ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA
------------

SINH HÓA MIỄN DỊCH:

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH
QUANG

Giáo viên hướng dẫn : Th.s Đoàn Thị Hoài Nam

Lớp : 18SH
Nhóm :8
Sinh viên thực hiện : Trương Thị Minh Châu
: Nguyễn Đức Tâm Đăng
: Nguyễn Thái Huy
: Trần Văn Nhật
: Nguyễn Nhật Phong
: Lê Bá Triệu Phong

Đà Nẵng, ngày 16 tháng 5 năm 2022

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

MỤC LỤC

MỤC LỤC .........................................................................................................1

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG .............................................. 2
I. Định nghĩa về các phản ứng miễn dịch huỳnh quang ............................. 2
II. Phân loại ..................................................................................................2
1. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp ...................................................... 3
2. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp ..................................................... 4
III. Nguyên lý hoạt động ............................................................................. 5
1. Phương pháp trực tiếp ....................................................................... 5
2. Phương pháp gián tiếp .......................................................................5
IV. Ví dụ về phản ứng miễn dịch huỳnh quang ..........................................6
Hình 1. 3 ...................................................................................................... 6
Hình 1. 4 ...................................................................................................... 7
Hình 1. 5 ...................................................................................................... 8
V. Kết luận ...................................................................................................8
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................9

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 1

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

I. Định nghĩa về các phản ứng miễn dịch huỳnh quang

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật có sự kết hợp giữa kỹ thuật
mô bệnh và kỹ thuật miễn dịch học. Trong đó, chất đánh dấu là các chất kháng
nguyên, được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và sẽ phát
quang dưới kích thích của tia cực tím.

II. Phân loại

Miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật được sử dụng để phát hiện sự hiện
diện của các kháng nguyên cụ thể trong một mẫu. Kỹ thuật này sử dụng các kháng
thể đặc hiệu. Do đó, trong trường hợp này, các kháng thể kết hợp với các
fluorophores để phát hiện chúng bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hơn nữa, có hai
loại miễn dịch huỳnh quang cụ thể là miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp.
Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp liên quan đến một kháng thể duy nhất và
fluorophore liên hợp trực tiếp với kháng thể này. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
liên quan đến hai kháng thể; sơ cấp và thứ cấp và fluorophore kết hợp với kháng thể
thứ cấp. Vì một số kháng thể thứ cấp có thể liên kết với một kháng thể chính và một
số fluorophores có thể kết hợp với các kháng thể thứ cấp.
Có hai loại miễn dịch huỳnh quang: Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và
gián tiếp. Sự khác biệt giữa miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp chủ yếu
nằm ở số lượng kháng thể được sử dụng và sự liên hợp fluorophore. Có nghĩa là,
trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, fluorophore tiếp hợp trực tiếp với kháng thể
chính trong khi trong miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, fluorophore tiếp hợp với
kháng thể thứ cấp.

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 2

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Hình 1. 1 Hai loại miễn dịch huỳnh quang

1. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp là một trong hai loại miễn dịch huỳnh quang.
Trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, một kháng thể đơn lẻ (kháng thể chính) liên
quan và fluorophore kết hợp trực tiếp với kháng thể chính. Khi liên kết kháng thể
với kháng nguyên đích, fluorophore phát ra huỳnh quang có thể được phát hiện
bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Hình 1. 2 Mễn dịch huỳnh quang trưc tiếp

Nhược điểm: Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp là một phương
pháp đắt tiền vì các kháng thể liên hợp sơ cấp có giá thành cao hơn so với các kháng
thể thứ cấp. Nhưng khi phát hiện, độ nhạy của miễn dịch huỳnh quang trực tiếp yếu
hơn so với huỳnh quang miễn dịch gián tiếp.

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 3

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Ưu điểm: Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp có kỹ thuật tiện và nhanh hơn
miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Hơn nữa, các liên kết không đặc hiệu bị giảm đi
trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Do đó, phản ứng chéo giữa các loài thấp.

2. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp là loại thứ hai của huỳnh quang miễn dịch
liên quan đến hai loại kháng thể như kháng thể chính và kháng thể thứ cấp trong
việc ghi nhãn kháng nguyên đích. Trong phương pháp này, fluorophore kết hợp với
kháng thể thứ cấp. Do đó, kỹ thuật này bao gồm một bước bổ sung. Tuy nhiên, độ
nhạy cao trong phương pháp này vì một số fluorophores có thể được liên hợp với
các kháng thể thứ cấp và nó giúp việc phát hiện dễ dàng hơn. Hơn nữa, miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp ít tốn kém hơn do sự liên hợp của các kháng thể thứ cấp ít
tốn kém và dễ dàng hơn. So với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp,
phản ứng chéo giữa các loài cao hơn trong phương pháp gián tiếp.
Ưu điểm:
 Nhanh và độ tin cậy cao hơn.
 Vì từng phân tử kháng thể kết hợp với kháng nguyên sẽ tự bắt cặp với một
vài phân tử kháng globulin nên huỳnh quang phát ra sẽ sáng hơn so với phương
pháp trực tiếp.
 Bằng việc sử dụng các kháng globulin chuyên biệt cho từng lớp globulin
nhiễm nên từng lớp kháng thể chuyên biệt cũng sẽ được phát hiện.

Bảng 1. 1 So sánh miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và trực tiếp

Huỳnh Quang trực tiếp Huỳnh quang gián tiếp

Là loại miễn dịch có Là loại miễn dịch có
Định nghĩa fluorophore trực tiếp liên fluorophore trực tiếp liên
kết với kháng thể chính` kết với kháng thể thứ cấp
Cơ chế gắn với
Gắn trực tiếp Không gắn
fluorophore
Số lượng kháng
1 2
thể sử dụng
Kháng thể thứ Không có sự tham gia Fluorophore kết hợp với
cấp của kháng thể thứ cấp kháng thể thứ cấp
Thời gian diễn ra Ít thời gian Chậm
Cần 1 bước bổ sung để
Quy trình Chỉ có 1 bước
phát hiện kháng thể

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 4

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

chính
Độ nhạy Độ nhạy kém Độ nhạy cao
Giá thành Giá thành cao Giá thành rẻ

III. Nguyên lý hoạt động

Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kết hợp
với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể. Kháng thể liên
hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT có thể quan sát
ở kính hiển vi huỳnh quang.
Nguyên lý kĩ thuật chung bao gồm: Kháng nguyên + Kháng thể + Chất đánh
dấu huỳnh quang + Nguồn sáng huỳnh quang
Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin.
Phụ thuộc vào các yếu tố:
 Bảo quản tốt các kháng nguyên
 Có đủ kháng thể để kết hợp
 Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang có chất lượng tốt
 Cần nhuộm cẩn thận và có phương thức ủ ấm đúng

1. Phương pháp trực tiếp

Các tế bào được nhuộm với kháng thể đã đánh dấu huỳnh quang.
Kháng thể trực tiếp đáp ứng với kháng nguyên như là vi khuẩn hay virus
được đánh dấu huỳnh quang với FITC. Mô hoặc các phết chứa sinh vật được gắn
lên phiến kính và được ủ với kháng huyết thanh đã đánh dấu huỳnh quang. Sau đó
rửa để loại bỏ những kháng thể không được bắt cặp. Khi được kiểm tra dưới kính
hiển vi bằng nguồn sáng UV, các mẫu đã gắn với kháng thể sẽ phát sáng.
=> Thử nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn khi số lượng của chúng rất
thấp.

2. Phương pháp gián tiếp

Các tế bào trước tiên được ủ với kháng thể sau đó được nhuộm với kháng thể
sơ cấp gắn chất phát huỳnh quang.
Kháng thể, kháng nguyên (các phết mô, lát cắt hoặc môi trường tế bào) được
gắn trên phiến kính. Sau đó được ủ với huyết thanh( nghi ngờ chứa kháng thể kháng

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 5

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

kháng nguyên đó). Huyết thanh sẽ được rửa, (chỉ để lại kháng thể đặc hiệu kết hợp
với kháng nguyên). Các kháng thể này sẽ được nhìn thấy sau khi ủ kính phết trong
kháng globulin có đánh dấu FITC. Sau khi các kháng globulin không gắn kết bị rửa
để loại đi sẽ được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nếu có sự phát huỳnh
quang thì chứng tỏ có sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh.

IV. Ví dụ về phản ứng miễn dịch huỳnh quang

Ví dụ, bệnh lupus ban đỏ hệ thống (SLE) (xem Rối loạn tự miễn dịch ) được
đặc trưng bởi mức độ biểu hiện của kháng thể kháng nhân (ANA) tăng cao. Các tự
kháng thể này có thể được biểu hiện chống lại nhiều loại protein liên kết DNA và
thậm chí chống lại chính DNA. Bởi vì tự miễn dịch thường khó chẩn đoán, đặc biệt
là giai đoạn đầu của bệnh tiến triển, xét nghiệm ANA có thể là một manh mối có giá
trị trong việc chẩn đoán và bắt đầu điều trị thích hợp.

Hình 1. 3
(a) Thử nghiệm IFA được sử dụng để phát hiện các kháng thể đặc hiệu với
kháng nguyên bằng cách cho phép chúng liên kết với kháng nguyên cố định trên
một bề mặt và sau đó chiếu sáng các phức hợp này bằng liên hợp kháng thể thứ
cấp-fluorogen.
(1) Kháng nguyên được cố định vào một bề mặt
(2) Huyết thanh bệnh nhân được thêm vào. Nếu có khánh thể chúng liên kết
với kháng nguyên
(3) Kháng thể thứ cấp (có nhãn huỳnh quang) được thêm vào; nếu có kháng
thể của bệnh nhân, thì kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với kháng thể của bệnh nhân

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 6

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Hình 1. 4
(b) Trong ví dụ này về hình ảnh hiển vi của xét nghiệm kháng thể huỳnh
quang gián tiếp, các kháng thể của bệnh nhân đối với vi rút sởi liên kết với các
kháng nguyên vi rút có trên các tế bào nhiễm bệnh sởi bất hoạt được gắn trên một
phiến kính. Các kháng thể thứ cấp liên kết các kháng thể của bệnh nhân và mang
một phân tử huỳnh quang. (tín chỉ b: sửa đổi công việc của Hiệp hội Vi sinh vật học
Hoa Kỳ).
IFA cho ANA bắt đầu bằng cách cố định các tế bào được nuôi cấy vào lam
kính và làm cho chúng có thể thấm được kháng thể. Các phiến kính sau đó được ủ
với các dung dịch pha loãng nối tiếp của huyết thanh từ bệnh nhân. Sau khi ủ, phiến
kính được rửa để loại bỏ các protein không liên kết và được thêm vào kháng thể
huỳnh quang (kháng thể IgG liên kết với fluorogen). Sau khi ủ và rửa, tế bào có thể
được kiểm tra huỳnh quang xung quanh nhân (Hình 1.4). Hiệu giá của ANA trong
huyết thanh được xác định bằng độ pha loãng cao nhất cho thấy huỳnh quang.

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 7

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Hình 1. 5

V. Kết luận

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang có vai trò sàng lọc các kháng thể
tự miễn như: kháng thể dsDNA,… Các kháng thể này có vai trò trong việc chẩn
đoán nhiều bệnh tự miễn như xơ cứng bì như lupus ban đỏ hệ thống, viêm cơ tự
miễn, xơ đường mật nguyên phát. Chính vì vậy, xét nghiệm này có vai trò quan
trọng trong sàng lọc và chẩn đoán các bệnh tự miễn.

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 8

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Ekins, R. P. (1989). Multi-analyte immunoassay. Journal of pharmaceutical and
biomedical analysis, 7(2), 155-168.
[2] https://dalieu.vn/benh-pemphigoid-bong-nuoc/
[3] https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/vi-sinh-vat/ky-thuat-mien-d
ich-su-dung-trong-chan-doan-vi-sinh-vat
[4] Hinh, PGS TS Nguyễn Đức, et al. "HƯỚNG DẪN CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU
TRỊ CÁC BỆNH SẢN PHỤ KHOA."
[5] http://www.vetshop.com.vn/2013/10/phan-ung-mien-dich-huynh-quang.html
[6] https://dalieu.vn/tiep-can-chan-doan-mien-dich-huynh-quang-trong-cac-benh-da
-co-bong-nuoc-tu-mien/
[7] http://tailieu.yte.gov.vn/tim-kiem/tu-khoa?key=k%E1%BB%B9%20thu%E1%
BA%ADt%20mi%E1%BB%85n%20d%E1%BB%8Bch%20hu%E1%BB%B3nh%
20quang
[8] https://luanvanyhoc.com/ung-dung-ky-thuat-mien-dich-huynh-quang-phat-hien-
vi-khuan-ta-o-moi-truong-nuoc-ngoai-canh/
[9] https://www.dieutri.vn/bgvisinhyhoc/phan-ung-mien-dich-huynh-quang-trong-c
han-doan-vi-sinh

NHÓM: 8 GVHD: Th.s Đoàn Thị Hoài Nam 9