилат) (DOX-
PIHCА) е поведено върху 21 пациенти с различни солидни тумори – на
бъбрек, гастро-интестинални, пикочен мехур, бял дроб и др. (Kattan et al.,
1992). Използвани са стабилизирани с декстран-70 PIHCA наночастици
натоварени с 10% доксорубицин (10 mg DOX натоварен в 100 mg части-
ци) и приложени i.v. след разреждане в 250 ml 5% глюкоза (време за
инфузията 60 min; дози от 15 до 90 mg/m2). Наблюдавани са преходни
токсични ефекти, представени като повишена температура при 9 пациен-
та (<39 °C, появила се 8–14 h след приложението и преминала до 24 h след
третирането), гадене и повръщане (при 7 пациента), дифузна болка в кос-
тите при 3 пациента (болката се е появила 20–30 min след началото на
инфузията и е продължила около 30–60 min) и алергични реакции при 3
пациента. Само при двама пациента е наблюдавано известно задържане в
развитието на заболяването, докато при останалите заболяването е про-
гресирало. Друга клинично тествана РАСА-базирана форма на доксо-
рубицин е препаратът Doxorubicin-Transdrug (DT; Livatag®), съдържащ
наночастици от поли(етилбутилцианоакрилат) (PEBCA) с размери от 100
до 300 nm, обвити с полоксамер и циклодекстрин. Препаратът е прилаган
при чернодробни тумори, първоначално интраартериално, след което и
като интравенозни (i.v.) инфузии (Merle et al., 2017). Въпреки, че препа-
ратът е показал подобрена преживяемост при някои пациенти, приложе-
нието му е причинило остър респираторен дистрес синдром (ARDS) и три
смъртни случая, поради което изпитванията са прекратени. Експерименти
с плъхове са показали силна дозозависимост на ARDS: 0% смъртност при
доза DT-DOX от 5,0 mg/kg и 62% смъртност при 7,5 mg/kg. Освен това
смъртността при третираните плъхове силно зависи от времето за ин-
фузия и спада до 0% при време за инфузия >2,5 h. Във фаза III (ReLive) от
изпитванията на Livatag, препаратът е вливан интравенозно и бавно (6 h)
317
на всеки 4 седмици, което е предотвратило развитието на подобни реак-

ции, но поради липса на подобрение в преживяемостта проучването е
прекратено.
Известни са данни от клинично проучване (фаза II) на митоксантрон
натоварен в РВСА наночастици при пациенти с хепатоцелуларен карци-
ном (Zhou et al., 2009). Използвани са наночастици с размер около 56 nm,
приложени интравенозно като дисперсия във физиологичен разтвор или в
5% глюкоза (време за инфузия 15 min). Използавнето на митоксантрон в
наночастици (MTX-PBCA) е довело до повишаване на средната прежи-
вяемост до 5,46 месеца в сравнение с 3,23 месеца в контролната група
(еквивалентна доза чист митоксантрон). При третираните с наночастици
пациенти едногодишна преживяемост са достигнали 8 (от 57) пациента и
нито един от третираните с конвенционален митоксантрон. Използването
на наночастици е свързано с по-ниска честота на наблюдавана левкопе-
ния, но повишена честота на анемия.
Трябва да се спомене, че тестове на натоварени с цитостатици РАСА
наночастици са провеждани не само чрез инжекционно въвеждане, но и
чрез външно приложение, върху кожата. Ефективно локално лечение на
пациенти с повърхностен базално-клетъчен карцином е постигнато с 5-
флуороурацил, формулиран с PBCA наночастици (3% 5-флуороурацил в
РВСА, диспергирани в смес от вазелин/ланолин; третиране за период от
35–40 дни) (Hadjikirova et al., 2005). Не са установени системни токсични
ефекти, например промяна в броя на функционалните Т-лимфоцити. В
това проучване 31 от 32 пациенти са постигнали хистологично потвърде-
но пълно изчезване на тумора за периода на проследяване (1 година).
Ефективността обаче не е сравнена с тази на други лекарствени форми на
5-флуороурацил за външно приложение.
BIND-014® е препарат, съдържащ PEGилирани наночастици (~100 nm)
от поли(млечна киселина) (PLA) с включен доцетаксел, конюгиран с мал-
ка молекула за насочено доставяне до клетки, експресиращи простат-спе-
цифичен мембранен антиген (PSMA) при рак на простатата (Gagliardi et
al., 2021). Активната субстанция се освобождава при биоразграждането
на полимера, докато PEG обвивката намалява поглъщането му от фагоци-
тите. В същото време цитотоксичният ефект е насочен целево към PSMA-
експресиращи клетки. Предклиничните проучавния са показали по-голя-
ма пикова концентрация (Cmax), по-голяма площ под кривата (AUC) и
занижени стойности за обема на разпределение и клирънса при сравнение
с конвенционален доцетаксел. При проведени клинични проучвания вър-
ху пациенти с рак на простатата е установено, че препаратът се понася
относително добре и са постигнати заложените цели (Autio et al., 2018).
318
По-нататъшни тестове и клинични изпитвания са прекратени, а фирмата-

разработчик (BIND Therapeutics) е обявена в несъстоятелност през 2016 г.
2. ПОЛИМЕРНИ МИЦЕЛИ
2.1. Видове мицели и използвани полимери
Мицелите са структури (агрегати) от амфифилни молекули, които се

получават в течна среда при определени условия (концентрация и темпе-
ратура). При формирането на мицелите във водна среда хидрофилните
части на молекулите се ориентират към водната дисперсна среда, докато
хидрофобните им части формират вътрешната част, ядрото на мицела.
Мицелите от нискомолекулни сърфактанти са класически обект на ко-
лоидната химия, чието изучаване е важно за технологията на лекарствата,
козметиката и битовата химия. За наномедицината интерес представляват
полимерните мицели, образувани от амфифилни полимери. Тези мицели
са относително по-стабилни и по-големи по размер (до ~100 nm). При
полимерните мицели почти всички формиращи ги молекули са в контакт
с водната дисперсна среда чрез хидрофилната си част, а хидрофобните
части на молекулите формират ядрото на мицела. Ако хидрофобното ядро
съдържа и други полимерни молекули, които не контактуват с дисперс-
ната среда и съответните структури са доста по-големи, обикновено >100
nm, такива частици вече би трябвало да се означават като полимерни
наночастици от тип ядро/обвивка (ядрото се състои от включените в него
полимерни молекули и от хидрофобните блокове на молекулите от фазо-
вата граница, а обвивката се състои от хидрофилните блокове на повърх-
ностните молекули). Понякога обаче такова разграничение не се прави и
в научната литература едни и същи структури се означават като полимер-
ни мицели от едни автори и като полимерни наночастици от други автори.
Полимерните мицели служат не просто за солюбилизиране на малко раз-
творими лекарствени вещества, но и за тяхното насочено доставяне в ор-
ганизма, подобно на останалите лекарствени наноносители, което е от
особено значение за разработката на нови лекарствени форми с потенциал
за приложение в онкологията (Majumder et al., 2020; Tawfik et al., 2021).
Полимерните мицели са с хидрофилна обвивка, което намалява протеино-
вата адсорбция и ги прави подходящи за системно парентерално приложе-
ние в качеството им на лекарствени носители. Всеки мицел се формира от
около няколко стотин полимерни молекули и най-често има диаметър
около 20–50 nm (понякога и по-големи, според използваните полимери).
319
Този относително малък размер прави възможна стерилизацията на мице-

ларните разтвори чрез филтруване през мембрани с размери на порите
<0,45 µm.
Полимерните мицели са основно няколко вида – самоасемблирани (от
амфифилни ди- и триблок съполимери), омрежени мицели, полийонни
комплекси (PIC) и едномолекулни мицели. При самоасемблираните мицели
обикновено се използва един вид амфифилен съполимер, но някои данни
показват, че смес от различни съполимери дава мицели с подобрена ста-
билност и/или капацитет на лекарствено натоварване (Li L. et al., 2007).
При омрежените мицели отделните полимерни молекули са свързани с
омрежващ агент, като по този начин мицелите са стабилизирани срещу
дезинтегриране в биологични среди и/или при разреждане. Полийонните
комплекси (PIC) се получават между противоположно заредени полиелек-
тролити; например между mPEG-поли(L-лизин) (поликатион) и нук-
леинови киселини (полианиони). В този случай ядрото на мицела се фор-
мира от полиелектролитния комплекс, а хидрофилната обвивка – от PEG
веригите на PEGилирания полимер. В качеството на наноносители за
ДНК са използвани комплекси на ДНК с катионни полимери, наречени
полиплекси (polyplexes). За осигуряване на хидрофилна обвивка на поли-
плексите се използват блок-съполимери PEG-b-поликатион, които вза-
имодействат електростатично с ДНК и образуват полиелектролитен комп-
лекс. Тези полиплекси са хидрофилни и стерично стабилизирани от PEG-
веригите, образуващи обвивката на мицелите (Lächelt and Wagner, 2015;
Ita, 2020). Относително прости по структура полиплекси от ДНК и PEG-
b-PLL се получават спонтанно при бързо смесване на компонентите във
водни разтвори (Katayose and Kataoka, 1996).
Едномолекулните мицели са изградени от една макромолекула с хид-
рофобна вътрешна част и хидрофилни краища, каквито са дендримерите,
звездовидните полимери и други подобни структури (Newkome et al.,
1991; Liu et al., 2000; Ordanini and Cellesi, 2018). Тези мицели са моно-
дисперсни по размер, който размер се обуславя от молекулната маса на
макромолекулната структура. Известни са някои интересни опити за
използване на дендримери и наноразмерни дендримерни агрегати като
лекарство доставящи системи (Pan et al., 2020), за фотодинамична терапия
(Nishiyama et al., 2009) и др.
Синтезирани са голям брой разнообразни по състав и свойства (вклю-
чително отговарящи на стимул – изменения в рН, температурата и др.)
съполимери за получаване на полимерни мицели (Majumder et al., 2020;
Tawfik et al., 2021). Често тези полимери съдържат PEG (или полиети-
ленокид, PEO) или декстран като хидрофилен блок. Като хидрофобен
320
блок служат поли(пропиленоксид) (PPO), полиестери (PLGA, PLA, PCL и

др.), поли(аминокиселини) и други (фиг. 10.6). За формиране на омрежени
мицели с полианионна сърцевина (за вграждане на катионни молекули) са
ползвани и съполимери на PEG с поли(метакрилова киселина) (РМА)
(Kim et al., 2009). За получавне на полиплекси се ползват съполимери на
PEG с поликатиони, например поли(L-лизин) (PLL) (Osada et al., 2009).
Особено популярни триблок съполимери за получаване на полимерни
мицели за лекарствено доставяне са т.нар. полоксамери (PEO-PPO-PEO)
(Bartrakova and Kabanov, 2008). Във воден разтвор формират мицели с
хидрофобно ядро от РРО и хидрофилна външна част от РЕО-блоковете.
Свойствата на полоксамерите и съответните полимерни мицели зависят
от съотношението РЕО/РРО и дължините на РЕО и РРО блоковете в
полимерните молекули. Получени са и смесени мицели от полоксамери и
други амфифилни вещества, например смесени мицели от полоксамер 335
(Pluronic P-105), полоксамер 181 (Pluronic L-61) и полиетоксилиран фос-
фатидилетаноламин (PEG-PE) са показали повишена стабилност и увели-
чен капацитет на натоварване за паклитаксел (Li L et al., 2007).
Фиг. 10.6. Формули на съполимери за получаване на полимерни мицели
Полимерни мицели са получени и от модифицирани полизахариди,

например декстран (Mocanu et al., 2017). Декстранът е хидрофилен хомо-
полимер на глюкозата и няма амфифилни свойства, но след модифици-
рането му с хидрофобни остатъци (например с октадецилови групи, хо-
лестерол, деоксихолева киселина и др.) се получават амфифилни продукти, от
които могат да бъдат формирани мицели, включващи във вътрешната си
част хидрофобни лекарствени вещества. Някои мицели могат да бъдат
стабилизирани чрез химично омрежване. Синтезирани са и амфифилни
присадени (graft) съполимери на декстран с полиестери (PLGA, PCL), от които
са получени мицели за доставяне на хидрофобни лекарствени вещества като
321
амфотерицин Б, доцетаксел и други (Choi et al., 2008; Zhang Z. et al., 2015a;

Raza et al., 2016).
Мицели се образуват спонтанно над определена прагова концентрация

на изграждащите ги молекули в разтвора, наречена критична концентра-
ция на мицелообразуване (СМС) и над определена температура (критична
температура на мицелообразуване, температура на Krafft). Формата на
мицелите често е сферична. Агрегационното число показва средния брой
молекули в състава на мицела. За основна движеща сила при образуването
на мицелите се приема т.нар. хидрофобен ефект, при който енергията на
системата като цяло намалява вследствие намаляване на контактната по-
върхност между водните молекули и хидрофобните части на молекулите.
По същество това е ентропиен ефект, тъй като при концентрации на амфи-
филното вещество над CMC, намаляването на ентропията от асемблира-
нето на молекулите в мицел е по-малко от увеличаването на ентропията
от освобождаване на водните молекули, които формират солватацион-
ните обвивки около отделните, невключени в мицели молекули (Zhulina
and Borisov, 2012).
Самоасемблирани мицели от амфифилни съполимери се получават
чрез директно разтваряне на съполимера или чрез някой от методите за
подмяна на разтворител (нанопреципитация, диализен метод или емул-
гиране с изпарение на разтворителя), които методи се използват и при
получаване на някои полимерни наночастици. Ако използваният блок-
съполимер е умерено хидрофобен, обикновено молекулите му се само-
асемблират (самосглобяват) в мицели чрез директно разтваряне в дис-
персната среда. При този метод едновременно се разтварят лекарството и
съполимера в подходящо съотношение във водния разтвор, който след
това се нагрява, за да започне образуването на мицели (при нагряването
вътрешната част на структурите претърпява дехидратация, което води до
образуване на мицели) (Tawfik et al., 2021). Критичната концентрация на
мицелообразуване (СМС) при амфифилните полимери обикновено е дос-
та по-ниска от тази на нискомолекулните сърфактанти, поради което
полимерните мицели в общия случай са относително по-стабилни при
разреждане. За подобряване стабилността на мицелите и капацитетът им
за включване на лекарства понякога се използват смеси от няколко амфи-
филни полимера (Li L. et al., 2007).
Един от най-ползваните методи за получаване на натоварени с лекар-
ства полимерни мицели е хидратацията на тънък филм, който е удобен за
322
получаване на големи количества продукт (Hwang et al., 2020). При този

метод полимерите и лекарствата се разтварят в органичен разтворител и
разтворът се изпарява в поток от въздух или при понижено налягане до
образуване на тънък филм от смес полимер–лекарство. След това този
филм се хидратира с воден разтвор, при което полимерът и лекарството
се диспергират в разтвора, формирайки натоварени с лекарство мицели.
Важно е получаването на сух тънък филм без остатъчен разтворител (фил-
мът се поставя под вакум за няколко часа, за да се гарантира възможно
най-пълно отстраняване на разтворителя).
При методите с подмяна на разтворител полимерът и лекарството се
разтварят в подходящ водоразтворим органичен разтворител (ацетон,
етанол, DMSO и др.) и се прибавят към водна среда или разворителят се
подменя с вода през диализна мембрана. Диализният метод е подходящ
при използване на органични разтворители, смесващи се с вода, но с
висока температура на кипене. При този вариант разтвор на полимер и
лекарство се поставят в диализна торбичка и се диализират срещу вода за
повече от 12 часа. По време на диализата органичният разтворител бавно
се отстранява и в диализната торбичка навлиза вода, което инициира
образуването на мицели с включено лекарство. При този метод обаче
може да се загуби известно количество от лекарството по време на диали-
зата. Ако полимерът и/или лекарството не е разтворимо в смесващ се с
вода органичен разтворител, може да се приложи методът с емулгиране и
изпарение на разтворителя (за летливи, несмесващи се с вода разтвори-
тели, например хлороформ). При този метод лекарството и полимерът се
разтварят в органичния разтворител и полученият разтвор се диспергира
във водна среда до получаване на o/w (масло във вода) емулсия. Следва
изпарение на разтворителя, при което лекарственото вещество се улавя в
образуваните мицели (La et al., 1996).
Омрежените мицели се получават също чрез подобни методи, но след
получаването им полимерните молекули изграждащи мицела се свързват
една с друга чрез омрежващ агент, което ги стабилизира и не се дезинте-
грират при разреждане и при попадане в биологични среди (в присъствие
на протеини). За получаване на такива мицели могат да се използват блок
съполимери, при които един от блоковете съдържа функционални групи,
реагиращи с омрежващия агент (Liu et al., 2002; Kim et al., 2009). Използ-
ват се също полимери, съдържащи двойни връзки и омрежване чрез поли-
меризация (Shuai et al., 2004) и др.
Освен чрез физично включване в мицелните хидрофобни ядра по
време на получаването им, лекарствени вещества могат да бъдат натова-
рени в полимерни мицели и чрез химична конюгация при наличие на
323
подходящи функционални групи в молекулите на лекарството и полимера

и при необходимост за по-здраво и дълготрайно свързване на лекарството
с носителя (Wang W. et al., 2018). Връзката натоварено вещество–полимер
може да се осъществи и чрез електростатично взаимодействие, например
включване на ДНК в полиплекси или на катионни лекарства в анионни
ядра на мицели (Kim et al., 2009; Lächelt and Wagner, 2015).
2.3. Приложения и фармакологични аспекти
Тук ще бъдат споменати някои мицеларни форми на цитостатици,

които са изучени по-обстойно и са тествани в клинични изпитвания
(Varela–Moreira et al., 2017; Hwang et al., 2020; Majumder et al., 2020).
Характеристиките на полимерните мицели предлагат възможност за раз-
лични пътища на прилагане – инжекционно, перорално, дермално и др.
Почти всички от разработваните мицеларните форми на цитостатици са
предвидени за интравенозно приложение, при което, попадайки в систем-
ното кръвообращение, се разчита на EPR ефекта за акумулирането им в
солидни туморни образувания. Вътрешната хидрофобна сърцевина на
мицелите служи като наноконтейнер за хидрофобните цитостатици, а
външната хидрофилна обвивка (обикновено съставена от PEG) цели да
осигури стабилност на мицела, намалена адсорбция на опсонини и дълго
време на циркулация в кръвния поток. Освен това е показано, че някои
полимерни мицели могат да бъдат насочени към кавеолин-медииран ме-
ханизъм на ендоцитоза, постигайки селективно навлизане в ракови клет-
ки, но не и в съседни нормални клетки. Това е демонстрирано с омрежени
мицели от поли(етиленоксид)-b-поли(метакрилова киселина) (PEO-b-
PMA) (Bronich et al., 2005, Sahay et al., 2010a).
Постиженията в науката за полимерите позволиха разработването на
„интелигентни“ полимерни мицели, притежаващи чувствителност към
промените в околната среда, които могат да бъдат насочени към специ-
фични клетки и тъкани. Описани са различни pH-чувствителни мицели,
които могат да експлоатират киселата микросреда в туморната тъкан, за
да разтоварят лекарствения си товар. Това може да се постигне чрез
въвеждане на функционални групи, които могат да бъдат протонирани
или депротонирани (амини, карбоксилни групи и др.) или с конюгиране
на лекарственото вещество към полимерния носител чрез лабилни връзки,
разкъсващи се в кисела среда. Разработени са също полимерни мицели,
чувствителни на промени в температурата, в окислително-редукционния
потенциал и др. (Ghosh and Biswas, 2021).
324
Сред голямото многообразие от лекарствени форми с полимерни ми-

цели, описани в научната литература могат да бъдат споменати няколко
формулировки, всичките на цитостатици, с които са проведени клинични
проучвания (Varela–Moreira et al., 2017; Hwang et al., 2020; Majumder et al.,
2020). Препаратът BIND-014, в състава на който влиза амфифилен PEG-
PLA съполимер, се разглежда от някои автори не като мицеларен, а като
съдържащ полимерни наночастици (вж. §1.3).
Genexol® PM. Разработен от Samyang Co. (Ю. Корея), съдържащ пак-
литаксел включен в мицели от mPEG-b-PLA (mPEG: 2000 g/mol, PLA:
1750 g/mol, PDI 1,0–1,2). Мицелите се получават чрез метода на хидрата-
ция на тънък филм, получен от изпарение на ацетонитрилов разтвор на
лекарството и полимера (Kim et al., 2001; Hwang et al., 2020). Предста-
вляват сферични структури, 20–50 nm в диаметър и капацитет на нато-
варване с паклитаксел 16,7%. Препаратът позволява прилагане на по-
големи дози лекарствено вещество при понижена токсичност в сравнение
с конвенционалния препарат. Дозолимитираща токсичност се явява неу-
тропения (ниско ниво на неутрофили в кръвта).
Nanoxel® M. Доцетаксел вграден в мицели от mPEG-b-PLA (mPEG
2000 g/mol; PLA 1765 g/mol), получени чрез хидратация на тънък филм, с
размери на мицелите около 25 nm и ограничена стабилност (до 6 ч във
физиологичен разтвор) (Lee et al., 2011). Разработен от Samyang Co. (Ю.
Корея). Показва съизмерима ефикасност и по-ниска токсичност в сравне-
ние с конвенционален доцетаксел (формулиран с полисорбат 80).
NK105. Паклитаксел, включен в мицели от модифициран mPEG-b-
P(Asp) (mPEG 12000 g/mol; P(Asp) 8000 g/mol) с размери около 85 nm и
капацитет на натоварване 23% (Hwang et al., 2020). Около половината
карбоксилни групи от аспарагиновите остатъци (Asp) са модифицирани с
4-фенил-1-бутилови остатъци чрез естерификация за формиране на хид-
рофобното ядро на мицелите. Разработка на NanoCarrier Co. (Япония).
При изпитвания във фаза I е показал по-голяма (15 пъти) площ под кривата
(AUC) за паклитаксел и намалена честота на реакциите на свръхчувстви-
телност в сравнение с конвенционален паклитаксел, но при изпитвания
във фаза III не е установена подобрена ефикасност (Fujiwara et al., 2019).
NK012. Полимерно прелекарство на SN-38 (7-етил-10-хидроксикамп-
тотецин), в което лекарственото вещество е ковалентно свързано с PEG-
b-поли(L-глутаминова киселина) чрез естерификация на лекарствената
фенолна група с карбоксилна група от полимера. Лиофилизираната форма
при диспергиране във вода дава мицели с размери 20 nm и капацитет на
лекарствено натоварване 20% (Varela–Moreira et al., 2017). При клинични
325
изпитвания е показало известна ефикасност при чувствителен дребнокле-

тъчен рак на белия дроб. Разработван от Nippon Kayaku (Япония).
NK911. Доксорубицин (DOX), включен в мицели от PEG-b-p(Asp-
DOX) (част от DOX e ковалентно свързан с остатъци на аспарагиновата
киселина, Asp); размерът на мицелите е около 40–50 nm. Разработван от
Nippon Kayaku (Япония). При изпитвания във фаза I е показал по-голямо
време на плазмен полуживот, по-голяма площ под кривата (AUC) и ток-
сикологичен профил, съизмерим с този на невключен в мицели DOX
(Matsumura et al., 2004).
NC6004. Цисплатин, включен в мицели от PEG-b-P(Glu). Между цис-
платина и глутаминовите (Glu) карбоксилни групи се формира комплекс,
при което се образува ядрото на мицелите, чиито размер е около 28 nm, с
капацитет на натоварване 39%. Първоначално е разработен от групата на
Kataoka и NanoCarrier Co. (Япония). Клинични проучвания във фаза II са
показали подобрена безопасност, но умерена ефикасност (Subbiah et al.,
2018).
NC6300. Епирубицин, ковалентно свързан чрез хидразонов линкер с
PEG-b-p(Asp), формиращ pH-чувствителни мицели с размери 60–70 nm
(Harada et al., 2011). Синтезиран в NanoCarrier Co. (Япония) (Bobe et al.,
2009). След свързването с епирубицин първоначално хидрофилния и во-
доразтворим полимер се превръща в амфифилен конюгат, който образува
мицели, стабилни при рН 7 и отделящи епирубицин при рН 5. Първите
клинични проучвания са показали по-добра поносимост в сравнение с
конвенционален епирубицин (Mukai et al., 2017).
NC4016. Оксалиплатин включен в мицели от PEG-b-p(Glu) чрез обра-
зуване на комплекс между платината и карбоксилните групи от полимера
(Ueno et al., 2014). Мицелите са със среден размер от 40 nm. Разработка на
NanoCarrier Co. (Япония). Предклиничните проучвания са показали съиз-
мерим антитуморен ефект с този на оксалиплатин.
CPC634 (CriPec®). Ковалентен конюгат на доцетаксел със съполимер
на mPEG5000 и N-(2-хидроксиетил)метакриламид-олиголактат, mPEG-b-
p(HEMAm-Lacn) (Rijcken et al., 2007), разработван от Cristal Therapeutics
(Холандия). Размерът на мицелите е 66 nm, с капацитет на натоварване
12%. При клинични проучвания във фаза I е установена дозолимитираща
кожна токсичност, която може да бъде потисната в известна степен чрез
премедикация с дексаметазон (Atrafi et al., 2020).
SP1049C. Мицеларна форма на доксорубицин, физически включен в
мицели, съставени от Pluronic® L61 и F127, продукт на Supratek Pharma
Inc. (Канада). Мицелите са с размер около 30 nm и с капацитет на нато-
326
варване 8,2%. Получават се при разтваряне на лиофилизиран доксоруби-

цин хидрохлорид (до концентрация 2 mg/ml) в 0,9% NaCl с 0,25% (w/v)
L61 и 2% (w/v) L127. Показал е положителни резултати при клинични
проучвания във фаза II (Valle et al., 2011).
3. ПРОТЕИНОВИ НАНОЧАСТИЦИ
3.1. Използвани протеини
За получаването на протеинови наночастици са използвани различни

протеини – с растителен (зеин, глиадин) и животински произход (човешки
или говежди серумен албумин, различни типове желатин и др.) (Hong et
al., 2020). Сред тях особено популярни в наномедицината са наночасти-
ците от човешки серумен албумин, каквито има и одобрени за клинична
употреба (частици, натоварени с паклитаксел) (Hawkins et al., 2008).
Човешкият серумен албумин (HSA) е основният протеин в човешката
кръвна плазма (~55% от плазмените протеини), синтезира се в черния
дроб, с молекулна маса 66,5 kDa. Изпълнява много различни функции в
организма: свързва се и транспортира в кръвта мастни киселини, били-
рубин, метални йони и голям брой лекарствени вещества, регулира ко-
лоидното осмотично налягане на кръвта и може да осигури хранене на
периферните тъкани чрез разграждане до аминокиселини. Неговата ста-
билност, акумулиране в солидни тумори и възпалени тъкани, неимуно-
генност и биоразградимост го определят като идеален биоматериал за
доставяне на лекарства (Kratz 2008). Говеждият серумен албумин (BSA)
също се ползва за получаване на наночастици.
Желатинът е водоразтворим протеинов продукт получен чрез хидро-
лиза или ензимно разграждане на колаген. Желатинът е един от първите
материали, които са били използвани за получаване на протеинови нано-
частици. Молекулната маса на различните видове желатин варира в ши-
роки граници, до 220 kDa, разтворими са във вода при нагряване над 35–
40 °C и се предлагат два основин типа желатин (А и В) в зависимост от
метода на хидролиза и произхода на колагена (тип А – получен чрез час-
тична киселина хидролиза на свински колаген; тип В – чрез частична
алкална хидролиза на говежди колаген). Известни са опити за използване
на рекомбинантен човешки желатин за получаване на наночастици с цел
предотвратяване на имунни реакции, каквито биха могли да се явят към
желатина от животински произход (Won and Kim, 2008).
327
Известни са различни методи за получаване на протеинови наночасти-

ци – разпрашително сушене, метод с емулгиране, метод с получаване на
полиелектролитни комплекси, електроразпрашаване и други (Hong et al.,
2020). Сред най-популярните е т.нар. десолватационен метод, при който
към воден разтвор на протеин се прибавя контролирано десолватиращ
агент – водоразтворим органичен разтворител (етанол, ацетон), при което
настъпва наноутаяване с получаване на протеинови наночастици; следва
добавяне на омрежващ агент (например глутаров алдехид), който стаби-
лизира частиците (ако протеинът не е омрежен, ще се разтвори във водна
среда при разреждане). Лекарствено вещество може да се натовари в час-
тиците чрез предварително разтваряне в изходния воден разтвор на про-
теина. Този метод широко се използва за получаване на албуминови нано-
частици, при което глутаровият алдехид свързва чрез двете си алдехидни
групи различни амино групи от протеиновите молекули. Чрез този метод
се получават албуминови наночастици с диаметър от 100 до 300 nm (фиг.
10.7), като размерът зависи от концентрацията на протеина, вида на десол-
ватиращия агент и от скоростта на прибавянето му, рН на средата, темпе-
ратурата, наличие на соли и др. По-малки частици се получават при по-
високо рН и при по-ниски изходни концентрации на протеин.
Фиг. 10.7. Наночастици от човешки серумен албумин, получени чрез десолватация с

етанол и омрежване с глутаров алдехид (SEM микрофотография)
328
Първият търговски лекарствен продукт, съдържащ протеинови наночас-

тици, в онкологията е Abraxane®, който съдържа 130 nm-ови албуминови
(HSA) частици с включен паклитаксел, одобрен от FDA през 2005 г. за трети-
ране на рак на гърдата (Hawkins et al., 2008). Албуминовите наночастици
могат да бъдат насочени към солидни тумори чрез EPR ефекта, както и чрез
трансцитоза (вероятно чрез кавеолин-медиирана ендоцитоза и последваща
екзоцитоза) през ендотелните клетки, реализирана чрез свързване на албуми-
на с гликопротеинов рецептор (gp60; 60 kDa) от клетъчната повърхност. При
клиничните изпитвания на свързания с албуминови наночастици паклитак-
сел е установено известно подобрение на ефективността и намаляване често-
тата на невропатия. Като предимство на албуминовите наночастици пред
разтворите на цитостатици се явява премахването на необходимостта от из-
ползване на солюбилизиращи сърфактанти, с които се свързват някои реак-
ции на свръхчувствителност.
Положителните резултати от внедряването на Abraxane® мотивират
някои по-нататъшни изследвания към повишаване ефикасността на албу-
миновите наночастици като носители на противоракови средства, главно
чрез модификация с насочващи лиганди, като фолат, трансферин, анти-
тела или RGD-пептиди (Wagner et al. 2010; Ulbrich et al. 2011; Bae et al.
2012; Long et al., 2020). Повечето от тези експерименти демонстрират
повишено клетъчно проникване на препаратите, повишена цитотоксич-
ност in vitro и повишено акумулиране в тумори in vivo, но реалната им
терапевтична ефикасност трябва да бъде допълнително изследвана.
4. ЛИПОЗОМИ
4.1. Видове липозоми и фосфолипиди
Липозомите са сферични везикули, изградени от поне един липиден

двоен слой (бислой). Липозомната мембрана се състои от фосфолипиди и
холестерол, като по този начин наподобява клетъчна мембрана, която
загражда вътрешна водна среда. Липозомите могат да се използват като
средства за доставяне на лекарствени и хранителни вещества, намират
приложение в козметиката и в научните изследвания (Akbarzadeh et al.,
2013; Pandey et al., 2016; Antimisiaris et al., 2021; Lu and Qi, 2021). Липо-
зомни структури са описани за първи път от британския хематолог Алек
Бангъм (Alec Bangham) докато е изследвал изсушени фосфолипиди с
329
електронен микроскоп и използване на негативен контраст (Bangham and

Horne, 1964).
По размери липозомите могат да варират значително, от наноразмерни
везикули с диаметър около 25 nm до микроразмерни везикули (т.нар. ги-
гантски липозоми). Липозомите могат да бъдат класифицирани въз осно-
ва на размера и броя на мембранните слоеве (фиг. 10.8) както следва.
Мултиламеларни везикули (MLV) – съставени от редица концентрични
фосфолипидни двуслойни мембрани, разделени от водна фаза. Те са голе-
ми по размер и могат да достигнат до 5 μm. Често такива структури се
получават първоначално, например при хидратацията на фосфолипидни
филми, които след това се преработват в по-малки липозоми чрез екс-
трузия или ултразвук (вж. §4.2).
Мултивезикуларни везикули (MVV) – представляват везикули, които
съдържат различен брой по-малки везикули.
Едноламеларни (еднослойни) везикули – биват големи (LUV; 100–250
nm) и малки (SUV; 20–100 nm). Едноламеларните везикули по размери
съответстват на наноносители, най-вече малките SUV. Тези липозоми са
съставени от водно пространство, затворено от един липиден бислой.
Фиг. 10.8. Схематично представяне на различни видове мембранни везикули според

строежа и размера им: MLV (multilamellar vesicle; мултиламеларна везикула), MVV
(multivesicular vesicle; мултивезикуларна везикула), LUV (large unilamellar vesicle; голяма
едноламеларна везикула) и SUV (small unilamellar vesicle; малка едноламеларна везикула)
330
Според повърхностния електричен заряд липозомите биват анионни,

неутрални и катионни. Зарядът се определя от природата на използваните
функционални групи в полярната част на фосфолипидните молекули.
Според съдбата на липозомите при интравенозно приложение се раз-
личават конвенционални и дългоциркулиращи („стелт“) липозоми. Дълго-
циркулиращите липозоми обикновено съдържат PEGилирани фосфоли-
пиди, които ги стабилизират и намаляват адсорбцията на опсонини. Тези
липозоми притежават важни терапевтични предимства, тъй като могат да
променят фармакокинетичните параметри на лекарствата в желана посо-
ка, особено при комбиниране с насочващи лиганди или материали, отго-
варящи на стимул (рН, температура и др.) (Antimisiaris et al., 2021).
Основните компоненти на липозомите са фосфолипиди и холестерол,
които са също и основни съставки на естествените клетъчни мембрани.
Физикохимичните свойства на тези липиди определят свойствата на ли-
позомите. Най-често използваните фосфолипиди за получаване на липо-
зоми са с естествен (яйчен или соев) или синтетичен произход. Молният
процент на фосфолипидите в липозомите може да варира от 55 до 100%
от общите липозомни компоненти. Най-често използваните са дипалми-
тоилфосфатидилхолин (DPPC) и дистеароилфосфатидилхолин (DSPC).
Химичната структура на някои липозомни компоненти е представена на
фиг. 10.9. Молекулата на един фосфолипид се състои от полярна глава
(фосфатната група и естерните връзки) и хидрофобна част, съставена от
въглеводородни вериги (остатъци от дълговерижни мастни киселини).
Въглеводородните вериги образуват вътрешната част, а полярните глави
образуват външната част на мембраните. Фосфолипидната глава може да
бъде модифицирана чрез свързване с PEG или други полимери. Важен
критерий за избор на фосфолипид за получаване на липозоми е т.нар. тем-
пература на фазовия преход (Tc), която се дефинира като температурата,
при която физическото състояние на липидите преминава от подредена
гелна фаза в неподредена течно-кристална фаза (Pandey et al., 2016). Тази
температура зависи от дължината на въглеводородната верига, степента
на насищане (наличие на двойни С=С връзки), заряда и вида на полярните
групи. Яйчните и соевите фосфолипиди съдържат значителни количества
полиненаситени мастни киселини. Използването на фосфолипиди с по-
високи температури на фазовия преход води до формирането на по-ста-
билни бислойни структури.
Движението на фосфолипидните молекули в мембрана, изградена са-
мо от фосфолипиди е причина за относително високата пропускливост на
такава мембрана. За ограничаване на мембранната пропускливост и моде-
331
лиране на необходимата стабилност и течливост на липозомната мембра-

на се добавя холестерол в молен процент около 30–45% от всички липо-
зомни компоненти. Химичната структура на холестерола е представена на
фиг. 10.9. Хидроксилната група (полярната част от молекулата) на холес-
терола се подрежда до полярните глави на фосфолипидите в бислоя, дока-
то останалата (хидрофобна) част от молекулата му се намира във вътреш-
ната част на слоя, където запълва пространствата между хидрофобните
участъци на фосфолипидните молекули.
Фиг. 10.9. Струкутри на някои компоненти на липозоми
Крайната хидроксилна група от PEG-веригата в PEGилираните фосфо-

липиди може да бъде модифицирана, например с карбоксиметилиране и
въведената по такъв начин карбоксилна група да бъде конюгирана с раз-
лични насочващи лиганди или антитела, при което да бъдат получени
липозоми за лекарствено доставяне чрез активно насочване. Липозоми,
чиято повърхност е модифицирана с антитела за насочено доставяне, са
известни като имунолипозоми (Di et al., 2020).
Най-често прилаган и първият описан метод за получаване на липозо-

ми е хидратацията на тънък липиден филм (Pandey et al., 2016; Xiang and
332
Cao, 2021). При този метод липидната смес се разтваря органичен разтво-
рител, например в хлороформ и/или метанол, след което разтворителят се
отстранява чрез ротационен изпарител при понижено налягане, за да се
получи тънък липиден слой (филм). Образуваният тънък филм се изсуша-
ва за определено време и се хидратира чрез добавяне на воден разтвор с
физиологичен осмоларитет, при което се получават главно MLV с разме-
ри 200–1000 nm. Тези MLV се превръщат в SUV чрез обработка с ултра-
звук или чрез екструзия под налягане през поликарбонатни мембрани с
определен размер на порите. Крайният размер на екструдираните липозо-
ми обикновено е близък до размера на мембранните пори.
Липозоми могат да бъдат получени и чрез разтваряне на липидната
смес в диетилов етер или смес етер-метанол и инжектиране на получения
разтвор във воден разтвор при 55–65 °C или под понижено налягане
(Akbarzadeh et al. 2013). Последващото отстраняване на етера под вакуум
води до формирането на липозоми с относително широко разпределение
по размери (70–200 nm). Подобен е и методът с разтваряне на липидната
смес в етанол и последващо инжектиране във воден буфер, при което се
формират везикулите (30–110 nm).
Методът „изпаряване в обрърната фаза“ (reverse-phase evaporation) (Shi
and Qi, 2021) е значим напредък в липозомната технология и позволява
висока ефективност на капсулиране на водоразтворими лекарства чрез
включване на голяма част от водния разтвор на лекарството в липозомите.
При този метод липидите се разтварят в органичен разтворител или в смес
от разтворители (диетилов етер, изопропилов етер, хлороформ) и се смес-
ват с воден разтвор на лекарството. Сместа се обработва за кратко (някол-
ко минути) в ултразвукова водна баня до формирането на прозрачна или
леко опалесцираща смес – получава се микроемулсия или w/o емулсия.
Амфифилните фосфолипидни молекули образуват в неполярния органи-
чен разтворител обърнати мицели (молекулите са ориентирани с хидро-
фобните си остатъци към разтворителя), в чието хидрофилно ядро се
включва водната фаза при смесването и получаването на микроемулсията.
Следва бавно изпарение на органичните разтворители при понижено на-
лягане с ротационен изпарител до образуване на вискозен гел. В критичен
момент гелът се разрушава, а фосфолипидите от някои разрушени мицели
участват във формирането на бислойна мембрана около останалите емул-
сионни капки и създаване на липозоми.
Натоварването на лекарства в липозомите може да бъде постигнато
пасивно (т.е. лекарството се капсулира по време на образуването на липо-
зомите) или активно (след образуване на липозомите) (Pandey et al., 2016).
Хидрофилните и водоразтворими лекарства се включват пасивно във
333
вътрешната водна сърцевина на липозомите чрез разтварянето на лекарс-

твата във водния буфер, използван при получаване на липозомите. Липо-
филните лекарства се натоварват пасивно чрез съвместното им разтваряне
с липидните компоненти в органичния разтворител, използван за получа-
ване на липозомите, при което тези лекарства се включват в хидрофобната
вътрешност на липозомната мембрана. Някои лекарствени молекули, кои-
то се явяват слаби киселини или основи, се натоварват активно в предва-
рително получени липозоми чрез създаване на разлика в рН или в концен-
трацията на определени йони от двете страни на липозомната мембрана.
Такъв подход е използван при включване на доксорубицин в липозоми
при разработката на препарата Myocet® (Batist et al., 2002). В този случай
за получаване на липозомите се използва кисел цитратен буфер (рН 4),
който се включва в липозомата, след което дисперсната среда се подменя
с алкален или неутрален буфер (рН 7). Лекарствените молекули в електро-
неутрална форма (непротонирани; DOX) преминават през липозомната
мембрана и попадайки в киселата среда във вътрешността на липозомата
се протонират, при което вече под формата на катиони (DOXH+) не могат
да напуснат обратно липозомата (не могат да преминат през мембраната).
Активното включване на доксорубицин по метода на рН-градиента е
илюстрирано на фиг. 10.10.
Фиг. 10.10. Активно натоварване на доксорубицин в липозоми чрез рН градиент
Пречистването на липозомите от невключени в тях лекарствени веще-

ства може да се осъществи чрез диализа или гел-филтруване. При това
невключените нискомолекулни лекарства преминават през диализната
мембрана (при диализата) или се задържат в порите на гелните частици
(при гел-филтруването).
334
Много и дългогодишни усилия са вложени в разработката на различни

липозоми за доставяне на лекарствени средства, които са довели до някол-
ко клинично одобрени продукта и множество други в различни етапи на
клинични проучвания (Bulbake et al., 2017). Капсулирането на противо-
ракови средства в липозоми предлага създаване на платформи за целена-
соченото им доставяне до туморни формации (Batist et al., 2002; Barenholz,
2012; Olusanya et al., 2018; Antimisiaris et al., 2021). За тази цел са при-
лагани конвенционални (немодифицирани), но най-вече дългоциркулира-
щи PEGилирани липозоми, както и такива за активно насочване към
раковите клетки или освобождаващи лекарствения товар в резултат на
стимул (Lee and Thompson, 2017; Aghdam et al., 2019).
Липозомите, които нямат прикрепени към повърхността си хидрофил-
ни полимери, бързо се разпознават от фагоцитите и се концентрират във
фаголизозомите. Това ги прави подходящи кандидати за доставяне на
антибиотици (Pinto–Alphandary et al., 2000) и ваксини (Gregoriadis et al.,
2006). За улесняване на фагоцитозата липозомите могат да бъдат направе-
ни с определени размери, а също така да бъдат модифицирани с опсонини
и други лиганди за активиране на фагоцитозата. Липозомите могат да
бъдат насочени към лимфните възли чрез подкожно инжектиране, което
може да осигури доставянето на лекарства до лимфната система (Oussoren
and Storm, 1998). Дългоциркулиращите липозоми се получават с изпол-
зване на PEGилирани фосфолипиди и могат да се използват за пасивно
насочване на лекарства към солидни тумори чрез EPR ефекта.
Липозомите, предназначени за активно насочване към ракови клетки,
се получават чрез конюгиране на фосфолипиди с различни насочващи
лиганди, като фолат, антитела (обикновено свързани с фосфолипидите
чрез PEG линкер) и проникващи в клетки пептиди (CPPs). Интересни
двойно насочени липозоми са получени от PEGилирани липозоми с на-
сочващи антитела, разположени на повърхността (над PEG слоя) и с про-
никващи в клетки пептиди, скрити в PEG слоя (Sawant et al., 2006). Връз-
ката между PEG и липозомната повърхност е проектирана да бъде лабил-
на в кисела среда, като по този начин PEG веригите следва да бъдат
отделени от липозомите в киселата туморна микросреда и да разкрият
скритите в тях пептиди, чрез които носителите следва да взаимодействат
с клетъчната мембрана на целевите клетки.
Липозомите могат да бъдат модифицирани с чувствителни към рН
компоненти за постигане на рН чувствителност. Такива рН-чувствителни
липозоми могат да бъдат ендоцитирани и попадайки в киселата ендозомна
335
среда, се сливат с ендозомната мембрана, освобождавайки натовареното

в тях вещество в цитоплазмата. Такава рН чувствителност може да бъде
постигната чрез промяна в липидния състав на липозомната мембрана или
чрез модифициране на липозомите с различни рН-чувствителни полиме-
ри (Aghdam et al., 2019). Например липозоми, изградени от фосфатидил-
етаноламин и холестерилов хемисукцинат, са стабилни в кръвта, но в ки-
села среда агрегират и освобождават липозомното съдържимо. За получа-
ване на рН-чувствителни липозоми се използват и синтетични полимери,
които обикновено съдържат дълги хидрофобни вериги, чрез които се при-
крепят към липозомната мембрана и карбоксилни групи, определящи рН-
чувствителността (чрез степента на депротониране). Широко изследвани
са и чувствителните към температурата липозоми, които освобождават
съдържанието си при температури над физиологичните (Aghdam et al.,
2019). Чрез използването на такива липозоми може да се постигне целена-
сочено доставяне на биоактивни вещества чрез локална хипертермия.
Термочувствителни липозоми могат да бъдат получени чрез използване
на подходящо съотношение между фосфолипидните компоненти (DPPC
и DSPC) или чрез термочувствителни полимери. Тези полимери претър-
пяват конформационен преход при промяна на температурата, което води
до промяна в тяхната хидрофобност и повърхностните свойства на моди-
фицираните липозоми. Дисулфидните (–S–S–) връзки могат да се използ-
ват като линкери за получаване на липозомни конюгати, при които дисул-
фидната връзка е от решаващо значение за липозомната стабилност. Таки-
ва липозоми могат да бъдат дестабилизирани в редуцираща среда, която
редуцира дисулфидните връзки и води до разрушаване на липозомната
мембрана с освобождаване на съдържимото (Mollazadeh et al., 2021).
Сред одобрените за клинично приложение могат да бъдат споменати
следните липозомни противотуморни препарати (Bulbake et al., 2017):
Doxil® (Caelyx). Одобрен за първи път в САЩ през 1995 г. (първо-
начално разработен от Sequus Pharmaceuticals) за третиране на рак на
яйчниците, мултиплен миелом и сарком на Капоши. Представлява липо-
зомен доксорубицин, получен чрез активно натоварване на лекарството в
PEGилирани липозоми посредством градиентен метод (Barenholz, 2012).
Липозомите се състоят от хидрогениран соев фосфатидилхолин (HSPC),
холестерол и mPEG-DSPE в молно съотношение 56:38:5. Общото липид-
но съдържание в препарата е 16 mg/mL и 2 mg/mL доксорубицин (DOX),
включен във водната вътрешност на липозомите под формата на DOX-
сулфат със степен на натоварване в липозомите около 90%. Липозомите
са униламеларни, с размери около 80–100 nm. Doxil® е показал много по-
малък обем на разпределение (4 L) и клирънс (0,1 L/h), както и много по-
336
голяма площ под кривата и 4–16 пъти по-висока туморна концентрация в

сравнение с невключения в липозоми DOX. Ефективността на препарата
е съизмерима с тази на конвенционалния DOX, но при намалена кардио-
токсичност. Наблюдавани са обаче две странични реакции, нетипични за
конвенционалния DOX. Първата и понякога дозолимитираща реакция се
проявява като десквамиращ дерматит и се нарича палмарно-плантарна
еритродизестезия (РРЕ) или „синдром на краката и ръцете“, който се про-
явява като зачервяване и лющене на кожата (Lorusso et al., 2007). Неблаго-
приятен ефект на PEGилираният липозомен доксорубицин може да е
също така свързана с инфузията реакция, проявяваща се като зачервяване
и задух. Представлява имунна реакция, свързана с активиране на компле-
мента (псевдоалергия; CARPA синдром), която може да бъде намалена
чрез забавяне на инфузията и премедикация (Szebeni et al., 2011; 2012).
DaunoXome®. Липозомен препарат за доставяне на даунорубицин, раз-
работен от NeXstar Pharmaceuticals (САЩ) и одобрен от FDA през 1996 г.
за третиране на напреднал сарком на Капоши (Forssen, 1997). Липозомите
са малки, енднослойни и електронеутрални везикули, със среден размер
около 45 nm и съдъражат DSPC, холестерол и даунорубицин в молно
съотношение 10:5:1. Предклиничните проучвания на препарата са показа-
ли, че вграждането на даунорубицин в липозомите е довело до много-
кратно повишена площ под кривата (AUC) и повишена интратуморна
акумулация (около 10 пъти). Клиничното приложение на препарата е по-
казало редуцирана токсичност и съизмерима или подобрена антитуморна
активност в сравнение с конвенционален даунорубицин.
Myocet®. Липозомен препарат за доставяне на доксорубицин, първо-
начално разработен от Elan Pharmaceuticals (САЩ), одобрен през 2000 г.
за третиране на пациенти с рак на гърдата в комбинация с циклофосфамид
(Batist et al., 2002). Липозомите са с размери около 150 до 250 nm и съдър-
жат яйчен фосфатидилхолин (ЕРС) и холестерол в молно съотношение
55:45. Доксорубицинът е натоварен с висока ефективност (99%) чрез рН
градиентен метод. Относително големият размер на липозомите и липсата
на PEG е причина за локализация на голяма част от тях във фагоцитите
след i.v. приложение. Клиничните проучвания са показали антитуморна
ефективност, съизмерима с тази на конвенционалния доксорубицин, но с
понижежена кардиотоксичност и миелосупресия.
Onivyde™. Липозомна форма на иринотекан, продукт на Merrimack
Pharmaceuticals Inc. (САЩ), одобрен през 2015 г. Препаратът, съчетан с
левковорин и флуороурацил, е показан за лечение на пациенти с мета-
статичен аденокарцином на панкреаса. Липозомите са едноламеларни,
PEGилирани везикули със среден диаметър 110 nm и съдържат DSPC,
337
холестерол и mPEG-2000-DSPE в съотношение 3:2:0,015. Повече от 90%

от лекарственото вещество е капсулирано (Drummon et al., 2006).
Освен за третиране на рак, липозомни продукти са разработени и за
други заболявания, като гъбични инфекции. Такъв пример е липозомният
амфотерицин Б (AmBisome®). Липозомите са съставени от хидрогениран
соев фосфатидилхолин, холестерол, DSPG и амфотерицин Б в молно
съотношение 2:1:0,8:0,4; размерът им е около 100 nm (Adler–Moore and
Proffitt, 1993; Stone et al., 2016). След i.v. приложение на препарата при
мишки е установено, че повече от половината доза се акумулира в далака
и черния дроб, което по всяка вероятност се дължи на фагоцитозата на
липозомите от макрофагите в тези органи. Препаратът показва съизмери-
ма ефективност с тази на конвенционалния амфотерицин, но с намалена
токсичност.
Липозоми се използват и като носители на антигени в състава на някои
ваксини, например във ваксините Epaxal® (Bovier, 2008) и Inflexal V®
(Mischler and Metcalfe, 2002), съответно за хепатит А и грип. Такива липо-
зоми, съдържащи вирусни протеини (антигени) се означават понякога в
научната литература като вирозоми.
5. ЛИПИДНИ НАНОЧАСТИЦИ
5.1. Видове наночастици и използвани липиди
Липидните наночастици са субмикронни (<1000 nm) частици, изгра-

дени от липиди и стабилизирани във водна среда чрез сърфактанти и/или
PEGилирани липиди. Използваните липиди включват моно-, ди- и тригли-
цериди, мастни киселини, холестерол, восъци, синтетични амино-липиди
(катионни липиди) или смеси от тях. Липидните наночастици намират
приложение в козметиката (Zielińska and Nowak, 2016) и фармацията,
където се прилагат като носители на биологично активни вещества за дер-
мално (Zhang J. et al., 2006), орално (McClements, 2013) и парентерално
приложение (Joshi and Müller, 2009). Различават се няколко типа липидни
наночастици (Shah et al., 2015), от които по-важни са твърдолипидните
наночастици и наноструктурираните липидни носители.
Твърдолипидни наночастици (Solid Lipid Nanoparticles, SLN). Получа-
ват се от един вид липид, който е в твърдо агрегатно състояние при фи-
зиологична температура.
338
Наноструктурирани липидни носители (Nanostructured Lipid Carriers,

NLC). Получават се от смес от твърди и течни липиди, но като цяло са в
твърдо състояние при физиологична температура.
Изборът на подходящи липиди е от съществено значение предвид из-
ползването им за получаване на липидни наночастици. Този избор като
цяло се определя от два фактора:
i) Разтворимостта на лекарството в липидната матрица – особено
важен фактор, определящ ефективността на капсулиране на лекарството
и капацитета на натоварване, съответно полезността на липидните нано-
частици за доставяне на лекарството (Kasongo et al., 2011). Различната
разтворимост на лекарството в различните липидни матрици води до раз-
лични капацитети на лекарствено натоварване.
ii) Склонността на липида да кристализира и да образува различни
полиморфни форми. Липидният полиморфизъм, съответно наличието на
на множество кристални форми на твърдите липиди, е от полза за осигу-
ряване на структурни дефекти в липидната матрица, в които могат да бъ-
дат вмъкнати лекарствени молекули. Кристализацията на липидите в пер-
фектна структура (която обаче е термодинамично по-стабилна) води до
намаляване на структурните дефекти и съответно до изхвърляне на вгра-
деното в липидната матрица лекарство, например по време на съхранение
на препаратите. Липидната кристализация може силно да се намали, като
се използват липиди с по-дълговерижни мастни киселини или се използва
смес от два различни липида, например твърд липид и течен липид (мас-
ло) при NCL (Shah et al., 2015).
Катионни липиди (съдържащи амино група) се използват при получа-
ване на липидни наночастици за доставяне на нуклеинови киселини (РНК,
ДНК). Положителният заряд на катионните липиди привлича електроста-
тично полианионните молекули на нуклеиновите киселини и осигурява
ефективното им включване в наночастиците. Използването на катионен
липид също така може да повиши ефективността на трансфекцията. Пред-
почитат се катионни липиди с разклонени вериги пред тези с неразклоне-
ни поради цитотоксичността на последните (Tabatt et al., 2004). Примери
за такива амино-липиди, които се използват в иРНК ваксини (Verbeke et
al., 2019; 2021) са показани на фиг. 10.11.
За стабилизиране на липидните частици във водна среда се ползват
различни амфифилни вещества – фосфолипиди, нейоногенни сърфактан-
ти (полисорбати, полоксамери), PEGилирани фосфолипиди и мастни ки-
селини и др. (Shah et al., 2015).
339
Фиг. 10.11. Структури на някои катионни амино-липиди, използвани като компоненти на

липидни наночастици за включване на РНК
Известни са различни методи за получаване на липидни наночастици

(Duong et al., 2020), от които тук ще споменем само някои по-широко
използвани методи: хомогенизация под налягане (при висока и ниска тем-
пература), разреждане на микроемулсии, емулгиране с изпарение на раз-
творителя и наноутаяване. Наночастиците, предназначени за парентерал-
но приложение, следва да бъдат стерилизирани. Ако това не е възможно,
следва да бъдат получени при асептични условия. Някои наночастици
могат да бъдат автоклавирани (при което преминават в течно състояние и
след това отново се втвърдяват), а други – филтрувани (отново в течно
състояние), подобно на парентералните емулсии, или подложени на гама-
облъчване (Müller et al., 2000; Pandey et al., 2018).
340
5.2.1. Хомогенизация под високо налягане
SLN могат да бъдат получени чрез хомогенизация под високо налягане

(high pressure homogenization), подобно на парентералните o/w емулсии,
но използвайки твърд вместо течен липид (масло). Производствените
линии за парентерални емулсии в повечето случаи са оборудвани с въз-
можност за контрол на температурата, което позволява да бъдат използ-
вани за производство на SLN чрез гореща хомогенизация (Müller et al.,
2000). Другият вариант на метода е студената хомогенизация. И при двата
варианта лекарството се разтваря в разтопен липид (при около 5 °C над
точката на топене). При горещата хомогенизация стопилката от липид и
лекарство се диспергира при разбъркване в горещ воден разтвор на сър-
фактант и се хомогенизира чрез хомогенизатор при повишено налягане до
получаване o/w наноемулсия, която след това се охлажда до стайна темпе-
ратура до формиране на SLN. Около 3 до 5 хомогенизационни цикъла при
500–1500 bar са достатъчни (при повишаване на налягането и броя на цик-
лите се наблюдава увеличаване размера на частиците поради коалесцен-
ция в резултат на голямата им кинетична енергия) (Pandey et al., 2018).
При студената хомогенизация стопилката от липид и лекарство се охлаж-
да и се смила до микрочастици, които се диспергират в студен разтвор на
сърфактант. Получената суспензия се обработва в хомогенизатора при
стайна или по-ниска температура, което е достатъчно за раздробяване на
микрочастиците до SLN. В зависимост от технологията на процеса и раз-
творимостта на лекарството в липидната и водната фаза, лекарственото
вещество може да е равномерно разпределено в липидната матрица или
да бъде концентрирано в периферията или в центъра на частиците (Müller
et al., 2000; Pandey et al., 2018).
5.2.2. Микроемулсионна техника
Методът се основава на разреждане на микроемулсии. Първоначално

се получава o/w микроемулсия чрез разбъркване при 65–70 °C на смес от
нискотопяща се мастна киселина (например стеаринова киселина), емул-
гатор (например полисорбат 20), ко-емулгатор (например бутанол) и вода.
Горещата микроемулсия се разрежда при разбъркване в студена вода (2–
3 °C). Недостатък на метода се явява ниското съдържание на липидни час-
тици в дисперсията поради етапа на разреждане. Методът е първоначално
разработен през 90-те години на ХХ в., след което е модифициран и опти-
мизиран (Gasco, 1993; Cavalli et al., 1996).
341
5.2.3. Наноутаяване (нанопреципитация)
Получаването на SLN по този метод е аналогично на получаването на

полимерни наночастици. Понякога се означава като като „инжектиране на
разтворител“ (solvent injection method) (Duong et al., 2020). Методът е
използван за получаване на липидни наночастици за първи път в доклад
от 2003 г. (Schubert and Müller–Goymann, 2003). При този метод, липидите
и лекарствата се разтварят в разтворител, който се смесва с вода (метанол,
етанол, изопропанол или ацетон). Водната фаза обикновено се приготвя
чрез добавяне на емулгатор или емулгаторна смес към вода или буферен
разтвор. След това органичният разтвор бързо се инжектира във водната
фаза при непрекъснато механично разбъркване. Например наночастици
от стеаринова киселина могат да бъдат получени чрез разтваряне на леци-
тин, стеаринова киселина (и лекарство) в ацетон и инжектиране на полу-
чения разтвор в равен обем воден разтвор на подходящ сърфактант (на-
пример Brij78) при 75 °C и интензивно разбъркване (Chen et al., 2001).
Сместа се изпарява при 75 °C на водна баня и се разрежда в студена вода
(при температури <5 °C) за втвърдяване на липидните частици.
5.2.4. Емулгиране с изпарение на разтворителя
И този метод е принципно същият, който се използва и за получаване

на полимерни наночастици. Липидите и лекарството се разтварят в орга-
ничен разтворител (например хлороформ) или смес от разтворители и
след това се емулгират във водна среда до образуване на наноемулсия.
След изпаряване на разтворителя чрез разбъркване или в ротационен из-
парител се образуват липидни наночастици (Siekmann and Westesen 1996).
Явен недостатък на метода е необходимостта от използване на органични
разтворители.
Първоначално липидните наночастици са разработвани като алтерна-

тива на полимерните наноносители на хидрофобни лекарства през 90-те
години на ХХ в. (Müller et al., 2000), но в момента разработките са насо-
чени главно към използването им като носители на нуклеинови киселини
(РНК, ДНК) за терапевтични приложения (Bondi and Craparo, 2010) и за
ваксини (Thi et al., 2021; Verbeke et al., 2021).
Първият одобрен за клинична употреба терапевтичен препарат e
Onpattro® (патизиран) – одобрен през 2018 г. от FDA. В това лекарство се
342
използват липидни наночастици като система за доставяне на siRNA (мал-

ка интерферираща РНК) при третиране на пациенти с транстиретин-меди-
ирана амилоидоза (Kristen et al., 2018). Препаратът се прилага интравеноз-
но (i.v.) след премедикация (дексаметазон, антихистамини) за минимизи-
ране на нежелани реакции на свръхчувствителност. Чрез въвеждане на
съответна siRNA се цели намаляване експресията на мутантния транс-
тиретин. При нормални условия транстиретинът е транспортен протеин,
който се синтезира основно в черния дроб и хороидалния плексус в мозъ-
ка и пренася в кръвната плазма тироксин (хормон на щитовидната жлеза)
и ретинол (посредством свързване на транстиретина с ретинол-свързващ
белтък). Мутиралият транстиретин се свързва с амилоидна полиневропа-
тия и лечението цели потискане на експресията му. В състава на патизи-
ран влизат: катионен липид DLin-MC3-DMA, DSPC, холестерол, PEGили-
ран липид PEG2000-C-DMG и siRNA (комплементарна на участък от
транстиретиновата иРНК) (Kristen et al., 2018; Yonezawa et al., 2020).
През 2020/2021 г. бяха въведени в употреба ваксини срещу SARS-Cov-
2, базирани на иРНК, включена в липидни наночастици (Thi et al., 2021;
Verbeke et al., 2021). В състава на тези препарати има няколко липидни
компонента: холестерол, DSPC, катионен липид (ALC-0315, SM-102; вж.
фиг. 10.11) и PEGилиран липид (PEG2000-DMG, PEG2000-DMA). Кати-
онният липид съдържа третична амино група, която се протонира при фи-
зиологични условия и ниско рН и свързва електростатично отрицателно
заредената иРНК (полианион), като по този начин се осигурява натовар-
ването на иРНК в липидния носител. Предполага се, че катионният липид
също така участва в дестабилизирането на ендозомите (в които попадат
наночастиците, след като биват погълнати от клетките), като по този на-
чин освобождава наночастиците в цитоплазмата на клетката. PEGилира-
ният липид осигурява хидрофилна повърхност на липидната частица и
колоидната стабилност на дисперсията при получаването и съхранението
на препаратите. Целта на тези препарати е доставяне на иРНК до клет-
ките, намиращи се в мястото на инжектиране, където информацията в
иРНК се транслира във вирусен протеин, играещ ролята на антиген, срещу
който се изработват антитела (вж. Гл. 5, §5.5) (Liang et al., 2017; Bettini and
Locci, 2021; Cagigi and Loré, 2021).
РЕЗЮМЕ
Полимерни наночастици. Полимерни наночастици с размери до няколко стотин
нанометра могат да бъдат получени от различни синтетични полимери – полиестери
343
(PLA, PGA, PLGA, PLC), полиалкилцианоакрилати (PACA), полизахариди и др. Спо-

ред строежа могат да бъдат наносфери, нанокапсули или нанокомпозитни частици
(полимерни наносфери, в които са вградени по-малки неорганични наночастици).
Полимерни наночастици могат да бъдат получени чрез различни полимеризационни
(емулсионна полимеризация, междуфазова полимеризация и др.) и утаителни техни-
ки (наноутаяване, емулгиране с изпарение на разтворителя и др.). Повърхността на
наночастиците може да бъде модифицирана с хидрофилни полимери, с насочващи
лиганди (в т.ч. антитела и др.) или полимери, отговарящи на външен стимул (измене-
ния в рН, температурата, редоксипотенциала и др.). Наночастиците от синтетични
полимери се изучават най-вече във връзка с потенциално приложение в онкологията.
В тази връзка важно условие за тяхната приложимост е да бъдат изградени от биораз-
градими полимери и да не предизвикват силни реакции на свръхчувствителност.
Полимерни мицели. Полимерните мицели са структури с размери от порядъка на
няколко десетки нанометра, получени най-често от самоорганизиращи се амфифилни
блок-съполимери чрез различни методи на основата на подмяна на разтворителя
(наноутаяване, диализен метод и др.). Известни са и мицели на основата на поли-
електролитни комплекси (например получени от нуклеинови киселини и поликатио-
ни като PEG-PLL), омрежени мицели (при които отделните молекули са свързани с
ковалентни връзки), едномолекулни мицели (дендримерни структури, звездовидни
полимери и др.). Разработват се основно като носители на хидрофобни лекарства,
които да бъдат включени в хидрофобното ядро на мицели, основно за приложения в
онкологията, където редица препарати са в различни фази на клинични проучвания.
Протеинови наночастици. Наночастици за лекарствено доставяне са получени от
различни видове протеини, най-често чрез наноутаяване, последвано от омрежване
на протеиновите молекули, изграждащи частицата (например чрез глутаров алдехид).
Наночастиците могат да бъдат допълнително функционализирани за активно насоч-
ване чрез модификация с подходящи насочващи лиганди, включително с антитела.
Паклитаксел, включен в наночастици от човешки серумен албумин, е одобрен за кли-
нична употреба в онкологичната практика.
Липозоми. Липозомите са мембранно-ограничени везикули от резервоарен тип, из-
градени от фосфолипиди и холестерол. Могат да бъдат едноламеларни, мултила-
меларни или мултивезикуларни, с размери от няколко десетки нанометра до няколко
микрона. Изграждащите ги фосфолипиди могат да бъдат модифицирани с PEG или
други полимери. Хидрофилни лекарствени вещества могат да бъдат включени във
вътрешната водна част на липозомата, а хидрофобни - в самата липозомна мембрана.
Получават се най-често чрез хидратация на фосфолипиден филм и чрез изпаряване в
обърната фаза, като малки едноламеларни везикули се получават чрез екструзия през
поликарбонатни мембрани или чрез обработка на големи мултиламеларни везикули
с ултразвук. Лекарственото вещество може да бъде включено в липозомите в хода на
тяхното формиране или постсинтетично – чрез активно натоварване (например чрез
рН градиентен метод). Известни са няколко одобрени за клинична употреба липозом-
ни лекарствени форми и редица други в различни фази на клинични проучвания. Сред
одобрените лекарства могат да бъдат споменати доксорубицин, включен в PEGилира-
ни липозоми, липозомен амфотерицин Б и др.
Липидни наночастици. Известни са различни видове наночастици, съдържащи раз-
лични видове липиди, но най-изучавани са твърдолипидните наночастици и нано-
структурираните липидни носители (изградени от поне два вида липиди, от които
344
единият е течен, но наночастиците са в твърдо агрегатно състояние). Ползват се раз-

лични липиди – триглицериди, мастни киселини, фосфолипиди, холестерол, синте-
тични катионни липиди и др. Някои от липидните компоненти могат да бъдат пред-
варително модифицирани, например с PEG, като играят ролята на стабилизатори на
частиците в процеса на получаване и съхранение. Липидни наночастици се получават
чрез различни утаителни методи с подмяна на разтворителя (подобно на методите,
използвани за получаване на полимерни мицели и наночастици), както и с хомогени-
зация под високо налягане. Първоначално са разработвани като носители на хидро-
фобни лекарства, но основният интерес е насочен към използването им за доставяне
на нуклеинови киселини (РНК, ДНК) за генна терапия и ваксини.
345
Цитирана литература
Abbina S., Takeuchi L., Anilkumar P. et al. (2020) Blood circulation of soft nanomaterials is
governed by dynamic remodeling of protein opsonins at nano-biointerface, Nat.
Commun., 11, 3048.
Abdifetah O., Na–Bangchang K. (2019) Pharmacokinetic studies of nanoparticles as a
delivery system for conventional drugs and herb-derived compounds for cancer therapy:
a systematic review, Int. J. Nanomed., 14, 5659–5677.
Abdoon A., Al–Ashkar E., Kandil O., et al. (2016) Efficacy and toxicity of plasmonic
photothermal therapy (PPTT) using gold nanorods (GNR) against mammary tumors in
dogs and cats, Nanomedicine, 12, 2291–2297.
Achiam M., Løgager V., Chabanova E., et al. (2009) Diagnostic accuracy of MR colono-
graphy with fecal tagging, Abdom. Imaging, 34, 483–490.
Adamo G., Campora S., Ghersi G. (2017) Functionalization of nanoparticles in specific
targeting and mechanism release, In: Nanostructures for novel therapy: synthesis,
characterization and applications (Ficai D., Grumezescu A., Eds.) (Elsevier), p. 57–80.
Adler–Moore J., Proffitt R. (1993) Development, characterization, efficacy and mode of
action of AmBisome, a unilamellar liposomal formulation of amphotericin B, J.
Liposome Res., 3, 429–450.
Agarwal N., Nair M., Mazumder A., Poluri K. (2018) Characterization of nanomaterials using
nuclear magnetic resonance spectroscopy, In: Bhagyaraj S. et al. (Eds.), Characterization
of nanomaterials, Elsevier, pp. 61–102.
Aggarwal P., Hall J., McLeland C., et al. (2009) Nanoparticle interaction with plasma proteins
as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy, Adv.
Drug Deliv. Rev., 61, 428–437
Aghdam M., Bagheri R., Mosafer J., et al. (2019) Recent advances on thermosensitive and
pH-sensitive liposomes employed in controlled release, J. Control. Release, 315, 1–22.
Ahangaran F., Navarchian A. (2020) Recent advances in chemical surface modification of
metal oxide nanoparticles with silane coupling agents: a review, Adv. Colloid Interf. Sci.,
286, 102298.
Ahmad A., Khan J., Haque S. (2019) Strategies in the design of endosomolytic agents for
facilitating endosomal escape in nanoparticles, Biochimie, 160, 61–75.
Akbarzadeh A., Rezaei–Sadabady R., Davaran S., et al. (2013) Liposome: classification, pre-
paration, and applications, Nanoscale Res. Lett., 8(1), 102.
Al–Deen F., Selomulya C., Ma C., Coppel R. (2014) Superparamagnetic nanoparticle delivery
of DNA vaccine, In: Rinaldi M. et al. (Eds.), DNA vaccines: methods and protocols,
methods in molecular biology, Springer, vol. 1143, p. 181.
346
Aldosari B., Alfagih I., Almurshedi A. (2021) Lipid nanoparticles as delivery systems for
RNA-based vaccines, Pharmaceutics, 13(2), 206.
Alfagih I., Aldosari B., AlQuadeib B., et al. (2020) Nanoparticles as adjuvants and
nanodelivery systems for mRNA-based vaccines, Pharmaceutics, 13, 45.
Al–Jamal K., Bai J., Wang J., et al. (2016) Magnetic drug targeting: preclinical in vivo studies,
mathematical modeling, and extrapolation to humans, Nano Lett., 16, 5652–5660.
Algar W., Krull U. (2006) Adsorption and hybridization of oligonucleotides on mercapto-
acetic acid-capped CdSe/ZnS quantum dots and quantum dot-oligonucleotide conju-
gates, Langmuir, 22, 11346–11352.
Ali M., Wu Y., El–Sayed M. (2019) Gold-nanoparticle-assisted plasmonic photothermal
therapy advances toward clinical application, J. Phys. Chem. C, 123, 15375–15393.
Aliyandi A., Satchell S., Unger R., et al. (2020) Effect of endothelial cell heterogeneity on
nanoparticle uptake, Int. J. Pharm., 587, 119699.
Alivisatos A., Harris A., Levinos N., et al. (1988) Electronic states of semiconductor clusters:
homogeneous and inhomogeneous broadening of the optical spectrum, J. Chem. Phys.,
89, 4001.
Alkilany A., Murphy C. (2010) Toxicity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we
have learned so far?, J. Nanopart. Res., 12, 2313–2333.
Allswede D., Yolken R., Buka S. Cannon T. (2020) Cytokine concentrations throughout
pregnancy and risk for psychosis in adult offspring: a longitudinal case-control study, The
Lancet Psychiatry, 7(3), 254–261.
Alvand Z., H. Rajabi, A. Mirzaei, et al. (2019) Rapid and green synthesis of cadmium telluride
quantum dots with low toxicity based on a plant-mediated approach after microwave and
ultrasonic assisted extraction: Synthesis, characterization, biological potentials and
comparison study, Mater. Sci. Eng. C, 98, 535–544.
Angelova N., Yordanov G. (2017) Iron(III) and aluminium(III) based mixed nanostructured
hydroxyphosphates as potential vaccine adjuvants: Preparation and physicochemical
characterization, Colloids Surf. A, 535, 184–193.
Antcheva M., Simeonova M., Boeva M., Konstantinov C. (1994) Effect of polybutylcyano
acrylate nanoparticles on primary immune response of mice to sheep erythrocytes, Int. J.
Pharm., 103, 303–307.
Antimisiaris S., Marazioti A., Kannavou M., et al. (2021) Overcoming barriers by local drug
delivery with liposomes, Adv. Drug Deliv. Rev., 174, 53–86.
Antonii F. (1618) Panacea aurea-auro potabile, Hamburg, Bibliopolio Frobeniano.
Arias J., Gallardo V., Gómez–Lopera S., et al. (2001) Synthesis and characterization of poly(ethyl-
2-cyanoacrylate) nanoparticles with a magnetic core, J. Control. Release, 77(3), 309–321.
Arima Y., Toda M., Iwata H. (2008) Complement activation on surfaces modified with
ethylene glycol units, Biomaterials, 29, 551–560.
347
Atrafi F., Dumez H., Mathijssen R., et al. (2020) A phase I dose-escalation and pharmaco-
kinetic study of a micellar nanoparticle with entrapped docetaxel (CPC634) in patients
with advanced solid tumours, J. Control. Release, 325, 191–197.
Attia M., Anton N., Wallyn J., et al. (2019) An overview of active and passive targeting
strategies to improve the nanocarriers efficiency to tumour sites, J. Pharm. Pharmacol.,
71(8), 1185–1198.
Autio K., Dreicer R., Anderson J., et al. (2018) Safety and efficacy of BIND–014, a docetaxel
nanoparticle targeting prostate-specific membrane antigen for patients with metastatic
castrationresistant prostate cancer: a phase 2 clinical trial, JAMA Oncol., 4, 1344–1351.
Awan M., Rauf S., Abbas A., et al. (2020) A sandwich electrochemical immunosensor based
on antibody functionalized-silver nanoparticles (Ab-Ag NPs) for the detection of dengue
biomarker protein NS1, J. Molecular Liquids, 317, 114014.
Azzazy H., M. Mansour (2009) In vitro diagnostic prospects of nanoparticles, Clinica Chimica
Acta, 403, 1–8.
Bae S., Ma K., Kim T., et al. (2012) Doxorubicin-loaded human serum albumin nanoparticles
surface-modified with TNF-related apoptosis-inducing ligand and transferrin for
targeting multiple tumor types, Biomaterials, 33, 1536–1546.
Baird C., Courtenay E., Myszka D. (2002) Surface plasmon resonancecharacterization of
drug/liposome interactions, Anal. Biochem., 310(1), 93–99.
Ballou B., Lagerholm B., Ernst L., et al. (2004) Noninvasive imaging of quantum dots in mice,
Bioconjugate Chem., 15, 79–86.
Baláž P., Achimovičová M., Baláž M., et al. (2013) Hallmarks of mechanochemistry: from
nanoparticles to technology, Chem. Soc. Rev., 42, 7571–7637.
Bancos S., Stevens D., Tyner K. (2015) Effect of silica and gold nanoparticles on macrophage
proliferation, activation markers, cytokine production, and phagocytosis in vitro, Int. J.
Nanomed., 10, 183–206.
Banerjee A., T. Pons, N. Lequeux, B. Dubertret (2016) Quantum dots-DNA bioconjugates:
synthesis to applications, Interface Focus, 6, 20160064.
Banfalvi G. (2017) Methods to detect apoptotic cell death, Apoptosis, 22(2), 306–323.
Bangham A., Horne R. (1964) Negative staining of phospholipids and their structural
modification by surface-active agents as observed in the electron microscope, J. Mol.
Biol., 8(5), 660–668.
Barany S. (2015) Polymer adsorption and electrokinetic potential of dispersed particles in
weak and strong electric fields, Adv. Colloid Interface Sci., 222, 58–69.
Bareford L., Swaan P. (2007) Endocytic mechanisms for targeted drug delivery, Adv. Drug
Deliv. Rev., 59(8), 748–758.
Barenholz Y. (2012) Doxil® – the first FDA-approved nano-drug: lessons learned, J. Control.
Release, 160(2), 117–134.
Barzegar–Jalali M., Adibkia K., Valizadeh H., et al. (2008) Kinetic analysis of drug release
from nanoparticles, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 11(1), 167–177.
348
Bateman J., Weneck E., Eshler D. (1959) Determination of particle size and concentration
from spectrophotometric transmission, J. Colloid Sci., 14, 308–329.
Batist G., Barton J., Chaikin P., et al., (2002) Myocet (liposome-encapsulated doxorubicin citrate):
a new approach in breast cancer therapy, Expert Opin. Pharmacother., 3(12), 1739–1751.
Batrakova E., Kabanov A. (2008) Pluronic block copolymers: evolution of drug delivery concept
from inert nanocarriers to biological response modifiers, J. Control. Release, 130(2), 98–106.
Bazak R., Houri M., El Achy S., et al. (2014) Cancer active targeting by nanoparticles: a
comprehensive review of literature, J. Cancer Res. Clin. Oncol., 141(5), 769–784.
Bechhold H. (1919) Colloids in biology and medicine, D. van Nostrand Company.
Behan N., Birkinshaw C. (2000) The mechanism of polymerisation of butyl cyanoacrylate in
aqueous dispersions, Macromol. Rapid Commun., 21, 884–886.
Behan N., Birkinshaw C., Clarke N. (2001) Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a
mechanistic study of polymerisation and particle formation, Biomaterials, 22, 1335.
Bentolila L. (2010) Direct in situ hybridization with oligonucleotide functionalized quantum
dot probes, In: Bridger J. and Volpi E. (Eds.) Fluorescence in situ hybridization (FISH):
protocols and applications, Methods in Molecular Biology, vol. 659, p. 147.
Bergin I., Witzmann F. (2013) Nanoparticle toxicity by the gastrointestinal route: evidence
and knowledge gaps, Int. J. Biomed. Nanosci. Nanotechnol., 3(1/2), 163.
Berne B, Pecora R. (2000) Dynamic light scattering with applications to chemistry, biology,
and physics, John Wiley & Sons, Inc.
Berry C., Wells S., Charles S., Curtis A. (2003) Dextran and albumin derivatised iron oxide
nanoparticles: influence on fibroblasts in vitro, Biomaterials, 24, 4551–4557.
Bertholon I., Vauthier C., Labarre D. (2006) Complement activation by core-shell
poly(isobutylcyanoacrylate)-polysaccharide nanoparticles: influences of surface
morphology, length, and type of polysaccharide, Pharm. Res., 23(6), 1313–1323.
Bettini E., Locci M. (2021) SARS-CoV-2 mRNA vaccines: immunological mechanism
and beyond, Vaccines, 9, 147.
Beveridge T., Murray R. (1980) Sites of metal deposition in the cell wall of Bacillus
subtilis, J. Bacteriol., 141, 876.
Bhushan B. (Ed.) (2010) Scanning probe microscopy in nanoscience and nanotechno-
logy, Springer.
Bi H., Xue J., Jiang H., et al. (2018) Current developments in drug delivery with
thermosensitive liposomes, Asian J. Pharm. Sci., 14(4), 365–379.
Bi Q., Song X., Hu A., et al. (2020) Magnetofection: Magic magnetic nanoparticles for
efficient gene delivery, Chin. Chem. Lett., 31(12), 3041–3046.
Biehl P., von der Lühe M., Dutz S., Schacher F. (2018) Synthesis, characterization, and
applications of magnetic nanoparticles featuring polyzwitterionic coatings,
Polymers, 10, 91.
Birrenbach G., Speiser P. (1976) Polymerized micelles and their use as adjuvants in
immunology, J. Pharm. Sci., 65(12), 1763–1766.
349
Bobe I., Shibata N., Saito H., Harada M. (2009) Block copolymer for drug complex
and pharmaceutical composition, Patent EP2077293A1.
Bohren C., Huffman D. (1998) Absorption and scattering of light by small particles,
John Wiley & Sons.
Bongaerts E., Nawrot T., Van Pee T., et al. (2020) Translocation of (ultra)fine particles
and nanoparticles across the placenta; a systematic review on the evidence of in
vitro, ex vivo, and in vivo studies, Part. Fibre Toxicol., 17, 56.
Bondì M., Craparo E. (2010) Solid lipid nanoparticles for applications in gene therapy:
a review of the state of the art, Exp. Opin. Drug Deliv., 7(1), 7–18.
Bootz A., Russ T., Gores F., et al. (2005) Molecular weights of poly(butyl cyano-
acrylate) nanoparticles determined by mass spectrometry and size exclusion chro-
matography, Eur. J. Pharm. Biopharm., 60(3), 391–399.
Boraschi D., Costantino L., Italiani P. (2012) Interaction of nanoparticles with immuno-
competent cells: nanosafety considerations, Nanomedicine, 7(1), 121.
Borenfreund E., Babich H., Martin–Alguacil N. (1988) Comparisons of two in vitro
cytotoxicity assays – the neutral red (NR) and tetrazolium MTT tests, Toxicology
in Vitro, 2(1), 1–6.
Bovier P. (2008) Epaxal®: a virosomal vaccine to prevent hepatitis A infection, Expert
Rev. Vaccines, 7(8), 1141–1150.
Brayner R., Barberousse H., Hemadi M., et al. (2007) Cyanobacteria as bioreactors for the
synthesis of Au, Ag, Pd, and Pt nanoparticles via an enzyme-mediated route, J. Nanosci.
Nanotechnol., 7, 2696–2708.
Bredig G. (1898) Sitzungsberichte der Bezirksvereine. Darstellung colloïdaler Metalllösungen
durch elektrische Zerstäubung, Z. Ang. Chem., 11, 950–956.
Briones E., Isabel Colino C., Lanao J. (2008) Delivery systems to increase the selectivity of
antibiotics in phagocytic cells, J. Control. Release, 125(3), 210–227.
Brohi R., Wang L., Talpur H., et al. (2017) Toxicity of nanoparticles on the reproductive
system in animal models: a review, Front. Pharmacol., 8, 606.
Bronich T., Keifer P., Shlyakhtenko L., Kabanov A. (2005) Polymer micelle with crosslinked
ionic core, J. Am. Chem. Soc., 127, 8236–8237.
Brown M., Semelka R. (2003) MRI: Basic principles and applications, 3-rd Edition, Wiley.
Bruchez M., Moronne M., Gin P., et al. (1998) Semiconductor nanocrystals as fluorescent
biological labels, Science, 281, 2013.
Brust M., Walker M., Bethell D., et al. (1994) Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles
in a two-phase liquid-liquid system, Chem. Commun., 7, 801–802.
Bulbake U., Doppalapudi S., Kommineni, N., Khan W. (2017) Liposomal formulations in
Clinical Use: An Updated Review, Pharmaceutics, 9(4), 12.
Bullen C., Mulvaney P. (2004) Nucleation and growth kinetics of CdSe nanocrystals in
octadecene, Nanoletters 4, 2303.
350
Bychkova A., Sorokina O., Kovarskii A., et al. (2010) Interaction between blood plasma
proteins and magnetite nanoparticles, Colloid J., 72(5), 696–702.
Cagigi A., Loré K. (2021) Immune responses induced by mRNA vaccination in mice,
monkeys and humans, Vaccines, 9, 61.
Cai S., Yang Q., Bagby T., Forrest M. (2011) Lymphatic drug delivery using engineered
liposomes and solid lipid nanoparticles, Adv. Drug Deliv. Rev., 63, 901–908.
Campagnolo L., Massimiani M., Vecchione L., et al. (2017) Silver nanoparticles inhaled during
pregnancy reach and affect the placenta and the foetus, Nanotoxicology, 11(5), 687–698.
Campo A., Sen T., Lellouche L.–P., Bruce I. (2005) Multifunctional magnetite and silica-
magnetite nanoparticles: synthesis, surface activation and applications in life sciences, J.
Magnetism Magnetic Mater., 293, 33–40.
Can K., Ozmen M., Ersoz M. (2009) Immobilization of albumin on aminosilane modified super-
paramagnetic magnetite nanoparticles and its characterization, Colloids Surf. B, 71, 154–159.
Canovi M., Lucchetti J., Stravalaci M., et al. (2012) Applications of surface plasmon
resonance (SPR) for thecharacterization of nanoparticles developed for biomedical
purposes, Sensors, 12(12), 16420–16432.
Cao Y. (2018) The toxicity of nanoparticles to human endothelial cells, In: Cellular and
molecular toxicology of nanoparticles (Saquib Q. et al., Eds.), Advances in experimental
medicine and biology, vol. 1048, Springer, pp. 59–69.
Capjak I., Goreta S., Jurašin D., Vrček I. (2017) How protein coronas determine the fate of
engineered nanoparticles in biological environment, Arh .Hig. Rada Toksikol., 68, 254.
Carlander U., Midander K., Hedberg Y., et al. (2019) Macrophage-assisted dissolution of gold
nanoparticles, ACS Appl. Bio Mater., 2, 1006–1016.
Carter D., He X. (1990) Structure of human serum albumin, Science, 249(4966), 302–303.
Carvalho T., Peters J., Williams III R. (2011) Influence of particle size on regional lung depo-
sition – What evidence is there?, Int. J. Pharm., 406(1–2), 1–10.
Cavalli R., Marengo E., Rodriguez L., Gasco M. (1996) Effects of some experimental factors on
the production process of solid lipid nanoparticles, Eur. J. Pharm. Biopharm., 43, 110–115.
Cedervall T., Lynch I., Foy M., et al. (2007) Detailed identification of plasma proteins
adsorbed on copolymer nanoparticles, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 46, 5754–5756.
Chain C., Millone M., Cisneros J., et al. (2021) Surface plasmon resonance as a characteriza-
tion tool for lipid nanoparticles used in drug delivery, Front. Chem., 8, 605307.
Chan W., Nie S. (1998) Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection,
Science, 281, 2016.
Chan W., Maxwell D., Gao X., et al. (2002) Luminescent quantum dots for multiplexed
biological detection and imaging, Curr. Opin. Biotech., 13, 40.
Chandran P., Riviere J., Monteiro–Riviere N. (2017) Surface chemistry of gold nanoparticles
determine the biocorona composition impacting cellular uptake, toxicity and gene
expression profiles in human endothelial cells, Nanotoxicology, 11, 507–519.
351
Chang E., Miller J., Sun J, Yu W., Colvin V., Drezek R., West J. (2005) Protease–activated
quantum dot probes, Biochem. Biophys. Res. Comm., 334, 1317.
Chapman L. (1913) A contribution to the theory of electrocapillarity, Philosophical Magazine
Series 6 25, 148, 475–481.
Chattopadhyay P., S. Perfetto, J. Yu, M. Roederer (2010) The use of quantum dot nanocrystals
in multicolor flow cytometry, WIREs Nanomed. Nanobi., 2, 334–348.
Chegel V., Rachkov O., Lopatynskyi A., et al. (2012) Gold nanoparticles aggregation: drastic
effect of cooperative functionalities in a single molecular conjugate, J. Phys. Chem. C,
116, 2683–2690.
Chen D.–B., Yang T., Lu W.–L., Zhang Q. (2001) In vitro and in vivo study of two types of
long-circulating solid lipid nanoparticles containing paclitaxel, Chem. Pharm. Bull.,
49(11), 1444–1447.
Chen L., Wang J., Li W., Han H. (2012) Aqueous one-pot synthesis of bright and ultrasmall
CdTe/CdS near-infrared-emitting quantum dots and their application for tumor targeting
in vivo, Chem. Commun., 48, 4971–4973.
Chen C., He X., Gao L., Ma N. (2013) Cation exchange-based facile aqueous synthesis of
small, stable, and nontoxic near-infrared Ag2Te/ZnS Core/Shell quantum dots emitting
in the second biological window, ACS Appl. Mater. Interf., 5, 1149–1155.
Chen X., Gao C. (2017) Influences of size and surface coating of gold nanoparticles on
inflammatory activation of macrophages, Colloids Surf. B, 160, 372–380.
Chen Y., Xianyu Y., Jiang X. (2017) Surface modification of gold nanoparticles with small
molecules for biochemical analysis, Acc. Chem. Res., 50(2), 310–319.
Chen L., Wu M., Jiang S., et al. (2019) Skin toxicity assessment of silver nanoparticles in a
3D epidermal model compared to 2D keratinocytes, Int. J. Nanomedicine, 14, 9707.
Chequer F., Venâncio V., Bianchi M., Antunes L. (2012) Genotoxic and mutagenic effects of ery-
throsine B, a xanthene food dye, on HepG2 cells, Food Chem. Toxicol., 50(10), 3447–3451.
Chin A., Yaacob I. (2007) Synthesis and characterization of magnetic iron oxide nanoparticles via
w/o microemulsion and Massart’s procedure, J. Mater. Process. Technol., 191, 235–237.
Chithrani B., Ghazani A., Chan W. (2006) Determining the size and shape dependence of gold
nanoparticle uptake into mammalian cells, Nano Lett., 6, 662–668.
Chithrani B., Chan W. (2007) Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of
protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes, Nano Lett., 7, 1542.
Choi H., Liu W., Misra P., et al. (2007) Renal clearance of quantum dots, Nat. Biotechnol.,
25(10), 1165–1170.
Choi K.–C., Bang J.–Y., Kim P.–I., et al. (2008) Amphotericin B-incorporated polymeric
micelles composed of poly(d,l-lactide-co-glycolide)/dextran graft copolymer, Int. J.
Pharm., 355(1–2), 224–230.
Choi H., Ipe B., Misra P., et al. (2009) Tissue and organ-selective biodistribution of NIR
fluorescent quantum dots, Nano Lett ., 9, 2354–2359.
352
Choi C., Zuckerman J., Webster P., Davis M. (2011) Targeting kidney mesangium by
nanoparticles of defined size, Proc. Natl. Acad. Sci., 108(16), 6656–6661.
Christiansen T., Cotte M., de Nolf W., et al. (2020) Insights into the composition of ancient
Egyptian red and black inks on papyri achieved by synchrotron-based microanalyses,
PNAS, 117(45), 27825–27835.
Cinteza L., Ohulchanskyy T., Sahoo Y., et al. (2006) Diacyllipid micelle-based nanocarrier for
magnetically guided delivery of drugs in photodynamic therapy, Mol. Pharm., 3(4), 415–423.
Cole J., Lary J., Moody T., Laue T. (2008) Analytical ultracentrifugation: sedimentation velocity
and sedimentation equilibrium, Methods Cell Biol., 84, 143–179.
Cole L. (2015) Antibodies and hCG tests, In: Human Chorionic Gonadotropin (HGC) (2–nd
Ed.), Elsevier, pp. 313–321.
Cosgrove T. (Ed.) (2005) Colloid science: principles, methods and applications, Blackwell
Publishing Ltd.
Costa da Silva M., Breckwoldt M., Vinchi F., et al. (2017) Iron induces anti-tumor activity in
tumor-associated macrophages, Front. Immunol., 8, 1479.
Coty J.–B., Eleamen Oliveira E., Vauthier C. (2017) Tuning complement activation and
pathway through controlled molecular architecture of dextran chains in nanoparticle
corona, Int. J. Pharm., 532(2), 769–778.
Couvreur P., Tulkens P., Roland M., et al. (1977) Nanocapsules: a new type of lysosomotropic
carrier, FEBS Lett., 84(2), 323.
Couvreur P., Kante B., Roland M., Speiser P. (1979) Adsorption of antineoplastic drugs to
polyalkylcyanoacrylate nanoparticles and their release in calf serum, J. Pharm. Sci.,
68(12), 1521–1524.
Couvreur P., Fattal E., Andremont A. (1991) Pharm. Res., 8(9), 1079–1086.
Creighton J., Blatchford C., Albrecht M. (1979) Plasma resonance enhancement of Raman
scattering by pyridine adsorbed on silver or gold sol particles of size comparable to the
excitation wavelength, J. Chem. Soc., Faraday Trans. II, 75, 790–798.
Crowley L., Marfell B., Waterhouse N. (2016) Analyzing cell death by nuclear staining with
Hoechst 33342, Cold Spring Harb. Protoc., 2016(9), 778–781.
Cruz T., Gaspar R., Donato A., Lopez C. (1997) Interaction between polyalkylcyanoacrylate
nanoparticles and peritoneal macrophages: MTT metabolism, NBT reduction, and NO
production, Pharm. Res., 14(1), 73–79.
Culpeper N. (1657) Mr. Culpepper's Treatise of aurum potabile, London.
Dabbousi B., Rodriguez–Viejo J., Mikulec F., et al. (1997) (CdSe)ZnS core-shell quantum
dots: synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites,
J. Phys. Chem. B, 101, 9463.
Dagtepe P., Chikan V., Jasinski J., Leppert V. (2007) Quantized growth of CdTe quantum
dots; observation of magic-sized CdTe quantum dots, J. Phys. Chem. C, 111, 14977–14983.
Dahan M., Levi S., Luccardini C., et al. (2003) Diffusion dynamics of glycine receptors
revealed by single-quantum dot tracking, Science, 302, 442.
353
Dahiya D., Renuka, Puniya A. (2018) Impact of nanosilver on gut microbiota: a vulnerable
link, Future Microbiol., 13, 483–492.
Dalzon B., Aude–Garcia C., Diemer H., et al. (2020) The longer the worse: a combined
proteomic and targeted study of the long-term versus short-term effects of silver nano-
particles on macrophages, Environ. Sci.: Nano, 7, 2032–2046.
Damasceno J., Zarbin A. (2018) Electrostatic stabilization of multi–walled carbon nanotubes
dispersed in nonaqueous media, J. Colloid Interf. Sci., 529, 187–196.
Dameron C., Reese R., Mehra R., et al. (1989a) Biosynthesis of cadmium sulfide quantum
semiconductor crystallites, Nature, 338, 596.
Dameron C., Smith B., Winge D. (1989b) Glutathione–coated cadmium sulfide crystallites in
C. Glabrata, J. Biol. Chem., 264, 17355–17360.
Dandamudi S., Campbell R. (2007) The drug loading, cytotoxicty and tumor vascular targeting
characteristics of magnetite in magnetic drug targeting, Biomaterials, 28(31), 4673–4683.
Daniel M.–C., Astruc D. (2004) Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry,
quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nano-
technology, Chem. Rev., 104, 293–346.
Darbandi M., Thomann R., Nann T. (2005) Single quantum dots in silica spheres by micro-
emulsion synthesis, Chem. Mater., 17, 5720–5725.
Dadfar S., Roemhild K., Drude N., et al. (2019) Iron oxide nanoparticles: diagnostic,
therapeutic and theranostic applications, Adv. Drug Deliv. Rev., 138, 302–325.
Das R., Pachapur V., Lonappan L., et al. (2017) Biological synthesis of metallic nanoparticles:
plants, animals and microbial aspects, Nanotechnol. Environ. Eng., 2, 18.
Davda J., Labhasetwar V. (2002) Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells,
Int. J. Pharm., 233(1–2), 51–59.
De Jong W., Hagens W., Krystek P., et al. (2008) Particle size-dependent organ distribution
of gold nanoparticles after intravenous administration, Biomaterials, 29(12), 1912–1919.
De Jong W., Van Der Ven L., Sleijffers A., et al. (2013) Systemic and immunotoxicity of silver
nanoparticles in an intravenous 28 days repeated dose toxicity study in rats, Biomaterials,
34, 8333–8343.
De Rooy N., De Bruyn P., Overbeek J.T. (1980) Stability of dispersions in polar organic
media, J. Colloid Interf. Sci., 75(2), 542–554.
Decker T., Lohmann–Matthes, M.–L. (1988) A quick and simple method for the quantitation
of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor
necrosis factor (TNF) activity, J. Immunol. Methods, 115(1), 61–69.
Deirram N., Zhang C., Kermaniyan S. (2019) pH-Responsive polymer nanoparticles for drug
delivery, Macromol. Rapid Commun., 40, 1800917.
Delgado A., González–Caballero F., Hunter R., et al. (2005) Measurement and interpretation of
electrokinetic phenomena (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem., 77(10), 1753–1805.
Denkova P., Momekova D., Rangelov S., et al. (2010) Investigation of sterically stabilized
liposomes by diffusion ordered NMR spectroscopy, J. Control. Release, 148, e47–48.
354
Derenzis F., Schechtman A. (1973) Staining by neutral red and trypan blue in sequence for
assaying vital and nonvital cultured cells, Stain Technol., 48(3), 135–136.
Derfus A. (2004) Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots, Nano Lett., 4, 11.
Derjaguin B., Landau L. (1941) Theory of the stability of strongly charged lyophobic sols and
of the adhesion of strongly charged particles in solutions of electrolytes, Acta Phys.
Chim., 14, 633–662 (Prog. Surf. Sci., 43, 30–59; 1993).
Desai N. (2016) Nanoparticle Albumin-bound paclitaxel (Abraxane®), In: Otagiri M. and
Chuang V. (Eds.) Albumin in medicine, Springer, p. 101.
Di J., Xie F., Xu Y. (2020) When liposomes met antibodies: drug delivery and beyond, Adv.
Drug Deliv. Rev., 154/155, 151–162.
Diaspro A. (Ed.) (2011) Optical fluorescence microscopy – from spectral to the nano
dimension, Springer.
Ding C., Li Z. (2017) A review of drug release mechanisms from nanocarrier systems, Mater.
Sci. Eng. C, 76, 1440–1453.
Dobrovolskaia M., Germolec D., Weaver J. (2009) Evaluation of nanoparticle
immunotoxicity, Nat. Nanotechnol., 4(7), 411–414.
Dobrovolskaia M., Shurin M., Shvedova A. (2016) Current understanding of interactions
between nanoparticles and the immune system, Toxicol. Appl. Pharmacol., 299, 78–89.
Domenech A., Domenech–Carbo M., de Agredos–Pascual M. (2011) From Maya blue to
“Maya yellow”: a connection between ancient nanostructured materials from the volt-
ammetry of microparticles, Angew. Chem. Int. Ed., 50, 5741.
Donahue N., Acar H., Wilhelm S. (2019) Concepts of nanoparticle cellular uptake, intra-
cellular trafficking, and kinetics in nanomedicine, Adv. Drug Deliv. Rev., 143, 68.
Donega C., Hickey S., Wuister S., et al. (2003) Single-step synthesis to control the photolumi-
nescence quantum yield and size dispersion of CdSe nanocrystals, J. Phys. Chem. B, 107, 489.
Dong B., Li C., Chen G., et al. (2013) Facile synthesis of highly photoluminescent Ag2Se
quantum dots as a new fluorescent probe in the second near–infrared window for in vivo
imaging, Chem. Mat., 25, 2503–2509.
Dong Y., Hajfathalian M., Maidment P., et al. (2019) Effect of gold nanoparticle size on their
properties as contrast agents for computed tomography, Sci. Rep., 9, 14912.
Dong J., Carpinone P., Pyrgiotakis G., et al. (2020) Synthesis of precision gold nanoparticles
using Turkevich method, KONA Powder Particle J., 37, 224–232.
Doodnauth S., Grinstein S., Maxson M. (2019) Constitutive and stimulated macropinocytosis
in macrophages: roles in immunity and in the pathogenesis of atherosclerosis, Phil. Trans.
R. Soc. B, 374, 20180147.
Douglas S., Davis S., Illum L. (1986) Biodistribution of poly(butyl 2-cyanoacrylate) nano-
particles in rabbits, Int. J. Pharm., 34(1–2), 145–152.
Drummond D., Noble C., Guo Z., et al. (2006) Development of a highly active nanoliposomal
irinotecan using a novel intraliposomal stabilization strategy, Cancer Res., 66(6), 3271–3277.
355
D’Souza S. (2014) A review of in vitro drug release test methods for nano-sized dosage forms,
Adv. Pharmaceutics, 2014, Article ID 304757.
Du Y., Xu B., Fu T., et al. (2010) Near-infrared photoluminescent Ag2S quantum dots from a
single source precursor, J. Am. Chem. Soc., 132, 1470–1471.
Du B., Li Z., Liu C. (2006) One-step homogeneous detection of DNA hybridization with gold
nanoparticle probes by using a linear light-scattering technique, Angew. Chem., 45,
8022–8025.
Du B., Yu M., Zheng J. (2018) Transport and interactions of nanoparticles in the kidneys, Nat.
Rev. Mater., 3, 358–374.
Dubertret B., Skourides P., Norris D., et al. (2002) In vivo imaging of quantum dots
encapsulated in phospholipid micelles, Science, 298, 1759.
Duong V.–A., Nguyen T.–T.–L., Maeng H.–J. (2020) Preparation of solid lipid nanoparticles
and nanostructured lipid carriers for drug delivery and the effects of preparation
parameters of solvent injection method, Molecules, 25(20), 4781.
Dushkin C., Papazova K., Dushkina N., Adachi E. (2005) Attenuated quantum confinement
of the exciton in semiconductor nanoparticles, Colloid Polym. Sci., 284, 80–85.
Dutz S. (2016) Are magnetic multicore nanoparticles promising candidates for biomedical
applications? IEEE Trans. Magn., 52(9), Art no. 0200103.
Dykman L., Khlebtsov N. (2019) Methods for chemical synthesis of colloidal gold, Russ.
Chem. Rev., 88(3), 229–247.
Dziendzikowska K., Gromadzka–Ostrowska J., Lankoff A., et al. (2012) Time-dependent
biodistribution and excretion of silver nanoparticles in male Wistar rats, J. Applied
Toxicology, 32(11), 920–928.
Einstein A. (1905) Über die von der molekularkinetischen Theorie der Wärme geforderte
Bewegung von in ruhenden Flüssigkeiten suspendierten Teilchen, Annalen der Physik,
322(8), 549–560.
Eisler R. (2003) Chrysotherapy: a synoptic review, Inflamm. Res., 52, 487–501.
El–Boubbou K. (2018) Magnetic iron oxide nanoparticles as drug carriers: clinical relevance,
Nanomedicine, 13(8), 953–971.
Elghanian R., Storhoff J., Mucic R., et al. (1997) Selective colorimetric detection of poly-
nucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles,
Science, 277, 1078.
El–Sayed I., Huang X., El–Sayed M. (2005) Surface plasmon resonance scattering and
absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics:
applications in oral cancer, Nano Lett., 5(5), 829–834.
Elsabahy M., Wooley K. (2013) Cytokines as biomarkers of nanoparticle immunotoxicity,
Chem. Soc. Rev., 42(12), 5552–5576.
Elsaesser A., Howard C. (2012) Toxicology of nanoparticles, Adv. Drug Deliv. Rev., 64, 129–137.
356
Enea M., Peixoto de Almeida M., Eaton P., et al. (2019) A multiparametric study of gold
nanoparticles cytotoxicity, internalization and permeability using an in vitro model of blood-
brain barrier. Influence of size, shape and capping agent, Nanotoxicology, 13(7), 990–1004.
Engberink R., van der Pol S., Döpp E., et al. (2007) Comparison of SPIO and USPIO for in vitro
labeling of human monocytes: MR Detection and cell function, Radiology, 243, 467–474.
Engin A.B., Engin A. (2019) Nanoparticles and neurotoxicity: dual response of glutamatergic
receptors (Ch. 9), In: Progr. Brain Res., 245, ISSN 0079–6123, Elsevier, pp. 281–303.
Erdoğar N., Akkın S., Bilensoy E. (2018) Nanocapsules for drug delivery: an updated review
of the last decade, Recent Pat. Drug Deliv. Formul., 12(4), 252–266.
Estevanato L., Lacava L., Carvalho L., et al. (2012) Long-term biodistribution and biocompatibility
investigation of dextran-coated magnetite nanoparticle using mice as the animal model, J.
Biomed. Nanotechnology, 8, 301–308.
Evangelatov A., Skrobanska R., Mladenov N., et al. (2016) Drug Deliv., 23(7), 2235–2244.
Faivre D., Schüler D. (2008) Magnetotactic bacteria and magnetosomes, Chem. Rev., 108(11), 4875.
Fang J., Nakamura H., Maeda H. (2011) The EPR effect: unique features of tumor blood
vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect,
Adv. Drug Deliv. Rev., 63, 136.
Fang Y., Xue J., Gao S., et al. (2017) Cleavable PEGylation: a strategy for overcoming the
“PEG dilemma” in efficient drug delivery, Drug Deliv., 24(2), 22–32.
Fang Z., Shen Y., Gao D. (2021) Stimulus-responsive nanocarriers for targeted drug delivery,
New J. Chem., 45, 4534–4544.
Faraday M. (1857) The Bakerian Lecture: Experimental relations of gold (and other metals)
to light, Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 147, 145–181.
Fathi N., Hoseinipanah S., Alizadeh Z., et al. (2019) The effect of silver nanoparticles on the
reproductive system of adult male rats: a morphological, histological and DNA integrity
study, Adv. Clin. Exp. Med., 28, 299–305.
Fattal E., Youssef M., Couvreur P., Andremont A. (1989) Treatment of experimental salmonellosis
in mice with ampicillin-bound nanoparticles, Antimicrob. Agents Chemother., 33(9),
1540–1543.
Faulk W., Taylor G. (1971) An immunocolloid method for the electron microscope,
Immunochemistry, 8(11), 1081–1083.
Feng L., Kong X., Chao K., et al. (2005) Efficient phase transfer of hydrophobic CdSe
quantum dots: From nonpolar organic solvent to biocompatible water buffer, Mater.
Chem. Phys., 93, 310.
Ferdous Z., Nemmar A. (2020) Health impact of silver nanoparticles: a review of the
biodistribution and toxicity following various routes of exposure, Int. J. Mol. Sci., 21,
2375 (31 pages).
Fitzpatrick J., Andreko S., Ernst L., et al. (2009) Long-term persistence and spectral blue
shifting of quantum dots in vivo, Nano Lett., 9, 2736–2741.
357
Fleisher M., Loeb L., (1914) The influence of various substances on the growth of mouse
carcinoma, J. Exp. Med., 20(5), 503–521.
Flora S.J.S. (2017) The applications, neurotoxicity, and related mechanism of gold nano-
particles, In: Jiang X. and Gao H. (Eds.) Neurotoxicity of nanomaterials and nano-
medicine, Academic Press, pp. 179–203.
Forest V., Pourchez J. (2017) Preferential binding of positive nanoparticles on cell membranes
is due to electrostatic interactions: a too simplistic explanation that does not take into
account the nanoparticle protein corona, Mater. Sci. Eng. C, 70, 889–896.
Foroozandeh P., Aziz A., (2018) Insight into cellular uptake and intracellular trafficking of
nanoparticles, Nanoscale Res. Lett., 13, 339.
Forssen E. (1997) The design and development of DaunoXome® for solid tumor targeting in
vivo, Adv. Drug Deliv. Rev., 24(2–3), 133–150.
Freestone I., Meeks N., Sax M., Higgitt C. (2007) The Lycurgus cup – a Roman nanotechnology,
Gold Bulletin 40(4), 270.
Frens G., Overbeek J. (1969) Carey Lea’s colloidal silver, Kolloid Z. Z. Polym., 233, 922–929.
Fröhlich E. (2016) Cellular elimination of nanoparticles, Environ. Toxicol. Pharmacol., 46, 90–94.
Fütterer S., Andrusenko I., Kolb U., et al. (2013) Structural characterization of iron oxide/-
hydroxide nanoparticles innine different parenteral drugs for the treatment of iron
deficiency anaemia by electron diffraction (ED) and X–ray powder diffraction (XRPD),
J. Pharm. Biomed. Analysis, 86, 151.
Fujiwara Y., Mukai H., Saeki T., et al. (2019) A multi-national, randomised, open-label,
parallel, phase III non-inferiority study comparing NK105 and paclitaxel in metastatic or
recurrent breast cancer patients, Br. J. Cancer, 120, 475–480.
Gac S., Vermes I., Berg A. (2006) Quantum dots based probes conjugated to Annexin V for
photostable apoptosis detection and imaging, Nano Lett., 6, 1863.
Gagliardi A., Giuliano E., Venkateswararao E., et al. (2021) Biodegradable polymeric nano-
particles for drug delivery to solid tumors, Front. Pharmacol., 12, 601626.
Gallardo M., Couarraze G., Denizot B., et al. (1993) Study of the mechanisms of formation of
nanoparticles and nanocapsules of polyisobutyl-2-cyanoacrylate, Int. J. Pharm., 100, 55–64.
Ganguly R., Singh A.K., Kumar R., et al. (2019) Nanoparticles as modulators of oxidative
stress (ch. 3), In: Nanotechnology in modern animal biotechnology, Elsevier, p. 29–35.
Gao X., Cui Y., Levenson R., et al. (2004) In vivo cancer targeting and imaging with
semiconductor quantum dots, Nat. Biotechnol., 22, 969.
Gao G., Li Y., Lee D. (2013) Environmental pH-sensitive polymeric micelles for cancer
diagnosis and targeted therapy, J. Control. Release, 169(3), 180–184.
Gao W., Chen Y., Zhang Y.,et al. (2018) Nanoparticle-based local antimicrobial drug
delivery, Adv. Drug Deliv. Rev., 127, 46–57.
Gaponenko S.V. (2005) Optical properties of semiconductor nanocrystals, Cambridge University
Press.
358
Garza–Ocaňas L., Ferrer D., Burt J., et al. (2010) Biodistribution and long-term fate of silver
nanoparticles functionalized with bovine serum albumin in rats, Metallomics, 2, 204.
Gasco M. (1993) Method for producing solid lipid microspheres having a narrow size distribution,
US Patent 5,250,236.
Gaspar R., Preat V., Opperdoes F., Roland M. (1992) Macrophage activation by polymeric
nanoparticles of polyalkylcyanoacrylates: activity against intracellular Leishmania dono-
vani associated with hydrogen peroxide production, Pharm. Res., 9, 782–787.
Geisser P. (2007) Safety and efficacy of iron(III)-hydroxide polymaltose complex, Arzneimittel–
Forschung (Drug Research), 57(6a), 439–452.
Gerion D., Pinaud F., Williams S., et al. (2001) Synthesis and properties of biocompatible and
water-soluble silica-coated CdSe/ZnS semiconductor quantum dots, J. Phys. Chem. B,
105, 8861.
Ghanem G., Joubran C., Arnould R., et al. (1993) Labelled polycyanoacrylate nanoparticles
for human in vivo use, Appl. Radiat. Isot., 44(9), 1219–1224.
Ghosh B., Biswas S. (2021) Polymeric micelles in cancer therapy: state of the art, J. Control.
Release, 332, 127–147.
Gibbs W., Drew R., Perfect J. (2005) Liposomal amphotericin B: clinical experience and
perspectives, Expert Rev. Anti Infect. Ther., 3, 167–181.
Gipps E., Groscurth P., Kreuter J., Speiser P. (1987) The effects of polyalkylcyanoacrylate
nanoparticles on human normal and malignant mesenchymal cells in vitro, Int. J. Pharm.,
40(1–2), 23–31.
Gojova A., Guo B., Kota R., et al. (2007) Induction of inflammation in vascular endothelial
cells by metal oxide nanoparticles: effect of particle composition, Environ. Health
Perspect., 115(3), 403–409.
Goldman E., Anderson G., Tran P., et al. (2002) Conjugation of luminescent quantum dots
with antibodies using an engineered adaptor protein to provide new reagents for fluoro-
immunoassays, Anal. Chem., 74, 841–847.
Goldstein J., Newbury D., Echlin P., et al. (2003) Scanning electron microscopy and X-ray
microanalysis (3rd Ed.), Kluwer Academic/Plenum Publishers.
Gomes A., Fernandes E., Lima J. (2006) Use of fluorescence probes for detection of reactive
nitrogen species: a review, J. Fluoresc., 16(1), 119–139.
Gomez M., Guerra J., Myers V., et al. (2009) Nanoparticle size determination by 1H NMR
spectroscopy, J. Am. Chem. Soc., 131(41), 14634–14635.
González J., Shelton W., Díaz–Vallejo M., et al. (2020) Immunological assays for SARS-
CoV-2: an analysis of available commercial tests to measure antigen and antibodies,
Open J. Immunol., doi: 10.4236/oji.2020.102003.
Gonzalez–Carreno T., Morales M., Gracia M., Serna C. (1993) Preparation of uniform γ-
Fe2O3 particles with nanometer size by spray pyrolysis, Mater. Lett., 18, 151–155.
Goodhew P., Humphreys J., Beanland R. (2001) Electron microscopy and analysis (3rd Ed.),
Taylor & Francis.
359
Göppert T., Müller R. (2005) Adsorption kinetics of plasma proteins on solid lipid nano-
particles for drug targeting, Int. J. Pharm., 302(1–2), 172–186.
Göppert T. , Müller R. (2005a) Protein adsorption patterns on poloxamer- and poloxamine-
stabilized solid lipid nanoparticles (SLN), Eur. J. Pharm. Biopharm., 60(3), 361–372.
Gouy G. (1910) Sur la constitution de la charge electrque a la surface d'un electrolyte, Journal
de Physique Theorique et Appliquee Series 4 9, 457–468.
Grecco H., Lidke K., Heintzmann R., et al. (2004) Ensemble and single particle photophysical
properties (two-photon excitation, anisotropy, FRET, lifetime, spectral conversion) of
commercial quantum dots in solution and in live cells, Microsc. Res. Tech., 65, 169–179.
Gref R., Lück M., Quellec P., et al. (2000) ‘Stealth’ corona-core nanoparticles surface
modified by polyethylene glycol (PEG): influences of the corona (PEG chain length and
surface density) and of the core composition on phagocytic uptake and plasma protein
adsorption, Colloids Surf. B, 18, 301–313.
Gregoriadis G., Bacon A., McCormack B., Laing P. (2006) Genetic vaccines: a role for liposomes,
In: Torchilin V. (Ed.), Nanoparticulates as drug carriers, Imperial College Press, pp. 43–55.
Greish K., Sawa T., Fang J., et al. (2004) SMA-doxorubicin, a new polymeric micellar drug
for effective targeting to solid tumours, J. Control. Release, 97(2), 219–230.
Greish K., Nagamitsu A., Fang J., Maeda H. (2005) Copoly(styrene-maleic acid)-pirarubicin
micelles: high tumor-targeting efficiency with little toxicity, Bioconjugate Chem., 16, 230.
Grislain L., Couvreur P., Lenaerts V., et al. (1983) Pharmacokinetics and distribution of a bio-
degradable drug-carrier, Int. J. Pharm., 15, 335–345.
Grossen P., Witzigmann D., Sieber S., Huwyler J. (2017) PEG-PCL-based nanomedicines: A
biodegradable drug delivery system and its application, J. Control. Release, 260, 46–60.
Guinebretière R. (2007) X-ray diffraction by polycrystalline materials, ISTE Ltd.
Guo H., Zhang J., Boudreau M., et al. (2016) Intravenous administration of silver nanoparticles
causes organ toxicity through intracellular ROS-related loss of inter-endothelial junction, Part.
Fibre Toxicol., 13, 21.
Gurunathan S., Kalishwaralal K., Vaidyanathan R., et al. (2009) Biosynthesis, purification and
characterization of silver nanoparticles using Escherichia coli, Colloids Surf. B, 74, 328–335.
Haase A., Tentschert J., Jungnickel H., et al. (2011) Toxicity of silver nanoparticles in human
macrophages: uptake, intracellular distribution and cellular responses, J. Phys.: Conf.
Ser., 304, 012030.
Hadjikirova M., Troyanova P., Simeonova M. (2005) Nanoparticles as drug carrier system of
5-fluorouracil in local treatment of patients with superficial basal cell carcinoma, J.
BUON, 10, 517–521.
Hӓfeli U., Riffle J., Harris–Shekhawat L., et al., (2009) Cell uptake and in vitro toxicity of
magnetic nanoparticles suitable for drug delivery, Mol. Pharm., 6(5), 1417–1428.
Haines P. (1995) Thermal methods of analysis: principles, applications and problems, (Blackie
Academic & Professional).
360
Haiss W., Thanh N., Aveyard J., Fernig D. (2007) Determination of size and concentration of
gold nanoparticles from UV-Vis spectra, Anal. Chem., 79, 4215–4221.
Häkkinen H. (2012) The gold-sulfur interface at the nanoscale, Nat. Chem., 4, 443–455.
Hamad I., Al–Hanbali O., Hunter A., et al. (2010) Distinct polymer architecture mediates switching
of complement activation pathways at the nanosphere-serum interface: implications for stealth
nanoparticle engineering, ACS Nano, 4(11), 6629–6638.
Hama S., Itakura S., Nakai M., et al. (2015) Overcoming the polyethylene glycol dilemma via
pathological environment-sensitive change of the surface property of nanoparticles for
cellular entry, J. Control. Release, 206, 67–74.
Han M., Gao X., Su J., Nie S. (2001) Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical
coding of biomolecules, Nat. Biotechnol., 19, 631.
Haque M., Im H.–Y., Seo J.–E., et al. (2013) Acute toxicity and tissue distribution of
CdSe/CdS-MPA quantum dots after repeated intraperitoneal injection to mice, J. Appl.
Toxicol., 33(9), 940–950.
Harada M., Bobe I., Saito H., et al. (2011) Improved anti-tumor activity of stabilized anthra-
cycline polymeric micelle formulation, NC–6300, Cancer Sci., 102(1), 192–199.
Hardman R (2006) A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physico-
chemical and environmental factors, Environ. Health Perspect., 114(2), 165.
Hardy W. (1900) A preliminary investigation of the conditions which determine the stability
of irreversible hydrosols, Proc. Roy. Soc. London, 66, 110–125.
Harizaj A., De Clercq O., Descamps B., et al. (2019) Biocompatible lipid‐coated persistent
luminescent nanoparticles for in vivo imaging of dendritic cell migration, Part. Part. Syst.
Charact., 1900371.
Hashempour S., Ghanbarzadeh S., Maibach H., et al. (2019) Skin toxicity of topically applied
nanoparticles, Therapeutic Deliv., 10(6), 383–396.
Hauser E., Lynn J. (1940) Experiments in colloid chemistry, Mcgraw–Hill Book Company.
Hawkins M., Soon–Shiong P., Desai N. (2008) Protein nanoparticles as drug carriers in clinical
medicine, Adv. Drug Deliv. Rev., 60, 876–885.
Hayat M. (1989) Colloidal gold – Principles, Methods, and Applications, Academic Press.
He S., Zhang Y., Guo Z., Gu N. (2008) Biological synthesis of gold nanowires using extract
of Rhodopseudomonas capsulate, Biotechnol. Prog., 24, 476.
Helcher H. (1712) Aurum Potabile, oder Gold–Tinctur, Breslau, Leipzig.
Helmholtz H. (1853) Ueber einige gesetze der vertheilung elektrischer ströme in körperlichen
leitern mit anwendung auf die thierisch-elektrischen versuche, Annalen der Physik und
Chemie, 165(6), 211–233.
Hem S., White J. (1995) Structure and properties of aluminum–containing adjuvants, In:
Powell M. and Newman M. (Eds.), Vaccine design: the subunit and adjuvant approach,
Plenum, pp. 249–276.
Heng B., Zhao X., Tan E., Khamis N., et al. (2011) Evaluation of the cytotoxic and inflammatory
potential of differentially shaped zinc oxide nanoparticles, Arch. Toxicol., 85(12), 1517–1528.
361
Henry D. (1931) The cataphoresis of suspended particles. part I. The equation of cataphoresis,
Proc. Royal Soc. A, 133(821), 106–129.
Herb M., Schramm M. (2021) Functions of ROS in macrophages and antimicrobial immunity,
Antioxidants, 10(2), 313.
Herizchi R., Abbasi E., Milani M., Akbarzadeh A. (2016) Current methods for synthesis of
gold nanoparticles, Artif. Cells Nanomed. Biotechnol., 44(2), 596–602.
Higuchi T. (1961) Rate of release of medicaments from ointment bases containing drugs in
suspension, J. Pharm. Sci., 50(10), 874–875.
Hillenkamp F., Peter–Katalinic J. (Eds.) (2007) MALDI MS: A practical guide to instrumen-
tation, methods and applications, Wiley–VCH.
Hillyer J., Albrecht R.(2001) Gastrointestinal persorption and tissue distribution of differently
sized colloidal gold nanoparticles, J. Pharm. Sci., 90, 1927–1936.
Hinkley G., Carpinone P., Munson J., et al. (2015) Oral absorption of PEG-coated versus
uncoated gold nanospheres: does agglomeration matter?, Part. Fibre Toxicol., 12, 9.
Hoa L., Chi N., Nguyen L., Chien D. (2012) Preparation and characterisation of nanoparticles
containing ketoprofen and acrylic polymers prepared by emulsion solvent evaporation
method, J. Exp. Nanosci., 7(2), 189–197.
Hodes M., Palmer C., Warren A. (1960) The effect of surface active agents on the permeability
to dye of the plasma membrane of ehrlich ascites cells, Exp. Cell Res., 21(1), 164–169.
Hofmeister F. (1888) Zur lehre von der wirkung der salze, Arch. Exp. Pathol. Pharmacol., 24, 247.
Honary S., Zahir F. (2013) Effect of zeta potential on the properties of nano-drug delivery
systems – A review (part 1), Tropical J. Pharm. Res., 12(2), 255–264.
Hong S., Choi D., Kim H., et al. (2020) Protein-based nanoparticles as drug delivery systems,
Pharmaceutics, 12, 604.
Hoshino A., Fujioka K., Oku T., et al. (2004) Physicochemical properties and cellular toxicity of
nanocrystal quantum dots depend on their surface modification, Nano Lett., 4, 2163–2169.
Hosseini M., Sarvi M. (2015) Recent achievements in the microbial synthesis of semicon-
ductor metal sulfide nanoparticles, Mater. Sci. Semicond. Processing, 40, 293–301.
Hsu M., Dufresne E., Weitz D. (2005) Charge stabilization in nonpolar solvents, Langmuir,
21, 4881–4887.
Hu Y.–L., Gao J.–Q. (2010) Potential neurotoxicity of nanoparticles, Int. J. Pharm., 394, 115–121.
Hu C., Peng Q., Chen F., et al. (2010) Low molecular weight polyethyleneimine conjugated
gold nanoparticles as efficient gene vectors, Bioconjug. Chem., 5, 836–843.
Hu L., Zhang C., Zeng G., et al. (2016) Metal-based quantum dots: synthesis, surface modi-
fication, transport and fate in aquatic environments and toxicity to microorganisms, RSC
Advances, 6(82), 78595–78610.
Hu G., Guo M., Xu J., et al. (2019) Nanoparticles targeting macrophages as potential clinical
therapeutic agents against cancer and inflammation, Front. Immunol., 10, 1998.
Huang J.–P., Hsieh P., Chen C.–Y., et al. (2015) Nanoparticles can cross mouse placenta and
induce trophoblast apoptosis, Placenta, 36(12), 1433–1441.
362
Huang R., Lau B. (2016) Biomolecule-nanoparticle interactions: elucidation of the thermo-

dynamics by isothermal titration calorimetry, Biochim. Biophys. Acta, 1860, 945–956.
Huang Z., Ma C., Wu M., et al. (2020) Exploring the drug-lipid interaction of weak-
hydrophobic drug loaded solid lipid nanoparticles by isothermal titration calorimetry, J.
Nanopart. Res., 22, 3.
Huang Y., Lu X., Chen R., Chen Y. (2020) Comparative study of the effects of gold and silver
nanoparticles on the metabolism of human dermal fibroblasts, Regen. Biomater., 7, 221–232.
Huang Y., Wang J., Jiang K., Chung E. (2021) Improving kidney targeting: The influence of
nanoparticle physicochemical properties on kidney interactions, J. Control. Release, 334, 127.
Huisgen R. (1961) Centenary lecture – 1,3-Dipolar Cycloadditions, Proc. Chem. Soc. of
London, 357.
Hwang D., Ramsey J., Kabanov A. (2020) Polymeric micelles for the delivery of poorly soluble
drugs: from nanoformulation to clinical approval, Adv. Drug Deliv. Rev., 156, 80–118.
Iavarone C., O’hagan D., Yu D., et al. (2017) Mechanism of action of mRNA-based vaccines,
Exp. Rev. Vaccines, 16(9), 871–881.
Iavicoli I., Fontana L., Nordberg G. (2016) The effects of nanoparticles on the renal system,
Crit. Rev. Toxicol., 46(6), 490–560.
Ibraimi F., Kriz D., Lu M., et al. (2006) Rapid one-step whole blood C-reactive protein magnetic
permeability immunoassay with monoclonal antibody conjugated nanoparticles as
superparamagnetic labels and enhanced sedimentation, Anal. Bioanal. Chem., 384, 651–657.
Illum L., Khan M., Mak E., Davis S. (1986) Evaluation of carrier capacity and release
characteristics for poly( butyl 2-cyanoacrylate) nanoparticles, Int. J. Pharm., 30, 17–28.
Inerbaev T., Masunov A., Khondaker S., et al. (2009) Quantum chemistry of quantum dots:
Effects of ligands and oxidation, J. Chem. Phys., 131, 044106.
Iravani S., Korbekandi H., Mirmohammadi S., Zolfaghari B. (2014) Synthesis of silver nano-
particles: chemical, physical and biological methods, Res. Pharm. Sci., 9(6), 385.
Iravani S. (2019) Bio-based synthesis of magnetic nanoparticles and their applications, In:
Abd–Elsalam K. et al. (Eds.) Magnetic nanostructures, nanotechnology in the life
sciences, Springer.
Ita K. (2020) Polyplexes for gene and nucleic acid delivery: progress and bottlenecks, Eur. J.
Pharm. Sci., 105358.
Iversen T.G., Skotland T.,Sandvig K. (2011) Endocytosis and intracellular transport of
nanoparticles: present knowledge and need for future studies, Nano Today, 6, 176–185.
Izyumov Y., Ozerov R. (1995) Magnetic neutron diffraction (Springer).
Jacob J., P. Lens, R. Balakrishnan (2016) Microbial synthesis of chalcogenide semiconductor
nanoparticles: a review, Microb. Biotechnol., 9(1), 11–21.
Jain P., Lee K., El–Sayed I., El–Sayed M. (2006) Calculated absorption and scattering
properties of gold nanoparticles of different size, shape, and composition: applications in
biological imaging and biomedicine, J. Phys. Chem. B, 110, 7238–7348.
363
Jain K., Mehra N.K., Jain N.K. (2014) Potentials and emerging trends in nanopharmacology,
Curr. Opin Pharmacol., 15, 97–106.
Jamdagni P., Khatri P., Rana J. (2016) Nanoparticles based DNA conjugates for detection of
pathogenic microorganisms, Int. Nano Lett. 6, 139–146.
Jangpatarapongsa K., Polpanich D., Yamkamon V., et al. (2011) DNA detection of chronic
myelogenous leukemia by magnetic nanoparticles, Analyst, 136, 354–358.
Jani P., Halbert G., et al. (1990) Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa-
quantitation and particle-size dependency, J. Pharm. Pharmacol., 42(12), 821–826.
Javidi J., A. Haeri, F. Shirazi, et al. (2017) Synthesis, characterization, in vivo imaging, hemolysis,
and toxicity of hydrophilic Ag2S near-infrared quantum dots, J. Clust. Sci., 28, 165–178.
Jazayeri M., Amani H., Pourfatollah A., et al. (2016) Various methods of gold nanoparticles
(GNPs) conjugation to antibodies, Sensing and Bio–Sensing Res., 9, 17–22.
Jia H.Y., Liu Y., Zhang X.J., et al. (2009) Potential oxidative stress of gold nanoparticles by
induced-NO releasing in serum, J. Am. Chem. Soc., 131, 40–41.
Jia Y.P., Ma B.Y., Wei X.W., Qian Z.Y. (2017) The in vitro and in vivo toxicity of gold nano-
particles, Chin. Chem. Lett., 28(4), 691–702.
Jia J., Wang Z., Yue T., et al. (2020) Crossing bological barriers by engineered nanoparticles,
Chem. Res. Toxicol., 33(5), 1055–1060.
Jiang P., Tian Z.Q., Zhu C.N., et al. (2012) Emission-tunable near-infrared Ag2S quantum
dots, Chem. Mater., 24, 3–5.
Jiang P., Zhu C., Zhang Z., et al. (2012a) Water-soluble Ag2S quantum dots for near-infrared
fluorescence imaging in vivo, Biomaterials, 33, 5130–5135.
Jiang X., Gao H. (Eds.) (2017) Neurotoxicity of nanomaterials and nanomedicine (Elsevier).
Jimenez–Lamana J., Laborda F., Bolea E., et al. (2014) An insight into silver nanoparticles
bioavailability in rats, Metallomics, 6, 2242.
Jin X., Asghar S., Zhu X., et al. (2018) In vitro and in vivo evaluation of 10-hydroxycampto-
thecin-loaded poly(n-butyl cyanoacrylate) nanoparticles prepared by miniemulsion poly-
merization, Colloids Surf. B, 162, 25–34.
Jing L., S. Kershaw, Y. Li, X. Huang, Y. Li, A. Rogach, M. Gao (2016) Aqueous based
semiconductor nanocrystals, Chem. Rev., 116, 10623–10730.
Jo H., Ban C. (2016) Aptamer-nanoparticle complexes as powerful diagnostic and therapeutic
tools, Exp. Mol. Med., 48, e230.
Josefowicz J., Hallett F. (1975) Homodyne electrophoretic light scattering of polystyrene
spheres by laser cross-beam intensity correlation, Applied Optics, 14(3), 740–742.
Joshi M., Müller R. (2009) Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives, Eur. J.
Pharm. Biopharm., 71(2), 161–172.
Joshi S., Chavhan S., Sawant K. (2010) Rivastigmine-loaded PLGA and PBCA nanoparticles:
preparation, optimization, characterization, in vitro and pharmacodynamic studies, Eur.
J. Pharm. Biopharm., 76(2), 189–199.
364
Jungblut S., Eychmüller A. (2020) Modeling nanoparticle aggregation, In: Chem. Modell., 15,
1–27, The Royal Society of Chemistry.
Kallay N., Žalac S. (2002) Stability of nanodispersions: a model for kinetics of aggregation
of nanoparticles, J. Colloid Interf. Sci., 253, 70–76.
Kalyanasundaram K., Borgarello E., Duonghong D., Gratzel M. (1981) Cleavage of water by
visible-light irradiation of colloidal CdS solutions; inhibition of photocorrosion by RuO2,
Angew. Chem. Int. Ed., 20, 987.
Kamaly N., Yameen B., Wu J., Farokhzad O. (2016) Degradable controlled-release polymers
and polymeric nanoparticles: mechanisms of controlling drug release, Chem. Rev., 116, 2602.
Kante B., Couvreur P., Dubois–Krack G., et al. (1982) Toxicity of polyalkylcyanoacrylate
nanoparticles I: free nanoparticles, J. Pharm. Sci., 71(7), 786–790.
Kanwar R., Rathee J., Tanaji M., Mehta S. (2019) Microemulsions as nanotemplates: a soft
and versatile approach, In: Mejuto J. (Ed.), Microemulsion – a chemical nanoreactor.
Karimi M., Eslami M., Sahandi–Zangabad P., et al. (2016) pH-Sensitive stimulus-responsive
nanocarriers for targeted delivery of therapeutic agents, Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed.
Nanobiotechnol., 8(5), 696–716.
Karimi M., Sahandi Zangabad P., Ghasemi A., et al. (2016a) Temperature-responsive smart
nanocarriers for delivery of therapeutic agents: applications and recent advances, ACS
Appl. Mater. Interfaces, 8(33), 21107–21133.
Karnovsky M., Badwey J. (1986) Respiratory burst during phagocytosis: an overview, Methods
Enzymol. (Immunochemical Techniques Part J), 132, 353–354.
Kasongo W., Pardeike J., Müller R., Walker R. (2011) Selection and characterization of suitable
lipid excipients for use in the manufacture of didanosine-loaded solid lipid nanoparticles and
nanostructured lipid carriers, J. Pharm. Sci., 100(12), 5185–5196.
Kasseh A., Keh E. (1998) Transfers of colloidal silica from water into organic solvents of
intermediate polarities, J. Colloid Interf. Sci., 197, 360–369.
Katayose S., Kataoka K. (1996) PEG-Poly(lysine) block copolymer as a novel type of
synthetic gene vector with supramolecular structure, In: Ogata N. et al. (Eds.), Advanced
biomaterials in biomedical engineering and drug delivery system, Springer–Verlag, pp.
319–320.
Kattan J., Droz P., Couvreur P., et al. (1992) Phase I clinical trial and pharmacokinetic
evaluation of doxorubicin carried by polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles, Invest. N.
Drugs, 10, 191–199.
Kelly K., Coronado E., Zhao L., Schatz G. (2003) The optical properties of metal nanoparticles: the
influence of size, shape, and dielectric environment, J. Phys. Chem. B, 107, 668–677.
Khalafalla S.E., Reimers G.W. (1980) Preparation of dilution-stable aqueous magnetic fluids,
IEEE Trans. Magn., 16, 178–183.
Kheirollahpour M., Mehrabi M., Dounighi N. et al. (2020) Nanoparticles and vaccine develop-
ment, Pharm. Nanotechnol.,8(1), 6–21.
365
Khlebtsov N., Dykman L. (2011) Biodistribution and toxicity of engineered gold nano-
particles: a review of in vitro and in vivo studies, Chem. Soc. Rev., 40(3), 1647.
Kim S., Kim D., Shim Y., et al. (2001) In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel
formulation: toxicity and efficacy, J. Control. Release, 72, 191–202.
Kim E.H., Lee H.S., Kwak B.K., Kim B.K. (2005) Synthesis of ferrofluid with magnetic
nanoparticles by sonochemical method for MRI contrast agent, J. Magn. Magn. Mater.,
289, 328–330.
Kim K., Park J.–K. (2005) Magnetic force-based multiplexed immunoassay using superpara-
magnetic nanoparticles in microfluidic channel, Lab Chip, 5, 657–664.
Kim J., Kabanov A., Bronich T. (2009) Polymer micelles with cross-linked polyanion core
for delivery of a cationic drug doxorubicin, J. Control. Release, 138(3), 197–204.
Kim S., Lee J., Lee S.J., Lee H.J. (2010) Ultra-sensitive detection of IgE using biofunctionalized
nanoparticle-enhanced SPR, Talanta, 81, 1755–1759.
Kim D.S., Kim Y.T., Hong S.B., et al. (2016) Development of lateral flow assay based on size-
controlled gold nanoparticles for detection of hepatitis B surface antigen, Sensors, 16, 2154.
Kim S., Kim H., Lee H., Lee K., et al. (2016) Application of a non-hazardous vital dye for cell
counting with automated cell counters, Anal. Biochem., 492, 8–12.
Kim Y., Roh Y. (2018) Effects of microbial growth conditions on synthesis of magnetite
nanoparticles using indigenous Fe(III)-reducing bacteria, Minerals, 8, 212.
Kirdaite G., Leonaviciene L., Bradunaite R., et al. (2019) Antioxidant effects of gold nanoparticles
on early stage of collagen-induced arthritis in rats, Res. Veterinary Sci., 124, 32–37.
Kisi E., Howard C. (2008) Applications of neutron powder diffraction, Series: Oxford Series
on Neutron Scattering in Condensed Matter, Oxford University Press.
Kobayashi H., Hama Y., Koyama Y., et al., (2007) Simultaneous multicolor imaging of five
different lymphatic basins using quantum dots, Nano Lett., 7, 1711–1716.
Koda J., Venook A., Walser E., Goodwin S. (2002) A multicenter, phase I/II trial of hepatic
intra-arterial delivery of doxorubicin hydrochloride adsorbed to magnetic targeted
carriers in patients with hepatocellular carcinoma, Eur. J. Cancer, 38, S18.
Kolb H., Finn M., Sharpless K. (2001) Click chemistry: diverse chemical function from a few
good reactions, Angew. Chem. Int. Ed., 40(11), 2004–2021.
Komarneni S., Katsuki H. (2002) Nanophase materials by a novel microwave-hydrothermal
process, Pure Appl. Chem., 74, 1537–1543.
Kong F.–Y., Zhang J.–W., Li R.–F., et al. (2017) Unique roles of gold nanoparticles in drug
delivery, targeting and imaging applications, Molecules, 22, 1445.
Kotsuchibashi Y. (2020) Recent advances in multi-temperature-responsive polymeric materials,
Polym. J., 52, 681–689.
Koyama Y., Matsui Y., Shimada Y., Yoneda M. (2015) Biodistribution of gold nanoparticles
in mice and investigation of their possible translocation by nerve uptake around the
alveolus, The J. Toxicol. Sci., 40(2), 243–249.
366
Kozma G., Mészáros T., Vashegyi I., et al. (2019) Pseudo-anaphylaxis to polyethylene glycol
(PEG)-coated liposomes: roles of anti-PEG IgM and complement activation in a porcine
model of human infusion reactions, ACS Nano, 13, 9315–9324.
Kratz F. (2008) Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates and nano-
particles, J. Control. Release, 132, 171–183.
Kreuter J. (2001) Nanoparticulate systems for brain delivery of drugs, Adv. Drug Deliv. Rev., 47, 65.
Kreuter J., Shamenkov D., Petrov V., et al. (2002) Apolipoprotein-mediated transport of nano-
particle-bound drugs across the blood–brain barrier, J. Drug Target., 10, 317–325.
Kreuter J., Gelperina S. (2008) Use of nanoparticles for cerebral cancer, Tumori J., 94(2), 271–277.
Kreuter J. (2012) Mechanism of polymeric nanoparticle-based drug transport across the
blood-brain barrier (BBB), J. Microencapsul., 30(1), 49–54.
Kristen A., Ajroud–Driss S., Conceição I., et al. (2018) Patisiran, an RNAi therapeutic for the treatment
of hereditary transthyretin-mediated amyloidosis, Neurodegener. Dis. Manag., 9(1), 5–23.
Krysko D., Vanden Berghe T., Parthoens E., et al. (2008) Methods for distinguishing apoptotic
from necrotic cells and measuring their clearance, Methods Enzymol., 442, 307–341.
Kumar C. (Ed.) (2013) UV–VIS and photoluminescence spectroscopy for nanomaterials
characterization (Springer).
Kumru B., Cruz D., Heil T, et al. (2018) Electrostatic stabilization of carbon nitride colloids
in organic solvents enables stable dispersions and transparent homogeneous CN films for
optoelectronics, J. Am. Chem. Soc., 140, 17532–17537.
Kunckels J. (1676) Nuetliche observationes oder anmerkungen von auro und argento potabili,
Hamburg, Schutzens.
La S., Okano T., Kataoka K. (1996) Preparation and characterization of the micelle-forming
polymeric drug indomethacin-incorporated poly(ethylene oxide)-poly(β-benzyl L-aspartate)
block copolymer micelles, J. Pharm. Sci., 85(1), 85–90.
Labouta H., El–Khordagui L., Kraus T., Schneider M. (2011) Mechanism and determinants
of nanoparticle penetration through human skin, Nanoscale, 3(12), 4989–4999.
Lächelt U., Wagner E. (2015) Nucleic acid therapeutics using polyplexes: a journey of 50
years (and beyond), Chem. Rev., 115(19), 11043–11078.
Lajoie P., Nabi I. (2010) Lipid rafts, caveolae, and their endocytosis, Int. Rev. Cell Mol. Biol.,
282, 135–163.
Lakowicz J. (2006) Principles of fluorescence spectroscopy (3rd edition), Springer.
Larguinho M., Baptista P. (2012) Gold and silver nanoparticles for clinical diagnostics – from
genomics to proteomics, J. Proteomics, 75, 2811–2823.
Laskar A., Eilertsen J., Li W., Yuan X. (2013) SPION primes THP1 derived M2 macrophages
towards M1–like macrophages, Biochem. Biophys. Res. Commun., 441, 737.
LattuadaM., Hatton T. (2007) Functionalization of monodisperse magnetic nanoparticles,
Langmuir, 23, 2158–2168.
Lee P., Meisel D. (1982) Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold
sols, J. Phys. Chem., 86, 3391–3395.
367
Lee K., Lee H., Bae K., Park T. (2010) Heparin immobilized gold nanoparticles for targeted
detection and apoptotic death of metastatic cancer cells, Biomaterials, 31, 6530–6536.
Lee S., Yun M., Jeong S., et al. (2011) Development of docetaxel-loaded intravenous formulation,
Nanoxel–PM™ using polymer-based delivery system, J. Control. Release, 155, 262–271.
Lee J., Zhou Z.–L., Alas G., Behrens S. (2015) Mechanisms of particle charging by surfactants
in nonpolar dispersions, Langmuir, 31(44), 11989–11999.
Leelarasamee N., Howard S., Malanga C., et al. (1986) Kinetics of drug release from poly-
lactic acid – hydrocortisone microcapsule, J. Microencapsulation, 3(3), 171–179.
Leitner W., Ying H., Restifo N. (1999) DNA and RNA-based vaccines: principles, progress
and prospects, Vaccine, 18(9–10), 765–777.
LenaertsV., Nagelkerke J., van Berkel T. , et al. (1984) In vivo uptake of polyisobutyl cyano-
acrylate nanoparticles by rat liver Kupffer, endothelial and parenchymal cells, J. Pharm.
Sci., 73(7), 980–982.
Leng W., Pati P., Vikesland P. (2015) Room temperature seed mediated growth of gold nano-
particles: mechanistic investigations and life cycle assessment, Environ. Sci.: Nano, 2, 440.
Lepeltier E., Bourgaux C., Couvreur P. (2014) Nanoprecipitation and the “Ouzo effect”:
Application to drug delivery devices, Adv. Drug Deliv. Rev., 71, 86–97.
Leroy P., Sapin–Minet A., Pitarch A., et al. (2011) Interactions between gold nanoparticles
and macrophages: activation or inhibition?, Nitric Oxide, 25(1), 54–56.
Lévy M., Lagarde F., Maraloiu V., et al. (2010) Degradability of superparamagnetic nano-
particles in a model of intracellular environment: follow-up of magnetic, structural and
chemical properties, Nanotechnology, 21(39), 395103.
Li H., Rothberg L. (2004) Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA
amplified by the polymerase chain reaction, J. Am. Chem. Soc., 126(35), 10958–10961.
Li H., Wang X., Gao Z., He Z. (2007) Gemini surfactant for fluorescent and stable quantum
dots in aqueous solution, Nanotechnology, 18, 205603.
Li J., Hartono D., Ong C., et al. (2010) Autophagy and oxidative stress associated with gold
nanoparticles, Biomaterials, 31, 5996–6003.
Li J., Muralikrishnan S., Ng C.–T., et al. (2010a) Nanoparticle-induced pulmonary toxicity,
Exp. Biol. Med., 235(9), 1025–1033.
Li J., Zhang Y., Xiao Q., et al. (2011) Mitochondria as target of quantum dots toxicity, J.
Hazard. Mater., 194, 440–444.
Li K., Chen J., Bai S., et al. (2009) Intracellular oxidative stress and cadmium ions release
induce cytotoxicity of unmodified cadmium sulfide quantum dots, Toxicology in Vitro,
23, 1007–1013.
Li L., Mu L., Torchilin V. (2007) Mixed micelles made of Pluronic and PEG-PE for solubilization
of poorly soluble anticancer drug paclitaxel, J. Drug Deliv. Sci. Technol., 17(6), 389–392.
Li L., Chen Y., et al. (2020) In vivo comparison of the biodistribution and toxicity of InP/ ZnS
quantum dots with different surface modifications, Int. J. Nanomed., 15, 1951.
368
Li P., Kumar A., Ma J., et al. (2018) Density gradient ultracentrifugation for colloidal nano-
structures separation and investigation, Science Bulletin, 63(10), 645–662.
Li X., Xu H., Chen Z.–S., Chen G. (2011) Biosynthesis of nanoparticles by microorganisms
and their applications, J. Nanomaterials, 1–16.
Li X., Aldayel A., Cui Z. (2014) Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine
adjuvant activity than traditional aluminum hydroxide microparticles, J. Control. Release,
173, 148–157.
Li Z., Yi Y., Luo X., et al. (2020) Development and clinical application of a rapid IgM‐IgG
combined antibody test for SARS-CoV-2 infection diagnosis, J. Med. Virol., 92, 1518.
Liang R., Li W., Li Y., et al. (2005) An oligonucleotide microarray for microRNA expression
analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe, Nucleic Acid
Res., 33, e17.
Liang F., Lindgren G., Lin A., et al. (2017) Efficient targeting and activation of antigen-presen-
ting cells in vivo after modified mRNA vaccine administration in Rhesus macaques, Mol.
Ther., 25(12), 2635–2647.
Liang G., Ma W., Zhao Y., et al. (2021) Risk factors for pegylated liposomal doxorubicin-
induced moderate to severe hand–foot syndrome in breast cancer patients: assessment of
baseline clinical parameters, BMC Cancer, 21, 362.
Lianos P., Thomas J. (1987) Cadmium sulfide of small dimensions produced in inverted
micelles, J. Colloid Interf. Sci., 117, 505.
Lidke D., Nagy P., Heintzmann R., et al. (2004) Quantum dot ligands provide new insights
into erbB/HER receptor-mediated signal transduction, Nat. Biotechnol., 22(2), 198.
Liedtke S., Wissing S., Müller R., Mäder K. (2000) Influence of high pressure homogenisation
equipment on nanodispersions characteristics, Int. J. Pharm., 196(2), 183–185.
Lifshitz I., Slyozov V. (1961) The kinetics of precipitation from supersaturated solid solutions,
J. Phys. Chem. Solids, 19(1–2), 35–50.
Lin T.–Y., Lian Z.–J., Yao C.–X., et al. (2020) CdSe quantum dots labeled Staphylococcus
aureus for research studies of THP–1 derived macrophage phagocytic behavior, RSC
Adv., 10, 260–270.
Lin Y., Hu C., Chen A., et al. (2020) Neurotoxicity of nanoparticles entering the brain via
sensory nerve-to-brain pathways: injuries and mechanisms, Arch. Toxicol., 94(5), 1479.
Link S., El–Sayed M. (1999) Size and temperature dependence of the plasmon absorption of
colloidal gold nanoparticles, J. Phys. Chem. B, 103, 4212–4217.
Liu M., Kono K., Fréchet J. (2000) Water-soluble dendritic unimolecular micelles: their
potential as drug delivery agents, J. Control. Release, 65(1–2), 121–131.
Liu S., Weaver J., Save M., Armes S. (2002) Synthesis of pH-responsive shell cross-linked
micelles and their use as nanoreactors for the preparation of gold nanoparticles,
Langmuir, 18(22), 8350–8357.
Liu H., Owen J., Alivisatos A. (2007) Mechanistic study of precursor evolution in colloidal
group II–VI semiconductor nanocrystal synthesis, J. Am. Chem. Soc., 129, 305.
369
Liu J., Wang Z., Liu F., et al. (2012) Chemical transformations of nanosilver in biological
environments, ACS Nano, 6(11), 9887–9899.
Liu S., Wang S., Lu S. (2016) DNA immunization as a technology platform for monoclonal
antibody induction, Emerg. Microbes Infect., 5(4), e33.
Liu X., Jiang J., Meng H. (2019) Transcytosis – An effective targeting strategy that is
complementary to “EPR effect” for pancreatic cancer nano drug delivery, Theranostics,
9(26), 8018–8025.
Liu J., Li H.–J., Luo Y.–L., et al. (2019) Enhanced primary tumor penetration facilitates nano-
particle draining into lymph nodes after systemic injection for tumor metastasis inhibition,
ACS Nano, 13, 8, 8648–8658.
Lojk J., Bregar V., Strojan K., et al. (2018) Increased endocytosis of magnetic nanoparticles into
cancerous urothelial cells versus normal urothelial cells, Histochem. Cell Biol., 149, 45–59.
Long Q., Zhu W., Guo L., Pu L. (2020) RGD–conjugated resveratrol HSA nanoparticles as a
novel delivery system in ovarian cancer therapy, Drug Des. Devel. Ther., 14, 5747.
Longley C., Zhao H., Lozanguiez Y., Conover C. (2013) Biodistribution and excretion of
radiolabeled 40kDa polyethylene glycol following intravenous administration in mice, J.
Pharm. Sci., 102(7), 2362–2370.
Lopez–Chaves C., Soto–Alvaredo J., Montes–Bayon M., et al. (2018) Gold nanoparticles: Dis-
tribution, bioaccumulation and toxicity. In vitro and in vivo studies, Nanomedicine, 14, 1–12.
Lorusso D., Di Stefano A., Carone V., et al. (2007) Pegylated liposomal doxorubicin-related
palmar-plantar erythrodysesthesia (’hand-foot’ syndrome), Ann. Oncol., 18, 1159–1164.
Lovric J., Bazzi H., Cuie Y., et al. (2005) Differences in subcellular distribution and toxicity
of green and red emitting CdTe quantum dots, J. Mol. Med., 83(5), 377–385.
Lu A., Salabas E., Schüth F. (2007) Magnetic nanoparticles: synthesis, protection, functionalization,
and application, Angew. Chem. Int. Ed., 46(8), 1222–1244.
Lu W.–L., Qi X.–R. (Eds.) (2021) Liposome-based drug delivery systems (Springer).
Lu Q., Choi K., Nam J.–D., Choi H. (2021) Magnetic polymer composite particles: design
and magnetorheology, Polymers (Basel), 13(4), 512.
Luo Y., Chang L., Lin P. (2015) Metal-based nanoparticles and the immune system:
activation, inflammation, and potential applications, BioMed Res. Int., 2015, 143720.
Lynch I., Cedervall T., Lundqvist M., et al. (2007) The nanoparticle-protein complex as a
biological entity; a complex fluids and surface science challenge for the 21st century,
Adv. Colloid Interf. Sci., 134–135, 167–174.
Lynch I., Dawson K. (2008) Protein-nanoparticle interactions, Nanotoday, 3(1–2), 40–47.
Maeda H. (2001) SMANCS and polymer-conjugated macromolecular drugs: advantages in
cancer chemotherapy, Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 169.
Maeda H. (2012) Macromolecular therapeutics in cancer treatment: the EPR effect and
beyond, J. Control. Release, 164(2), 138–144.
370
Maeda H. (2021) The 35th anniversary of the discovery of EPR effect: a new wave of
nanomedicines for tumor-targeted drug delivery – personal remarks and future prospects,
J. Pers. Med., 11, 229.
Magenheim B., Levy M.Y., Benita S. (1993) A new in vitro technique for the evaluation of
drug release profile from colloidal carriers – ultrafiltration technique at low pressure, Int.
J. Pharm., 94, 115–123.
Maier–Hauff K., Ulrich F., Nestler D., et al. (2011) Efficacy and safety of intratumoral thermo-
therapy using magnetic iron-oxide nanoparticles combined with external beam radiotherapy
on patients with recurrent glioblastoma multiforme, J. Neuro-Oncol., 103, 317–324.
Maincent P., Thouvenot P., Amicabile C., et al. (1992) Lymphatic targeting of polymeric
nanoparticles after intraperitoneal administration in rats, Pharm. Res., 9(12), 1534–1539.
Majumder N., Das N., Das S. (2020) Polymeric micelles for anticancer drug delivery, Ther.
Deliv., 11(10), 613–635.
Makwana V., Karanjia J., Haselhorst T., et al. (2021) Liposomal doxorubicin as targeted
delivery platform: current trends in surface functionalization, Int. J. Pharm., 593, 120117.
Malamatari M., Charisi A., Malamataris S., et al. (2020) Spray drying for the preparation of
nanoparticle-based drug formulations as dry powders for inhalation, Processes, 8, 788.
Malhotra N., Lee J.–S., Liman R., et al. (2020) Potential toxicity of iron oxide magnetic nano-
particles: a review, Molecules, 25, 3159.
Malik B., Pirzadah T., Kumar M., Rehman R. (2017) Biosynthesis of nanoparticles and their
application in pharmaceutical industry, In: Metabolic engineering for bioactive com-
pounds (Kalia V. and Saini A., Eds.), Springer, p. 331–349.
Mamo T., Poland G. (2012) Nanovaccinology: the next generation of vaccines meets 21st
century materials science and engineering, Vaccine, 30(47), 6609–6611.
Mandal M., Donnelly R., Elkabes S., et al. (2013) Maternal immune stimulation during pregnancy
shapes the immunological phenotype of offspring, Brain Behav. Immun., 33, 33–45.
Manil L., Davin J., Duchenne C. , et al. (1994) Uptake of nanoparticles by rat glomerular
mesangial cells in vivo and in vitro, Pharm. Res., 11, 1160–1165.
Manil L., Couvreur P., Mahieu P. (1995) Acute renal toxicity of doxorubicin (adriamycin)-
loaded cyanoacrylate nanoparticles, Pharm. Res., 12(1), 85–87.
Manke A., Wang L., Rojanasakul Y. (2013) Mechanisms of nanoparticle-induced oxidative
stress and toxicity, BioMed Res. Int., 2013, Article ID 942916.
Mansoureh G., Parisa V. (2018) Synthesis of metal nanoparticles using laser ablation
technique, In: Emerging applications of nanoparticles and architecture nanostructures
(Barhoum A., Makhlouf A., Eds.), Elsevier, p. 575–596.
Martin M., Basham J., Chando P., Eah S. (2010) Charged gold nanoparticles in non–polar
solvents: 10-min synthesis and 2D self–assembly, Langmuir, 26(10), 7410–7417.
Marty J., Oppenheim R., Speiser P. (1978) Nanoparticles – a new colloidal drug delivery
system, Pharm. Acta Helv., 53, 17–23.
371
Mason J., Tomlinson I., Rosenthal S., Blakely R. (2005) Labeling cell-surface proteins via
antibody quantum dot streptavidin conjugates, In: Methods in Molecular Biology, vol.
303: NanoBiotechnology Protocols (Rosenthal S. and Wright D., Eds.), Humana Press.
Massart R. (1980) Preparation of aqueous ferrofluids without using surfactant – behavior as a
function of the pH and the counterions, C. R. Seances Acad. Sci. Ser. C, 291, 1–3.
Masson J.–D., Thibaudon M., Bélec L., Crépeaux G. (2016) Calcium phosphate: a substitute
for aluminum adjuvants? Exp. Rev. Vaccines, 16(3), 289–299.
Matsumura Y., Maeda H. (1986) A new concept for macromolecular therapeutics in cancer
chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor
agent SMANCS, Cancer Res., 46, 6387–6392.
Matsumura Y., Hamaguchi T., Ura T., et al. (2004) Phase I clinical trial and pharmacokinetic
evaluation of NK911, a micelle-encapsulated doxorubicin, Br. J. Cancer, 91, 1775.
Mattoussi H., Mauro J., Goldman E., et al. (2000) Self-assembly of CdSe-ZnS quantum dot
bioconjugates using an engineered recombinant protein, J. Am. Chem. Soc., 122, 12142.
Matusiak J., Grządka E. (2017) Stability of colloidal systems – a review of the stability
measurements methods, Ann. Univer. Mariae Curie–Sklodowska Lublin – Polonia, vol.
LXXII, 1, 33–45.
Maughan C., Preston S., Williams G. (2015) Particulate inorganic adjuvants: recent
developments and future outlook, J. Pharm. Pharmacol., 67(3), 426–449.
Mayer C. (2005) NMR studies of nanoparticles, Ann. Rep. NMR Spectroscopy, 205.
Medeiros S., Santos A., Fessi H., Elaissari A. (2011) Stimuli-responsive magnetic particles for
biomedical applications, Int. J. Pharm., 403, 139–161.
Merle P., Camus P., Abergel A., et al. (2017) Safety and efficacy of intra-arterial hepatic
chemotherapy with doxorubicin-loaded nanoparticles in hepatocellular carcinoma,
ESMO Open 2, e000238, doi: 10.1136/esmoopen–2017–000238.
McClements D. (2013) Edible lipid nanoparticles: digestion, absorption, and potential toxicity,
Progr. Lipid Res., 52(4), 409–423.
McFarland J. (1907) The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria
in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines, J. Am. Med.
Assoc., XLIX(14), 1176–1178.
McHugh K., Jing L., et al. (2019) Biocompatible near-infrared quantum dots delivered to the
skin by microneedle patches record vaccination, Sci. Transl. Med., 11(523), eaay7162.
McCarthy J., Weissleder R. (2008) Multifunctional magnetic nanoparticles for targeted
imaging and therapy, Adv. Drug Deliv. Rev., 60, 1241.
McClurg C., Sweek W., Lyon H., et al. (1915) A study of general and localized effects of
intravenous injections of colloidal copper and casein in cases of human cancer, Archiv.
Intern. Med., 15(6), 974.
McFarland A., Haynes C., Mirkin C., et al. (2004) Color my nanoworld, J. Chem. Education,
81(4), 544A.
372
Mi P. (2020) Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery, tumor imaging, therapy and
theranostics, Theranostics, 10(10), 557–4588.
Mie G. (1908) Beitrӓge zur optik trüber medien, speziell kolloidaler metallösunfen, Annalen
der Physik, 330(3), 377–445.
Micic O., Sprague J., Curtis C., et al. (1995) Synthesis and characterization of InP, GaP, and
GaInP2 quantum dots, J. Phys. Chem., 99, 1995, 7754.
Miller M., Zheng Y.–R., Gadde S., et al. (2015) Tumour-associated macrophages act as a
slow-release reservoir of nano-therapeutic Pt(IV) pro-drug, Nat. Commun., 6, 8692.
Miltenyi S., Muller W., Weichel W., Radbruch A. (1990) High-gradient magnetic cell-
separation with MACS, Cytometry 11, 231–238.
Mir M., Ahmed N., Rehman A. (2017) Recent applications of PLGA based nanostructures in
drug delivery, Colloids Surf. B, 159, 217–231.
Mischler R., Metcalfe I. (2002) Inflexal®V a trivalent virosome subunit influenza vaccine:
production, Vaccine, 20, B17–B23.
Mocanu G., Nichifor M., Sacarescu L. (2017) Dextran based polymeric micelles as carriers
for delivery of hydrophobic drugs, Curr. Drug Deliv., 14(3), 406–415.
Mollazadeh S., Mackiewicz M., Yazdimamaghani M. (2021) Recent advances in the redox–
responsive drug delivery nanoplatforms: a chemical structure and physical property
perspective, Mater. Sci. Eng. C, 118, 111536.
Monteiro–Riviere N., Tran C. (Eds.) (2014) Nanotoxicology – progress toward nanomedicine,
CRC Press.
Mora L., Chumbimuni–Torres K., Clawson C., et al. (2009) Real-time electrochemical monitoring
of drug release from therapeutic nanoparticles, J. Control. Release, 140(1), 69–73.
Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods, 65(1–2), 55–63.
Mouaziz H., Veyret R., Theretz A., et al. (2009) Aminodextran containing magnetite nano-
particles for molecular biology applications: preparation and evaluation, J. Biomed.
Nanotechnol., 5(2), 172–181.
Mukai H., Kogawa T., Matsubara N., et al. (2017) A first-in-human phase 1 study of epirubicin-
conjugated polymer micelles (K–912/NC–6300) in patients with advanced or recurrent solid
tumors, Invest. New Drugs, 35(3), 307–314.
Mukherjee P. Senapati S., Mandal D., et al (2002) Extracellular synthesis of gold nanoparticles
by the fungus Fusarium oxysporum, ChemBio–Chem., 3(5), 461–463.
Müller R., Mäder K., Gohla S. (2000) Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug
delivery – a review of the state of the art, Eur. J. Pharm. Biopharm., 50, 161–177.
Müller R., Junghanns J. (2006) Drug nanocrystals/nanosuspensions for the delivery of poorly
soluble drugs, In: Nanoparticulates as drug carriers (Torchilin V., Ed.) (Imperial College
Press), p. 307.
Murray C., Norris D., Bawendi M. (1993) Synthesis and characterization of nearly monodis-
perse CdE (E = S, Se, Te) semiconductor nanocrystallites, J. Am. Chem. Soc., 115, 8706.
373
Nagamitsu A., Greish K., Maeda H. (2009) Elevating blood pressure as a strategy to increase
tumor targeted delivery of macromolecular drug SMANCS: cases of advanced solid
tumors, Jpn. J. Clin. Oncol., 39, 756–766.
Nagarajan V., Chiome T., Sudan S. (2019) Surface modification of metallic nanoparticles. In:
Pathak Y. (Ed.) Surface modification of nanoparticles for targeted drug delivery, Springer, p.
237–244.
Nahrendorf M., Keliher E., Marinelli B., et al., (2010) Hybrid PET-optical imaging using
targeted probes, PNAS, 107(17), 7910–7915.
Nann T. (2005) Phase-transfer of CdSe@ZnS quantum dots using amphiphilic hyperbranched
polyethylenimine, Chem. Commun., 1735.
Nativo P., Prior I., Brust M. (2008) Uptake and intracellular fate of surface-modified gold
nanoparticles, ACS Nano, 2, 1639–1644.
Nehilla B., Allen P., Desai T. (2008) Surfactant-free, drug-quantum-dot coloaded poly(lactide-co-
glycolide) nanoparticles: towards multifunctional nanoparticles, ACS Nano, 2, 538.
Nel A., Xia T., Mädler L., Li N. (2006) Toxic potential of materials at the nanolevel, Science,
311(5761), 622–627.
Nel A., Madler L., Velegol D., et al. (2009) Understanding biophysicochemical interactions
at the nano-bio interface, Nat. Mater., 8(7), 543–557.
Neouze M.–A., Schubert U. (2008) Surface modification and functionalization of metal and
metal oxide nanoparticles by organic ligands, Monatsh. Chem., 139(3), 183–195.
Neuwelt E., Hamilton B., Varallyay C., et al. (2009) Ultrasmall superparamagnetic iron oxides
(USPIOs): a future alternative magnetic resonance (MR) contrast agent for patients at risk
for nephrogenic systemic fibrosis (NSF)? Kidney Int. 75, 465–474.
Newburgh R., Peidle J., Rueckner W. (2006) Einstein, Perrin, and the reality of atoms: 1905
revisited, Am. J. Phys., 74, 478–481.
Newkome G., Moorefield C., Baker G., et al. (1991) Unimolecular micelles, Angew. Chem.
Int. Ed., 30(9), 1178–1180.
Nicolas J., Mura S., Brambilla D., et al. (2013) Design, functionalization strategies and bio-
medical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nano-
carriers for drug delivery, Chem. Soc. Rev., 42(3), 1147–1235.
Nida D., Rahman M., Carlson K., et al. (2005) Fluorescent nanocrystals for use in early
cervical cancer detection, Gynecol. Oncol., 99, S89.
Niemirowicz K., Markiewicz K., Wilczewska A., Car H. (2012) Magnetic nanoparticles as
new diagnostic tools in medicine, Adv. Med. Sci., 57(2), 196–207.
Niikura K., Matsunaga T., Suzuki T., et al. (2013) Gold nanoparticles as a vaccine platform:
influence of size and shape on immunological responses in vitro and in vivo, ACS Nano,
7(5), 3926–3938.
Nishimoto M., Abe S., Yonezawa T. (2018) Preparation of Ag nanoparticles using hydrogen
peroxide as a reducing agent, New J. Chem., 42, 14493–14501.
374
Nishiyama N., Nakagishi Y., Morimoto Y., et al. (2009) Enhanced photodynamic cancer
treatment by supramolecular nanocarriers charged with dendrimer phthalocyanine, J.
Control. Release, 133(3), 245–251.
Norde W. (2003) Colloids and Interfaces in Life sciences, Marcel Dekker Inc., New York.
Norris C., Joseph P., Mackiewicz M., Reed S. (2010) Minimizing formaldehyde use in the
synthesis of gold-silver core-shell nanoparticles, Chem. Mater., 22(12), 3637–3645.
Nowack B., Krug H., Height M. (2011) 120 Years of Nanosilver History: Implications for
Policy Makers, Environ. Sci. Technol., 45, 1177–1183.
Nöske N., Breitung–Faes S., Kwade A. (2019) Electrostatic stabilization and characterization
of fine ground silicon particles in ethanol, Silicon, 11, 3001–3010.
Ogawara K., Furumoto K., Nagayama S., et al. (2004) Pre-coating with serum albumin
reduces receptor-mediated hepatic disposition of polystyrene nanosphere: implications
for rational design of nanoparticles, J. Control. Release, 100(3), 451–455.
Oh N., Park J.–H. (2014) Surface chemistry of gold nanoparticles mediates their exocytosis in
macrophages, ACS Nano, 8(6), 6232–6241.
Oh N., Park J.–H. (2014a) Endocytosis and exocytosis of nanoparticles in mammalian cells,
Int. J. Nanomed., 9(Suppl. 1), 51–63.
Ojea–Jiménez I., Romero F., Bastús N., Puntes V. (2010) Small gold nanoparticles synthesized
with sodium citrate and heavy water: Insights into the reaction mechanism, J. Phys. Chem. C,
114, 1800–1804.
Olivier J.C. (2005) Drug transport to brain with targeted nanoparticles, NeuroRx 2, 108–119.
Olusanya T., Ahmad R., Ibegbu D., et al. (2018) Liposomal drug delivery systems and anti-
cancer drugs, Molecules, 23(4), 907.
Ordanini S., Cellesi F. (2018) Complex polymeric architectures self-assembling in unimolecular
micelles: preparation, characterization and drug nanoencapsulation, Pharmaceutics, 10, 209.
Osada K., Christie R., Kataoka K.(2009) Polymeric micelles from poly(ethylene glycol)-poly-
(amino acid) block copolymer for drug and gene delivery, J. R. Soc. Interface, 6, S325–S339.
Oussoren C., Storm G. (1998) Targeting to lymph nodes by subcutaneous administration of
liposomes, Int. J. Pharm., 162, 39–44.
Owens D.E., Peppas N.A. (2006) Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of
polymeric nanoparticles, Int. J. Pharm., 307, 93–102.
Paal C. (1902) Über colloidales Silber, Ber. Dtsch. Chem. Ges., 35(2), 2224–2236.
Page–Clisson M., Pinto–Alphandary H., Ourevitch M., et al. (1998) Development of cipro-
floxacin-loaded nanoparticles: physicochemical study of the drug carrier, J. Control.
Release, 56, 23–32.
Palazzo G., Valenza G., Dell'Aglio M., De Giacomo A. (2017) On the stability of gold
nanoparticles synthesized by laser ablation in liquids, J. Colloid Interface Sci., 489, 47.
Pan J., Feng S. (2009) Targeting and imaging cancer cells by Folate-decorated, quantum dots
(QDs)– loaded nanoparticles of biodegradable polymers, Biomaterials, 30, 1176.
375
Pan J., Attia S., Filipczak N., Torchilin V. (2020) Dendrimers for drug delivery purposes, In:
Nanoengineered biomaterials for advanced drug delivery (Elsevier), pp. 201–242.
Pandey H., Rani R., Agarwal V. (2016) Liposome and their applications in cancer therapy,
Braz. Arch. Biol. Technol., 59, e16150477.
Pandey P., Gupta P., Yadav S. (2018) Solid lipid nanoparticle: a potential approach in drug
delivery system, Eur. J. Pharm. Med. Res., 5(9), 225–236.
Papini E., Tavano R., Mancin F. (2020) Opsonins and dysopsonins of nanoparticles: facts,
concepts and methodological guidelines, Front. Immunol., 11, 2343.
Parikh R., Singh S., Prasad B., et al. (2008) Extracellular synthesis of crystalline silver
nanoparticles and molecular evidence of silver resistance Morganella sp: towards
understanding biochemical synthesis mechanisms, Chem. Bio. Chem., 9, 1415–1422.
Park E.–J., Yi J., Kim Y., Choi K., Park K. (2010) Silver nanoparticles induce cytotoxicity by
a Trojan-horse type mechanism, Toxicology in Vitro, 24, 872–878.
Park H., Saravanakumar G., Kim J., et al. (2020) Tumor microenvironment sensitive
nanocarriers for bioimaging and therapeutics, Adv. Healthc. Mater., 10(5), 2000834.
Pati R., Shevtsov M., Sonawane A. (2018) Nanoparticle vaccines against infectious diseases,
Front. Immunol., 9, 2224.
Patil T., Deshpande A. (2020) Mannosylated nanocarriers mediated site-specific drug delivery
for the treatment of cancer and other infectious diseases: a state of the art review, J
Control. Release, 320, 239–252.
Patra A., Ding T., Engudar G., et al. (2016) Component-specific analysis of plasma protein
corona formation on gold nanoparticles using multiplexed surface plasmon resonance,
Small, 12(9), 1174–1182.
Patra J., Das G., Fraceto L., et al. (2018) Nano based drug delivery systems: recent develop-
ments and future prospects, J. Nanobiotechnol., 16, 71.
Paul D. (2011) Elaborations on the Higuchi model for drug delivery, Int. J. Pharm., 418, 13.
Paul W., Sharma C. (2020) Inorganic nanoparticles for targeted drug delivery, In: Sharma C.
(Ed.) Biointegration of medical implant materials (2nd Ed.), Elsevier, pp. 333–373.
Peek L., Middaugh C., Berkland C. (2008) Nanotechnology in vaccine delivery, Adv. Drug
Deliv. Rev., 60(8), 915–928.
Pelaz B., del Pino P., Maffre P., et al. (2015) Surface functionalization of nanoparticles with
polyethylene glycol: effects on protein adsorption and cellular uptake, ACS Nano, 9, 6996.
Peng X., Wickham J., Alivisatos P. (1998) Kinetics of II–VI and III–V colloidal semiconductor
nanocrystal growth: “focusing” of size distributions, J. Am. Chem. Soc., 120, 5343–5344.
Peng Z., Peng X. (2001) Formation of high-quality CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals using
CdO as precursor, J. Am. Chem. Soc., 123, 183.
Pennycook S., Nellist P. (Eds.) (2011) Scanning transmission electron microscopy (Springer).
Peracchia M., Vauthier C., Passirani C., et al. (1997) Complement consumption by poly-
(ethylene glycol) in different conformations chemically coupled to poly(isobutyl 2–
cyanoacrylate) nanoparticles, Life Sci., 61(1), 749–761.
376
Peracchia M., Vauthier C., Puisieux F., Couvreur P. (1997a) Development of sterically
stabilized poly(isobutyl 2–cyanoacrylate) nanoparticles by chemical coupling of poly-
(ethylene glycol), J. Biomed. Mater. Res., 34(3), 317–326.
Perkampus H.–H. (1992) UV–VIS spectroscopy and its applications, Springer–Verlag.
Perez J., Josephson L., O’Loughlin T., et al. (2002) Magnetic relaxation switches capable of
sensingmolecular interactions, Nat. Biotechnol., 20, 816–820.
Perrin J. (1909) Le mouvement brownien et la réalité moleculaire, Ann. Chimi. Phys., 18, 5.
Petrarca C., Mangifesta R., Di Giampaolo L. (2020) Immunotoxicity of nanoparticles (Ch. 6),
In: Allergy and immunotoxicology in occupational health – the next step (Otsuki T. et al.,
Eds.), Current topics in environmental health and preventive medicine (Springer).
Petri B., Bootz A., Khalansky A., et al. (2007) Chemotherapy of brain tumour using doxo-
rubicin bound to surfactant-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles: revisiting the
role of surfactants, J. Contr. Release, 117, 51–58.
Pinaud F., Michalet X., Bentolila L., et al. (2006) Advances in fluorescence imaging with
quantum dot bio–probes, Biomaterials, 27, 1679.
Pinto–Alphandary H., Balland O., Laurent M. et al. (1994) Intracellular visualization of ampicillin-
loaded nanoparticles in peritoneal macrophages infected in vitro with Salmonella
typhimurium, Pharm. Res., 11, 38–46.
Pinto–Alphandary H., Andremont A., Couvreur P. (2000) Targeted delivery of antibiotics using
liposomes and nanoparticles: research and applications, Int. J. Antimicrob. Agents, 13, 155.
Pleskova S., Kriukov R., Gorshkova E., Boryakov A. (2019) Characteristics of quantum dots
phagocytosis by neutrophil granulocytes, Heliyon, 5(3), e01439.
Plouffe B., Murthy S., Lewis L. (2015) Fundamentals and application of magnetic particles in
cell isolation and enrichment, Rep. Prog. Phys., 78, 016601.
Polte J. (2015) Fundamental growth principles of colloidal metal nanoparticles – a new
perspective, CrystEngComm, 17(36), 6809–6830.
Pons T., Medintz I., Sapsford K., et al. (2007) On the quenching of semiconductor quantum
dot photoluminescence by proximal gold nanoparticles, Nano Lett., 7(10), 3157.
Pons T., Pic E., Lequeux N., et al., (2010) Cadmium-free CuInS2/ZnS quantum dots for
sentinel lymph node imaging with reduced toxicity, ACS Nano, 4(5), 2531–2538.
Poole C. P., Owens F. (2003) Introduction to Nanotechnology, Wiley, New York, p. 90.
Poon W., ZhangY.–N., Ouyang B., et al. (2019) Elimination pathways of nanoparticles, ACS
Nano, 13, 5785–5798.
Popova M., Trendafilova I., Tsacheva I., et al. (2018a) Amino-modified KIT-6 mesoporous
silica/polymer composites for quercetin delivery: Experimental and theoretical approaches,
Microporous Mesoporous Mater., 270, 40.
Popova M., Trendafilova I., Szegedi Á., et al. (2018b) Novel SO3H functionalized magnetic
nanoporous silica/polymer nanocomposite as a carrier in a dual-drug delivery system for
anticancer therapy, Microporous Mesoporous Mater., 263, 96.
377
Popova M., Koseva N., Trendafilova I., et al. (2020) Tamoxifen delivery system based on
PEGylated magnetic MCM-41 silica, Molecules, 25, 5129.
Popova M. (2021) Novel approaches in the preparation of nanoporous materials with application
as catalysts or drug carriers, DSc Thesis, Sofia, Bulgaria.
Pradhan N., Battaglia D. Liu Y., Peng X. (2007) Surface ligand dynamics in growth of nano-
crystals, Nano Lett., 7, 312.
Pulendran B., Ahmed R. (2011) Immunological mechanisms of vaccination, Nat. Immunol.,
12(6), 509–517.
Purves R. (1992) Optimum numerical integration methods for estimation of area-under-the-curve
(AUC) and area-under-the-moment-curve (AUMC), J. Pharmacokinetics Biopharmaceutics,
20(3), 211–226.
Rabe M., Verdes D., Seeger S. (2011) Understanding protein adsorption phenomena at solid
surfaces, Adv. Colloid Interf. Sci., 162(1–2), 87–106.
Radziuk D., Grigoriev D., Zhang W., et al. (2010) Ultrasound-assisted fusion of preformed
gold nanoparticles, J. Phys. Chem. C, 114(4), 1835–1843.
Rampado R., Crotti S., Caliceti P., et al. (2020) Recent advances in understanding the protein
corona of nanoparticles and in the formulation of “stealthy” nanomaterials, Front. Bioeng.
Biotechnol., 8, 166.
Rao J., Geckeler K. (2011) Polymer nanoparticles: preparation techniques and size-control
parameters, Progr. Polymer Sci., 36(7), 887–913.
Raza K., Kumar N., Misra C., et al. (2016) Dextran-PLGA-loaded docetaxel micelles with
enhanced cytotoxicity and better pharmacokinetic profile, Int. J. Biol. Macromol., 88, 206.
Raza A., Hayat U., Rasheed T., et al. (2018) Redox-responsive nano–carriers as tumor-
targeted drug delivery systems, Eur. J. Med. Chem., 157, 705–715.
Regel L., Wilcox W. (Eds.) (2001) Processing by centrifugation (Springer).
Reibold M., Paufler P., Kochmann W. (2007) Nanocementite and carbon nanotubes in a
damascene sabre, Microsc. Microanal., 13 (Suppl. 3), 274.
Reimer P., Balzer T. (2003) Ferucarbotran (Resovist): a new clinically approved RES-specific
contrast agent for contrast-enhanced MRI of the liver: properties, clinical development,
and applications, Eur. Radiol., 13, 1266–1276.
Reiss H. (1951) The growth of uniform colloidal dispersions, J. Chem. Phys., 19, 482–487.
Rempel J., Bawendi M., Jensen K. (2009) Insights into the kinetics of semiconductor nano-
crystal nucleation and growth, J. Am. Chem. Soc., 131, 4479–4489.
Rennick J., Johnston A., Parton R. (2021) Key principles and methods for studying the
endocytosis of biological and nanoparticle therapeutics, Nat. Nanotechnol., 16, 266.
Rettcher S., Jungk F., Kühn C., et al. (2015) Simple and portable magnetic immunoassay for
rapid detection and sensitive quantification of plant viruses, Appl. Environ. Microbiol.,
81, 3039–3048.
Rich J., Neely J., Paniello R., et al. (2010) A practical guide to understanding Kaplan–Meier
curves, Otolaryngol Head Neck Surg., 143(3), 331–336.
378
Richards D., Maruani A., Chudasama V. (2017) Antibody fragments as nanoparticle targeting
ligands: a step in the right direction, Chem. Sci., 8, 63–77.
Rife J., Miller M., Sheehan P., et al. (2003) Design and performance of GMR sensors for the
detection of magnetic microbeads in biosensors, Sensors and Actuators A, 107, 209.
Rijcken C., Snel C., Schiffelers R., et al. (2007) Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive
polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies, Biomaterials, 28, 5581.
Ritger P., Peppas N. (1987) A simple equation for description of solute release I. Fickian and
non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or
discs, J. Control. Release, 5(1), 23–36.
Ritger P., Peppas N. (1987a) A simple equation for description of solute release II. Fickian
and anomalous release from swellable devices, J. Control. Release, 5(1), 37–42.
Rodgers A., Velický M., Dryfe R. (2015) Electrostatic stabilization of graphene in organic
dispersions, Langmuir, 31, 13068–13076.
Rodriguez–Garraus A., Azqueta A.,Vettorazzi A., López de Cerain A. (2020) Genotoxicity of
silver nanoparticles, Nanomaterials, 10, 251.
Romano E., Stolinski C., Hughes–Jones N. (1974) An antiglobulin reagent labeled with
colloidal gold for use in electron microscopy, Immunochemistrv, 11, 521–522.
Roser M., Fischer D., Kissel T. (1998) Surface-modified biodegradable albumin nano- and
microspheres. II: effect of surface charges on in vitro phagocytosis and biodistribution in
rats, Eur. J. Pharm. Biopharm., 46(3), 255–263.
Roth J., Bendayan M., Orci L. (1978) Ultrastructural localization of intracellular antigens by
the use of protein A-gold complex, The J. Histochem. Cytochem., 26(12), 1074–1081.
Rümenapp C., Gleich B., Haase A. (2012) Magnetic nanoparticles in magnetic resonance
imaging and diagnostics, Pharm. Res., 29, 1165–1179.
Sabella S., Carney R., Brunetti V., et al. (2014) A general mechanism for intracellular toxicity
of metal-containing nanoparticles, Nanoscale, 6(12), 7052–7061.
Sadauskas E., Wallin H., Stoltenberg M., et al. (2007) Kupffer cells are central in the removal
of nanoparticles from the organism, Part. Fibre Toxicol., 4(1), 10.
Sadauskas E., Danscher G., Stoltenberg M., et al. (2009) Protracted elimination of gold nano-
particles from mouse liver, Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Med., 5(2), 162–169.
Safarik I., Safarikova M., Forsythe S. (1995) The application of magnetic separations in
applied microbiology, J. Appl. Microbiol., 78, 575–585.
Sahay G, Alakhova D., Kabanov A. (2010) Endocytosis of nanomedicines, J. Control.
Release, 145, 182–195.
Sahay G., Kim J., Kabanov A., Bronich T. (2010) The exploitation of differential endocytic
pathways in normal and tumor cells in the selective targeting of nanoparticulate chemo-
therapeutic agents, Biomaterials, 31(5), 923–933.
Saito G., Swanson J., Lee K.–D. (2003) Drug delivery strategy utilizing conjugation via
reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv. Drug Deliv.
Rev., 55(2), 199–215.
379
Sakhtianchi R., Minchin R., Lee K.–B., et al. (2013) Exocytosis of nanoparticles from cells:
role in cellular retention and toxicity, Adv. Colloid Interf. Sci., 201–202, 18–29.
Sakurai Y., Akita H., Harashima H. (2019) Targeting tumor endothelial cells with nano-
particles, Int. J. Mol. Sci., 20(23), 5819.
Samali A., Holmberg C., Sistonen L., Orrenius S. (1999) Thermotolerance and cell death are
distinct cellular responses to stress: dependence on heat shock proteins, FEBS Lett., 461, 306.
Samanta A., Medintz I. (2016) Nanoparticles and DNA – a powerful and growing functional
combination in bionanotechnology, Nanoscale, 8, 9037.
Sanità G., Carrese B., Lamberti A. (2020) Nanoparticle surface functionalization: how to
improve biocompatibility and cellular internalization, Front. Mol. Biosci., 7, 587012.
Saraiva C., Praça C., Ferreira R., et al. (2016) Nanoparticle-mediated brain drug delivery:
overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases, J. Control. Release,
235, 34–47.
Saran A., Bellare R. (2010) Green engineering for large–scale synthesis of water soluble and
bio–taggable CdSe and CdSe–CdS quantum dots from microemulsion by double–
capping, Colloids Surf. Physicochem. Eng. Aspects 369 (10), 165–175.
Sarhan O., Hussein R. (2014) Effects of intraperitoneally injected silver nanoparticles on histo-
logical structures and blood parameters in the albino rat, Int. J. Nanomedicine, 9, 1505–1517.
Sawant R., Hurley J., Salmaso S., et al. (2006) “SMART” drug delivery systems: double-
targeted pH-responsive pharmaceutical nanocarriers, Bioconjugate Chem., 17, 943–949.
Schamberg J. (1928) Chrysoderma, Arch. Dermatol.Syphilology, 18(6), 862–867.
Scherer F., Anton M., Schillinger U., et al. (2002) Magnetofection: enhancing and targeting
gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo, Gene Ther., 9(2), 102–109.
Schipper M., Cheng Z., Lee S.–W., et al. (2007) MicroPET-based biodistribution of quantum
dots in living mice, J. Nucl. Med., 48, 1511–1518.
Schipper M., Iyer G., Koh A., et al. (2009) Particle size, surface coating, and PEGylation
influence the biodistribution of quantum dots in living mice, Small, 5, 126–134.
Schlee H., Zweifel E. (1924) Über das Verhalten von Silberprӓparaten, insbesondere von
Kollargol im Organismus, Z. Hyg. Infekt., 102, 454–460.
Schroedter, A., Weller H. (2002) Biofunctionalization of silica-coated CdTe and gold nano-
crystals, Nano Lett. 2, 1363.
Schotter J., Kamp P., Becker A., et al. (2004) Comparison of a prototype magnetoresistive
biosensor to standard fluorescent DNA detection, Biosens. Bioelectron., 19, 1149.
Schudel A., Francis D., Thomas S. (2019) Material design for lymph node drug delivery, Nat.
Rev. Mater., 4(6), 415–428.
Schulze H. (1882) Schwefelarsen in wässriger Lösung, J. Prakt. Chem., 25(1), 431–452.
Schubert M., Müller–Goymann C. (2003) Solvent injection as a new approach for manufac-
turing lipid nanoparticles – evaluation of the method and process parameters, Eur. J.
Pharm. Biopharm., 55, 125–131.
380
Schwenk M. (2010) Ferumoxytol: a new intravenous iron preparation for the treatment of iron
deficiency anemia in patients with chronic kidney disease, Pharmacotherapy, 30, 70–79.
Sciau P. (2012) Nanoparticles in ancient materials: the metallic lustre decorations of medieval
ceramics, In: The delivery of nanoparticles (Hashim A., Ed.) (IntechOpen), p. 525.
Sehgal D., Vijay I. (1994) A method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-
mediated amidiation, Analytical Biochem., 218, 97–91.
Sengul A., Asmatulu E. (2020) Toxicity of metal and metal oxide nanoparticles: a review,
Environ. Chem. Lett., 18, 1659–1683.
Setyawati M., Tay C., Bay B., Leong D. (2017) Gold nanoparticles induced endothelial
leakiness depends on particle size and endothelial cell origin, ACS Nano, 11, 5020.
Seyfoddin A., Shaw J., Al–Kassas R. (2010) Solid lipid nanoparticles for ocular drug delivery,
Drug Deliv., 17(7), 467–489.
Shah R., Eldridge D., Palombo E., Harding I. (auth.) (2015) Lipid nanoparticles: production,
characterization and stability (Springer).
Shastri L., Abdelhamid H., Nawaz M., Wu H. (2015) Synthesis, characterization and
bifunctional applications of bidentate silver nanoparticle assisted single drop micro-
extraction as a highly sensitive preconcentrating probe for protein analysis, RSC
Advances, 5(52), 41595–41603.
Sharon M. (Ed.) (2019) History of nanotechnology, Scrivener Publishing LLC.
Shardlow E., Mold M., Exley C. (2018) Unraveling the enigma: elucidating the relationship
between the physicochemical properties of aluminium‑based adjuvants and their immuno-
logical mechanisms of action, Allergy Asthma Clin. Immunol., 14, 80.
Shaw D. (1992) Introduction to Colloid and Surface Chemistry (4 ed.), Elsevier.
Shemsi A., Khanday F., Qurashi A., et al. (2019) Site-directed chemically-modified magnetic
enzymes: fabrication, improvements, biotechnological applications and future prospects,
Biotechnology Advances, 37, 357–381.
Shi L., Paoli V., Rosenzweig N., Rosenzweig Z. (2006) Synthesis and application of quantum
dots FRET-based protease sensors, J. Am. Chem. Soc., 128, 10378.
Shi S., Zhu H., Xia X., et al. (2019) Vaccine adjuvants: Understanding the structure and
mechanism of adjuvanticity, Vaccine, 37, 3167–3178.
Shi J., Li J. (2020) Neutrophil‐targeted engineered prodrug nanoparticles for anti‐inflam-
mation, The FASEB J., 34(8), 9828–9831.
Shi N.–Q., Qi X.–R. (2021) Preparation of drug liposomes by reverse-phase evaporation, In:
Liposome–based drug delivery systems (Lu W. and Qi X., Eds.) (Springer), pp. 37–46.
Shuai X., Merdan T., Schaper A., et al. (2004) Core-cross-linked polymeric micelles as
paclitaxel carriers, Bioconjug. Chem., 15(3), 441–448.
Siekmann B., Westesen K. (1996) Investigations on solid lipid nanoparticles prepared by
precipitation in o/w emulsions, Eur. J. Pharm. Biopharm., 43, 104–109.
Simone E., Ding B.–S., Muzykantov V. (2008) Targeted delivery of therapeutics to endo-
thelium, Cell Tissue Res., 335(1), 283–300.
381
Singh Y., Murata P., Defrancq E. (2010) Recent developments in oligonucleotide conjugation,
Chem. Soc. Rev., 39, 2054–2070.
Singh S., Bozhilov K., Mulchandani A., et al. (2010a) Biologically programmed synthesis of
core–shell CdSe/ZnS nanocrystals, Chem. Commun., 46, 1473–1475.
Skotland T., Sandvig K. (2021) Transport of nanoparticles across the endothelial cell layer,
Nano Today, 36, 101029.
Smith J., Morton L., Ulery B. (2015) Nanoparticles as synthetic vaccines, Curr. Opin.
Biotech., 34, 217–224.
Smith S., Selby L., Johnston A., Such G. (2019) The endosomal escape of nanoparticles:
towards more efficient cellular delivery, Bioconjugate Chem., 30, 263–272.
Smoluchowski M. (1916) Drei Vorträge über Diffusion, Brownsche Molekularbewegung und
Koagulation von Kolloidteilchen, Physik. Zeit., 17, 557–585.
Smulders S., Kaiser J., Zuin S., et al. (2012) Contamination of nanoparticles by endotoxin:
evaluation of different test methods, Part. Fibre Toxicol., 9(1), 41.
Soman P., Rice Z., Siedlecki C. (2008) Immunological identification of fibrinogen in dual-
component protein films by AFM imaging, Micron, 39, 832–842.
Sonavane G., Tomoda K., Makino K. (2008) Biodistribution of colloidal gold nanoparticles
after intravenous administration: Effect of particle size, Colloids Surf. B, 66, 274–280.
Song K., Lee S., Park T., Lee B. (2009) Preparation of colloidal silver nanoparticles by chemi-
cal reduction method, Korean J. Chem. Eng., 26(1), 153–155.
Soumiya H., Fukumitsu H., Furukawa S. (2011) Prenatal immune challenge compromises the
normal course of neurogenesis during development of the mouse cerebral cortex, J.
Neurosci. Res., 89(10), 1575–1585.
Sperling R., Parak W. (2010) Surface modification, functionalization and bioconjugation of
colloidal inorganic nanoparticles, Philos. Trans. R. Soc. A, 368, 1333–1383.
Stern O. (1924) Zur theorie der elektrolytischen doppelschicht, Zeitschrift für Elektrochemie,
30, 508–516.
Stockert J., Horobin R., Colombo L., Blázquez–Castro A. (2018) Tetrazolium salts and forma-
zan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling
perspectives, Acta Histochemica, 120(3), 159–167.
Stoeckl K., Vanino L. (1899) Ueber die Natur der sogenannten kolloidalen Metalllösungen,
Zeitschr. Phys. Chem., 30, 98–112.
Stone N., Bicanic T., Salim R., Hope W. (2016) Liposomal amphotericin B (AmBisome®): a
review of the pharmacokinetics, pharmacodynamics, clinical experience and future
directions, Drugs, 76(4), 485–500.
Striegel A., Yau W., Kirkland J., Bly D. (2009) Modern size-exclusion liquid chromato-
graphy: practice of gel permeation and gel filtration chromatography (Wiley).
Strober W. (2015) Trypan blue exclusion test of cell viability, Curr. Prot. Immunol., A3.B.1–
A3.B.3.
382
Strutt J. (1871) On the Scattering of Light by small Particles, The London, Edinburgh, and
Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science, 41, 447–454.
Strużyńska L. (2017) The application, neurotoxicity, and related mechanisms of silver
nanoparticles, In: Neurotoxicity of Nanomaterials and Nanomedicine (Jiang X. and Gao
H., Eds.) (Academic Press), p. 151–177.
Su K.-H., Wei Q.-H., Zhang X. (2003) Interparticle coupling effects on plasmon resonances
of nanogold particles, Nano Lett., 3(8), 1087–1090.
Subbiah V., Grilley–Olson J., Combest A., et al. (2018) Phase Ib/II Trial of NC–6004 (Nano-
particle Cisplatin) plus gemcitabine in patients with advanced solid tumors, Clin. Cancer
Res., 24, 43–51.
Suk J., Xu Q., Kim N., et al. (2016) PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based
drug and gene delivery, Adv. Drug Deliv. Rev., 99(PtA), 28–51.
Sulheim E., Iversen T.–G., To Nakstad V., et al. (2017) Cytotoxicity of poly(alkyl cyano-
acrylate) nanoparticles, Int. J. Mol. Sci., 18(11), 2454.
Sun B., Wang X., Ji Z., Li R., Xia T. (2013) NLRP3 Inflammasome activation induced by
engineered nanomaterials, Small, 9, 1595–1607.
Sun X., Luo L., Kuang Y., Li P. (2018) Nanoseparation using density gradient ultracentri-
fugation – mechanism, methods and applications (Springer).
Svedberg T. (1905) Ueber die elektrische Darstellung einiger neuen colloïdalen Metalle,
Berichte Der Deutschen Chemischen Gesellschaft, 38(3), 3616–3620.
Svedberg T. (1906) Ueber die elektrische Darstellung einiger neuer kolloidaler Metalle,
Zeitschrift Für Chemie Und Industrie Der Kolloide, 1(5), 144–145.
Svedberg T. (1909) Die Methoden zur Herstellung Kolloider Lösungen anorganischer Stoffe,
T. Steinkopff, Dresden.
Svedberg T., Andersson H. (1919) Zur messmethodik der elektrischen kataphorese, Kolloid–
zeitschrift, 24, 156–165.
Svedberg T. (1921) The formation of colloids, D. Van Nostrand Company, New York.
Svedberg T., Nichols J. (1923) Determination of size and distribution of size of particle by
centrifugal methods, J. Am. Chem. Soc., 45(12), 2910–2917.
Svedberg T., Rinde H. (1924) The ultra-centrifuge, a new instrument for the determination of
size and distribution of size of particle in amicroscopic colloids, J. Am. Chem. Soc.,
46(12), 2677–2693.
Swartzwelter B., Verde A., Rehak L., et al. (2021) Interaction between macrophages and
nanoparticles: in vitro 3D cultures for the realistic assessment of inflammatory activation
and modulation of innate memory, Nanomaterials (Basel), 11(1), 207.
Szebeni J. (2005) Complement activation-related pseudoallergy: a new class of drug-induced
acute immune toxicity, Toxicology, 216(2–3), 106–121.
Szebeni J., Muggia F., Gabizon A., Barenholz Y. (2011) Activation of complement by therapeutic
liposomes and other lipid excipient-based therapeutic products: prediction and prevention,
Adv. Drug Deliv. Rev., 63, 1020–1030.
383
Szebeni J., Bedocs P., Rozsnyay Z., et al. (2012) Liposome induced complement activation
and related cardiopulmonary distress in pigs: factors promoting reactogenicity of Doxil
and AmBisome, Nanomedicine, 8, 176–184.
Szebeni J. (2014) Complement activation-related pseudoallergy: a stress reaction in blood
triggered by nanomedicines and biologicals, Mol. Immunol., 61(2), 163–173.
Szebeni J. (2015) Complement activation-related pseudoallergy: an innate response to nano-
medicines acting as pseudo-viruses, Eur. J. Nanomed., 7, 203–205.
Szegedi Á., Popova M., Goshev I. (2012) Controlled drug release on amine functionalized
spherical MCM-41, J. Solid State Chem., 194, 257.
Tabatt K., Sameti M., Olbrich C., et al. (2004) Effect of cationic lipid and matrix lipid compo-
sition on solid lipid nanoparticle-mediated gene transfer, Eur. J. Pharm. Biopharm., 57, 155.
Takeda K., Suzuki K., Ishihara A., et al. (2009) Nanoparticles transferred from pregnant mice
to their offspring can damage the genital and cranial nerve systems, J. Health Sci., 55, 95–102.
Takeuchi I., Nobata S., Oiri N., et al. (2017) Biodistribution and excretion of colloidal gold
nanoparticles after intravenous injection: effects of particle size, Biomed. Mater. Eng.,
28(3), 315–323.
Talelli M., Hennink W. (2011) Thermosensitive polymeric micelles for targeted drug delivery,
Nanomedicine, 6(7), 1245–1255.
Tan L., Wan A., Zhao T., et al. (2014) Aqueous synthesis of multidentate-polymer-capping
Ag2Se quantum dots with bright photoluminescence tunable in a second near-infrared
biological window, ACS Appl. Mater. Interfaces, 6, 6217–6222.
Tan R., Tian D., Li J., et al. (2021) Doxorubicin-bound hydroxyethyl starch conjugate nano-
particles with pH/redox responsive linkage for enhancing antitumor therapy, Int. J.
Nanomed., 16, 4527–4544.
Tang Y., Han S., Liu H., et al. (2013) The role of surface chemistry in determining in vivo
biodistribution and toxicity of CdSe/ZnS core-shell quantum dots, Biomaterials, 34, 8741.
Tang H., Yang S.–T., Yang Y.–F., et al. (2016) Blood clearance, distribution, transformation,
excretion and toxicity of near–infrared quantum dots Ag2Se in mice, ACS Appl. Mater.
Interf., 8(28), 17859–17869.
Tassa C., Shaw S., Weissleder R. (2011) Dextran-coated iron oxide nanoparticles: a versatile
platform for targeted molecular imaging, molecular diagnostics, and therapy, Acc. Chem.
Res., 44(10), 842–852.
Tatur S., Maccarini M., Barker R., et al. (2013) Effect of functionalized gold nanoparticles on
floating lipid bilayers. Langmuir, 29(22), 6606–6614.
Tawfik S., Azizov S., Elmasry M., et al. (2021) Recent advances in nanomicelles delivery
systems, Nanomaterials, 11, 70.
Teoh W., Amal R., Mädler L. (2010) Flame spray pyrolysis: an enabling technology for
nanoparticles design and fabrication, Nanoscale, 2(8), 1324.
Thi T., Suys E., Lee J., et al. (2021) Lipid-based nanoparticles in the clinic and clinical trials:
from cancer nanomedicine to COVID-19 vaccines, Vaccines, 9, 359.
384
Thian Y., Riddell A., Koh D. (2013) Liver-specific agents for contrast-enhanced MRI: role in
oncological imaging, Cancer Imaging, 13, 567–579.
Thode K., Lück M., Schroder W., et al. (1998) The Influence of the sample preparation on
plasma protein adsorption patterns on polysaccharide-stabilized iron oxide particles and
N-terminal microsequencing of unknown proteins, J. Drug Target., 5(6), 459–469.
Thorek D., Elias D., Tsourkas A. (2009) Comparative analysis of nanoparticle-antibody
conjugations: carbodiimide versus click chemistry, Mol. Imaging, 8(4), 221–229.
Tiselius A. (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans.
Faraday Soc., 33, 524–531.
Torchilin V. (2009) Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers, Eur. J.
Pharm. Biopharm., 71(3), 431–444.
Tosi G., Duskey J., Kreuter J. (2020) Nanoparticles as carriers for drug delivery of macro-
molecules across the blood-brain barrier, Exp. Opin. Drug Deliv., 17(1), 23–32.
Trefalt G., Szilágyi I., Borkovec M. (2020) Schulze–Hardy rule revisited, Colloid Polym. Sci.,
298, 961–967.
Trendafilova I., Szegedi Á., Mihály J., et al., (2017) Preparation of efficient quercetin delivery
system on Zn-modified mesoporous SBA-15 silica carrier, Mater. Sci. Eng. C, 73, 285.
Tschopp J., Podack E., Müller–Eberhard H. (1982) Ultrastructure of the membrane attack
complex of complement: Detection of the tetramolecular C9-polymerizing complex C5b-
8, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7474–7478.
Tsoli M., Kuhn H., Brandau W., et al. (2005) Cellular uptake and toxicity of Au(55) clusters,
Small, 1, 841–844.
Turkevich J., Stevenson P., Hillier J. (1951) A study of the nucleation and growth processes
in the synthesis of colloidal gold, Discuss. Faraday Soc., 11, 55–75.
Tweney R. (2006) Discovering discovery: how Faraday found the first metallic colloid,
Perspect. Sci., 14(1), 197–121.
Uchiyama S., Arisaka f., Stafford W., Laue T. (Eds.) (2006) Analytical ultracentrifugation
instrumentation, software, and applications (Springer, Japan).
Ueno T., Endo K., Hori K. et al. (2014) Assessment of antitumor activity and acute peripheral
neuropathy of 1,2-diaminocyclohexane platinum (II)-incorporating micelles (NC–4016),
Int. J. Nanomed., 9, 3005–3012.
Ulbrich K., Michaelis M., Rothweiler F, et al. (2011) Interaction of folate–conjugated human
serum albumin (HSA) nanoparticles with tumour cells, Int. J. Pharm., 406, 128–134.
Valle J., Armstrong A., Newman C., et al. (2011) A phase 2 study of SP1049C, doxorubicin
in P-glycoprotein-targeting pluronics, in patients with advanced adenocarcinoma of the
esophagus and gastroesophageal junction, Invest. New Drugs, 29(5), 1029–1037.
Vallet–Regí M., Colilla M., Izquierdo-Barba I., Manzano M. (2018) Mesoporous silica
Nnanoparticles for drug delivery: current insights, Molecules, 23, 47.
385
Van der Zande M., Vandebriel R., Van Doren E., et al. (2012) Distribution, elimination, and
toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure, ACS
Nano, 6(8), 7427–7442.
Van Embden J., Sader J., Davidson M., Mulvaney P. (2009) Evolution of colloidal nano-
crystals: theory and modeling of their nucleation and growth, J. Phys. Chem. C, 113,
16342–16355.
Van Landeghem F., Maier–Hauff K., Jordan A., et al. (2009) Post-mortem studies in glioblas-
toma patients treated with thermotherapy using magnetic nanoparticles, Biomaterials, 30, 52.
Vangijzegem T., Stanicki D., Laurent S. (2019) Magnetic iron oxide nanoparticles for drug
delivery: applications and characteristics, Expert Opin. Drug Deliv., 16(1), 69–78.
Varela–Moreira A., Shi Y., Fens M., et al. (2017) Clinical application of polymeric micelles
for the treatment of cancer, Mater. Chem. Front., 1(8), 1485–1501.
Vassallo A., Silletti M.F., Faraone I., Milella L. (2020) Nanoparticulate antibiotic systems as
antibacterial agents and antibiotic delivery platforms to fight infection, J. Nanomater.,
2020, Article ID 6905631.
Veintemillas–Verdaguer S., del Puerto Morales M., Bomati–Miguel O., et al. (2004) Colloidal
dispersions of maghemite nanoparticles produced by laser pyrolysis with application as
NMR contrast agents, J. Phys. D Appl. Phys., 37, 2054.
Verbeke R., Lentacker I., De Smedt S., Dewitte H. (2019) Three decades of messenger RNA
vaccine development, NanoToday, 28, 100766.
Verbeke R., Lentacker I., De Smedt S., Dewitte H. (2021) The dawn of mRNA vaccines: The
COVID-19 case, J. Control. Release, 333, 511–520.
Vermes I., Haanen C., Steffens–Nakken H., Reutellingsperger C. (1995) A novel assay for
apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic
cells using fluorescein labelled Annexin V, J. Immunol. Methods, 184(1), 39–51.
Verwey E., Overbeek J. (1948) Theory of stability of lyophobic colloids, Elsevier.
Vetten M., Yah C., Singh T., Gulumian M. (2014) Challenges facing sterilization and depyro-
genation of nanoparticles: effects on structural stability and biomedical applications,
Nanomed. NBM, 10(7), 1391–1399.
Vijayakumar R., Koltypin Y., Felner I., Gedanken A. (2000) Sonochemical synthesis and
characterization of pure nanometer-sized Fe3O4 particles, Mater. Sci. Eng. A, 286, 101.
Vilela D., González M., Escarpa A. (2012) Sensing colorimetric approaches based on gold
and silver nanoparticles aggregation: chemical creativity behind the assay. A review,
Anal. Chim. Acta, 751 (2012) 24–43.
Vorobyev S., Vishnyakova E., Likhatski M., et al. (2019) Reactivity and chemical sintering
of Carey Lea silver nanoparticles, Nanomaterials, 9, 1525.
Vyas S., Katare Y., Mishra V., Sihorkar V. (2000) Ligand directed macrophage targeting of
amphotericin B loaded liposomes, Int. J. Pharm., 210, 1–14.
Wadhera A., Fung M. (2005) Systemic argyria associated with ingestion of colloidal silver,
Dermatol. Online J., 11(1), 12.
386
Wagner C. (1961) Theorie der Alterung von Niederschlägen durch Umlösen, Zeit. Electrochemie,
65, 581–591.
Wagner S., Rothweiler F., Anhorn M., et al. (2010) Enhanced drug targeting by attachment of
an anti av integrin antibody to doxorubicin loaded human serum albumin nanoparticles,
Biomaterials, 31, 2388–2398.
Wang Y., Herron N. (1991) Nanometer-sized semiconductor clusters: materials synthesis,
quantum size effects, and photophysical Properties, J. Phys. Chem., 95, 525.
Wang J., Sun J., Sun Q., Chen Q. (2003) One-step hydrothermal process to prepare highly
crystalline Fe3O4 nanoparticles with improved magnetic properties, Mater. Res. Bull.,
38(7), 1113–1118.
Wang Y., Yan X. (2013) Fabrication of vascular endothelial growth factor antibody bioconju-
gated ultrasmall near-infrared fluorescent Ag2S quantum dots for targeted cancer imaging
in vivo, Chem. Commun., 49, 3324–3326.
Wang Z., Li J., Cho J. et al. (2014) Prevention of vascular inflammation by nanoparticle
targeting of adherent neutrophils, Nature Nanotech., 9, 204–210.
Wang S., Xi W., Cai F., et al. (2015) Three-photon luminescence of gold nanorods and its
applications for high contrast tissue and deep in vivo brain imaging, Theranostics, 5, 251–266.
Wang L., Hu C., Shao L. (2017) The antimicrobial activity of nanoparticles: present situation
and prospects for the future, Int. J. Nanomed., 12, 1227–1249.
Wang R., Song B., Wu J., et al. (2018) Potential adverse effects of nanoparticles on the
reproductive system, Int. J. Nanomed., 13, 8487–8506.
Wang L., Xu D., Gao J., et al. (2020) Semiconducting quantum dots: modification and
applications in biomedical science, Sci. China Mater., 63(9), 1631–1650.
Wang Y., Pi C., Feng X., et al. (2020) The influence of nanoparticle properties on oral
bioavailability of drugs, Int. J. Nanomed., 15, 6295–6310.
Wang W., Zhao B., Meng X., et al. (2018) Preparation of dual-drug conjugated polymeric
micelles with synergistic anti-cancer efficacy in vitro, J. Drug Deliv. Sci. Technol., 43, 388.
Ward K., Matejtschuk P. (Eds.) (2019) Lyophilization of pharmaceuticals and biologicals:
new technologies and approaches, Springer.
Wardman P. (2007) Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and
nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects, Free Radic. Biol.
Med., 43(7), 995–1022.
Ware B. (1974) Electrophoretic light scattering, Adv. Colloid Interface Sci., 4(1), 1–44.
Ware M. (2006) Herschel’s chrysotype: a golden legend re-told, History of phtography, 30, 1–24.
Waser G., Müller U., Kreuter J., et al. (1987) Localization of colloidal particles (liposomes,
hexylcyanoacrylate nanoparticles and albumin nanoparticles) by histology and autoradio-
graphy in mice, Int. J. Pharm., 39(3), 213–227.
Washington C. (1990) Drug release from microdisperse systems: a critical review, Int. J.
Pharm., 58(1), 1–12.
387
Weissleder R., Stark D., Engelstad B. , et al. (1989) Superparamagnetic iron oxide: pharmaco-
kinetics and toxicity, Am. J. Roentgenology, 152, 167–173.
Weizenecker J., Gleich B., Rahmer J., et al. (2009) Three-dimensional real-time in vivo
magnetic particle imaging, Physics Med. Biol., 54(5), L1–L10.
Wen T., Du L., Chen B., et al. (2019) Iron oxide nanoparticles induce reversible endothelial-
to-mesenchymal transition in vascular endothelial cells at acutely non-cytotoxic concen-
trations, Part. Fibre Toxicol., 16(1), 30.
Werengowska–Ciećwierz K., Wiśniewski M., Terzyk A., Furmaniak S. (2015) The chemistry
of bioconjugation in nanoparticles-based drug delivery system, Adv. Condens. Matter
Phys., 2015, 1–27.
Whitehead C., Ӧzkar S., Finke R. (2019) LaMer’s 1950 model for particle formation of
instantaneous nucleation and diffusion-controlled growth: a historical look at the model’s
origins, assumptions, equations, and underlying sulfur sol formation kinetics data, Chem.
Mater., 31, 7116–7132.
Whitehead C., Ӧzkar S., Finke R. (2021) LaMer’s 1950 model of particle formation: a review
and critical analysis of its classical nucleation and fluctuation theory basis, of competing
models and mechanisms for phasechanges and particle formation, and then of its
application to silver halide, semiconductor, metal, and metal–oxide nanoparticles, Mater.
Adv., 2, 186–235.
Winau F., Westphal O., Winau R. (2004) Paul Ehrlich – in search of the magic bullet, Microb.
Infect., 6(8), 786–789.
Winter C., Djodari–Irani A., Sohr R., et al. (2009) Prenatal immune activation leads to multiple
changes in basal neurotransmitter levels in the adult brain: implications for brain disorders
of neurodevelopmental origin such as schizophrenia, The Int. J. Neuropsychopharmacol.,
12(04), 513–524.
Woehl T., Park C., Evans J., et al. (2013) Direct observation of aggregative nanoparticle
growth: kinetic modeling of the size distribution and growth rate, Nano Lett., 14, 373.
Wolcott A., Gerion D., Visconte M., et al. (2006) Silica-coated CdTe quantum dots function-
alized with thiols for bioconjugation to IgG proteins, J. Phys. Chem. B, 110, 5779.
Wolff J., Malone R., Williams P., et al. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo,
Science, 247(4949 Pt 1), 1465–1468.
WonY.–W., Kim Y.–H. (2008) Recombinant human gelatin nanoparticles as a protein drug
carrier, J. Control. Release, 127, 154–161.
Wong P., Choi S. (2015) Mechanisms of drug release in nanotherapeutic delivery systems,
Chem. Rev., 115(9), 3388–3432.
Wu W., He Q., Jiang C. (2008) Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface
functionalization strategies, Nanoscale Res. Lett., 3, 397–415.
Wu X., Tian F., Zhao J., Wu M. (2013) Evaluating pharmacokinetics and toxicity of lumi-
nescent quantum dots, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 9(10), 1265–1277.
388
Xiang B., Cao D.–Y. (2021) Preparation of drug liposomes by thin-film hydration and homo-
genization, In: Lu W., Qi X. (Eds.), Liposome-based drug delivery systems, Springer, p. 25.
Xu J., Yang H., Fu W., et al. (2007) Preparation and magnetic properties of magnetite
nanoparticles by sol–gel method, J. Magnetism Magnetic Mater., 309, 307–311.
Xu R. (2002) Particle characterization: light scattering methods, Kluwer Academic Publishers.
Xu S., Cui J., Wang L. (2016) Recent developments of low-toxicity NIR II quantum dots for
sensing and bioimaging, TrAC Trends Anal. Chem., 80, 149–155.
Xu G., Lin G., Lin S., et al. (2016a) The reproductive toxicity of CdSe/ZnS quantum dots on
the in vivo ovarian function and in vitro fertilization, Sci. Reports, 6, 37677.
Xu L., Wang Y., Huang J., et al. (2020) Silver nanoparticles: Synthesis, medical applications
and biosafety, Theranostics, 10(20), 8996–9031.
Yang H.–H., Zhang S.–Q., Chen X.–L., et al. (2004) Magnetite-containing spherical silica
nanoparticles for biocatalysis and bioseparations, Anal. Chem., 76, 1316–1321.
Yang L., Kuang H., Zhang W., et al. (2015) Size dependent biodistribution and toxicokinetics
of iron oxide magnetic nanoparticles in mice, Nanoscale, 7(2), 625–636.
Yang L., Kuang H., Zhang W., et al. (2017) Comparisons of the biodistribution and toxico-
logical examinations after repeated intravenous administration of silver and gold nano-
particles in mice, Sci Rep., 7, 3303.
Ye L., Yong K.–T., Liu L., et al. (2012) A pilot study in non-human primates shows no adverse
response to intravenous injection of quantum dots, Nat. Nano, 7, 453–458.
Ye D., Raghnaill M., Bramini M., et al. (2013) Nanoparticle accumulation and transcytosis in
brain endothelial cell layers, Nanoscale, 5(22), 11153.
Yeh Y.–C., Huang T.–H., Yang S.–C., et al. (2020) Nano-based drug delivery or targeting to
eradicate bacteria for infection mitigation: a review of recent advances, Front. Chem., 8, 286.
Yoffe A.D. (1993) Low-dimensional systems: quantum size effects and electronic properties
of semiconductor microcrystallites (zero-dimensional systems) and some quasi-two-
dimensional systems, Adv. Phys., 42, 173.
Yokel R. (2020) Nanoparticle brain delivery: a guide to verification methods, Nanomedicine
(Lond.), 15(4), 409–432.
Yonezawa S., Koide H., Asai T. (2020) Recent advances in siRNA delivery mediated by lipid-
based nanoparticles, Adv. Drug Deliv. Rev., 154, 64–78.
Yordanov G., Dushkin C., Gicheva G., et al. (2005) Synthesis of high-quality semiconductor
nanoparticles in a composite hot–matrix, Colloid Polymer Sci., 284, 229.
Yordanov G., Adachi E., Dushkin C. (2006) Growth kinetics and characterization of fluores-
cent CdS nanocrystals synthesized with different sulfur precursors in paraffin hot-matrix,
Colloids Surf. A, 289, 118–125.
Yordanov G., Yoshimura H., Dushkin C. (2008) Fine control of the growth and optical
properties of CdSe QDs by varying the amount of stearic acid in a liquid paraffin matrix,
Colloids Surf. A, 322, 177.
389
Yordanov G., Yoshimura H., Dushkin C. (2008a) Synthesis of high-quality core-shell QDs of
CdSe–CdS by means of gradual heating in liquid paraffin, Colloid Polymer Sci., 286, 1097.
Yordanov G., Trendafilova I., Fukano H., et al. (2010) Nanocrystal growth of thioglycolate-
coated cadmium telluride quantum dots in aqueous medium, Nanoscience & Nanotech-
nology, E. Balabanova, I. Dragieva (Eds.), vol. 10, 69–72.
Yordanov G., Abrashev N., Dushkin C. (2010a) Poly(n-butylcyanoacrylate) submicron
particles loaded with ciprofloxacin for potencial treatment of bacterial infections, Progr.
Colloid Polym. Sci., 137, 53–59.
Yordanov G. (2012) Influence of the preparation method on the physicochemical properties
of econazole-loaded poly(butyl cyanoacrylate) colloidal nanoparticles, Colloids Surf. A,
413, 260–265.
Yordanov G. (2012a) Poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticles as drug carriers: 33 years later,
Bulg. J. Chem., 1, 61–73.
Yordanov G., Skrobanska R., Evangelatov A. (2012a) Entrapment of epirubicin in poly(butyl
cyanoacrylate) colloidal nanospheres by nanoprecipitation: Formulation development
and in vitro studies on cancer cell lines, Colloids Surf. B, 92, 98–105.
Yordanov G., Evangelatov A., Skrobanska R. (2013) Epirubicin loaded to pre–polymerized
poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles: Preparation and in vitro evaluation in human
lung adenocarcinoma cells, Colloids Surf. B, 107, 115–123.
Yordanov G., Gemeiner P., Katrlík J. (2016) Study of interactions between blood plasma
proteins and poly(butylcyanoacrylate) drug nanocarriers by surface plasmon resonance,
Colloids Surf. A, 510, 309–316.
Yordanov G. (2019) Chapter 4 – Poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticles as promising tools
in cancer therapeutics, In: Polymeric nanoparticles as a promising tool for anti-cancer
therapeutics (Kesharwani P. et al., Eds.) (Academic Press), pp. 59–79.
Yu L., Yung L., Ong C.–N., et al. (2007) Translocation and effects of gold nanoparticles after
inhalation exposure in rats, Nanotoxicology, 1(3), 235–242.
Yu W., Peng X. (2002) Formation of high-quality CdS and other II–VI semiconductor
nanocrystals in noncoordinating solvents: Tunable reactivity of monomers, Angew.
Chem. Int. Ed., 41, 2368.
Yu W., Wang Y., Peng X. (2003) Experimental determination of the extinction coefficient of
CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals, Chem. Mater., 15, 4300.
Yuan Y., Zhang J., Zhang H., Yang X. (2011) Label-free colorimetric immunoassay for the
simple and sensitive detection of neurogenin3 using gold nanoparticles, Biosensors and
Bioelectronics, 26(10), 4245–4248.
Zeng L., Wu X. (2010) Modeling the sustained release of lipophilic drugs from liposomes,
Appl. Phys. Lett., 97(7), 073701.
Zeng L., An L., Wu X. (2011) Modeling drug-carrier interaction in the drug release from
nanocarriers, J. Drug Deliv., 2011, Article ID 370308.
390
Zhang C., O’Brien S., Balogh L. (2002) Comparison and stability of CdSe nanocrystals
covered with amphiphilic poly(amidoamine) dendrimers, J. Phys. Chem. B, 106, 10316.
Zhang J. (2004) Pharmaco attributes of dioleoylphosphatidylethanolamine/cholesterylhemi-
succinate liposomes containing different types of cleavable lipopolymers, Pharmacol.
Res., 49(2), 185–198.
Zhang J., Purdon C., Smith E. (2006) Solid lipid nanoparticles for topical drug delivery, Am.
J. Drug Deliv., 4(4), 215–220.
Zhang C., Chung J., Priestley R. (2012) Dialysis nanoprecipitation of polystyrene nano-
particles, Macromol. Rapid Comm., 33(20), 1798–1803.
Zhang H., Li Q., Lu Y., et al. (2005) Biosorption and bioreduction of diamine silver complex
by Corynebacterium, J. Chem. Technol .Biotechnol., 80, 285–290.
Zhang H. Huan X., Yang S., et al. (2018) Selection of viable human spermatozoa with low
levels of DNA fragmentation from an immotile population using density gradient centri-
fugation and magnetic-activated cell sorting, Andrologia, 50(1), e12821.
Zhang L., Bäumer W., Riviere N. (2011) Cellular uptake mechanisms and toxicity of quantum
dots in dendritic cells, Nanomedicine, 6(5), 777–791.
Zhang L., Mazouzi Y., Salmain M., et al. (2020) Antibody-gold nanoparticle bioconjugates
for biosensors: synthesis, characterization and selected applications, Biosens. Bioelectron.,
165, 112370.
Zhang M., Bishop B., Thompson N., et al. (2019) Quantum dot cellular uptake and toxicity in
the developing brain: implications for use as imaging probes, Nanoscale Adv., 1, 3424.
Zhang Q. (Ed.) (2019) Nanotoxicity – Methods and Protocols, Springer, New York.
Zhang W., Yang L., Kuang H., et al. (2016) Acute toxicity of quantum dots on late pregnancy
mice: effects of nanoscale size and surface coating, J. Hazard. Mater., 318, 61–69.
Zhang X., Wu H., Wu D., et al. (2010) Toxicologic effects of gold nanoparticles in vivo by
different administration routes, Int. J. Nanomedicine, 5, 771–781.
Zhang X., Shi H., Zhang R., et al. (2018) The competitive dynamic binding of some blood
proteins adsorbed on gold nanoparticles Part. Part. Syst. Charact., 1800257.
Zhang Y., Zhu S., Yin L.,et al. (2008) Preparation, characterization and biocompatibility of
poly(ethylene glycol)-poly(n-butyl cyanoacrylate) nanocapsules with oil core via mini-
emulsion polymerization, Eur. Polym. J., 44(6), 1654–1661.
Zhang Y., Li Y., Yan X. (2009) Aqueous layer-by-layer epitaxy of type-II CdTe/CdSe quan-
tum dots with near-infrared fluorescence for bioimaging applications, Small, 5, 185.
Zhang Y.–N., Poon W., Tavares A., et al. (2016) Nanoparticle-liver interactions: cellular
uptake and hepatobiliary elimination, J. Control. Release, 240, 332–348.
Zhang Z., Zhao L., Li Y., Chu M. (2015) A modified method to calculate critical coagulation
concentration based on DLVO theory, Math. Probl. Eng., 2015, Article ID 317483.
Zhang Z., Chen X., Gao X., et al. (2015a) Targeted dextran-b-poly(ε-caprolactone) micelles
for cancer treatments, RSC Advances, 5(24), 18593–18600.
391
Zhao H., Joseph J., Fales H., et al. (2005) Detection and characterization of the product of
hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence,
Proc. Nat. Acad. Sci., 102(16), 5727–5732.
Zhao Z., Ukidve A., Krishnan V., Mitragotri S. (2019) Effect of physicochemical and surface
properties on in vivo fate of drug nanocarriers, Adv. Drug Deliv. Rev., 143, 3.
Zhelev Z., Ohba H., Bakalova R., et al., (2005) Fabrication of quantum dot–lectin conjugates
as novel fluorescent probes for microscopic and flow cytometric identification of
leukemia cells from normal lymphocytes, Chem. Commun., 15, 1980.
Zheng M., Pan M., Zhang W., et al. (2021) Poly(α-l-lysine)-based nanomaterials for versatile
biomedical applications: current advances and perspectives, Bioactive Materials, 6, 1878.
Zhong Y., Meng F., Deng C., Zhong Z. (2014) Ligand-directed active tumor-targeting
polymeric nanoparticles for cancer chemotherapy, Biomacromolecules, 15, 1955–1969.
Zhou M., Ghosh I. (2006) Quantum dots and peptides: a great future together, Biopolymers
(Peptide Science), 88, 325.
Zhou M., Nakatani E., Gronenberg L., et al., (2007) Peptide-labeled quantum dots for imaging
GPCRs in whole cells and as single molecules, Bioconjugate Chem., 18, 323.
Zhou Q., Sun X., Zeng L., et al (2009) A randomized multicenter phase II clinical trial of
mitoxantrone-loaded nanoparticles in the treatment of 108 patients with unresected
hepatocellular carcinoma, Nanomedicine, 5, 419–423.
Zhou Y., Wang S., Zhang K., Jiang X. (2008) Visual detection of copper(II) by azide- and
alkyne-functionalized gold nanoparticles using click chemistry, Angew. Chem. Int. Ed.,
47, 7454 –7456.
Zhou Y., Peng Z., Seven E., Leblanc R. (2018) Crossing the blood-brain barrier with
nanoparticles, J. Control. Release, 270, 290–303.
Zhu M.–T., Wang Y., Feng W.–Y., et al. (2010) Oxidative stress and apoptosis induced by
iron oxide nanoparticles in cultured human umbilical endothelial cells, J. Nanosci.
Nanotechnol., 10(12), 8584–8590.
Zhu C., Jiang P., Zhang Z., et al. (2013) Ag2Se Quantum dots with tunable emission in the
second near-infrared window, ACS Appl. Mater. Interfaces, 5, 1186–1189.
Zhu G., Lee H. (2017) Electrochemical sandwich-type biosensors for α-1 antitrypsin with carbon
nanotubes and alkaline phosphatase labeled antibody-silver nanoparticles, Biosens.
Bioelectron., 89, 959–963.
Zhu S., Gong L., Li Y., et al. (2019) Safety assessment of nanomaterials to eyes: an important
but neglected issue, Adv. Sci., 1802289.
Zhulina E., Borisov O. (2012) Theory of block polymer micelles: recent advances and current
challenges, Macromolecules, 45(11), 4429–4440.
Zielińska A., Nowak I. (2016) Solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers as
novel carriers for cosmetic ingredients, In: Nanobiomaterials in galenic formulations and
cosmetics (Grumezescu A., Ed.) (Elsevier), pp. 231–255.
392
Zou P., Tyner K., Raw A., Lee S. (2017) Physicochemical characterization of iron carbohydrate
colloid drug products, AAPS J., 19(5), 1359–1376.
Zsigmondy R. (1898) Ueber wässrige Lösungen metallischen Goldes, Justus Liebigs Annalen
der Chemie, 301(1), 29–54.
Zsigmondy R. (1906) Über amikroskopische Goldkeime I, Zeit. Phys. Chemie, 56, 65–76.
Zsigmondy R. (1906a) Aaslösung von silberhaltigen rednktionsgemischen durch kolloidales
gold II, Zeit. Phys. Chemie, 56, 77–82.
Zsigmondy R. (1917) The Chemistry of Colloids Part I (English translation), Stanhope Press.
Zuberek M., Grzelak A. (2018) Nanoparticles-caused oxidative imbalance, In: Q. Saquib et
al. (eds.), Cellular and molecular toxicology of nanoparticles, 85–98.
393
Азбучен указател
Ag NPs. Вж. сребърни наночастици SLN. Вж. твърдолипидни наночастици

AOT (сърфактант), 216 SMANCS, 152
APTMS (аминосилан), 289, 290 SPIONs, 164, 283, 295, 301, 304
ARDS (синдром), 26, 188, 194, 317 TGA. Вж. тиогликолова киселина
Au NPs. Вж. златни наночастици TOPO. Вж. триоктилфосфиноксид
AUC. Вж. площ под кривата USPIONs, 295
CARPA. Вж. псевдоалергия
CLIO, 290, 291 абсорбция
CRP (С-реактивен протеин), 300 на електрони, 104
DHLA. Вж. дихидролипоева киселина на лекарство, 23, 138, 139
DOX. Вж. доксорубицин на светлина, 16, 65, 69, 86, 98, 109,
EDC. Вж. карбодиимид 118, 119, 176, 201, 243
EPR ефект, 10, 26, 127, 130, 142, 151, авидин, 223
152, 153, 156, 257, 267, 275, 317, 324, автоклавиране, 146
329, 335 агрегация, 88, 89, 93, Вж. коагулация
FACS, 230 адюванти, 27, 28, 156, 157, 158, 194,
FISH, 22, 232, 233 270, 308, Вж. наноадюванти
FRET, 227, 228, 232, 246 активно насочване, 147, 153
сензори, 268, 269 албумин, 130, 327, 328, 329
GMR сензор, 298, 300 алкилцианоакрилати, 310
hCG (хорион гонадотропин), 261 алуминиев фосфат, 15, 27, 83, 157
HSA. Вж. албумин алуминиев хидроксид, 14, 27
ICP-MS, 236 ампицилин, 150
LDH метод, 176 амфифилни полимери, 313
MRI, 289, 293, 296, 303 амфотерицин Б, 151, 338
MTT метод, 177, 178 анафореза, 77
NADPH оксидоредуктаза, 184, 185 анексин, 178, 179, 227, 297
NanoEL ефект, 268, 275 антигени, 16, 20, 64, 157, 262, 264
NIR, 234, 236, 268 антигенни тестове, 21, 261, 262
PEGилирани антиген-презентиращи клетки, 25, 28,
квантови точки, 237 137, 158
липиди, 92, 93, 338, 343 антитела, 16, 64, 66, 259, 263
липозоми, 154, 335, 337 апоптоза, 174, 190, 227
наночастици, 48, 90, 127, 310, 316, биоконюгация, 49, 222, 224
318 бионаличност, 138, 141
полимери, 289, 320 биоразпределение, 125, 141, 237, 239,
РВСА, 316 279, 305
фосфолипиди, 219, 331, 332, 335, биосинтези, 41, 217, 252, 287
339 биотин, 18, 22, 49, 223, 225, 233, 256,
QDs. Вж. квантови точки 298
ROS, 179, 184, 186, 275, 276 брауново движение, 60, 61, 67, 79, 94,
методи за детектиране, 179 97
SARS-Cov-2, 14, 21, 28, 158, 343
394
ваксини, 15, 25, 27, 28, 140, 141, 156, електрофореза, 77, 127
157, 269, 302, 335, 338, 342 електрофоретична мобилност, 63
атенюирани, 156 електрофоретично светоразсейване, 79
генни, 157 елктростатична стабилизация, 83
инактивирани, 157 емулгиране, 314, 340, 342
иРНК, 14, 28, 92, 158, 339, 343 ендозома, 25, 131, 132, 134, 136, 143,
конюгатни, 157 185, 188, 235, 273, 274, 278, 305, 306,
нановаксини, 28, 137, 156 343
субединични, 157 ендоцитоза, 25, 131, 132, 135, 143, 274
токсоиди, 156 механизми, 131
въглеродни нанотръбички, 10 енергийно-дисперсионна
гел-проникваща хроматография, 44, 118 спектроскопия, 106
гел-филтруване, 19, 44, 118, 127, 334, епидермален растежен фактор, 154,
Вж. гел-проникваща хроматография 227, 236
генотоксичност, 173, 174, 187, 275, 276 епирубицин, 326
глутатион, 163, 180, 213, 274, 276 епитоп, 16, 17
гума арабика, 90 ефект на
даунорубицин, 337 Вроман, 126
двоен електричен слой, 73 повишената пропускливост и
дебаева дължина, 76, 81 задържане. Вж. EPR ефект
дендримери, 320 желатин, 90, 327
дендритни клетки, 141, 236 желязодефицитна анемия, 303, 306
десолватационен метод, 328 закон на Браг, 113
дзета-потенциал, 63, 76, 94, 148, Вж. зародишообразуване, 36
електрокинетичен потенциал зол-гелен метод, 287
диализа, 41, 313 изоелектрична точка, 72, 83, 95
диализен метод, 313, 323 изотермична титрувална калориметрия,
динамично светоразсейване, 67, 97 128, 129
дисперсионни методи, 12, 32, 33, 34 изсолване, 96
диференциална сканираща имунодиагностика, 299
калориметрия, 121 имунодиагностични методи, 16, 17
дифузионен коефициент, 97 имунозлатен метод, 21
дифузионен слой, 74 имунофлуоресцентни анализи, 225
дихидролипоева киселина, 206, 212, 218 индекс на полидисперсност, 118
доза, 173 иринотекан, 337
доксорубицин, 317, 326, 336, 337 ИЧ спектроскопия, 109
доцетаксел, 318, 325, 326 кавеолин, 131
едномолекулни мицели, 320 казеин, 90
екзоцитоза, 135, 136, 143 карбодиимид, 312
екситон, 198 EDC, 18, 23, 222, 224, 226
екстракция, 48 карбодиимидна реакция, 18, 19, 22, 213,
електродиализа, 42 222, 256, 258, 259, 268
електрокинетичен потенциал, 75, 81, катафореза, 77
Вж. дзета-потенциал катионни липиди, 339, 340, 343
електрокоагулация, 95 квантови точки, 11, 198, Вж.
електронна дифракция, 116 полупроводникови наночастици
електростатична стабилизация, 88 квантово ограничение, 200
395
клатрин, 131, 134 мултивезикуларни, 330

клик-реакции, 18, 49, 256, 291, 293 мултиламеларни, 330
клирънс, 139, 318, 336 получаване, 332
клъстери, 11, 12, 13, 33, 39, 40, 93, 188, приложения, 335
273, 283, 305 магнетизация, 282
коагуланти, 93, 95 магнитна
коагулация, 95, Вж. агрегация възприемчивост, 282, 283, 300
коефициент на седиментация, 46, 85 сепарация, 16, 166, 297, 300
коларгол, 10, 15, 23, 59, 61, 90, 243, 271, хипертермия, 27, 156, 301, Вж.
277 хипертермична терапия
колоиден гел, 93, 98, 157 магнитни наночастици. Вж.
колоидна защита, 89 наночастици, Вж. наночастици
колоидна стабилност, 86 биомедицински приложения, 293
комплемент, 16 видове, 281
кондензационни методи, 12, 13, 32, 33, магнитни свойства, 281
36 модификация, 288
контрастни агенти, 293 получаване, 284
концентриране, 49 фармакологични аспекти, 304
криопротектори, 105 макропиноцитоза, 131
криофрактуриране, 105 макрофаги, 133, 136, 149
кръвно-мозъчна бариера, 155 мапинг, 106
купферови клетки, 142, 144, 189, 278, маркирани имунни реакции, 19
305 мас-спектрометрия
лазерно разпрашаване, 247 MALDI-TOF, 118, 119, 127
лактиди, 312 мезопорести силикати, 24
левковорин, 337 метални наночастици. Вж. наночастици
лекарствено освобождаване, 25, 159 биомедицински приложения, 259
в резултат на външен стимул, 25, модификация, 253
161, 311 оптични свойства, 243
количествено описание, 167 получаване, 246
методи за изследване, 164 фармакологични аспекти, 272
механизми, 159 метод на Бредиг, 246
чрез десорбция, 160 микроелектрофореза, 78
чрез дифузия, 160 микроемулсионен метод, 286
чрез ерозия, 160, 161 микроемулсионен синтез, 215
лиганден обмен, 219 микроемулсия, 215, 341
лиофилизация, 51 микроскоп
липидни наночастици. Вж. наночастици AFM, 108
видове, 338 SEM, 100, 315
получаване, 340 STEM, 105
приложения, 342 TEM, 21, 103
липозоми, 92, 229, 332 електронен, 97, 100
PEGилирани, 154, 335, 336 тъмнополев, 21, 97
видове, 329 ултрамикроскоп, 97
дългоциркулиращи, 331 флуоресцентен, 22, 71, 97, 179, 226,
едноламеларни, 330 229, 233
конвенционални, 331 митоксантрон, 318
396
мицели, 219, Вж. полимерни мицели некроза, 175

наноадюванти, 28, 194, Вж. адюванти неокарциностатин, 14, 152, Вж. SMANCS
нановаксини. Вж. ваксини неутронна дифракция, 117
нановаксинология, 28 неутрофили, 136, 137, 149, 236
нанодиаманти, 40 нефелометрия, 63
нанокапсули, 309, 316 обем на разпределение, 139
нанокомпозити, 9, 12, 309 образна диагностика, 23, 293, 296, 301
наномедицина, 13 оксалиплатин, 326
нанопрахове, 23, 52 оксидативен стрес, 173, 179, 183, 188,
нанопреципитация, 313 190, 191, 234, 235, 275, 276, 278, 279,
наноструктурирани липидни носители, 306
339 детектиране, 180
наносфери, 309, 316 ефекти, 186
нанотехнологии, 11 олигонуклеотиди, 15, 16, 21, 22, 224,
нанотоксикология, 26, 29, 171 233, 257, 269, 289, 298
наноутаяване, 313, 315, 340, 342, Вж. опсонизация, 133
нанопреципитация опсонини, 130
нанофармакология, 124 оствалдово зреене, 39, 40, 210
наночастици, 10, 11, 314 остър респираторен дистрес синдром.
PEBCA, 317 Вж. ARDS
PEGилирани, 257 отделяне, 143, 144
PIHCA, 317 ПАВ. Вж. повърхностно активни
PIНCA, 150 вещества
PLA, 229, 309, 318 паклитаксел, 325, 327
PLGA, 309, 315 парамагнитен материал, 282
албуминови, 14, 328, 329 паратоп, 17
за ваксини, 27 пасивно насочване, 148, 151
за диагностика, 15 пептизация, 93, 96
за терапия, 23 персорбция, 277
златни, 19, 21, 22, 48, 242, 247 пиролизни методи, 41, 285
липидни, 92, 93, 313, 338 плазмен полуживот, 139
магнитни, 16, 19, 21, 22, 281, 309, плазмохимични методи, 40
316 плазмоцити, 16
метални, 9, 16, 21, 69, 98, 241 планетарна мелница, 35
от ферихидроксид, 137 плацентарна бариера, 30, 142, 195, 238
полимерни, 150, 155, 156, 163, 164, площ под кривата, 138, 139, 318, 325,
182, 188, 308 326, 337
полупроводникови, 14, 16, 21, 69, повърхностен заряд, 72
246 повърхностен плазмонен резонанс, 128,
протеинови, 72, 327 259
РВСА, 14, 68, 111, 193, 315, 316, 318 повърхностно активни вещества, 35, 82,
РНСА, 188 88, 91, 96, 175
сребърни, 10, 14, 241, 271 повърхностно напрежение, 90
стелт, 127, 142 поли(L-глутаминова киселина), 325
тип ядро/обвивка, 11, 199, 200, 210, поли(L-лизин), 310, 311
211, 214, 219, 309, 310, 319 поли(ε-капролактон), 309, 311, 312
флуоресцентни, 97, 211 поли(етилбутилцианоакрилат), 317
397
поли(изохексилцианоакрилат), 317 Epaxal®, 338

поли(млечна киселина), 309, 311, 312, Genexol® PM, 325
318 Inflexal V®, 338
полиалкилцианоакрилати, 311 Livatag®, 317
полиамиди, 310, 311 Myocet®, 337
полибутилцианоакрилат, 14, 68, 107, Nanoxel® M, 325
111, 193, 315, 316, 318 NC4016, 326
полиелектролити, 95 NC6004, 326
полиестери, 309, 311, 312 NC6300, 326
полиетиленгликол, 90, 92, 119, 127, 136, NK012, 325
152, 154, 310, 315, Вж. PEGилирани NK105, 325
PEG дилема, 136 NK911, 326
полийонни комплекси, 320 Onivyde™, 337
полимеризация, 312, 314, 315 Onpattro®, 342
емулсионна, 314, 315 SP1049C, 326
междуфазова, 316 иРНК ваксини, 343, Вж. ваксини
полимерни мицели, 137, 219, 313, 314, протеинова корона, 125
319 псевдоалергия, 194, 337
видове, 319 пътища на въвеждане, 138, 140, 172
омрежени, 320, 323 равнина на прехлъзване, 75
получаване, 322 радиоизотопи, 19
приложения, 324 разпрашително сушене, 52, 328
полимерни наночастици. Вж. реактивни кислородни видове. Вж. ROS
наночастици рентгенова дифракция, 112
видове, 308 светоразсейване от частици, 58
получаване, 311 седиментационен анализ, 97
фармакологични аспекти, 316 седиментационно равновесие, 84, 86
полиплекси, 320 седиментация, 84
полисорбати, 92 силанизиране, 221
полоксамери, 91, 92, 321 скорост на коагулация, 94
полупроводникови наночастици, 198, скорост на седиментация, 85
Вж. наночастици сонохимични методи, 286
биоконюгация, 222 спектър на възбуждане, 71
биомедицински приложения, 225 сребърни наночастици, 15, 39, 54, 59,
модификация, 218 61, 90, 190, 192, 241, 245, 279, Вж.
оптични свойства, 200 метални наночастици
получаване, 208 стерилизация, 53
фармакологични аспекти, 234 лъчева, 55, 146
поточна цитометрия, 72, 179, 230 термична, 54
правило на Шулце-Харди, 95 химична, 54
препарати чрез микрофилтруване, 54
Abraxane®, 329 стерична стабилизация, 83, 89
AmBisome®, 338 стрептавидин, 18, 22, 49, 223, 224, 225,
BIND-014®, 318 227, 233, 256, 261, 298, 299
CPC634 (CriPec®), 326 супернатант, 45, 47, 253
DaunoXome®, 337 суперпарамагнитно състояние, 283
Doxil®, 336 сушене, 50
398
сърфактанти, 87, 91, 219, 220, 309, 319, на Hückel–Onsager, 81

322, 329, 338, 339, Вж. повърхностно на Браг, 112
активни вещества на Гибс-Томсон, 12, 39
твърдолипидни наночастици, 338, 341, на Дебай-Хюкел, 76
Вж. липидни наночастици на Стокс-Айнщайн, 62, 67, 111
теория на Шерер, 113
CNT, 39 утаечни методи, 284
DLVO, 88, 95 фаголизозоми, 149
LSW, 39 фагоцити, 149
на Mie, 242, 244 фагоцитоза, 133, 150, 229
на Smoluchowski, 39 фармакокинетика, 24, 137
на електрокинетичните явления, 81 фенестрации, 151
терапевтичен индекс, 24 ферихидроксид, 15, 137
термогравиметрия, 121 феромагнитен материал, 282
тиндалов ефект, 58 физиологични бариери, 24
тиогликолова киселина, 200, 212, 214, флокуланти, 93
218, 222 флокулация. Вж. агрегация
токсичност флуоресцентен
белодробна, 188 квантов добив, 206, 210, 217
бъбречна, 191 микроскоп. Вж. микроскоп
гастроинтестинална, 189 спектрофотометър, 70
ендотелна, 191 флуоресцентна in situ хибридизация.
имунотоксичност, 193 Вж. FISH
кожна, 187 флуоресцентно-резонансен енергетичен
невротоксичност, 190 пренос. Вж. FRET
очна, 187 флуоресценция, 70, 204
репродуктивна, 195 флуороурацил, 337
чернодробна, 189 фолат, 154, 227, 233, 329, 335
токсоиди. Вж. ваксини фосфолипиди, 146, 219, 329, 331, 333
траекторен анализ на наночастици, 61, DPPC, 331, 336
97 DSPC, 331, 336
трансферин, 137 PEGилирани. Вж. PEGилирани
трансцитоза, 145, 156 фосфолипиди
триоктилфосфиноксид, 199, 200, 208, структури, 332
212, 218, 219 фосфоресценция, 70
турбидиметрия, 65, 97 фототермична терапия, 257, 266
ултразвук, 12, 35, 96, 287, 333 фототермия. Вж. фототермична
ултрамикроскоп, 59, Вж. микроскоп терапия
ултрафилтруване, 43 фулерени, 11
ултрацентрофугиране. Вж. функционализиране, 48
центрофугиране хибридизация (на НК), 22, 265
аналитично, 46, 84, 85, 98 хидрозоли, 10
препаративно, 84 хидроксикамптотецин, 325
ултрацентрофуга, 84 хидротермални методи, 286
уравнение хидрофилно-липофилен баланс, 91
на Helmholtz–Smoluchowski, 81 хипертермична терапия, 15, 26, 301, 304
на Higuchi, 167
399
хипертермия. Вж. хипертермична диференциално, 46

терапия цисплатин, 326
холестерол, 332, 336, 337, 338 щернов слой, 74, 76, 95
хомогенизатор, 35, 341 ЯМР
хомогенизация, 35, 341 принцип, 293, 294
целево доставяне, 147 релаксометрия, 300
центрофугиране, 45, 127, Вж. спектроскопия, 109, 110
ултрацентрофугиране томография, 295, 301, Вж. MRI
в плътностен градиент, 46
400
За автора
Георги Йорданов завършва висшето си образование в Химическия

факултет на СУ „Св. Климент Охридски“ с магистърска степен по
„Наноматериали и нанотехнологии“ през 2006 г. Защитава дисерта-
ция за образователната и научна степен „доктор“ през 2010 г.,
посветена на синтез и охарактеризиране на флуоресцентни полу-
проводникови наночастици. През 2015 г. печели голямата награда
„Питагор“ за постижения в науката (за млад учен). През 2018 г.
защитава дисертация за научната степен „доктор на науките“ на
тема „Нанотехнологии за лекарствено доставяне: получаване и
охарактеризиране на полимерни наночастици за биомедицински
приложения“. Научните му интереси са в областта на приложение-
то на нанотехнологиите в биологията, медицината и фармацията.
Автор е на няколко глави от книги и над 50 научни публикации.
401

Биомедицина нанотехнологии

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Биомедицина нанотехнологии

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ГЕОРГИ ЙОРДАНОВ

480 530 580 630 680

Университетско издателство1 „Св. Климент Охридски“

© 2022 Георги Георгиев Йорданов

Нанотехнологиите обединяват множество научни дисциплини, като

Приложението на нанотехнологиите в биологията, медицината и фар-

Нанотехнологии и наномедицина. Наночастици за диагностика. Наночасти-

Нанотехнологиите обхващат получаването, охарактеризирането и при-

въглеродни нанотръбички (Reibold et al., 2007) и синьото багрило на маите

Дефинирането на съвременните нанотехнологии само според размера

поставянето на символа @ между емпиричните формули на състава на

използват наноутаителни процеси или химични реакции, при които от

Фиг. 1.1. Електронномикроскопски изображения на някои видове наночастици, изпол-

Трябва да се отбележи, че на фона на огромния брой научни публика-

за третиране на желязодефицитни състояния, съдържащи наноразмерен

Наночастиците, притежаващи потенциал за приложение в диагности-

Най-често наночастиците за диагностични приложения се модифицират с

Таблица 1.1. Някои видове неорганични наночастици за диагностични приложения

Антителата (известни още като имуноглобулини, Ig) са протеини,

повърхността на В-клетките и като секреторна пентамерна форма и участ-

IgD, IgE, IgG IgA IgM

В диагностичната и изследователската практика намират приложение

Фиг. 1.3. Молекула на антитяло IgG (схема)

Молекулите на антителата могат да се свържат по различни начини с

al., 2005). След осъществяване на свързването между антителата и нано-

Фиг. 1.4. Схематично представяне на ковалентно свързване на карбоксил-функционали-

Съществуват два основни проблема при свързването на антитела с

или върху твърд носител, при което се налага промиване за отстраняване

Фиг. 1.5. а) директно и б) индиректно свързване на наночастица (модифицирана с анти-

Директният метод изисква наличие на специфични маркирани с нано-

бъде осъществено с различни методи благодарение специфичните свой-

синтез и намират голямо приложение в различни диагностични и изсле-

Фиг. 1.6. Конюгиране на амино-функционализирана наночастица с олигонуклеотид чрез

Съществуват опити за приложението на магнитни и метални наночас-

Наночастиците с фармакологично действие представляват частици,

Приложението на нанотехнологиите в медицината предлага известни

носители за лекарства се разработват основно за потенциално приложе-

доставяне на лекарствени вещества до туморни клетки, за доставяне на

4. НАНОЧАСТИЦИ ЗА ХИПЕРТЕРМИЧНА ТЕРАПИЯ

Хипертермичната (хипертермия: повишаване на температурата) тера-

Локална хипертермия може да се получи при облъчване на златни

От близо век в повечето инактивирани ваксини се използва гелообра-

Функцията на ваксиналните адюванти е да усилят имуногенността на

антигенни носители, доставяйки ги целево до фагоцитиращите антиген-

Настоящите проблеми в биомедицинските нанотехнологии могат да се

на стерилизация на парентералните формулировки и лиофилизацията (не-

и да взаимодействат с различни биологични структури и системи (напри-

Общи методи за получаване (кондензационни методи, дисперсионни мето-

1. ОБЩИ МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ

През 1909 г. Svedberg предлага методите за получаване на колоиди да

представляват своеобразен подход от долу нагоре (bottom-up), докато

Фиг. 2.1. Схематично представяне на основните подходи при получаване на колоидни

1.1. Кондензационни методи (bottom-up approach)

При кондензационните методи се изхожда от молекулни разтвори, от

1.1.1. Физични кондензационни методи

Тук се причисляват основно различни наноутаителни методи, основа-

1.1.2. Химични кондензационни методи

Химичните кондензационни методи са сред най-разпространените

1.2. Дисперсионни методи (top-down approach)

При дисперсионните методи се извършва раздробяване на дисперсната

да е механично, чрез мелница (например планетарна), ултразвук или хо-

1.3. Дисперсионно-кондензационни методи

Тези методи са в основата си главно физични и включват дисперсио-

1.4. Образуване на наночастици в течна среда