TEMA 10: ORGANOXÉNESE EN VERTEBRADOS

.FORMACIÓN DAS EXTREMIDADES:

Ven determinada polos programas do desenvolvemento. Habitualmente todos os tetrápodos

teñen 4 patas, pero cando algo altera o programa de desenvolvemento e falla, atopamos
organismos con máis extremidades das normais. En humanos é relativamente frecuente o
fenómeno da polidactilia, é decir, a presenza de máis dedos do habitual ou que non remataron
de separarse.

Hay distintos factores que inflúen:

Para formar una extremidade funcional as células

que inicialmente son parecidas teñen que irse
especificando, determinando e diferenciando en
células de cartilaxe, células músculo e células de
oso, que son as que formar parte das nosas
extremidades (ademáis da pel e da epidermis que
rodea todo o conxunto).

Ademais as células téñense que producir nunha secuencia espacial e temporal que xenere
unha estructura funcional, é decir, sempre os dedos van a estar na extremidade, o codo no
medio e o hombro na parte máis proximal. Tamén é importante o lugar de donde salen, que se
organicen dentro do corpo (no caso dos humanos as pernas sempre van a estar abaixo e os
brazos arriba). Cando o programa de desenvolvemento sucede segundo o previsto as cousas
saen segundo o habitual e cando o programa se altera ao final podemos ter fenómenos
aparentemente perxudiciais como a polidactilia.

As extremidades teñen que formarse de maneira coordinada en 3 eixos principais:

- O primeiro eixo é o próximo-distal (marcado no lado esquerdo): a parte proximal é

bastante distinta á parte distal onde se atopan os dedos. Evolutivamente moi
conservado (humano, ave e cabalo), estructuralmente o programa de
desenvolvemento é similar e polo tanto o resultado tamén.
- Eixo anteroposterior: a parte anterior onde está o pulgar e a parte posterior onde
queda o dedo maimiño.
- Eixo dorsoventral: a parte ventral son as palmas.

Os 3 eixos deben estar coordinados ao longo do tempo, ao mesmo tempo que se vai
extendendo a extremidade no eixo próximo-distal vanse estar establecendo o que vai a ser a
parte anterior e posterior e a parte dorsal e ventral da man, de xeito que cando a extremidade
se forma todo está ordenado. Isto vai depender da expresión de varios xenes que vamos ir
vendo, denominados xenes do desenvolvemento por ter una gran influencia sobre este
proceso.
 Os mecanismos morfoxenéticos básicos
que forman as extremidades son os
mesmos en todos os tetrápodos (están
moi conservados). Imos estudiar os
mecanismos utilizando de modelo o
polo, pero son os mesmos que
podemos atopar en ratos ou peixes xa
que interveñen as mesmas familias de
xenes.

¿Cómo se forman?

A partir de 4 rexións particulares ao longo do noso corpo.

Interesa coñecer o campo de extremidade e como
conseguimos demostrar cal é o campo a nivel metodolóxico.
Nun organismo completo, si quero determinar cales son as
células que van dar lugar as extremidades, hay que facer 3
tipos de experimentos:

1- Marcar grupos de células ao longo do corpo do

embrión e observar si as células fillas acaban
formando parte da extremidade, si é así xa podo
sospeitar que esas células son precursoras da
extremidade. (Marcar, observar, teñir, seguir…)
2- Eliminar distintos grupos de células (illamento) para
observar que sucede. Si se elimina un grupo de
células
e non se forma a extremidade, implica que esas células serán importantes para a
formación da extremidade. (Eliminar, inhibir, bloquear…)
3- Transplante de grupos de células (orientados principalmente para saber si están
especificadas ou determinadas). Estos experimentos son fundamentais, baséanse en
expresar ou facer que xenes se expresen en lugares onde non lles corresponde. Si
sospeito que un grupo de cél. pode estar implicado na formación da extremidade e o
coloco noutro lugar e se forma una extremidade, podo concluir que ese grupo de
células é responsable da formación da extremidade. (Transplantar, mover, expresar
ectópicamente…)

Facendo estos 3 tipos de experimentos chegouse a conclusión de que hai unha área no corpo
(en realidade 4) que inclúe todas as células que son capaces de formar unha extremidade á
que se lle denomina campo de extremidade. En morado está marcada a rexión que vai formar
extremidade, sen embargo se faltan as células (morado), as células do redor (marcadas en
verde e rosa ou incluso as grises) tamén son capaces de cambiar o seu destino para formar una
extremidade. Como estas células son capaces de cambiar o seu destino, o campo de
extremidade ten un comportamento regulador, é decir, ten a capacidade de regular a perda ou
a adición de partes.
O campo de extremidade é capaz de formar un bulto, un esbozo da extremidade. O
desenvolvemento deste esbozo comeza a partir de células que veñen por un lado do
mesodermo da placa lateral que vai dar lugar aos precursores esqueléticos, e por outro lado de
células do mesodermo do somita que vai dar lugar aos precursores do músculo.

Habería unha extremidade por

cada somita, pero isto non
ocurre así nos tetrápodos. A
posición e o nivel de expresión
dos xenes Hox ao longo do eixo
anteroposterior provoca a
formación dos 4 bultos que
formarán as extremidades. Os
xenes Hox se expresan ao longo
do eixo anteroposterior e son os
que van a determinar coa súa
concentración en qué lugar
emerxen as extremidades, isto
funciona tamén no eixo
próximo-distal no que a
concentración de distintos xenes da familia Hox vai determinar que se formen moitos osos
pequenos ou un solo oso máis groso.

No mesodermo da placa
lateral vai haber un gradiente
de expresión de Sonic, que
vai influir na expresión de
ácido retinoico que a súa vez
vai influir na expresión
doutro xen da familia TBX
(esencial para a formación
das extremidades). TBX sólo
se vai a expresar onde hai
unha concentración
particular de Hox (non se
expresa nin por debaixo nin por enriba desta cantidade), TBX vai influir na expresión de xenes
da familia Fgf que a súa vez activan a expresión de xenes da familia Wnt que a súa vez activan
a expresión de xenes da familia Fgf8. Cando se expresa esta familia de xenes empezase a
inducir unha serie de cambios onde as células cambian de forma abombándose e ademáis
estos xenes poden inducir un bucle de retroalimentación positiva que permite que se faga un
bulto e medre aumentando de tamaño. A esta rexión unha vez que se alarga e adquire a
capacidade de inducir o que esta por debaixo, recibe o nome de crista ectodérmica apical. O
bucle de retroalimentación positiva leva a que teñamos Fgf8 no ectodermo (a un nivel preciso
donde se forman as extremidades anteriores e posteriores), e a que TBX esté debaixo no
mesénquima do mesodermo (TBX5 no caso de extremidades anteriores e TBX4 nas
posteriores). A interacción
de TBX5 con Fgf8 da lugar a unha extremidade anterior e TBX4 con Fgf8 da lugar a unha
posterior. Si experimentalmente poñemos fgf nunha rexión onde non debería habelo (entre as
extremidades porque non hay a concentración adecuada de Hox), van a difundir un pouco de
TBX4 e TBX5 e se van a formar unha especie de extremidades que no caso das anteriores van a
ter un aspecto similar ao dunha ala (por TBX5) e na parte posterior un aspecto máis similar a
unha pata (por TBX4). Conclusión: o tipo de extremidade que se forma vai a depender do tipo
de TBX que haxa no mesodermo subxacente (debaixo da crista ectodérmica apical).

Unha concentración
particular de xenes
Hox vai a facer que
nunha rexión concreta
onde a concentración
de Hox está nun
umbral correcto (nin
moi alto nin moi
baixo) induce ácido
retinoico que induce
TBX5 (no
caso das extremidades anteriores) que induce a expresión de Fgf8 no ectodermo. Este
mecanismo na extremidade anterior está moi conservado, é decir, ocorre tanto en polo
como en rato ou peixe.

No caso da extremidade posterior hai un pouco máis de variación. Unha vez que se activan
estes xenes Hox, o factor que hai no mesodermo e que se activa non se sabe cal é (en
extremidades anteriores é o ácido retinoico), en calquera caso este factor activa TBX4 que
a súa vez consigue que se active Fgf8 no ectodermo no caso da extremidade posterior de
polo. Na extremidade posterior de rato en lugar de ocorrer unha activación directa vía
TBX4 parece que interveñen outros xenes.

Así se forman os bultos, esbozos da extremidade, pero ¿cómo se alongan? Os 3 eixos teñen
que traballar de maneira coordinada e para iso se necesita un proceso de expresión dunha
serie de xenes que está coordinado. No caso do eixo próximo-distal hai ácido retinoico
condicionado pola expresión de Hox na parte máis proximal, eFgf 8 que se expresa a partir da
crista ectodérmica apical. O eixo anteroposterior, depende da expresión de Sonic para que na
parte anterior se forme o pulgar e na posterior o maimiño, e no caso do eixo dorsoventral
tamén depende da expresión de certos xenes que determinarán cal será a rexión dorsal e cal a
rexión ventral.
 Os propios xenes que determinan
que se forme o esbozo da
extremidade son os que van a
determinar o seu eixo próximo-
distal. Entonces vai haber dous
umbrais de xenes importantes: o do
ácido retinoico é moi elevado ao
lado dos somitas e que despois vai
descendendo e o de Fgf8 que é moi
baixo cerca dos somitas e que vai a
ter a súa máxima expresión na
crista ectodérmica apical. A
concentración destos xenes vai a
ser fundamental
para determinar que xen da familia Hox se expresa, a expresión de Hox ao longo do eixo
próximo-distal vai a depender de que nunha zona hai moito ácido retinoico e pouco fgf8 e
noutra zona ocorre a inversa, isto determina que se formen dedos ou un oso groso.

A crista ectodérmica apical está localizada

ao longo da marxe máis distal do esbozo da
extremidade e vai a ser o principal centro
sinalizador do crecemento da extremidade
no eixo próximo-distal. Realiza tres
funcións principais: mantén o mesénquima
que está por debaixo nun estado
proliferativo que permite o crecemento
próximo-distal, mantén a expresión das
moléculas que xeneran a polaridade
próximo-distal (a partir da expresión de
fgf8 se inicia e se mantén a expresión
doutros xenes que
están por debaixo da cascada para manter a polaridade), e ademáis non só interactúa cos
xenes que son os encargados da polaridade próximo-distal senón que tamén interactúan con
xenes que codifican as proteínas fundamentais para especificar os otros eixos (antero-
posterior e dorso-ventral).

Experimentos que nos

permiten ver as células
responsables do
crecemento no eixo
próximo-distal. O
crecemento e
diferenciación dunha
extremidade vai a
depender dunha serie de
interacións que se
producen entre a crista
ectodérmica apical e
 células mesenquimáticas subxacentes a crista denominadas zona de progreso. Si quitamos a
crista, cesa completamente o crecemento da extremidade, si engadimos unha cresta apical a
carón doutra o que ocorre é que crece de máis ou se duplica a extremidade.

Si quitamos as células do
mesénquima correspondente
á extremidade anterior e o
sustituimos por mesénquima
da extremidade posterior,
onde se estaría expresando
TBX4 en vez de TBX5, e
formaráse unha pata. Si
poñemos un mesénquima
que non é nin de ala nin de
pata, se non que é dun nivel
medio (do noso costado) non
se formará nin ala nin pata.

Si quitamos a crista e a sustiuimos por fgf8 haberá un desenvolvemento normal, porque as

células de mesénquima non necesitan unha capa de células por encima tapando se non que o
que necesitan é o que se secreta (Fgf8). Polo tanto, dedúcese que se vai a formar unha
extremidade si hai unha interacción entre a crista e o que expresa e o mesénquima subxacente
(zona de progreso). Ademáis, demostrouse que a información posicional para a polaridade
próximo-distal reside na idade do mesénquima que está por debaixo, que vai a determinar os
osos que se forman. O primeiro mesénquima que se forma da lugar aos osos proximais, e
último mesénquima que se forma da lugar aos osos máis distais.

NON CONFUNDIR os dous sitios onde interveñen os xenes Hox:

1. Hox nun gradiente (caudo-dorsal) non estadio temporal no mesodermo da placa

lateral induce o ácido retinoico que a súa vez van a inducir Tbx5 e Fgf8 dependendo da
extremidade, e permite que se forme o esbozo da extremidade.

2. Eixo próximo-distal temos o ácido retinoico a nivel do mesodermo e Fgf8 a nivel do

ectodermo, e combinación destes dous gradientes vai permitir que se expresen xenes
Hox, serven para determinar o que será proximal e o que será distal, a secuencia sería
Hox, ácido retinoico e Fgf 8 e despois Hox

EIXO ANTERO-POSTERIOR

Parte anterior dedo polgar (1, cara arriba) e a posterior o dedo meniño (5, cara
abaixo), temos a unha nova rexión na parte posterior, a zona de actividade
polarízante (ZPA), e xunto AER (cista ectodérmica apical) e a zona de progreso
van a definir o eixo anterior posterior.

Sabémolo por experimentos de transplante, collese a ZPA e colocase nunha

rexión anterior, o que provoca a formación de novos díxitos na nova rexión,
tendo os dedos 4,3 e 2 e despois 2,3 e 4 tendo unha imaxe especular, polo que
ZPA pode inducir dedos e a polaridade antero-posterior coa que se forman os
dedos, as rexións máis próximas van ser os dedos posterior (5,4...) e as máis
afastadas o dedo polgar.
O xene responsable da polaridade é o Sonic (Shh), se inducimos a
expresión de Sonic na rexión onde trasladamos antes a ZPA, vamos ter
os mesmo resultado.

O feito de que se forme un dedo ou outro vai depender da cantidade

de Sonic que haxa, para que se formen o dedo 5 e 4 necesitase Sonic
en grande cantidade e durante moito tempo, onde vai actuar a nivel lugar con regulación autocrina,
na rexión 3 vamos ter Sonic en regulación autrocrina (expresado polas células desa rexión durante
un período curto) pero tamén por difusión da ZPA, no lugar 2 só vamos ter Sonic que ven por
difusión de lugares máis posteriores e na rexión 1 (polgar) non hai Sonic.

Polo que se facemos un experimento onde eliminamos Sonic vamos obter 1 só polgar máis gordo
en lugar de 5 polgares e se o verde escuro chegara a sitios máis anteriores teríamos dedos número
5,4, un dedo número 2 no lugar do polgar e non teríamos polgar.

EIXO DORSO-VENTRAL

Ventral a palma da man, na parte dorsal vamos ter unha expresión de de Wnt7a no
ectodermo e de Lmx1 no mesodermo e na parte ventral unha expresión de Engrailed
no ectodermo e de BMP no mesodermo, necesitamos os xenes para que se forme a
entidade dorso-ventral.

Se hai mutación e non se expresa Lmx1 por exemplo o que ocorre e que esa parte
vaise ventralizar, todo a sinalización ventral estendese cara a rexión dorsal, polo que
temos 2 rexións ventrais.

COORDINACIÓN (dixo que non facía falta saber como é se non saber que se coordinan xa chega)

Os 3 eixos coordínanse, non só hai unha retro-alimentación de Fgf8 con Fgf10 que estaba por
debaixo pa favorecer o crecemento do mesodermo no eixo próximo-distal, se non que esta
sinalización vaise coordinar coa sinalización que intervén no eixo antero-posterior e coa que ven no
eixo dorso-ventral.

Por exemplo a expresión de Fgf8 é responsable de que non se exprese Sonic na rexión onde se vai
formar un polgar, pero permítese, inhíbese o inhibidor, que se exprese Sonic na rexión máis
posterior. O mesmo sucede cos xenes que interveñen na polaridade dorso-ventral.

Tamén ao longo a do tempo, ao medida que o mesodermo medra afastándose do ectodermo onde
se expresa Fgf8, vaise perdendo a intensidade da sinalización permitindo que a sinalización varia ao
longo do tempo, polo que non se especifican os mesmo tecidos ao principio, na parte proximal, que
na parte final cando xa se van formar os dedos. Polo que a reacción entre os xenes tamén varía ao
longo do tempo, cara o final desaparece a crista ectodermica apical (AER).