11/12/2022

Lưu ý
• Giáo trình thực tập
KẾT TỦA – NGƯNG KẾT • Bảng tên, điện thoại di động
MIỄN DỊCH • Đổi buổi thực tập
• Điểm thực hành
Bộ môn MD-SLB – Các cột điểm
Đại học Y Dược Huế – Điều kiện thi lý thuyết

Mục tiêu Nội dung

1. Trình bày được nguyên tắc và ứng dụng của
kỹ thuật kết tủa miễn dịch – ngưng kết miễn
dịch
2. Thực hiện và đọc được kết quả kỹ thuật xét
nghiệm bán định lượng ASLO – ngưng kết
miễn dịch
• Phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể
• Nguyên lý chung
• Kỹ thuật kết tủa miễn dịch
• Kỹ thuật ngưng kết miễn dịch
• Tổng kết

1
 11/12/2022

Định nghĩa Định nghĩa (tt)

• Kháng thể (antibody): glycoprotein hòa tan, có
khả năng nhận diện và gắn với kháng nguyên
• Kháng thể màng
• Kháng thể lưu hành
• Kháng nguyên (antigen): các chất được gắn
đặc hiệu với kháng thể hoặc TCR
• Quyết định kháng nguyên (epitop): vị trí chịu
trách nhiệm chính tạo KT và gắn đặc hiệu với
KT

Kháng nguyên – Kháng thể

2
 11/12/2022

Phản ứng kết hợp KN-KT

Làm sao để bắt 1 con cá nào đó?

Nguyên lý chung Điều kiện cần

• Hình thành mạng Marrack • Kháng thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên
• Kháng thể đa hóa trị
• Kháng nguyên đa hóa trị

3
 11/12/2022

Đường cong Heidelberger Kỹ thuật kết tủa miễn dịch

• Phản ứng kết hợp KN hòa tan và KT
• KN đa hóa trị
• KT đa hóa trị

4
 11/12/2022

Kết tủa trong môi trường lỏng Định tính và định lượng

Ứng dụng: định lượng

protein trong huyết thanh:
Kháng thể, bổ thể, 1 vài
yếu tố đông máu …

Turbidimetry và Nephelometry

Kỹ thuật khuếch tán vòng đơn

Kết tủa trong Gel
• KN hoặc KT hoặc cả hai khuếch tán vào trong
một lớp gel (có thể là gelatin, pectin,
polyacrilamid…): kỹ thuật khuếch tán thụ động
• KN và KT gặp nhau và tạo liên kết với nhau sẽ
xuất hiện đường kết tủa hoặc vùng kết tủa: vùng
tương đương
(kỹ thuật Mancini)
Nguyên tắc
- KN hòa tan từ 1 lỗ tròn,
khuếch tán đều đặn ra xung
quanh vào trong lớp gel
thạch có độ dày 1mm chứa
KT đặc hiệu tương ứng.
- Sự tiếp xúc giữa KN và KT
đặc hiệu sẽ hình thành một
vòng kết tủa, không tan.
Diện tích vòng tủa phụ thuộc
tỉ lệ thuận với nồng độ KN.

20

5
 11/12/2022

Ứng dụng
• Định tính và định lượng các protein (trọng
lượng phân tử không quá lớn)
• Ví dụ: định lượng kháng thể IgG trong huyết
thanh

Thực tập Kỹ thuật khuếch tán vòng kép

• Ouchterlony
non-
identity

HTf HSA Y
HSA
X
complete partial
identity identity

BSA
HTf Ab BSA
X

6
 11/12/2022

Ouchterlony: Double Diffusion in Agarose

Kỹ thuật khuếch tán vòng kép Reaction of Partial Identity

X,Y Y
HSA
X
HSA
HSA

X
BSA
BSA
BSA
aX,aY aY X

Ab
Ab

Ab = rabbit anti-HSA

Kỹ thuật ngưng kết miễn dịch

• Ngưng kết
– Kết thành đám
– Ngưng thành cặn
• Kháng nguyên hữu hình
– Hồng cầu, tế bào…
– Vi khuẩn
– Hạt nhựa tổng hợp: Latex, bentonit
• Ưu điểm so với kết tủa

7
 11/12/2022

Ngưng kết chủ động (trực tiếp)

• Kháng nguyên: có sẵn trên bề mặt tiểu phần
hữu hình

KỸ THUẬT NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP KỸ THUẬT NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP
anti-A anti-B anti-AB
 Chuẩn bị  Tiến hành
• Bộ huyết thanh mẫu (anti-A, anti-B, • Đánh dấu vị trí
anti-AB), dd NaCl 0.9% (1) (2) (3)
• Nhỏ theo thứ tự
• Phiến đá hoặc lame kính, que khuấy,
(1): 1 giọt anti-A
ống nghiệm, kim tiêm…
(2): 1 giọt anti-B
• Mẫu nghiệm: máu TM có chống (1) (2) (3)
(3): 1 giọt anti-AB
đông hoặc máu mao mạch
• Nhỏ thêm 1 giọt máu của người
cần định nhóm máu vào mỗi vị
trí 1, 2, 3. (1) (2) (3)
• Dùng que khuấy đều hỗn dịch
thành vòng tròn có đường kính
2-3cm và lắc nhẹ
• Đọc kết quả (1) (2) (3)
31 32

8
 11/12/2022

KỸ THUẬT NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP KỸ THUẬT NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP

 Kết quả:
- Dương tính (+): HC kết lại thành đám tách rời rõ rệt trên nền
A B
dung dịch trong

?
- Âm tính (-): hỗn dịch vẫn đỏ đều và đục
Dựa vào kết quả ngưng kết ở các vị trí anti-A, anti-B, anti-AB
để kết luận nhóm máu
AB O
Nhóm máu Anti-A Anti-B Anti-AB

A (+) (-) (+)

B (-) (+) (+) Nguyên nhân sai lệch kết quả:
AB (+) (+) (+) Mẫu máu bị tan máu, tỉ lệ KN-KT không phù hợp,
O (-) (-) (-) thuốc thử không còn tác dụng, đọc sai kết quả…
33 34

KỸ THUẬT NGƯNG KẾT GIÁN TIẾP

Ngưng kết thụ động(gián tiếp)
Chuẩn bị
• Biết KN hòa tan, tìm KT • Bộ thuốc thử ASLO
• Ứng dụng: phát hiện ASLO • Pipett, phiến kính nền đen,
• ASLO: anti-streptolysin O que khuấy…
• Mẫu nghiệm: huyết thanh
• Ý nghĩa của ASLO (+) bệnh nhân nghi thấp tim
– Đang nhiễm liên cầu
– Đã nhiễm liên cầu
– Không nhiễm liên cầu
– Gần đây có nhiễm liên cầu

36

9
 11/12/2022

Ngưng kết thụ động đảo ngược

• Biết KT hòa tan, tìm KN
• Ứng dụng: HBsAg theo nguyên lý ngưng kết
• Anti-HBs: kháng thể chống HBsAg
• Ý nghĩa của HBsAg (+)?

Ức chế ngưng kết

Định tính hCG trong
nước tiểu

10