基因治疗药物的质量控制分析方法

李永红 饶春明
中国食品药品检定研究院重组药物室
卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050

基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿
基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的，也就是通过基因转移技术将外
源基因插入患者适当的受体细胞中，使外源基因表达的产物能治疗某种疾病。从
广义说，基因治疗还可包括在核酸水平治疗某些疾病的措施和新技术，如RNA干
扰技术。基因治疗药物亦成为目前生物技术药物研发的重点和热点领域之一。在
研发过程中，研究建立产品的质量控制分析方法和质量标准，保障产品的安全性
和有效性，是创新基因治疗药物能否进入临床研究以及顺利上市的重要环节之
一。目前我国先后已有十多个基因治疗药物进入临床研究，本文根据现有的质量
标准和国内外文献，对基因治疗药物的质量控制分析方法进行简要总结如下。
一、鉴别试验（Identity）
基因治疗药物的鉴别试验常需要从核酸水平和蛋白水平进行。核酸水平常
采用的方法有限制性酶切图谱分析、PCR、RT-PCR 和核酸序列测定等对载体和目
的基因进行鉴定。限制性酶切图谱分析中需要选用适当的内切酶，必要时可使用
多个内切酶，使切得的 DNA 片段能比较充分地反映载体的情况，并能在电泳时得
到良好的分离；酶切前的 DNA 抽提步骤应有详细的描述并有较好的可操作性；分
析中应设置对照品，要求供试品的酶切图谱和对照品相一致。在 PCR 和 RT-PCR
中，应对载体部分、插入基因、缺失片段以及影响表达的重要部分进行鉴定，同
时应设置合适的阳性和阴性对照样品。蛋白水平常采用的方法有 SDS-PAGE 和免
疫印迹，也应设置合理的对照品进行比较。
二、 滴度（Titer ）
在以病毒为载体的基因治疗药物中，滴度是表示病毒数量的指标。由于在产
品中通常存在大量的空壳病毒、死病毒或无效病毒，病毒滴度分为病毒颗粒数、
感染性滴度、基因组滴度等不同的种类。病毒颗粒数常采用紫外吸收法、ELISA
或血凝素试验等方法。感染性滴度测定的传统方法有噬斑法（PFU）和 CPE 法
（TCID50），也有方法采用重组病毒感染细胞后对包装产生的病毒蛋白进行免疫检
测来计算病毒的感染性滴度。基因组滴度的检测可采用 DNA 斑点杂交、定量 PCR
的方法，测定病毒基因组存在的数量。在质量标准中应对感染性滴度与病毒颗粒
数的比例进行控制，如以腺病毒为载体的基因治疗药物中要求该比例应不低于
3.3%。
三、效力（Potency）
表征基因治疗药物效力的常见指标为目的基因的表达量、表达产物的生物学
活性等。目的基因表达量的检测常采用重组病毒（或质粒）体外感染（或转染）
宿主细胞，如目的蛋白为分泌性表达，可采用 EILSA 法检测细胞培养上清中目标
蛋白的含量；如目的蛋白不能分泌表达，可采用免疫印迹的方法。表达产物的生
物学活性常常是基因治疗药物产生治疗作用的重要因素，由于不同产品的生物学
功能有很大的区别，需要根据其特定的生物学特性开发活性检测方法，多以体外
细胞试验法检测为常见，并应尽量开发出定量检测的方法。在增殖性溶瘤病毒为
载体的基因治疗药物中，应检测重组病毒对肿瘤细胞的杀伤作用以及在肿瘤细胞
和正常组织细胞中的相对增殖能力。
四、纯度（Purity）和杂质（Impurity）
纯度的检测通常需要两种或两种以上不同原理的方法进行，常见的基因治疗
药物的纯度检测方法包括紫外吸收法、HPLC 法和 SDS-PAGE 法等。杂质包括生产
相关的杂质和产品相关的杂质。生产相关的杂质主要包括宿主细胞蛋白和宿主细
胞 DNA。宿主细胞蛋白如 293 细胞蛋白的残留量可用相应的 ELISA 试剂盒进行检
测。宿主细胞 DNA 检测的方法可采用 DNA 杂交法、 Pico-Green 染色法或
Real-time PCR 的方法进行检测。另外，在生产过程中常用到的牛血清、Benzonase
和抗生素等物质也需要控制其残留量。牛血清残留量检测可采用 ELISA 试剂盒检
测牛血清白蛋白残留量，Benzonanse 也有相应的试剂盒进行检测，残留抗生素
可用抑菌圈的方法进行检测是否有残留抗生素的活性。病毒制品中产品相关的杂
质包括病毒聚合体和缺陷性病毒颗粒（如空壳病毒）等，目前尚缺乏良好的检测
方法。
五、 安全性（Safety）
 基因治疗药物的安全性检测指标除包括无菌试验、支原体检测、细菌内毒素
/热原试验、异常毒性试验等常规项目外，还包括残留复制型病毒、残留辅助病
毒和其它外源性病毒的检测。其具体的检测指标和方法需要根据具体品种的情况
进行确定。
六、 制剂相关检测指标（Fomulation related tests）
根据制剂的检测要求，常需检测外观、pH、装量、可见异物、渗透压以及相
关辅料的含量测定等指标。