PTVSTP - Nhóm 7

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN
ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS
Sinh viên thực hiện: NHÓM 7
2005218057 Nguyễn Quỳnh Như Thảo
2005218063 Trần Lê Thị Thanh Thảo
2005190573 Nguyễn Trọng Tài
2005210306 Phạm Hoàng Phương Thảo
Giảng viên hướng dẫn: Th.S Hoàng Xuân Thế

TP. Hồ Chí Minh, ngày 11 tháng 10 năm 2023
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài bài tập lớn lần này, trước hết nhóm chúng em xin chân
thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm từ cô, anh chị và bạn bè. Đặc biệt,
nhóm xin gửi đến thầy Hoàng Xuân Thế người đã ra sức truyền đạt, chỉ dẫn chúng em
đề tài báo cáo lần này lời cảm ơn sâu sắc nhất.
Không thể không nhắc đến sự hợp tác, đoàn kết của các thành viên trong nhóm.
Xin cảm ơn mọi người đã cùng góp sức, hợp lực để hoàn thành bài báo cáo này.
Trong quá trình trao đổi hoàn thành bài tập lớn này, vì còn tồn tại những hạn
chế về mặt kiến thức, chúng em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được
sự đóng góp ý kiến từ quý thầy. Những góp ý từ thầy sẽ là động lực để chúng em hoàn
thiện hơn. Một lần nữa, nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy vì đã
giúp chúng em đạt được kết quả này.
BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ
Hoàn
MSSV Họ và tên Nhiệm vụ
thành
- Tìm nội dung phần 1, 2, 5,
6
2005218057 Nguyễn Quỳnh Như Thảo - Làm PowerPoint 100%
- Thuyết trình phần 5, 6

8
2005190573 Nguyễn Trọng Tài 100%

8
3005218063 Trần Lê Thị Thanh Thảo 100%

6
2005210306 Phạm Hoàng Phương Thảo - Làm Word 100%

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................................i
BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ................................................................................ii
MỤC LỤC.....................................................................................................................iii
MỤC LỤC HÌNH ẢNH.................................................................................................iv
MỤC LỤC BẢNG BIỂU................................................................................................v
LỜI MỞ ĐẦU.................................................................................................................1
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT..........................................................................................2
NỘI DUNG.....................................................................................................................3
1. TỔNG QUAN:.....................................................................................................3
1.1. Phân loại.......................................................................................................3
1.2. Đặc điểm hính thái của Bacillus cereus........................................................4
1.3. Tác động đối với sức khoẻ............................................................................5
2. TÌNH HÌNH NHIỄM ĐỘC TRONG THỰC PHẨM TRONG NƯỚC, PHẠM
VI ÁP DỤNG TIÊU CHUẨN PHÂN TÍCH...............................................................6
2.1. Tình hình nhiễm độc trong thực phẩm trong nước.......................................6
2.2. Phạm vi áp dụng tiêu chuẩn phân tích..........................................................8
3. NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH..............................................................................8
4. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH..................................................................................9
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ.....................................10
5.1. Môi trường và hóa chất...............................................................................10
5.2. Dụng cụ.......................................................................................................11
5.3. Thiết bị........................................................................................................13
6. TÍNH KẾT QUẢ................................................................................................15
7. VÍ DỤ MINH HỌA...........................................................................................16
8. KẾT LUẬN........................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................22
MỤC LỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Vi khuẩn Bacillus cereus...................................................................................3
Hình 2: Tế bào vi khuẩn Bacillus cereus quan sát qua kính hiển vi...............................4
Hình 3: Hình thái khuẩn lạc B. cereus............................................................................5
Hình 4: Quy trình phân tích............................................................................................9
Hình 5: Đồng nhất mẫu................................................................................................17
Hình 6: Pha loãng mẫu.................................................................................................17
Hình 7: Nuôi cấy phân lập............................................................................................18
Hình 8: B. cereus trên thạch MYP................................................................................19
Hình 9: Tan máu β của B. cereus..................................................................................19

MỤC LỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Đặc điểm của 2 loại độc tố chính tiết ra từ vi khuẩn Bacillus cereus...............6
Bảng 2: Một số trường hợp ngộ độc thực phẩm do B. cereus được báo cáo tại Việt
Nam.................................................................................................................................7
LỜI MỞ ĐẦU
Vi khuẩn là một trong những loại vi sinh vật nhỏ bé nhưng có vai trò to lớn
trong cuộc sống của chúng ta. Trong rừng rú, trong đất đỏ, và thậm chí trong những
thực phẩm chúng ta ưa thích, các vi khuẩn tồn tại và thực hiện những chức năng quan
trọng, đóng góp không nhỏ vào sự đa dạng và cân bằng của hệ sinh thái. Trong số
những vi khuẩn này, vi khuẩn Bacillus cereus đã thu hút sự quan tâm đặc biệt của nhà
khoa học và những người làm việc trong lĩnh vực y học và thực phẩm.
Trong bài tiểu luận này, chúng ta sẽ tìm hiểu về phương pháp và quá trình
“định lượng vi khuẩn Bacillus cereus”. Bacillus cereus, một trong những thành viên
của họ Bacillaceae, đã được xác định là nguyên nhân gây ra nhiều trường hợp ngộ độc
thực phẩm và nhiễm trùng trong người. Khả năng sinh sản nhanh chóng và kháng
kháng sinh của loài vi khuẩn này đã làm cho việc quản lý và kiểm soát sự xuất hiện
của nó trở nên cực kỳ quan trọng.
Sự hiện diện và tăng trưởng của Bacillus cereus trong các sản phẩm thực phẩm
và môi trường sống đã tạo ra mối quan tâm lớn đối với việc đảm bảo an toàn thực
phẩm và sức khỏe con người. Do đó, việc định lượng vi khuẩn này là một phần quan
trọng của công việc đánh giá và kiểm tra chất lượng thực phẩm, đặc biệt là trong
ngành công nghiệp thực phẩm và dịch vụ ăn uống.
Qua bài tiểu luận này, mong muốn rằng chúng ta sẽ có cái nhìn sâu rộng hơn về
việc định lượng vi khuẩn Bacillus cereus và vai trò quan trọng của nó trong việc bảo
vệ sức khỏe và an toàn thực phẩm cho mọi người.
7
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Bacillus cereus: B. cereus
Staphylococcus aureus: S. aureus
Clostridium perfringens: C. perfringens
Colony-Forming Units: CFU
European Food Safety Authority: EFSA
Saline Peptone Water: SPW
Mannitol – Egg Yolk – Polymixin: MYP agar base
8
NỘI DUNG
1. TỔNG QUAN:
Bacillus cereus không chỉ là tác nhân gây hư hỏng thực phẩm mà còn được biết
đến rộng rãi với khả năng gây ngộ độc thực phẩm Theo các báo cáo hàng năm của Cơ
quan An toàn thực phẩm Châu Âu (ESPA), B. cereus được xem xét là một trong
những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu, chỉ sau Clostridium botulinum,
Salmonella và virus. Trong khoảng thời gian từ năm 2011 đến năm 2015, đã có gần
300 trường hợp ngộ độc thực phẩm do B. cereus được báo cáo tại các quốc gia Châu
Âu.
Tại Việt Nam, ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đáng lo ngại, với tổng cộng
1.604 trường hợp ngộ độc được ghi nhận từ năm 2010 đến năm 2020. Nguyên nhân
chính gây ra ngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (chiếm 38,7%) [1], và B.
cereus được xem là một trong các nguyên nhân chính. Việc nghiên cứu đặc điểm và
cấu trúc của loại vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ tìm ra các
phương pháp ngăn ngừa và hạn chế những trường hợp mắc bệnh do B. cereus.
Hình 1: Vi khuẩn Bacillus cereus
1.1. Phân loại
Phân loại quốc tế B. cereus:
 Thuộc giới: Bacteria

 Ngành (phylum): Firmicutes
 Lớp (class): Bacilli
9
 Bộ (order): Bacillales
 Họ (family): Bacillaceae
 Chi (genus): Bacillus
 Loài (species): B. cereus
Thuật ngữ “Bacillus” có nghĩa là “hình que”, trong khi từ “cereus” trong tiếng
Latin chỉ sự “giống sáp”. Theo đó, kiểu hình của B. cereus có thể dễ dàng nhận biết
qua quan sát khuẩn lạc trên đĩa thạch agar hoặc các môi trường chọn lọc khác. Ngoài
ra, việc phân loại còn dựa vào đặc điểm sinh hóa.
1.2. Đặc điểm hính thái của Bacillus cereus

 Hình thái tế bào vi khuẩn
B. cereus là trực khuẩn gram dương, có hình dạng que, di động, sinh bào tử, kỵ
khí tùy ý. Kích thước tế bào rộng 1,0 – 1,2 μm, dài 3,0 – 5,0 μm, tế bào xuất hiện đơn
lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 2A). Nhiều chủng
thuộc B. cereus có khả năng di động nhờ các tiên mao, di chuyển chậm. B. cereus có
khả năng hình thành nội bào tử hình elip hoặc hình trụ mà không làm phồng tế bào;
bào tử xuất hiện có màu xanh lục trong tế bào sinh dưỡng màu đỏ qua phương pháp
nhuộm bào tế bào Schaeffer-Fulton (Hình 2B). Bào tử của B. cereus có khả năng
chống chịu tốt ở các điều kiện môi trường cực đoan như nhiệt độ, tia cực tím, pH hoặc
môi trường nghèo dinh dưỡng, cũng như có khả năng đề kháng các hóa chất khử
nhiễm, dung dịch ion, ozon. Chính vì khả năng này nên B. cereus được tìm thấy ở hầu
hết mọi nơi, nhiều loại môi trường sống, do đó việc ô nhiễm thực phẩm bởi vi khuẩn
này là khó có thể tránh khỏi.
10
Hình 2: Tế bào vi khuẩn Bacillus cereus quan sát qua kính hiển vi
(A) Tế bào quan sát dưới kính hiển vi
(B) Tế bào được nhuộm bào tử bằng phương pháp Schaeffer-Fulton
 Hình thái khuẩn lạc
B. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng từ 10 - 48°C, tối ưu nhất là
28 - 35°C. Độ pH từ 4,9 – 9,3, tối ưu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 7 - 7,2 và
hoạt độ nước từ 0,92 đến 1,0.
Trên môi trường MYP agar base (Mannitol – Egg Yolk – Polymixin), B. cereus
có khuẩn lạc nhỏ (2 – 3 mm), rìa răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục do
thủy phân lecithin lòng đỏ trứng (Hình 3A); B. cereus hình thành khuẩn lạc lớn (3 – 8
mm), màu xám, bề mặt phẳng, thường có rìa gồ ghề, vòng tan huyết β xung quang
khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cừu (Hình 3B)
11
Hình 3: Hình thái khuẩn lạc B. cereus
(A) B. cereus trên môi trường MYP
(B) B. cereus trên môi trường thạch máu cừu
1.3. Tác động đối với sức khoẻ
Vi khuẩn Bacillus cereus có thể tiết ra hai loại độc tố chính, bao gồm độc tố gây
tiêu chảy (diarrheal toxin) và độc tố gây nôn mửa (emetic toxin). Sự ngộ độc thực
phẩm do B. cereus gây ra thường xảy ra khi thức ăn được chuẩn bị mà không được bảo
quản đúng cách trong vài giờ trước khi tiêu thụ.
Bảng 1: Đặc điểm của 2 loại độc tố chính tiết ra từ vi khuẩn Bacillus cereus
Đối với độc tố gây tiêu chảy Đối với độc tố gây nôn mửa
diarrheal toxin (Type 1) emetic toxin (Type 2)
Bền với nhiệt 45°C/30 phút 120°C/90 phút
Ổn định Ở pH=4, pH=11 Ở pH=2, pH=11.

Nhạy với enzyme protease và
Tính nhạy Kháng pepsin và trypsin
trypsin
12
Thời gian ủ bệnh 8-16h (đôi khi > 24h). 0,5-5h
Thời gian mắc

12-24h (hoặc vài ngày). 6-24h
bệnh
Buồn nôn, nôn mửa và khó
Đau bụng, tiêu chảy và thỉnh
Triệu chứng chịu (đôi khi theo sau là tiêu
thoảng buồn nôn
chảy).
Trên thịt, rau quả, gia vị. Bản Trong gạo, cơm nguội, đậu
chất là một loại protein gây các loại. Bản chất độc tố là
Vi khuẩn sản sinh hủy hoại biểu bì và niêm mạc phospholipit có tính ổn định
độc tố
ruột gây tiêu chảy có thể nguy cao không bị phân hủy ở nhiệt
hiểm đến tính mạng. độ cao và dịch dạ dày.
2. TÌNH HÌNH NHIỄM ĐỘC TRONG THỰC PHẨM TRONG NƯỚC, PHẠM
VI ÁP DỤNG TIÊU CHUẨN PHÂN TÍCH
2.1. Tình hình nhiễm độc trong thực phẩm trong nước
Khuẩn Bacillus cereus từng gây nhiều vụ ngộ độc lớn trên thế giới cũng như tại
Việt Nam.
Phần lớn các ca ngộ độc thực phẩm do B. cereus không được báo cáo. Nguyên
nhân là do triệu chứng bệnh ngắn và nhẹ nên các bệnh nhân thường không đi khám.
Hơn nữa, các trường hợp ngộ độc do B. cereus thường bị nhầm lẫn vì triệu chứng của
bệnh nôn mửa khó phân biệt với các triệu chứng nhiễm độc do S. aureus và bệnh tiêu
chảy có các triệu chứng giống với C. perfringens loại A. Ngoài ra, sự khác biệt lớn về
hệ thống giám sát và báo cáo giữa các quốc gia nên rất khó để so sánh dữ liệu và ước
tính tỷ lệ mắc bệnh thực sự.
Các ví dụ về các trường hợp và các đợt bùng phát ngộ độc liên quan đến B.
cereus được trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2: Một số trường hợp ngộ độc thực phẩm do B. cereus được báo cáo tại Việt
Nam.
Loại thực Tài liệu

Năm Địa điểm Hệ quả
phẩm tham
13
khảo
29 bé lớp chồi được đưa vào
Bệnh viện cấp cứu trong tình
2012 Cần Thơ Phở, sữa chua [2]
trạng nôn ói, sốt nhẹ và kiệt
sức.
230 người nhập viện với các
triệu chứng sốt, đau đầu, buồn
2020 Đà Nẵng Đồ ăn chay [3]
nôn, nôn mửa, đau bụng, đi
ngoài
82 công nhân xuất hiện các
triệu chứng chóng mặt, nôn
2021 Phú Yên Nấm xào [4]
ói… Trong đó có 10 người phụ
nữ đang mang thai
Cánh gà chiên 665 học sinh nhập viện, 1 học

2022 Nha Trang [5]
& nước mắm sinh tử vong
Có ít nhất 150 trường hợp bị
ngộ độc thực phẩm, trong đó
Quảng có hàng chục du khách nước

2023 Bánh mì [6]
Nam ngoài, có biểu hiện sốt cao, nôn
mửa, đau bụng, đi ngoài phân
lỏng nhiều lần và kéo dài.
35 người bị ngộ độc có triệu
2023 An Giang Chè đậu trắng chứng đau bụng, tiêu chảy [7]
nhiều lần, nôn, sốt...
2.2. Phạm vi áp dụng tiêu chuẩn phân tích
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)
dùng để định lượng B. cereus giả định có khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ
thuật đếm khuẩn lạc ở 30°C. Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng
cho người và thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử
lý thực phẩm.
14
3. NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH
Cấy một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm ban ở dạng lỏng, hoặc một
lượng huyền phù ban đầuquy định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt cấy đặc
chọn lọc đựng trong các đĩa petri.
Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha lỏng
thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC trong khoảng 18-48 giờ.
Tính số lượng B. cereus trong 1ml hoặc trong 1g mẫu từ số lượng khuẩn lạc
khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý
nghĩa và được khẳng định theo phép thử quy định.
4. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
15
Hình 4: Quy trình phân tích
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu:
- Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với
mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa
vô trùng (bình tam giác)
- Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào túi
nhựa (bình tam giác) nhớ mẫu
- Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc
lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng 2÷3 phút
- Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ
của dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ nhiệt độ
phòng
16
- Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang
(không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung
dịch pha loãng thích hợp
- Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh
các phần tử có vi sinh vật lắng xuống
Bước 2: Pha loãng mẫu:
- Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp
- Trộn kĩ bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10²
(đối với các laoij mấu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là
10-1). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4,
10-5, … cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp
Bước 3: Cấy và ủ mẫu:
- Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng
khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng thập
phân thiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2
đĩa petri. Dùng que cấy trải trải đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng
một que trải vô trùng cho mỗi đĩa. Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng
đế chất cấy bám vào thạch. Lật úp đĩa và ủ ở 30°C trong 24 giờ.
Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định:
- Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc B. cereus
giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi một vòng kết tủa.
Đếm các khuẩn lạc B. cereus giả định trên những đĩa có sôd đếm phù hợp.
- Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nêu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các
khuẩn lạc giả định. Cấy ria, cấy đâm sâu hạocư chấm các khuẩn lạc đã chọn lên
mặt thạch máu cừu, ủ ở 30°C trong 24 gờ. Đọc kết quả.
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ
5.1. Môi trường và hóa chất
17
Môi trường và hoá chất Mục đích
Tạo điều kiện thích hợp
SPW (Saline Peptone Water) cho vi khuẩn B. cereus
tăng trưởng
MYP agar base (Mannitol – Egg Yolk – Polymixin)
Polymixin B Nuôi cấy B. cereus
Egg Yolk
Blood agar base

Khẳng định B. cereus giả
định
Sheep blood
HCl và NaOH 10% Chỉnh pH
5.2. Dụng cụ
Dụng cụ Mục đích Hình ảnh dụng cụ

Để nuôi cấy vi sinh vật
trong môi trường lỏng, chuẩn
bị môi trường phát triển vô
Bình tam trùng, thúc đẩy sục khí và tạo
giác điều kiện cho vi sinh vật phát
(Erlenmeyer triển và phân tích.
flask) Hình dạng hình nón và độ
bền của chúng khiến chúng
trở thành công cụ có giá trị
trong vi sinh học.
18
Được sử dụng để thu thập,
vận chuyển và bảo quản các
mẫu sinh học trong môi
trường vô trùng. Chúng giúp
duy trì tính toàn vẹn của mẫu,
Túi nhựa vô
ngăn ngừa ô nhiễm và đảm
trùng
bảo điều kiện vô trùng trong
(Sterile
quá trình lấy và vận chuyển
Sample
mẫu. Những chiếc túi này rất
Rollbag)
quan trọng để phân tích vi
sinh chính xác và tuân thủ các
tiêu chuẩn quy định trong các
ngành công nghiệp khác
nhau.
Dùng để đo và chuyển
chính xác thể tích chất lỏng.
Chúng cho phép cấy mẫu
có kiểm soát, xử lý mẫu, phân
phối thuốc thử, pha loãng nối
Pipet
tiếp, xét nghiệm vi sinh và kỹ
thuật sinh học phân tử, đảm
bảo kết quả đáng tin cậy và
chính xác trong các thí
nghiệm và xét nghiệm vi sinh.
Để nuôi cấy, phân lập,

quan sát và thử nghiệm các vi
Đĩa petri sinh vật. Đĩa petri cung cấp
(Petri dish) một môi trường được kiểm
soát và là công cụ thiết yếu
trong phân tích vi sinh vật.
19
Sử dụng để thu thập và
chuyển vi sinh vật từ mẫu
sang đĩa thạch để nuôi cấy và
Que cấy trải
phân tích. Đóng vai trò quan
(Inoculation
trọng trong việc phân lập, thử
loop)
nghiệm và vận chuyển vi sinh
vật trong các nghiên cứu vi
sinh.
Là một công cụ được sử
dụng để phân bố đều vi sinh
vật trên đĩa thạch hoặc gel, hỗ
trợ phân lập khuẩn lạc, định
lượng và các xét nghiệm vi
sinh khác nhau.
Que trang
Nó đảm bảo sự phát triển
(Glass
đồng đều và rất quan trọng
spreader)
đối với các kỹ thuật như xét
nghiệm độ nhạy cảm với
kháng sinh, đếm khuẩn lạc và
xét nghiệm độ nhạy cảm. Đây
là một công cụ thiết yếu trong
phòng thí nghiệm vi sinh.
5.3. Thiết bị
Thiết bị Mục đích Hình ảnh thiết bị
20
Đảm bảo độ chính xác trong
Cân việc chuẩn bị mẫu rắn, kiểm soát
(Analytical chất lượng, nghiên cứu đáng tin
balance) cậy và tuân thủ các tiêu chuẩn
ngành.
Được sử dụng trong phân tích

vi sinh để trộn, phân tán vi sinh
vật, đồng nhất mẫu và tạo điều
Máy lắc kiện thuận lợi cho các quy trình
Vortex trong phòng thí nghiệm bằng cách
cung cấp chuyển động lắc mạnh và
nhất quán, đảm bảo tính đồng nhất
của mẫu và kết quả chính xác.
Có thể cô lập hiệu quả mẫu vi
khuẩn đồng nhất chứa bên trong
Máy dập
và trên bề mặt của mẫu rắn, đảm
Stomacher
bảo rằng tất cả các mẫu được trộn
(Stomacher
trong một túi vô trùng. Dung dịch
lab
mẫu đã qua xử lý có thể được lấy
blender)
mẫu và phân tích trực tiếp mà
không có sự thay đổi mẫu và nguy
cơ lây nhiễm chéo.
21
Được sử dụng để đếm chính
xác các khuẩn lạc vi sinh vật phát
triển trên môi trường thạch rắn
như đĩa petri. Việc đếm này rất
Máy đếm cần thiết để định lượng vi sinh vật
khuẩn lạc trong mẫu, đảm bảo kiểm soát chất
(Colony lượng, chẩn đoán nhiễm trùng và
counter) tuân thủ các tiêu chuẩn quy định.
Công cụ này hỗ trợ việc liệt kê
khuẩn lạc chính xác và hiệu quả,
giảm sai sót và cung cấp kết quả
đáng tin cậy.
Là thiết bị cần thiết để khử
trùng thiết bị, môi trường và dụng
cụ thuỷ tinh trong phòng thí
Nồi hấp nghiệm.
tiệt trùng Nó sử dụng hơi nước áp suất
(Autoclave cao để tiêu diệt vi sinh vật và ngăn
sterilizer) ngừa ô nhiễm, đảm bảo môi
trường vô trùng cho các thí
nghiệm và xử lý an toàn các vật
liệu nguy hiểm.
6. TÍNH KẾT QUẢ
Công thức này được sử dụng để tính nồng độ của vi khuẩn Bacillus cereus giả
định trong mẫu (X) dựa trên các bước độ pha loãng liên tiếp và kết quả đếm trên đĩa
Petri:
(C 1× R 1 )+(C 2 × R 2)+(C 3 × R 3)+(C 4 × R 4)

X= (CFU/g hay CFU/ml)
V ×(n 1+0 , 1× n 2)× d
X: Đây là nồng độ cuối cùng của vi khuẩn Bacillus cereus giả định trong mẫu,
được tính theo đơn vị Colony-Forming Units (CFU) trên mỗi gram hoặc mỗi milliliters
22
tuỳ thuộc vào loại mẫu.
C1,2,3,4: Đây là số khuẩn lạc B. cereus giả định đếm được trên 4 đĩa Petri sau
các bước độ pha loãng liên tiếp. Các con số này đại diện cho số lượng vi khuẩn sau
mỗi bước pha loãng.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa Petri, được tính bằng mililit (ml). Điều
này cho biết thể tích dịch cấy được sử dụng để pha loãng mẫu trên mỗi đĩa.
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại.
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại. Điều này biểu thị
mức độ pha loãng của mẫu sau bước pha loãng thứ nhất.
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trong 4 đĩa petri sau các bước
độ pha loãng. Các tỉ lệ này biểu thị phần trăm các đĩa cho thấy sự phát triển của vi
khuẩn B. cereus sau mỗi bước pha loãng.
 Biểu thị kết quả:
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 0.1 và 9.9 nhân với 10n (n là số
mũ thích hợp của 10).
Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của đậm độ
pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
Nếu 4 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu có ít
hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được ở cả 4 đĩa
tính ra cho 1g hoặc 1m sản phẩm.
Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau:
- Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1ml sản phẩm.

- Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1g sản phẩm.
7. VÍ DỤ MINH HỌA
 Đồng nhất và pha loãng mẫu
23
Tiến hành lấy mẫu đùi gà đông lạnh của cơ sở X, bị quá hạn 2 tháng, bị nhồi
nhét rách bao bì, chảy nước do nằm ở vị trí khuất hơi lạnh.
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (SPW) đồng
nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút.
Hình 5: Đồng nhất mẫu

Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9
ml nước pepon đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10 -2. Tiếp tục làm
tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3.
Hình 6: Pha loãng mẫu

 Nuôi cấy phân lập
24
Đánh dấu lên đĩa thạch tên mẫu, nồng độ dung dịch mẫu thử.
Dùng pipet 1 ml vô trùng, hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử 10 -1 (hoặc
0,1 ml từ mẫu thực phẩm lỏng) nhỏ lên bề mặt 2 đĩa thạch MYP, mỗi đĩa 0,1 ml. Làm
tương tự với các độ pha loãng tiếp theo.
Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tinh dàn đều dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch sao
cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều. Để các đĩa có đậy nắp ở nhiệt độ phòng khoảng
15 phút rồi lật ngược đưa vào tủ.
Ủ ở 30oC / 24h. Nếu không thấy các khuẩn lạc ủ thêm 24h nữa.
Lưu ý: Đĩa thạch nuôi cấy phải được hong khô trước khi dùng. Mỗi mẫu thực
phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ phải được cấy lên 2
đĩa thạch để tính trung bình cộng của mỗi đậm độ.
Hình 7: Nuôi cấy phân lập

 Đếm các khuẩn lạc điển hình B. cereus
Khuẩn lạc B. cereus điển hình trên môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 –
3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục.
Chọn các đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp, đếm các khuẩn lạc điển hình ở
các đĩa này.
25
 Tăng sinh thuần chủng
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình từ đĩa thạch MYP cấy sang môi trường thạch
nghiêng dinh dưỡng.
Ủ ấm 30oC/ 24h.
 Xác định
Nhuộm Gram: cấy ria các khuẩn lạc từ ống thạch dinh dưỡng
Nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi.
Sau khi thực hiện xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế bào bằng
vật kính 100x. B. cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với nhau tạo
thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử.
Thử nghiệm khả năng tan máu: cấy các khuẩn lên môi trường thạch máu. Ủ ở
30oC trong 24 giờ. B. cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn (β),
đường kính 2-4 mm xung quanh vùng phát triển.
 Đọc kết quả
Khuẩn lạc của B. cereus môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 – 3 mm, bờ
hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.
Hình 8: B. cereus trên thạch MYP
26
Hình 9: Tan máu β của B. cereus
 Tính kết quả:
B. cereus giả định trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức:
(C 1 xR 1)+(C 2 xR 2)+(C 3 xR 3)+(C 4 xR 4)

X= (CFU/g hay CFU/ml)
Vx( n+0 , 1 x n 2) x d
Ta có:
Đếm được khuẩn lạc từ độ pha loãng 10-1 (<150)
d = 10-1
Với nồng độ pha loãng 10-1:
C1 = 107 (khuẩn lạc)
n1 = 2 (đĩa)
R1 = R2 = 100%
Với nồng độ pha loãng 10-2:
n2 = 2 (đĩa)
R3 = R4 = 100%
Mỗi đĩa được cấy 0,1 ml dịch mẫu

27
V = 0,1 (ml)
Như vậy:
( 107 x 100 % )+ ( 83 x 100 % )+ ( 9 x 100 % ) +(11 x 100 %)

X= −1 −2 −1 = 2,1x105 (CFU/ml)
0 , 1 x (10 + 0 ,1 x 10 ) x 10
8. KẾT LUẬN
Bị nhiễm Bacillus cereus có thể gây khó chịu. Ngộ độc thực phẩm có thể cực
kỳ khó chịu và khiến bạn cảm thấy mệt mỏi. May mắn thay, ngộ độc thực phẩm do
Bacillus cereus gây ra thường chỉ kéo dài 24 giờ và hầu hết mọi người đều hồi phục
hoàn toàn. B. cereus cũng gây ra các bệnh ngoài đường tiêu hóa nhưng hiếm hơn. Nếu
bạn bị suy giảm miễn dịch hoặc mắc các bệnh lý tiềm ẩn khác, cả nhiễm trùng B.
cereus đường ruột và không đường ruột đều có thể nghiêm trọng hơn. Giữ đủ nước và
nghỉ ngơi có thể giúp bạn phục hồi nhanh hơn sau khi bị nhiễm trùng đường ruột.
Thuốc kháng sinh có thể giúp điều trị nhiễm trùng ngoài đường ruột. Cơ hội phục hồi
của bạn sẽ tốt hơn nếu bạn được điều trị kịp thời.
 Phức tạp
Các biến chứng của hội chứng đường tiêu hóa liên quan đến nhiễm B. cereus là
không phổ biến và chỉ xảy ra ở những người có hệ thống miễn dịch bị tổn thương. Các
biến chứng ở bệnh nhân nhiễm trùng ngoài đường ruột bao gồm hoại thư, viêm mô tế
bào, viêm màng não vô khuẩn, nhiễm trùng máu và tử vong.
 Nâng cao kết quả của nhóm chăm sóc sức khỏe
Nhiễm khuẩn Bacillus cereus là một bệnh nhiễm trùng tương đối phổ biến.
Trong phần lớn các trường hợp, nhiễm trùng được tự giới hạn mà không có biến chứng
và không cần bất kỳ điều trị nào khác ngoài chăm sóc hỗ trợ. Tuy nhiên, nhiễm B.
cereus có thể trở nên nghiêm trọng ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch và những
người bị nhiễm trùng mô mắt trực tiếp sau khi bị chấn thương thâm nhập. Những
trường hợp này có thể nhanh chóng tiến triển thành mất thị lực vĩnh viễn, nhiễm trùng
máu và thậm chí tử vong. Cần nhận biết kịp thời và mức độ nghi ngờ cao để cải thiện
kết quả. Các dược sĩ lâm sàng có thể hỗ trợ đội ngũ y tế bằng cách đảm bảo lựa chọn
kháng sinh thích hợp vì B. cereus kháng hai loại kháng sinh chính một cách tự nhiên.
28
Y tá chăm sóc quan trọng có thể giúp giảm thiểu các bệnh nhiễm trùng này ở những
người bị suy giảm miễn dịch bằng cách nhanh chóng loại bỏ các ống thông tĩnh mạch
trung tâm bên trong. Đối với các trường hợp nhẹ, y tá đóng một vai trò quan trọng
trong việc giáo dục bệnh nhân về cách bảo quản thực phẩm thích hợp để ngăn ngừa
dịch bệnh bùng phát. Sự phối hợp chăm sóc giữa y tá, dược sĩ và nhà cung cấp dịch vụ
y tế sẽ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh này và cải thiện kết quả cho những bệnh nhân bị bệnh
nặng. [Cấp độ 5]
 Răn đe và giáo dục bệnh nhân
Bệnh nhân cần được giáo dục về tầm quan trọng của việc rửa tay để phòng
ngừa các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn này. Ngoài ra, họ nên được cung cấp các tài
liệu cần thiết liên quan đến việc tiếp nhận, xử lý, chế biến và lưu trữ thực phẩm và các
sản phẩm thực phẩm thích hợp để ngăn ngừa nhiễm trùng.
29
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Trí An, 2020, 70% số vụ ngộ độc thực phẩm là do sử dụng suất ăn từ nơi khác vận
chuyển đến, TRANG TIN ĐIỆN TỬ ĐẢNG BỘ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. (Truy
cập: 06/10/2023), từ https://hcmcpv.org.vn/tin-tuc/70-so-vu-ngo-doc-thuc-pham-la-do-
su-dung-suat-an-tu-noi-khac-van-chuyen-den-1491866258
[2] T.Luỹ, 2012, Hàng chục trẻ mầm non ngộ độc do phở, sữa chua nhiễm khuẩn,
BÁO DÂN TRÍ. (Truy cập 06/10/2023), từ https://dantri.com.vn/suc-khoe/hang-chuc-
tre-mam-non-ngo-doc-do-pho-sua-chua-nhiem-khuan-1350751828.htm
[3] B.Vân, 2020, Đà Nẵng: Truy xuất nguồn gốc đồ chay khiến 230 người bị ngộ độc,
BÁO NGƯỜI LAO ĐỘNG. (Truy cập 06/10/2023), từ
https://nld.com.vn/suc-khoe/da-nang-truy-xuat-nguon-goc-do-chay-khien-230-nguoi-
bi-ngo-doc-20200517110041239.htm
[4] Trung Thi, 2021, Vụ 82 công nhân nhập viện: Món nấm xào nhiễm vi khuẩn
Bacillus cereus, BÁO DÂN TRÍ. (Truy cập: 06/10/2023), từ https://dantri.com.vn/an-
sinh/vu-82-cong-nhan-nhap-vien-mon-nam-xao-nhiem-vi-khuan-bacillus-cereus-
20210205143505488.htm
[5] Thái Bình, 2022, Đã tìm ra nguyên nhân vụ ngộ độc thực phẩm ở Trường iSchool
Nha Trang, VOV. (Truy cập: 06/10/2023), từ https://vov.vn/xa-hoi/da-tim-ra-nguyen-
nhan-vu-ngo-doc-thuc-pham-o-truong-ischool-nha-trang-post988545.vov
[6] Trần Thường, 2023, Vụ ngộ độc tại tiệm bánh mì Phượng: Thông báo kết quả xét
nghiệm các mẫu thực phẩm, BÁO NGƯỜI LAO ĐỘNG. (Truy cập: 06/10/2023), từ
https://nld.com.vn/suc-khoe/vu-ngo-doc-tai-tiem-banh-mi-phuong-thong-bao-ket-qua-
xet-nghiem-cac-mau-thuc-pham-20230921180819874.htm
[7] Giáo trình phân tích vi sinh thực phẩm (2023). Trường đại học Công thương
tp.HCM.
[8] TCVN 4992:2005, VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN
NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN
ĐĨA THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30°C. (Truy cập: 05/10/2023).
30
[9] Đinh Thị Hải Thuận (2014), Giáo trình thực hành phân tích vi sinh thực phẩm.
Trường đại học Công thương tp.HCM.
[10] Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước thực
phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục.
31

PTVSTP - Nhóm 7

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

PTVSTP - Nhóm 7

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS

Sinh viên thực hiện: NHÓM 7

2005218057 Nguyễn Quỳnh Như Thảo

2005218063 Trần Lê Thị Thanh Thảo

2005190573 Nguyễn Trọng Tài

2005210306 Phạm Hoàng Phương Thảo

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Hoàng Xuân Thế

- Thuyết trình phần 5, 6

- Tìm nội dung phần 3, 4, 7,

- Tìm nội dung phần 3, 4, 7,

- Tìm nội dung phần 1, 2, 5,

- Thuyết trình phần 1, 2

Hình 1: Vi khuẩn Bacillus cereus...................................................................................3

Hình 3: Hình thái khuẩn lạc B. cereus............................................................................5

Hình 4: Quy trình phân tích............................................................................................9

Hình 5: Đồng nhất mẫu................................................................................................17

Hình 6: Pha loãng mẫu.................................................................................................17

Hình 7: Nuôi cấy phân lập............................................................................................18

Hình 8: B. cereus trên thạch MYP................................................................................19

Hình 9: Tan máu β của B. cereus..................................................................................19

Bacillus cereus: B. cereus

Staphylococcus aureus: S. aureus

Clostridium perfringens: C. perfringens

Colony-Forming Units: CFU

European Food Safety Authority: EFSA

Saline Peptone Water: SPW

Mannitol – Egg Yolk – Polymixin: MYP agar base

Hình 1: Vi khuẩn Bacillus cereus

1.1. Phân loại

Phân loại quốc tế B. cereus:

 Thuộc giới: Bacteria

1.2. Đặc điểm hính thái của Bacillus cereus

(A) Tế bào quan sát dưới kính hiển vi

 Hình thái khuẩn lạc

(A) B. cereus trên môi trường MYP

(B) B. cereus trên môi trường thạch máu cừu

1.3. Tác động đối với sức khoẻ

Bền với nhiệt 45°C/30 phút 120°C/90 phút

Ổn định Ở pH=4, pH=11 Ở pH=2, pH=11.

Thời gian mắc

Loại thực Tài liệu

Cánh gà chiên 665 học sinh nhập viện, 1 học

Quảng có hàng chục du khách nước

2.2. Phạm vi áp dụng tiêu chuẩn phân tích

4. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Bước 2: Pha loãng mẫu:

Bước 3: Cấy và ủ mẫu:

Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định:

MYP agar base (Mannitol – Egg Yolk – Polymixin)

Polymixin B Nuôi cấy B. cereus

Blood agar base

HCl và NaOH 10% Chỉnh pH

Dụng cụ Mục đích Hình ảnh dụng cụ

Để nuôi cấy, phân lập,

Thiết bị Mục đích Hình ảnh thiết bị

Được sử dụng trong phân tích

6. TÍNH KẾT QUẢ

(C 1× R 1 )+(C 2 × R 2)+(C 3 × R 3)+(C 4 × R 4)

n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.