A muslica - egy százéves modell

Szabad János
Anyai Hatás és Embriológia MTA kutatócsoport
Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Biológiai Intézet
Szeged

Modell organizmus az olyan faj, amelyet azért tanulmányoznak intenzíven, hogy az általa
megismert biológiai jelenség alapján egy másik fajról lehessen ismereteket gyűjteni. A
modellfajok azért használhatók, mert az alapvető biológiai folyamatokat meghatározó
mechanizmusok az evolúció folyamán megőrződtek. Modellfajként olyan élőlények
szolgálhatnak, amelyek kísérletileg és genetikailag könnyen manipulálhatók, élettartamuk
rövid, kicsi a genomjuk. A legismertebb modellfajok a következők: az E. coli baktérium, a
Saccharomyces cerevisiae élesztő, a Caenorhabditis elegans fonalféreg, a közönséges muslica
(Drosophila melanogaster), a lúdfű (Arabidopsis thaliana) és az egér. (Wikipedia lexikon,
internet.)

Miért a muslica?
A muslica a kétszárnyú rovarfajok egyike, teljes átalakulással fejlődik (1. ábra). Immáron
századik éve használják modellfajként: az első muslicával kapcsolatos dolgozat 1906-ban
jelent meg. Azóta a genetikai kutatások modellfajaként vált ismerté a következő „érdemei”
miatt. Egy muslica generáció kifejlődéséhez csak két hétre van szükség (1. ábra). Tenyészetei
kis helyen elférnek, egyszerűen és olcsón fenntarthatók, a muslica mutánsok ezrei állnak a
kutatók rendelkezésére. A muslica genomja egy X, egy Y, két nagy, valamint egy nagyon kis
autoszómba szerveződött (2. ábra), nukleotid szekvenciája 2000. illetve 2002. óta ismert,
1,65x108 bp-ból áll, és mintegy 14000 gént tartalmaz. Az emberben és a muslicában jószerivel
azonos a génexpresszió szabályozás mechanizmusa, a sejtváz szerveződése, az idegrendszer
és a szinapszisok szerkezete és funkciója, a sejtek közötti kommunikáció, a sejthalál módja.
Minthogy a géncsaládok száma nagyjából azonos a két fajban, érthető, hogy az ember
öröklődő betegségeivel kapcsolatos gének háromnegyedének van muslica homológja. A
gének szerepe pedig kényelmesen tanulmányozható muslicában. Nem véletlen, hogy a
muslica olyan alapvető életjelenségek molekuláris alapjainak megismerésében játszott
szerepet, mint sejtosztódás szabályozása, a daganatképződés, a tanulás, a memória, a belső óra
és a napi ritmus, a szignáltranszdukció, a mintázatképződés, a neurodegeneráció, a
cukorbetegség, a meddőség, a kromatin szerveződés.

Markermutációk
A merkermutációk olyan mutáns allélok, amelyeknek látható fenotípusa van. Pántlikaként
jelölik meg a kromoszómák jól definiált pontjait. Zömük recesszív, ám szép számmal vannak
dominánsak is. (A legismertebbek a szemek, vagy a test színét, a szőrök, a szem, a szárnyak
alakját befolyásolják, és egy boncoló mikroszkópban kényelmesen felismerhetők.) A
markermutációk tették lehetővé az ún. kapcsolt öröklődés felfedezését, azt, hogy vannak
olyan gének, amelyek nem függetlenül kombinálódva öröklődnek, hanem többnyire együtt,
kapcsoltan. Az együtt öröklődő gének kapcsoltsági csoportot alkotnak. Minthogy a
kapcsoltsági csoportok száma azonos a genomot alkotó kromoszómák számával nyilvánvaló,
hogy a kromoszómák hordozzák az örökítő anyagot, a DNS-t. A kapcsoltsági csoporton belül
a crossing-over biztosítja a gének/allélok cseréjét az anyai és az apai eredetű homológ
kromoszómák között. A crossing-over alapján derült arra fény, hogy a gének
gyöngyfüzérszerűen, egymástól jól meghatározható távolságra sorakoznak a
kromoszómákban, és lehetett géntérképeket szerkeszteni (3. ábra).

Balanszer kromoszómák
Egy-egy marker mutációval jelölt, és értékes mutációt hordozó kromoszóma megőrzendő
érték az egymást követő generációk folyamában. Ha (1) kevés kromoszómából áll a genom,
és (2) kiküszöbölhetők a crossing-overek, az értékes kromoszómák változatlan formában
kerülhetnek generációról generációra, fenntarthatók. A muslica esetében az első feltétel
teljesül, mert a genetikai információ tartalom csaknem száz százalékát az X, a 2. és a 3.
kromoszóma tartalmazza (2. ábra). A crossing-overek kiüszübölésére, a kromoszómákat
egybetartandó készültek az ún. balanszer kromoszómák. A balanszer kromoszómák
mindegyikében több inverzió van, és megakadályozzák a homológ kromoszómák párosodását
az első meiótikus osztódás profázisában. A homológ kromoszómák párosodásának hiányában
nem következhetnek be crossing-overek, ami miatt nemcsak a balanszer kromoszóma kerül
változatlan állapotban a következő generációba, hanem az párja is, amely marker mutációval
jelölt és értékes mutációt hordoz. Minthogy a balanszer kromoszómák domináns és recesszív
markermutációkat is tartalmaznak, nyomon követhetők az egymást követő generációk során.

Az óriáskromoszóma
A muslicában, mint sok más rovarfajban, az embrionális élet során a sejteknek két típusa
különül el: az imaginális és a lárvális és sejtek. Az imaginális sejtek diploidok (köztük pl. a
szemkezdemények sejtjei), a lárvális életszakasz folyamán osztódnak, hogy a majdani imágó
szöveteit alkossák. A lárvális sejtek nem osztódnak, bennük anélkül folyik a DNS sorozatos
replikációja, hogy sejtosztódások történnének. A kromatidák kéveszerű kötegeket alkotnak,
külön-külön az anyai, és az apai eredetűek, hogy aztán ők is egymáshoz tapadjanak és ún.
politén kromoszómát alkossanak (2. ábra). A lárvaállapot végén a nyálmirigy egy-egy
sejtjében az anyai és az apai eredetű kromoszómákat egyaránt 512, összesen 1024 kromatida
reprezentálja. A kromoszóma igazi „óriás”: mintegy 1 mm hosszú, és óriáskromoszómaként
ismert (2. ábra). Orcein festés nyomán az erősen feltekeredett, sok DNS-t tartalmazó részek
sötét, a kevesebb DNS-t tartalmazók világos sávként tűnnek fel, jellegzetes „vonalkódot”
alkotva. A sávmintázat alapján a kromoszóma bármely része felismerhető (4. ábra). A
nyálmirigyet bábozódás előtti lárvából szokás kiboncolni, 45%-os ecetsavban tárgy- és
fedőlemez között szétnyomni, orceinnel megfesteni, és mikroszkópban tanulmányozni. A sáv-
mintázat alapján kijelölt 102 régió mindegyikben A-F betűvel jelölt alszakaszok, azokon belül
további sávok vannak. Egy betűvel jelölt alszakaszban átlagosan 300 kb DNS, és 15-25 gén
van. Az óriáskromoszóma vonalkód alapján kényelmesen meghatározható, hogy a különféle
átrendeződések (deficiencia, duplikáció, transzlokáció, inverzió) miként változtatták meg a
genom szerveződését (4. ábra). Egy DNS mintát alkalmasan megjelölve, vele in situ
hibridizációt végezve az óriáskromoszómán meg lehet állapítani, hogy van-e a DNS-nek
muslica homológja, és azt is, hogy hol.
Az óriáskromoszóma azon helyei megduzzadnak és ún. puffot alkotnak, ahol intenzív
transzkripció folyik. A puff-mintázat időbeni változása alapján látható jelek alapján követhető
nyomon a génexpresszió-változás, pl. azután, hogy a nyálmirigyekhez vedlési hormont
(ekdizont) adunk (2. ábra).
Az óriáskromoszómákkal kényelmesen jellemezhetők a kromoszóma részek
átrendeződésével kapcsolatos változások: deficienciák, inverziók, duplikációk és
transzlokációk. Olyan deficienciák sorozatával, amelyek átfednek térképezhetők a recesszív
mutációk: a mutáció annak a deficienciának a területére esik, amellyel kobinálva mutatja a
mutáns fenotípust. Száz év muslica genetika eredményeként olyan deficiencia-készlet áll
bárki rendelkezésére, amely csaknem az egész genomot átíveli. Sőt, már vannak olyan
deficiencia-készletek is, amelyekben bázispár pontossággal ismert a deficiencia kezdete és
vége.
A duplikációk megkettőzik a genom valamely szakaszát, az óriáskromoszóma alapján pedig
ponosan meghatározható a duplikálódott szakasz kezdeti és végpontja. A duplikációkkal
gyakorta meghatározható a domináns (D) mutáció természete, és a helye is a genomban. A D
mutációk jelentős többségének esetében ugyanis a mutáns fenotípus függ az ép (+) gének
számától. A duplikáció végpontjainak, valamint a D mutációra gyakorolt hatásának alapján
eldönthető, hogy a D mutáció (és az ép gén) a duplikálódott szakasz területére esik vagy sem.
Átfedő duplikációkkal megközelítő pontossággal térképezhető a D mutációval azonosított
gén.

Mutagenezis, mutációk
A DNS alapvető tulajdonsága, hogy bár ritkán, spontán is változik. A változás eredményeként
jönnek létre a mutáns génváltozatok, az allélok. Az allélokkal kapcsolatos mutáns fenotípus
alapján az ép gén funkciójára lehet következtetni. Például az ép white+ (w+) gént hordozó
muslicák szeme téglapiros. A w+ gén mutációja nyomán képződtek a white (w) mutáns allélok.
A w/w nőstény, valamint a w/Y mutáns muslicák szeme fehér, jelezve, hogy az ép w+ génnek
a szemszín kialakulásában van szerepe. (Y az hímekre jellemző nemi kromoszóma jele. A
muslica genetikában az ép gént gyakorta a mutáns fenotípus alapján nevezik el: a white gén
kifejezés tehát az ép white+ génre vonatkozik.) Lényegében tehát a mutáns fenotípus alapján
következtetni lehet az ép gén funkciójára.
Az itt említett megközelítés - a genetikai boncolás technikája - az etil-metánszulfonát
(EMS) használata után vált kézenfekvővé, 1968-tól kezdődően. Az EMS a mutagének egyike,
és főleg G≡C → A=T bázsipárcsere típusú pontmutációkat indukál. Ha pl. azokat a géneket
óhajtjuk azonosítani, amelyek a testszelvények kialakulásához szükségesek, első lépésként
mutációkat indukálunk. (Úgy, hogy hímeket EMS oldat jelenlétében tartjuk, azt fogyasztják.)
Az EMS a spermiumok kromoszómáiban véletlenszerűen indukál mutációkat. Genetikai
keresztezések itt nem tárgyalt sorozatával kideríthető, hogy van-e mutáció az EMS-el kezelt
kromoszómán, és az is, hogy a mutáció befolyásolja-e a testszelvények kialakulását. Ha elég
sok mutagenizált kromoszómát vizsgálunk meg, elvileg minden olyan gén azonosíthatunk,
amelyek részt vesznek a testszelvények kialakulásában. Az immáron mutációkkal azonosított
ép gének funkciójának megismerése a következő módon történik. Először kiderítik, hogy a
mutáció melyik kromoszómához kapcsoltan öröklődik, majd azt (a crossing-overek és a
markermutációk alapján), hogy a mutáció a kromoszóma mely szakaszának részé. Végezetül a
molekuláris biológia eszköztárával megklónozzák a mutációval azonosított ép gént, hogy
megismerjék molekuláris funkcióját. A klónozott gén birtokában megkereshető a gén
homológja más fajokban. A fenti megközelítés nyomán váltak ismerté a muslica azon génjei,
amelyek a testszelvények kialakulásában játszanak szerepet, és derült arra fény, hogy
ugyanazok a gének lényegében ugyanolyan mechanizmus alapján szabályozzák a muslica és
az ember testszelvényeinek kialakulását, a végtagok kifejlődését, érthettük meg az öröklődő
veleszületett rendellenességek genetikai alapjait (3. ábra). A mutációk lényegében tehát olyan
eszközök, amelyekből kiindulva hozzáférkőzhetünk az ép génhez, meghatározhatjuk
molekuláris funkcióikat, és alapvető folyamatokat ismerhetük meg. A balanszer
kromoszómák olyan eszközök, amelyekkel fenntarthatjuk az értékes mutációkat tartalmazó
kromoszómákat.

A P-elem
Mutagenezisre a P-elem, a transzpozonok, a mobilis genetikai elemek egyike is használatos.
A P-elemet 2907bp alkotja, szélein 31 bázispárból álló fordítottan ismétlődő szekvenciával (5.
ábra). Ugrálásuk közben a P-elemek úgy ékelődhetnek be génekbe, indukálhatnak mutációkat,
hogy elrontják a gének funkcióit. Minthogy a P-elem molekulárisan több mint húsz éve
ismert, in situ hibridizációval meghatározhatjuk a P-elem helyét az óriáskromoszómában, és -
a P elemből kiindulva - megklónozhatjuk a gént. Ma már több olyan P-elemmel indukált
mutáns-gyűjtemény áll a kutatók rendelkezésére, amelyekben ismert a P-elem helye. Sőt, a P-
elem nem precíz kiugrasztásával további mutáns allélok is készíthetők.

Transzgénikus muslicák
A P-elem kémcsőben a molekuláris biológia eszköztárával módosítható. Eltávolítható a belső
része, helyére tetszőleges szekvencia helyezhető: „nyomjelzőként” pl. az ún. mini-w+ marker
gén (amely a white mutáns hátteren sárgává, narancssárgává teszi a transzgént hordozó
muslicák szemét), valamint pl. egy olyan DNS szakasz, amelyben az α-tubulin és a zölden
fluoreszkáló proteint (GFP) kódoló szekvencia alkot egy további „szintetikus” gént. A
módosított P-elemet plazmidba építik, baktériumokban elszaporítják, majd izolálják, és a
transzpozáz enzim képződését kódoló DNS-el egyetemben fiatal muslica embriók hátulsó
végébe injektálják. Oda, ahol az embriógenezis kezdetén kialakulnak az ősivarsejtek,
amelyekből a majdan kifejlődő muslica ivarsejtjei származnak (6. ábra). A beinjektált DNS
koktélt a kialakuló ősivarsejtek a pete citoplazma kicsinyke részeként magukba zárják, hogy
aztán az esetek néhány százalékában a módosított P-elem a transzpozáz enzim tevékenysége
nyomán a DNS-be, valamely kromoszómába ékelődjön, annak részévé, transzgénné váljon.
Az ősivarsejtből ivarsejtek képződnek, és ha részt vehetnek a megtermékenyülésben, a
transzgént hordozó kromoszóma az utódok valamelyikében bukkan fel. Minthogy a
transzgénnek része a mini-w+ marker gén, a transzgént hordozó muslicák szeme narancssárga.
(A transzgént nem gordozó muslicák szeme fehér.) A transzgén generációról generációra
fenntartható. 1982-től kezdődően megszámlálhatatlan transzgénikus muslica vonalat
készítettek és használnak, köztük azokat is, amelyek zölden „kivilágítják” a mikrotubulusokat.
A zölden világító mikrotubulusokat figyelve élő embriókban tanulmányozható pl. a
magorsófonal-rendszer szerveződése, konfokális mikroszkópban készített optikai metszetek
időbeni sorozatával (7. ábra).
A transzgén technika használata szerteágazó. Pl. az enhanszer-csapda technika olyan
szekvenciák detektálására alkalmas, amelyek a muslica valamilyen génjének szövetspecifikus
expresszióját szabályozzák. Az enhancer-csapda egy olyan transzgén, amelyben az E. coli
LacZ génjének 5’ végéhez egy nagyon gyenge promóter kapcsolódik. A transzgént a genom
különböző pontjaira ugrasztva megesik, hogy olyan erős szövetspecifikus enhanszer hatása
alá kerül, hogy a LacZ gén erősen expresszálódik, a sejtekben sok β-galaktozidáz enzim
képződik, a sejtek egyfajta festés nyomán kékre festődnek. (Az ugrasztást úgy végzik, hogy
genetikai keresztezés nyomán egy transzpozáz-forrással kombináljál az enhanszer-csapda
transzént. A transzpozáz forrás is egy transzgén. A transzpozáz hatására az enhanszer-csapda
transzpozonként viselkedik, megváltoztatja helyét a genomban.) Az enhanszer csapda
technikával azonosíthatók, majd izolálhatók a szövet specifikus génexpressziót biztosító
szekvenciák.

A GAL4/UAS rendszer
A transzgén készítés egyik „termése” az ún. GAL4/UAS rendszer, amellyel bármely gén a
muslica bármely szövetében expresszáltatható (8. ábra). Az ún. „driver” transzgénben a
muslica valamely szövetspecifikusan expresszálódó génjének szabályozó szekvenciáját az
élesztő Gal4 génjével kombinálják. A GAL4 fehérje az élesztő UAS (angolul upstream-
activating sequence) szekvenciáihoz kötődve bekapcsolja azt a „meghajtott” gént, amely
expressziója az UAS szekvencia szabályozása alatt áll. A két transzgént alkotó DNS
darabkákat kémcsőben „varrják össze”, belőlük külön-külön transzgéneket készítenek, majd
genetikai keresztezésekkel hozzák össze a „driver” és a „meghajtott” transzgéneket
ugyanabba a muslicába.
Az eyless-Gal4 driver a szemkezdemény sejtekben biztosítja az UAS-hez kapcsolt gén
expresszióját. (A szem azért ideális vizsgálódási objektum, mert a torzszemű, sőt a
szemnélküli muslicák is életképesek. A szemkezdemény sejtek pusztulása a szokásosnál
kisebb, durva szemek képződéséhez vezet; 9. ábra.)
A muslica szemkezdemény sejtekben kiválóan modellezhető az ember ún. triplett expanziós
öröklődő betegsége, a Huntington betegség (vitustánc), amely a CAG szekvencia
megsokszorozódásával, poliglutamin szakaszok képződésével, fehérje aggregátumok
kialakulásával, az idegsejtek némelyikének pusztulásával, akaratlan rángatózással jár. A
Huntington betegség a huntingtin gén domináns mutációja nyomán alakul ki, amely allél
terméke toxikus, megmérgezi, megöli a sejteket. A Huntington betegség muslica
modellezésese során eyless-Gal4 driverrel hajtják azt az UAS transzgént, amelynek része a
mutáns huntingtin allél. És valóban, az itt említett muslicák szeme durva, csökkent méretű.
Azért, mert a szemkezdemény sejtek egy részét elpusztítja a bennük termelődő, toxikus
huntingtin fehérje (9. ábra). A fent említett két transzgén mellett a muslica genomjába
deficienciákat, duplikációkat, mutagenizált kromoszómákat lehet bevinni, miáltal fel lehet
deríteni azokat a géneket, amelyeknek szerepe van a poliglutamin expanziós betegség
kialakulásában. Az elképzelés eredményesnek bizonyult, és megmutatta, hogy a folyamatban
azoknak a dajka fehérjéknek van fontos szerepe, amelyek a fehérje molekulák térbeli
szerkezetének kialakításában szorgoskodnak. A muslica modell arra is alkalmas, hogy a fent
említett muslicákon különféle molekulákat is kipróbáljanak. (Általában úgy, hogy a
hatóanyagot a lárvák táptalajába keverik.) Ha a vizsgált molekula akadályozza a poliglutamin
expanziót, úgy a muslicák szeme ép marad. Nos, a fenilvajsav (a hiszton deacetiláz enzim
gátlószere), és a rapamicin hatékonynak bizonyult. Ma már mindkét molekula a klinikai
kipróbálás stádiumában van...
Az Alzheimer kór öröklődő változatában (is) olyan ún. amiloid plakkok képződnek,
amelyek az ún. amiloid prekurzor protein rendellenes bomlása során képződnek, 42
aminosavból állnak, aggregátumaik elpusztítják az idegsejteket. Nos, a muslica
szemkezdeményben (az eyless-Gal4 driverrel) expresszáltatott, a 42 aminosavból álló toxikus
peptidet kódoló transzgén nyomán csökkent méretű, durva szemek alakulnak ki. A transzgént
gént az idegrendszerben expresszálva (az elav-Gal4 driverrel) Alzheimer kóros muslicák
képződnek, tipikus tanulási defektussal és neurodegenerációval. Az itt említett genetikai
háttérbe bevitt mutagenizált kromoszómákkal már lehetett azonosítani azokat a géneket,
amelyek az amiloid plakkok kialakulásában játszanak szerepet.
A Prkinson kór a dopaminerg neuronok degenerációjával kapcsolatos önkéntelen,
koordinálatlan mozgás. Az alapja az, hogy a dopaminerg neuronok jellegzetes csoportjában a
sejteken belül α-synuclein halmozódik fel, és öli meg a sejteket. A Parkinson kór egyik típusa
azzal a domináns negatív mutációval kapcsolatos, amely az α-synuclein génben következett
be, és aminosav cserét okoz a kódolt fehérjében. A α-synuclein gén domináns mutáns allélját
muslicába transzformálva (egy UAS transzgénben) és az eyless-Gal4 driverrel meghajtva
csökkent méretű és durva szemek képződtek a szemkezdemény sejtekben felhalmozódó
toxikus α-synuclein miatt. Az itt említett genetikai háttérbe mutagenizált kromoszómákat
hozva világossá vált, hogy a szemkezdemény sejtek pusztulásában, a Parkinson kór
kialakulásában a dajkafehérjéknek fontos szerepe van. A muslica lárvákat geldanamicinnel
etetve a Parkinson megelőzhető volt. A geldanamicin fokozza azoknak a géneknek az
expresszióját, amelyek a dajka fehérjék kéződését kódolják.

Módszerek genetikai mozaikok generálására

Valamely gén funkcióját a sejtek életében úgy lehet legegyszerűbben megvizsgálni, hogy
olyan sejteket készítünk, amelyekből hiányzik a gén funkciója, és tanulmányozzuk a sejtek
sorsát. Hogy lehet egy sejtből egy gént „kiemelni”? A legegyszerűbb megoldás az, ha
mutagenezissel elkészítjük a gén null allélját (m), majd az m/+ heterozigóta sejtek utódsejtjei
között m/m homozigótákat indukálunk mitotikus rekombinációval (10. ábra). (A legújabban
kifejlesztett megoldást, az RNSi technikát, egy későbbi fejezet mutatja be.)
Egy mitózis nyomán egyetlen anyasejtből két olyan leánysejt képződik, amelyek
genetikailag azonos értékűek az anyasejttel (10. ábra). Hordozza a homológ kromoszómák
egyike m-et, egy gén funkcióját vesztett mutáns allélját, valamint az a recesszív
markermutációt. Hordozza a homológ kromoszómák másika a b recesszív markermutációt. A
sejtek sem az a, sem a b, sem pedig az m mutáció fenotípusát nem mutatják, mert mindhárom
mutációra heterozigóták. Mitotikus rekombinációt követően (10. ábra) viszont egy-egy
genetikailag megjelölt sejt képződik. (Mitotikus rekombinációt többnyire röntgensugárzással
szokás indukálni.) Az egyik az a, a másik a b markermutációra homozigóta. A genetikailag
megjelölt sejtek a szervkezdemény osztódása során örökítik jelöltségüket utódsejtjeikre, és
végeredményben sok olyan a/a, valamint b/b sejt képződik, amelyek felismerhetők a
heterozigóta sejtek között. Az a/a, valamint b/b sejtek két mozaik foltot, egy ún. ikerfoltot
alkotnak, hisz’ ugyanannak az anyasejtnek a leszármazottai. Az a/a sejt egyben m/m is (10.
ábra). Ha az m mutációval azonosított ép m+ génnek nincs funkciója a sejtek életében, az a
m/a m sejtek éppen olyan életképesek, mint a b/b sejtek. Ha azonban az m+ génnek van
funkciója a sejtek életében, az a m/a m sejtek elpusztulnak, esetleg élnek, ám osztódásra
képtelenek, vagy valamilyen jellegzetes defektust mutatnak. Vagyis, egy egyszerű
technikával, alkalmas markermutációk megválasztásával meghatározhatjuk valamely gén
szerepét a valamilyen sejttípus életében.

A domináns nőstény-steril technika

A kérdés, hogy mi egy m+ gén szerepe a nőstény ivarsejtvonal és az embriók életében,
különösen fontos. Azért, mert egy m/m+ nőstény és egy m/m+ hím házasságából származó m/m
embriók olyan citoplazmában fejlődnek, amely tartalmazza az anya m+ génjének termékét.
(Többnyire RNS és/vagy fehérje molekulák formájában. A jelenséget anyai hatásnak
nevezik.) Az anyai eredetű ép géntermék kisegíti az m/m embriót, „elfedi” az m mutációval
kapcsolatos mutáns fenotípust, m+ ép gén valódi szerepének megértését. Az, hogy van-e
szerepe az m+ génnek a nőstény ősivarsejtek és/vagy az embriók életében úgy dönthető el, ha
olyan ősivarsejteket készítünk, amelyek nem tartalmazzák az m+ gént, m/m-ek. Az m/m
nőstény ősivarsejtből származó embrióban nincs benne az m+ gén termékének „elfedő” hatása.
Mint fentebb láttuk, m/m sejtek mitotikus rekombináció nyomán képződnek. Hordozzanak az
ősivarsejtek az m mutáció mellett egy olyan domináns nőstény-steril mutációt (F) amely
megakadályozza a petekezdemények érését (10. ábra). Mitotikus rekombinációt követően egy
olyan leánysejt képződik, amely miközben m/m-é válik, nem hordozza F-et. A sejtből pete
fejlődhet, kivéve, ha az m+ gén hiánya megakadályozza a pete, illetve az embrió képződését.
Az itt bemutatott ún. domináns nőstény-steril technika - mivel eltávolítja az anyai eredetű m+
géntermék „elfedő” hatását - roppant fontos szerepet tölt be az embriógenezis genetika
szabályozásának megismerésében.

Az FLP/FRT technika a mozaikok generálására

Genetikai mozaikokat újabban az PLP/FRT technikával generálnak. Az élesztő Flp génje az
FLP hely-specifikus rekombináz enzim képződését kódolja. Az PLP fehérje ott indukál
rekombinációt, ahol az FRT szekvenciák a kromoszómákba ékelődtek. A rekombináció
nyomán genetikailag megjelölt sejtek képződnek (11. ábra). Az PLP/FRT technikában az FLP
forrása egy Flp gént tartalmazó transzgén. Az FRT szekvenciák is transzgének részei, és a
homológ kromoszómák azonos helyein vannak. (A tanulmányozandó m mutációt
mindenkinek magának kell összehozni az FRT szekvenciával, a meiózis során, a crossing-
overek eredményeként). Az Flp gén expresszióját, az FLP fehérje képződését alkalmasan
megválasztott szekvencia biztosítja. Például az eyless-Flp transzgének funkciója nyomán csak
a szemkezdemény sejtekben következnek be a 11. ábrán bemutatott események, lényegében a
szemkezdemény fejlődés teljes időtartama folyamán. A Hsp-Flp transzgénekről viszont csak a
hősokk időpontjában termelődik FLP fehérje, ám minden sejtben. Akkor, amikor a hősokk
fehérjék (angolul heat shock proteins) képződését kódoló gének aktíválódnak, miközben a
lárvákat 37oC-on tratjuk ½-1 órán át.

Az RNSi technika
Valamely gén funkcióját úgy is meg lehet szüntetni, hogy megsemmisítjük a génről képződő
mRNS molekulákat. Készítsünk egy olyan ”meghajtott” transzgént, amelyben egy 300-400 bp
hosszú szekvencia van (12. ábra). A szekvencia annak génnek az alapján készült, amely gén
funkcióját meg óhajtjuk szüntetni. A „meghajtott” génben ugyanaz a szekvencia kétszer van
meg, fordított irányban. A „meghajtott génről” képződő RNS komplementer szakaszai
párosodnak, miközben egy hajtűszerű hpRNS (angolul hair pin) képződik. A hpRNS itt nem
részletezett események nyomán rövid, kettősszálú darabokra, ún. siRNS-ekre (angolul small
interfering) hasítódik (12. ábra). Az siRNS-ek egyik szála annak az mRNS-nek a
komplementer szekvenciájához kapcsolódik, amely mRNS-t meg akarjuk semmisíteni. Az
RNS a kettős szálú részen elhasad, majd az immáron sérült mRNS apró darabokra esik.
Lényegében tehát interferáltunk az mRNS-el, a gén funkciójával (12. ábra). Alkalmasan
megválasztott driverrel és hpRNS-t kódoló transzgénnel elvileg bármely gén terméke bármely
sejttípusban megsemmisíthető.

Géncsere homológ rekombináció alapján

Talán meglepő, hogy bár a muslicában megszámlálhatatlan mutációt indukáltak, mégis
bőségesen vannak olyan gének, amelyeknek nincsenek mutáns alléljai. Ha például kiderül,
hogy az ember parkin génjének funkcióvesztéses típusú mutációja Parkinson kórhoz vezet, és
az is, hogy a parkin génnek van muslica homológja, a génfunkció és a betegség kapcsolatának
megismerésé a muslicában egyszerűbb, mint az emberben. A muslica parkin génjét az ember
és a muslica genom ismeretében könnyen megtalálhatjuk. A következő feladat mutáns allélok
készítése, majd a velük kapcsolatos elváltozások felderítése. (A muslica parkin génjének
hiánya a mitokondriumok duzzadásához, az izomsejtek pusztulásához, az izmok
degenerációjához, a muslicák korai pusztulásához vezet.) A homológ rekombináción alapuló
technikával a muslica bármely génje tetszés szerinti, kémcsőben (az ún. in vitro mutagenezis
módszerével) készített mutáns allélra cserélhető.
Az egyszerűbb megoldás az ún. „Ends out” technika, amellyel egy ép gént olyan ún. knock
out alléra cserélhető, amely elvesztette funkcióját (13. ábra). Az eljárás során először olyan
DNS-t állítanak össze, amelyben (i) a kicserélendő gén szekvenciáját a mini-w+ gén
megszakítja. (ii) A DNS végeire olyan 18 bázispárból álló szekvenciát illesztenek, amelyet az
I-SceI restrikciós enzim ismer fel, és vágja el ott a DNS-t, valamint (iii) a korábban már
említett FRT szekvenciát (13. ábra). A kémcsőben összeállított szekvencia transzgén
formájában valamely kromoszómába illeszthető, fenntartható. Genetikai keresztezések
nyomán ugyanabba a muslicába összehozható az (i) előbb említett transzgén, (ii) az FLP
fehérje képződését kódoló transzgén, valamint (iii) az a transzgén, amely az I-SceI restrikciós
enzim képződését kódolja. Az FLP és az I-SceI fehérjék nyomán szabaddá válik a donor DNS
(13. ábra), megkeresi a homológ szekvenciát, azzal párosodik, és amennyiben két
rekombináció játszódik le a homológ szekvenciák között, az ép allél arra a mutáns változatra
cserélődik ki, amely funkcióképtelen. Azért, mert a mini-w+ gén megszakítja.
Végeredményben tehát egy ép allél helyét egy funkció nélküli mutáns allél foglalja el. A
mutáns allél a mini-w+ markergén alapján izolálható, fenntartható, homozigóta állapotba
hozható, és meghatározható a génfunkció hiányával kapcsolatos defektus.
 Az „Ends in” megoldás során olyan DNS-t állítanak össze, amelyben az I-SceI hely a donor
DNS belsejében van (13. ábra). A donor DNS-t transzgénként a muslica kromoszómájába
transzformálják. Ott, az FLP és az I-SceI fehérjék hatására olyan DNS válik szabaddá, amely
az I-SceI helyen hasadt fel. A homológ szekvenciák párosodása és a köztük bekövetkező
rekombináció nyomán a donor DNS a kromoszómába ékelődik. Úgy, hogy a genomban
tandem elrendeződésben két gén van (13. ábra). A I-CreI restrikciós enzimmel (amit
transzgén kódol) folytatott további - itt nem részletezett - események nyomán a két gén egyike
eliminálódik. A megmaradó gént a bevitt, valamint az eredeti gén egy-egy szakasza alkotja.
Ha a bevitt rész mutációt tartalmaz (amit típusa és helye megtervezhető és az in vitro
mutagenezis módszerével elkészíthető), az „ends in” megoldás eredményeként a
kromoszómában az ép gén helyét egy mutáns allél foglalja el. Sokk allélt „legyártva”
meghatározható a kódoló gén és a génfunkció közötti kapcsolat.

Összefoglalás
Száz év modellkedés eredményeként nagyjából a fent bemutatott állapotban van muslica, és
használja ma rendszeresen mintegy 1600 kutatató csoport munkájában. 1992-ben a muslicás
laboratóriumok összefogásával jött létre a FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu) adatbázis,
ahol a muslica modellel kapcsolatos kérdésekre talál választ az olvasó. A fejezet összeállítója
örömmel írja, hogy Szegeden immáron 33. éve dolgoznak olyan muslica-műhelyek - az MTA
Szegedi Biológiai Központjában illetve a Szegedi Tudományegyetemen -, amelyek
munkájukkal hozzájárultak a muslica modell sikeréhez.

Irodalom
Duffy, J.B., GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis 34, 1, 2002.
Genetics 6, 179, 2005.
Kiger, A.A. et al., Functional genomic analysis of cell morphology using RNA interference. J. Biol. 2,
27, 2003.
Letsou, A. and Bohman, D., Small flies - big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and
development. Develop. Dynamics 232, 526, 2005.
Matthews, K.A et al., Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature Reviews
Preall, J.B. and Sontheimer, E.J., RNAi: RISC gets loaded. Cell 123, 543-553, 2005.
Rong, Y.S. and Golic, K.G., A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics 157, 1307, 2001.
Sanf, T.K. and Jackson, G.R., Drosophila models of neurodegenerative disease. J. Amer. Soc. Exp.
Neuro Therapeutics 2, 438, 2005.
Shulman, J.M. et al., From fruit fly to bedside: translating lessons from Drosophila models of
neurodegenerative disease. Curr Oppin Neurobiol 16, 443, 2003.
 Nőstény
Hím

Pete, embrió

Báb
Lárva, 1. stádium

Előbáb
Lárva, 2. stádium

Lárva, 3. stádium

1. ábra. A muslica életciklusa. A muslica 2-3, a pete 0,5 mm hosszú. A petében zajlik az
embriógenezis. A lárvaállapotnak három, vedlésekkel határolt szakasza van. 25oC-on az
embriógenezis, az első és a második lárvastádium egy-egy, a harmadik lárvastádium két, a
bábállapot négy napig tart. A kifejlett muslica egy nap alatt válik ivaréretté, hogy aztán
nagyjából egy hónapot éljen, mialatt - ideális körülmények között - egyetlen pártól akár 1000-
1500 utód is származhat.

A 2 2
2. ábra. A muslica kromoszómák sematikus 3
ábrázolása. (A) Kromoszómák a metafázisban, egy 3
nőstény (XX) és egy hím (XY) valamely diploid
sejtjében. (B) A kromoszómák sematikus ábrázolása.
(C) Az óriáskromoszóma szerveződése. Az ábra B és 4 4
X Y
C részein a centromer szürkében, a heterokromatin X X
zöldben, a különböző kromoszómák eukromatikus
részei különféle színekben tűnnek fel. Az ún. B
kromocentert az összetapadó centromerek, valamint a
csak csekély mértékben replikálódott heterokromatin
alkotja. A második és a harmadik kromoszómák bal
és jobb karját rendre L és R betűk jelölik.

C
 1933. Thomas 1946. Hermann 1995. Edward 1995. Christiane 1995. Eric F.
H. Morgan J. Muller B. Lewis Nüsslein-Volhard Wieschaus

3. ábra. A muslicával végzett kutatásaikkal Nobel-díjat kiérdemelt kutatók. Thomas H.

Morgan (1866 - 1945) az öröklődés kromoszóma elméletének megalkotója. Hermann J.
Muller (1890 - 1967) elsőként mutatta ki, hogy a röntgensugárzás mutációkat indukál.
Edward B. Lewis (1918 - 2004), Christiane Nüsslein-Volhard (1942 - ) és Eric F. Wieschaus
(1947 - ) az embriógenezis genetikai szabályozását, az ember születési rendellenességek
genetikai eredetét megvilágító munkájukkal érdemelte ki a Díjat. (Az 1995. évi Nobel-
díjasokról készült felvételeket a szerző készítette 1976-ban.)

A B

4. ábra. A muslica nyálmirigy óriáskromoszóma (A). Benne az anyai és az apai eredetű

homológ kromoszómákat 514-514 egymáshoz tapadt kromatida képviseli. Az
óriáskromoszómán jól azonosítható az X, a második és a harmadik kromoszómák bal és jobb
karjai, az apró negyedik kromoszóma, valamint a kromocenter (cc). Az X kromoszóma csúcsa
közelében a vastag fekete nyíl egy olyan puffra mutat, amelyben az ekdizon vedlési hormon
hatására egy egyik gén intenzív transzkripciója folyik. (B) Egy deficiencia, amely eltávolította
a genom egy részét a homológ kromoszómák egyikéből, a nyálmirigy óriáskromoszómán
kidudorodásként látszik. A homológ kromoszómák másikában meglevő kromatin - mert
hiányzik a párja - kitüremkedik. (C) Az inverziót reprezentáló szakaszok párosodnak,
miközben olyan kicsavarodott szerkezetet képeznek, amely alapján meghatározható az
inverzió két töréspontja.
 Exon

0 1 2 3

IR

IR
Intron

5. ábra. A P elem szerveződése. A P-elemet 2907 bázispár alkotja. Végein egyenként 31

bázispárból álló fordítottan ismétlődő szekvenciával (angolul inverted repeat, IR). A négy
exon (0-3) a transzpozáz enzimet kódolja. A P-elemről képződő pre-mRNS érése során
különféle mRNS-ek, azok alapján pedig különféle funkcióú transzpozáz enzimek képződnek
Köztük olyan is, amely gátolja a P-elem ugrását.

sejtmag sarki plazma

ősivarsejt

6. ábra. A muslica ősivarsejtjei a pete citoplazma hátulsó végében alakulnak ki. Úgy, hogy a
sarki plazmába érkező sejtmagvak körül kialakuló sejtek magukba zárják a sarki plazmában
levő RNS és fehérje molekulák rögöcskéit. A sarki plazmába injektált DNS molekulák
bekerülnek az ősivarsejtekbe. Meg-megesik, hogy DNS molekulák egyike-másika - a
transpozáz enzim hatására - beékelődik valamely ősivarsejt valamely kromoszómájába, és a
majdan a kromoszóma részeként transzgénként öröklődik. A vastag fekete nyíl egy olyan
ősivarsejtre mutat, amely egyik kromoszómájának része egy transzgén.
 A B C

D E F

5 μm

7. ábra. Konfokális mikroszkóppal készített optikai metszetek időbeli sorozata egy olyan élő
muslica embrióról, amelyben a mikrotubulusokat és a centroszómákat zölden fluoreszkáló α-
tubulin-GFP „világítja ki”. (Gáspár Imre felvételei.)

Kromoszóma
Muslica szövetspecifikus

Kromoszóma
szabályozó szekvencia

„Driver” „Meghajtott” gén

mini-w +
mini-w+
IR
IR

UAS
IR
IR

strukturális
Az élesztő
Gal4 gén

Szövetspecifikusan
része

expresszált fehérje

GAL4
fehérje

8. ábra. A GAL4/UAS rendszer elvi alapjai. A „driver” transzgénben levő muslica eredetű
szabályozó szekvencia biztosítja az élesztő eredetű GAL4 fehérje szövetspecifikus
expresszióját. A GAL4 fehérje az élesztő eredetű UAS szekvenciákhoz kapcsolódik,
biztosítva a „meghajtott” transzgénben levő gén szövetspecifikus expresszióját. Az IR
szekvenciák ahhoz szükségesek, hogy a transzgén a kromoszómák valamelyikébe
integrálódjon.
 A B

9. ábra. A muslica szem az emberi neurodegenerativ betegségek modellje. (A) Annak a

muslicának ép a szeme, amelyben az eyless-Gal4 „driver” transzgén hatására az ép huntingtin
gén (egy UAS-huntingtin transzgén részeként) a muslica szemében expresszálódik. (B)
Azoknak a muslicáknak csökkent méretű és durva a szemük, amelyekben a huntingtin gén
domináns negatív mutáns allélja expresszálódik. A csökkent méretű és durva szemek a
szemkezdemény sejtek egy részének pusztulása nyomán képződnek.
 Szervkezdemény
A.
a m +

+ + b
a m +

+ + b
a m +

Anyasejt
+ + b

Leánysejtek
yasejt
B.
 a m +

a m +
a m +

+ + b
+ + b

Anyasejt
Mitotikus + + b
rekombináció

Leánysejtek
yasejt
C.
 a m +

a m +
a m +

+ + F
+ + F

Anyasejt
Mitotikus + + F
rekombináció
Leánysejtek
yasejt

10. ábra. Módszer sejtek genetikai jelölésére, génfunkció megállapítására sejtekben. (A) Egy
mitózis sematikus ábrázolása. A mitózis eredményeként az anyasejttel azonos értékű
leánysejtek képződnek. (B) Mitotikus rekombináció nyomán (amit többnyire
röntgensugárzással indukálnak) olyan genetikailag megjelölt sejtek képződnek, amelyek sorsa
a markermutációk fenotípusa alapján nyomon követhető. (C) Az F domináns nőstény-steril
mutációt hordozó sejtekből nem származnak peték. A mitotikus rekombináció nyomán
képződő m/m sejt megszabadult terhétől (az F mutációtól), belőle pete és utód származhat,
kivéve, ha az m+ gén hiánya befolyásolja a sejt, illetve a belőle fejlődő pete, illetve embrió
életét. Az m/m sejtek, peték, embriók sorsa alapján meghatározható az ép m+ gén funkciója az
ivarsejtvonal, illetve az embriók életében. A + jel az ép allélokat szimbolizálja. Részletes
magyarázat a szövegben.
 FRT
a m +

a m +

FRT
FRT
a m +

+ + b

FRT

FRT
+ + b

Anyasejt FLP-indukált + + b

FRT
hely-specifikus
rekombináció
Leánysejtek
yasejt

11. ábra. Az FLP/FRT technika alkalmazása mozaik analízisre. Az ábrán nincs feltüntetve az
a transzgén, amely terméke, az FLP fehérje, azon a helyen okoz hely-specifikus
rekombinációt, ahol az FRT szekvencia (egy transzgén részeként) a kromoszómába
illeszkedett. Az esemény nyomán genetikailag megjelölt sejtek képződnek, amelyek
utódsejtjei mozaik foltokat alkoznak.

Kromoszóma

Kromoszóma

CATACTACT AGTAGTATG
mini-w+ GTATGATGA TGATCATAC mRNS
IR
IR

UAS

CAUACUACU AGUAGUAUG

CAUACUACU
hpRNS GTATGATGA

siRNS
S

12. ábra. Az RNSi technika elvi alapjai vázlatosan. A GAL4 fehérjével és az UAS
szekvenciával „meghajtott” gén 300-400 bp hosszú, és annak génnek megfelelő szekvencia
alapján készült, amely gén funkcióját meg óhajtjuk szüntetni. Úgy, hogy a génről átíródó
mRNS-t megsemmisítjük. A „meghajtott” génben ugyanaz a szekvencia kétszer van meg,
fordított irányban. A „meghajtott” génről képződő RNS szakaszai - lévén komplementerek -
párosodnak, miáltal egy hajtűszerű hpRNS képződik. A hpRNS itt nem részletezett
események nyomán rövid, kettősszálú darabokra, siRNS-ekre hasítódik. A következő
lépésben az siRNS-ek egyik szála annak az mRNS-nek a komplementer szekvenciájához
kapcsolódik, amelyet meg akarunk semmisíteni. Az RNS a kettős szálú részen elhasad, majd a
sérült mRNS apró darabokra esik.
 „Ends out” „Ends in”

I-CreI
I-SceI

I-SceI

I-SceI
Donor DNS mini-w+ Donor DNS Donor DNS mini-w+
+ +
FRT

FRT

FRT

FRT
FLP és I-SceI FLP és I-SceI

Rekombináció Beékelődés
Ép allél Ép allél

Mutáns allél
Donor DNS

13. ábra. Homológ rekombináción alapuló két megoldás mutáns allélok készítésére. Az
„Ends out” módszer során az ép gént egy olyanra cserélik, amely - mert a mini-w+ marker
gén megszakítja - funkcióképtelen, ún. knock out allél. Az „Ends in” megoldás
eredményeként tandem duplikáció képződik. Az I-CreI hely lehetővé teszi az egyik kópia
elminálását, azt, hogy csak egy olyan mutáns allél maradjon az ép gén helyén, amelyet
„kémcsőben” készítettünk. Részletesebb magyarázat a szövegben.