V.

Превантивна медицина

33. Предимплантационна (ПИГД) и предконцепционна генетична

диагностика (ПКГД) – Т. Милачич, Д. Тончева
33.1. Биологични материали за извършване на ПИГД и ПКГД
33.2. FISH техника за ПКГД и ПИГД хромозомна диагностика
33.3. Молекулярно-генетични анализи за ПИГД и ПКГД

Около 15% - 30% от бременностите, регистрираните с положителни тестове, не достигат

до живо раждане. Този висок процент на много ранна ембрионална смърт допринася за
наблюдаването на ниска плодовитост при човека.
Много и разнообразни фактори може да доведат до тази ранна загуба на бременност.
Доказано е, че неуспехът за осъществяването на бременност се случва най-често във
фазата преди имплантацията, поради хромозомни аномалии в ембрионите. Изследванията
и анализите на ембриони (чрез предимплантационна генетична диагностика - ПИГД) и на
гамети (чрез предконцепционна генетична диагностика - ПКГД) предоставят
доказателства за произхода на хромозомните аномалии, разкрити по-късно, по време на
бременността и раждането.
За първи път ПИГД е направена от Handyside и Kontogianni (1990). Те използвали PCR за
намножаване на У-хромозомни специфични последователности с цел определяне на пола
при ембриони, получени от двойка с установен риск от предаване на полово-свързано
генетично заболяване. По-късно същият метод е приложен за предотвратяване на риска от
хемофилия (Grifo et al.,1992), муковисцидоза (Handyside et al., 1992; Harper et al., 1994),
мускулна дистрофия (Sermon et al.,1994) и много други. Понастоящем тази диагностика се
прави за над 25 генетично детерминирани заболявания, сред които са и Хорея на
Хънтингтон, синдром на чупливата Х-хромозома, ,ретинитис пигментоза, мускулна
дистрофия Шарко-Мари-Тут, синдром на Търнер, синдром на Даун и други хромозомни
болести.
Заболяванията, при които се прилага ПИГД могат да се групират по следния начин:
хромозомни (31.6%), Х-свързани (26.0%), автозомно-рецесивни (24.0%), автозомно-
доминантни (18.0%) и митохондриални (0.4%) (Sermon et al., 2005):
Необходимостта от такава диагностика се е породила от факта, че шансовете за
забременяване намаляват с напредването на възрастта при жената, а това най-често се
дължи на хромозомни аномалии, които настъпват в яйцеклетките, докато все още са в
яйчника.
Диагностиката на генетичните аномалии в предимплантационния ембрион е трудна,
главно поради факта, че една до две клетки са достъпни за анализ. За хромозомна
диагностика обикновено се използват стотици хиляди до милиони ядрени клетки, които се
култивират и обработват, за да се увеличи броя на клетките в стадий метафаза и да се
улесни анализа на хромозомите. Вероятността клетки, извлечени от ембриона, да бъдат в
този стадий е много малка. Повечето клетки имат интерфазно ядро, в което се съхранява
генетичната информация, но то е трудно за наблюдение и изследване.

1
33.1. Биологични материали за извършване на ПИГД и ПКГД
При ПКГД се използва полярно телце за диагностика, а при ПИГД – бластомери.
Биопсия на полярно телце
Преди оплождането яйцеклетката претърпява биологично зреене – матурация, по време
на която се извършват двете последователни мейотични деления. Четири седмици преди
раждането на женските индивиди започва овогенезата и спира на стадий профаза на
мейоза 1. По време на зреенето цитоплазмата се разделя асиметрично, както през
първото, така и през второто мейотично делене и се оформят една голяма клетка
(яйцеклетка) и по-малка (полярно телце).
През първото мейотично делене от първичния ооцит се оформя вторичен ооцит и първо
полярно телце. И двете образувания имат диплоиден хромозомен набор. По време на
процеса, преди отделянето на полярното телце, между хомоложните хромозоми се
извършва обмяна на сегменти (кросинговър). Това води до генетична рекомбинация.
Започва второ мейотично делене (мейоза 2). Деленето е редукционно и диплоидният
хромозомен набор преминава в хаплоиден (Фиг. 33.1).
Ако сперматозоидът проникне в яйцеклетката, настъпва заключителният етап на мейоза
2. Получената зряла яйцеклетка и оформилото се полярно телце са с хаплоиден
хромозомен набор.

1 полярно телце

2 полярно телце

ОВОГОНИЙ 1ºООЦИТ 2ºООЦИТ ЗРЯЛА ЯЙЦЕКЛЕТКА

2n растеж 4n мейоза1 2n мейоза2 1n

Фиг. 33.1 Последователни етапи на мейоза 1 и 2 и разпределение на генетичния

материал между полярното телце и яйцеклетката при съзряването й

При този анализ трябва да се има в предвид, че за изследване е налична само една
клетка, която се получава чрез биопсия (Фиг. 33.2).

2
Фиг. 33.2 Яйцеклетка с нормална структура и нормално първо полярно телце

Биопсия на бластомери от тридневни ембриони

Около 64-66-тия час след инсеминирането, оплодената яйцеклетка достига 7-8 клетъчен
стадий.
Биопсирането на клетки (бластомери) от ембриона е възможно през ранния етап от
делене му. Обикновено се изваждат един или два бластомера от 7-8 клетъчен стадий на
зиготата, без това да уврежда нейното развитие (Cohen et al., 1992). Установено е, че
осем клетъчният стадий е най-благоприятен за осъществяване на биопсията по следните
причини: клетките имат най-висока скорост на митотично делене и ембрионът по-лесно
компенсира липсващата клетка; вътреклетъчната маса и трофектодерма не се изменя в
последствие; запазва се целостта на ембриона по време на трансцервикалния му
трансфер; бременности и раждания на новородени са получени предимно след биопсия
в този стадий.
Биопсия на трофобластни клетки от петдневни ембриони
На петия ден след инсеминирането (112-114-ти час), ембрионът се трансформира в
бластоцист. Той съдържа ембриобласт (от него произлиза същинския ембрион) и
трофобласт (дава начало на плацентата). Ембрионът се имплантира между 7- мия и 8-
мия ден от оплождането.
В бластоцистния стадий могат да се разграничат ембриобласт, от който се развива
същинския ембрион, и трофектодерм, даващ началото на плацентата. Клетки от
последния могат да бъдат селективно отстранени, без това да води до увреждане на
човешкия фетус. При бластоцистната биопсия има добив на 5 до 20 клетки, достатъчни
за получаване на по-сигурен резултат и намаляване на риска от последваща погрешна
диагноза (Фиг. 33.3). Основен недостатък на метода е, че 25% до 60% от всички
осемклетъчни ембриони имат потенциал в ин витро условия да достигнат до стадий
бластоцист. Друга негативна страна е изключително краткият срок за анализ. Именно
този предимплантационен стадий е последният при ин витро култивирането и след него
ембрионите са изцяло зависими от ин виво условията в маточната лигавица, където ще
започне процесът на „нидиране” (вгнездяване в ендометриума) и имплантация.
А. Б. В. Г.

3
Фиг. 33.3 Биопсия на трофобластни клетки:
А-Частично лизиране на обвивката на ембриона
Б: Биопсиран тридневен ембрион
В. Бластомер в биопсичната пипета
Г.Бластомер с ясно видимо ядро

33.2. FISH техника за ПИГД и ПКГД хромозомна диагностика

Използването на FISH за диагностика на анеуплоидии и транслокации в човешките
ембриони е разработена за първи път в света от Grifo (Grifo et al., 1990) и Munne (1993).
Оценката на плоидността на единични бластомери с FISH чрез използването на
автозомни и полово свързани сонди, бе постигнато в определено рамкирано време,
съвместимо с ин-витро процедурите.
ПИГД и ПКГД диагностика предотвратява раждането на дете с най-често срещаните
хромозомни аномалии: синдром на Даун (47, ХХ, + 21; 47, ХУ, + 21), синдром на
Търнър (45, ХО), синдром на Клайнфелтър (47, ХХУ), синдром на Патау (47, ХХ, + 13;
47, ХУ, + 13) и синдром на Едуардс (47, ХХ, + 18; 47, ХУ, + 18). Децата с допълнителна
или липсваща хромозома имат сериозни малформации, съпътствани от умствена
изостаналост и силно съкратена продължителност на живот.
Проблеми при използването на флуоресцентната ин ситу хибридизация (FISH) и
недостатъци на техниката при ПИГД и ПКГД
При FISH техниката два флуоресцентни сигнала маркират два специфични домена в две
хромозоми. Доменът е диаметъра на един сигнал (Фиг. 33.4).
Критериите за поставяне на ПИГД са следните:
- ембрион, при който всички налични за анализ бластомери са с общо два специфични
сигнала за половите хромозоми и по два сигнала за всяка автозома, се считат за
диплоидни;
-ембрион, при който всички налични за анализ бластомери са с една и съща аномалия е :
анеуплоиден, хаплоиден или полиплоден;
- анеуплоиден ембрион е този, при който индивидуалните бластомери (изследвани със
специфични сонди за няколко хромозомни двойки) имат по един или три сигнала за една
хромозомна двойка и по два сигнала за останалите хромозомни двойки.

4
- хаплоиден ембрион е този, при който индивидуалните бластомери (изследвани със
специфични сонди за няколко хромозомни двойки) имат само един сигнал за хромозомна
двойка;
- полиплоиден ембрион е този, при който индивидуалните бластомери (изследвани със
специфични сонди за няколко хромозомни двойки) имат три и повече сигнала за
хромозомна двойка;
- ембрион, при който отделни бластомери (изследвани със специфични сонди за няколко
хромозомни двойки) са с допълнителни сигнали или липса на такива, а съседните
бластомери обратно са с липса или екстра-сигнали за същите хромозомни двойки, се счита
за мозайцизъм, генериран от митотичното неразделяне.
а) б) в) г) д)

Фиг. 33.4 FISH диагностика на ядро от бластомери

а) от ембрион с женски пол – 2 оранжеви сигнала за двете Х хромозоми;
б) от ембрион от мъжки пол – 1 оранжев сигнал за Х и един зелен за У хромозомата;
в) с 3 оранжеви сигнала за Х и липсващ зелен сигнал за У хромозоми;
г) с 1 оранжев сигнал за Х хромозома;
д) със сигнали за две Х и две У хромозоми
Ограничения на FISH техниката при ПИГД за хромозомни аномалии
- Малък брой FISH проби
До момента само 5-6 FISH проби са достъпни за ПИГД. и ПКГД Изследването дава
информация за настъпили нарушения в ограничен брой хромозоми и не отчита
измененията в останалите хромозомни двойки.
Грешки при използване на FISH техниката могат да настъпят и при наличие на:
мозаицизъм, съвпадане или застъпване на сигнали.
- Грешна диагноза при мозаицизъм
Счита се, че наличието на мозаицизъм води до 5% погрешна диагноза. Скорошни
проучвания показаха, че в нормално развиващия се ембрион, мозайцизмът се
осъществява през второ делене или по-късно (през третото или последващо делене.
Следователно, дори анализът на 3 клетки от 8-клетъчен ембрион, не би бил достатъчен,
за да се открият всички ембриони с мозаицизъм. Най-ранните признаци на мозаицизъм
са открити при ембриони от две до четири клетъчен стадий.
Случаите на липсващи сигнали могат да са признак, както за наличие на монозомия,
така и за неуспех на FISH техниката. Причини за това могат да бъдат спад в

5
ефикасността на хибирдизацията, загуба на ядрото по време на фиксация на бластомера,
ниска способност за проникване на флуоресцентната сонда.
- Погрешно отчитане на флуоресцентните сигнали
Има данни, показващи, че в 7,5% от случаите се наблюдава разцепване или
припокриване на флуоресцентни сигнали, водещи до погрешна диагноза. Когато това се
отнася за хромозома 21, не се препоръчва връщане на ембрионите обратно в матката.
При използването на FISH техниката, хомоложните хромозоми изглеждат като дву-
точкови сигнали, по една точка за всяка хроматида. Понякога, близко разположените
хроматиди се припокриват и изглеждат като единична точка, което би могло да доведе
до погрешна диагноза.
Ограничения на FISH при ПКГД за хромозомни аномалии
При предконцепционна генетична диагноза (ПКГД) се анализират настъпили
нарушения в полярното телце. Първото полярно телце е като огледален образ на
яйцеклетката, ето защо наличието на екстра хромозома (с две хроматиди), би
означавало, че яйцеклетката ще е с липса на тази хромозома и полученият ембрион ще е
с монозомия по определената хромозома. При обратния случай, липсата на една
хромозома от хомоложна двойка в първото полярно телце, показва, че бъдещият
ембрион ще е с тризомия по тази конкретна хромозома.
Друга слабост на предимплантационната диагностика за анеуплоидия чрез анализа на
полярното телце е, че не се диагностицират хромозомни аномалии, които се унаследяват
от бащата.
Преимущество на FISH техниката за ПИГД на анеуплоидии
Едно от най-важните преимущества на метода е редуцирането на броя на новородените
с тризомии, като едновременно с това се увеличава степента на имплантация, поради
асистирано излюпване (assisted hatching AH) на zona pellucida преди извършване на
биопсията (Cohen et al., 1990).
Друго важно преимущество е намаляването на честотата на спонтанните аборти и
увеличаване броя на новородените спрямо броя на трансферираните ембриони, тъй като
се извършва селекция и игнориране на тези ембриони, които не биха се имплантирали
или биха довели до спонтанен аборт. При някои жени, всички ембриони могат да бъдат
абнормални и в такива случаи изобщо не се достига до фазата на трансфер.
33.3. Молекулярно-генетични анализи за ПИГД и ПКГД
При директния ДНК анализ, изследваният ген трябва да е предварително клониран и
секвениран, за да се получи информация за ДНК последователностите, по които се
различават нормалните от мутантните алели. Този тип анализ се използва широко в
молекулната диагностика, за бързо доказване наличието или липсата при даден пациент или
семейство, на най-честите мутации, срещани в съответната популация. За целите му
предварително се намножава специфичния участък от даден ген с PCR.
За да се намножи ДНК участък от една клетка, каквато е яйцеклетката, е необходимо
предварително разграждане на клетъчната мембрана и цитоплазмата (ооплазма) на
яйцеклетките.

6
Принцип: Използва се алкален лизиращ разтвор. Той се поставя в прозрачни
микроепруветки, в който се прибавят яйцеклетките за анализ (по една в епруветка). След
загряване се получава пълно разграждане на цитоплазмата и мембраната, без да уврежда
ДНК структурата.
За целите на анализа на ДНК се работи с оптимизирани протоколите за Гнездови PCR,
както по отношение на използваните концентрации от праймери, така и по отношение на
условията за лизис на единичните клетки и броят на циклите при двата кръга на PCR (Фиг.
33.5).

Фиг. 33.5 Изследване на амплификационен продукт на 10-ти екзон на CFTR гена върху
10% ПАА гел в единична клетка (Т. Милачич, 2009)

34. Пренатална диагностика (ПНД) на моногенни и хромозомни болести

С.Хаджидекова, Д. Тончева
34.1. Индикации за пренатална диагностика
34.2. Неинвазивни методи за ПНД
34.3. Биохимичен скрининг на бременни жени. (БХС)
34.4. Инвазивни методи за ПНД
34.4.1. Техники за взимане на материали за ПНД
34.4.2. Генетични методи за ПНД
34.4.2.1. Цитогенетична пренатална диагностика
34.4.2.2. Молекулярно-цитогенетични методи за ПНД на хромозомни заболявания
34.4.2.3. Молекулярно-генетични методи за ПНД на хромозомни заболявания
34.4.2.4.. Молекулярно-генетични методи за ПНД на моногенни болести
34.4.2.5. ПНД чрез молекулно кариотипиране.
34.4.2.6. Нови техники за пренатална диагостика

Пренаталната диагностика (ПД) е сравнително нов клон от медицината, наложил се през

80-те години на миналия век. Първото съобщение за ПД се появява през 1955 г., когато
Fuchs и Riis и Serr и сътрудници докладват за определяне на фетален пол чрез изследване
на полов хроматин (телце на Бар) в амниотични клетки.
ПД включва комплекс от техники и методи за диагностика с цел изясняване
здравословното състояние на фетуса преди раждането му и изясняване риска за раждане на
болно дете.

7
Предварителни условия за провеждане на ПД. Няколко важни фактора трябва да бъдат
внимателно обсъдени преди да се предприеме ПД.
1. Преценка на тежестта на заболяването. Важно е да се изясни тежестта
на заболяването. В случаите, когато със сигурност се знае, че заболяването води до
мъртвораждане или до летален изход в ранна детска възраст, нуждата от ПД е
очевидна.
2. Наличие или липса на ефективна терапия. Също така провеждането на
ПД има смисъл и при заболявания с по-голяма продължителност на живота, но с
нелечими тежки, множествени, често прогресиращи физически и/или умствени
увреждания като напр. синдром на Даун, дефекти на невралната тръба, мускулна
дистрофия и много малформативни синдроми. Не винаги патологичните резултати
от една ПД водят до прекъсване на бременността. Например при наличието на
ефективна терапия както при фенилкетонурията, ПД дава възможност на
родителите да се подготвят за раждането и грижите за засегнатото дете.
Пренаталното ехографско изследване на плода може да установи вродени
малформации, подлежащи на оперативна корекция, което налага раждането да
протече в съответно специализирано отделение с възможности за неонатална
хирургия и интензивни грижи.
3. Ефективност и сигурност на диагностичния тест. Пренаталният тест
трябва да бъде достатъчно сигурен, за да позволи вземането на решения относно
бременността след получаването на резултатите. Хромозомният анализ обикновено
дава лесни за интерпретация резултати. Изключение правят случаите на мозицизъм.
За много моногенни заболявания са възможни директен мутационен анализ или
биохимични изследвания, като дефектът във фамилията трябва да бъде
предварително изяснен. Ако са спазени всички изисквания ПД на менделовите
заболявания е с висока степен на сигурност. В някои случай се провежда
индиректен ДНК-анализ със скачени с мутацията маркери, при което резултатът се
дава в проценти за точност на диагностиката.
34.1. Индикации за пренатална диагностика.
На инвазивна пренатална диагностика подлежат всички високорискови
бременности:
1. Възраст на бременната над 35 години. Това е най-честата причина за
пренатална диагноза, като повечето центрове предлагат АЦ или ХБ на бременни
над 37 или 35 години. Няма приети стандартни критерии за възрастовия праг.
2. Аномалии, открити в хода на бременността - неясни резултати от
биохимичния скрининг и феталната морфология, изоставане във вътреутробното
развитие, несъвместима с живота аномалия могат да бъдат индикация за инвазивна
диагностика
3. Родено дете с хромозомна аномалия. При родено дете с Даун синдром на
родители с нормален кариотип, рискът за повторение при следващата бременност
се определя от възрастовия риск на майката + 5%. При родено дете с хромозомна
болест на родител, носител на балансирано хромозомно преустройство
(транслокация, инверсия), рискът за повторение е между 1-2% и 15-20%. Рискът
зависи от вида на преустройството и ангажирания хромозомен сегмент.

8
 4. Фамилна история за хромозомни аномалии. Обикновено рискът не е по-
висок от популационния, тъй като по-скоро хромозомните болести се дължат на де
ново неразделяне на хромозомите по време на деленето, отколкото на фамилни
преустройства. При дете със синдрома на Даун трябва да се изясни формата на
болестта (свободна тризомия, транслокационна форма, мозаицизъм) или незабавен
цитогенетичен анализ на родителите (при нормален кариотип отпада нуждата от
инвазивна диагностика).
5. Фамилна история за моногенна болест. Индикациите са родено болно
дете, болен родител или положителна фамилна история. Рискът при моногенните
болести е 25-50%. За много моногенни болести е възможна пренатална диагностика
като ДНК- или биохимичен анализ (ахондроплазия, болест на Хънтингтън,
неврофиброматоза и т.н.).
6. Фамилна история за дефект на невралната тръба. При първа и втора
степен на родство трябва да се определи риска. Диагностичен метод на избор е
ехография+ измерване на α-фетопротеин. Малки затворени дефекти на невралната
тръба могат да останат недиагностицирани.
7. Фамилна история на други вродени малформации. Провежда с анализ на
родословното дърво и се изчислява риска за повторение. При повишен риск се
препоръчва да се направи високорезолютивна фетална морфология между 16-18 г.с.
за насочено търсене на аномалии на черепни, сърдечни, бъбречни, мозъчни
малформации и аномалии на крайниците.
8. Други високо-рискови фактори - кръвнородствен брак (високо-резолютивен
ултразвук), обременена акушерска анамнеза като хабитуални аборти или
мъртвораждания (високо-резолютивен ултразвук на фетуса и хромозомен анализ на
родителите), майчини заболявания като лошо контролиран захарен диабет или
епилепсия, лекувана с валпроати (високо-резолютивен ултразвук).
34.2. Неинвазивни методи за ПНД
Към неинвазивните техники за ПД спадат ехографията на плода, електрокардиографията,
рентгенографията и др. Най-често прилаганият метод от тях е ултразвуковото изследване.
Това е високоефективен и безвреден за майката и плода метод. Той позволява да се
открият около 80-98% от плодовете с анатомични пороци и е особено информативен в
сроковете 11-14 г.с., 18-20 г.с. и 28-32 г.с. (Табл. 34.1).

Таблица 34.1 Ултразвуково изследване в различни срокове на бременността.

Срок на Диагностични възможности

бременността
I триместър  определяне срока на бременността
 определяне броя на фетусите
 идентифициране на плацентарните структури
 диагностика на ектопична бременност или спонтанен аборт
 преглед на матката и анатомични характеристики на таза
 диагностика на аномалии на плода
II триместър  най-често между 18 и 20 гест. сед.

9
  потвърждаване срока на бременността
 провеждане на процедури за вземане на материал от плода
(напр. амниоцентеза)
 преглед на фетуса за наличие на аномалии
 оценка на количеството амниотична течност
 оценка на кръвотока
 анатомична и функционална биометрия
 мониториране на феталния растеж
III триместър  мониториране на феталния растеж
 оценка на количеството амниотична течност
 определяне на предлежанието на фетуса
 оценка на локализацията и зрелостта на плацентата

34.3. Биохимичен скрининг на бременни жени (БХС).

За състоянието на плода се съди по биохимични показатели на кръвта и урината на
бременната, по акушеро-гинекологичната й анамнеза, от ехографските прегледи,
резултатите от проведените бактериологични, имунологични и ендокринологични
изследвания. Биохимичните изследвания на серумните маркерни протеини на бременната
заедно с ултразвуковото изследване са особено полезни за откриване на жени с висок риск
за раждане на деца с хромозомни болести и пороци на развитието. Трябва да се помни все
пак, че биохимичният скрининг (БХС) не е диагноза, а само оценка на риска.
Според срока на провеждане БХС е ранен БХС (11-14 г.с.) или късен (15-19 г.с.).
Ранният БХС се провежда когато дължината на разстоянието от темето на плода до
опашната кост (CRL - Crown-rump length) е 41 – 79 mm. Освен размера на CRL се отчитат
бипариеталния размер (BPD), обиколката на главата (HC), дебелината на нухалната
транслуценция, липсата или наличието на формирани носни кости. Нухалната
транслуценция представлява събиране на течност под кожата на врата, която изглежда
прозрачна при ехографското изследване и има различни размери през различните срокове
на бременността. Увеличаването й над 3 мм и повече може да се дължи на хромозомни
аномалии (синдром на Даун, синдром на Търнър и др.), сърдечни аномалии, скелетни
аномалии, вродени инфекции. Липсата на формирани носни кости е особено
информативна за синдрома на Даун. От особена важност за получаване на коректни
резултати са и други данни за бременната като дата на ПРМ, гестационна възраст по ПРМ,
гестационна възраст по ултразвук, тегло на бременната, възраст към датата на термина,
дата на вземане на пробата, дата на ултразвук. За изследването е необходим серум
изолиран от 2-3 мл венозна кръв в деня на вземане на пробата или най-късно до 2-3 дни.
Пробата се транспортира на стайна температура като при необходимост се съхранява на
4⁰С. Биохимичните показатели, които се изследват са PAPP – A (Pregnancy-associated
plasma protein A, pappalysin 1) и Fβ-hCG (бета субединица на човешкия
хориогонадотропин). При тризомични състояния поради нарушена пертурбация на фето-
плацентарния комплекс стойностите им се променят (намаляват или увеличават).
PAPP-A е протеин, който се произвежда от цитотрофобластните клетки. PAРР-А
представлява металопротеиназа, чиято функция е да разцепва IGF (insulin-like growth

10
factor)-свързващите протеини 4 и 5, при което IGF се освобождава и се свързва с
рецепторите си. IGF има важна роля за трофобластната инвазия и съотв. за развитието и
васкуларизацията на плацентата. Ниските серумни нива на РАРР-А асоциират с по висока
честота на анеуплоидни фетуси.
Хориогонадотропинът (ХГТ) е гликопротеин, състоящ се от две събединици – алфа и бета.
Секретира се от трофобластните клетки и се детектира в кръвния серум след 10-тия – 12-
тия ден от оплождането.
Ранният биохимичен скрининг е информативен за синдром на Даун, синдром на Търнер,
синдром на Патау, синдром на Едуардс и триплоидии. Ранният БХС не оценява дефекти на
невралната тръба и коремната стена. Софтуерна програма изчислява риска, като в
зависимост от него бременните се разпределят в три групи: 1) с висок риск > 1:100; 2) с
междинен риск 100-1000 и 3) с нисък риск < 1:1000.
Късен БХС. Късният БХС се провежда в срока от 14+4 до 19+3 г.с., като за изчисляването на
риска са необходими следните данни за плода – BPD, НС и FL (дължина на фемура).
Важни са и данните за бременната, описани по-горе при ранния БХС, като пробата се
третира по същия начин. Биохимичните показатели, които се изследват в серума на
бременните са: алфа-фетопротеин, хориогонадотропин и неконюгиран естрадиол.
Алфа-фетопротеинът (АФП) е белтък, който се произвежда в жлъчния мехур и черния
дроб на плода, екскретира се с урината на плода в амниотичната течност, от където
преминава в майчината кръв през плацентата и се детектира през 5-та – 6-та седмица след
оплождането. Нивото на АФП в кръвта на бременната силно се увеличава при отворени
дефекти на плода (най-вече при открити дефекти на невралната тръба се излива по-голямо
количество в амниотичната течност, което преминава в кръвта на бременната), при
чернодробни аномалии, при опасност от прекъсване на бременността, при близначна
бременнност.
Неконюгираният естриол (НЕ) се изработва от фетоплацентарния комплекс и прониква в
майчината циркулация, от където може да се определи концентрацията на неконюгираната
му форма.
Разработени са скринингови програми за съдържанието на тези маркери в кръвта на
бременната. Най-често в практиката се прилага „двоен” тест (за АФП и ХГТ), тъй като
изследването на НЕ изисква радиоактивно белязане и допринася за увеличаване на
информативността само с 3-4%. Тъй като абсолютните стойности на биохимичния маркер
зависят от използваните тест системи, общоприето обозначение за отклоненията е
средната стойност за даден набор в определен срок на бременността. т. е. стойността
кратна на средната – Моm (multiples of median). Например АФП 2,5 Моm означава, че
съдържанието на АФП е 2,5 пъти по-високо от средното за този срок на бременността. На
таблица 34.2 са показанени отклоненията серумните маркери при различни патологични
състояния.

Таблица 34.2 Отклоненията на серумните маркери при различни патологични състояния.

Повишен риск за: AFP UE3 HCG

11
 Синдром на Даун ↓ ↓ ↑

Синдром на ↓ ↓ ↓
Едуардс

Дефекти на ↑ Не се използва Не се използва

невралната тръба

Интерпретация на резултатите от БХС. За да илюстрираме тълкуването на резултатите

от БХС ще разгледаме следния пример:
Пример: В популация от 10 000 бременни с популационна честота на синдрома на Даун –
1,2‰ се очакват 12 новородени със синдрома на Даун. Ако БХС е с 15 % фалшиво
отрицателни резултати, то 2 от 12.-те случая ще бъде фалшиво отрицателни (т.е. при нисък
риск отчетен след биохимичния скрининг ще се роди болно дете със синдром на Даун).
При БХС с 4% фалшиво положителни резултати 400 жени ще имат повишен риск след
БХС (но ще има нормален фетален кариотип) (Табл. 34.3).

Таблица 34.3 Интерпретация на резултатите от БХС

Фетуси с Фетуси с Общо

синдром нормален
на Даун кариотип

Повишен 10 400 410

риск

Нисък риск 2 9588 9590

Общо 12 9988 10 000

• Чуствителността на метода (откриваемост) е 10/12 или ~ 85%

• 15% ще от случаите на тризомия 21 ще бъдат пропуснати
• Positive predictive value (позитивна прогнозна стойност): 10/410 (2,4%) или 97,6% от
бременните с висок риск ще имат бебе без Т21
• Negative predictive value (отрицателна прогнозна стойност): 9588/9590 (99,98% от
бременните с нисък риск ще имат бебе без Т21)
NB! Всяка лаборатория трябва да има определени откриваемост и фалшиво отрицателни
резултати.

12
Прилагат се две стратегии за биохимичен скрининг на бременни: интегриран биохимичен
скрининг и последователен биохимичен скрининг.
Интегриран БХС. При този вариант всички бременни се изследват с ранен БХС и след
това с скъсен БХС. Оценка на риска се прави след второто изследване. Предимства на
метода са висока откриваемост и нисък процент на фалшиво-положителни резултати.
Недостатъците са късно получаване на резултата и висока цена.
Последователен БХС. Първоначално се изследват всички бременни с ранен БХС. Прави
се оценка на риска, въз основа на който бременните се разделят на три групи: 1) с нисък
риск < 1:1000 (88% от всички изследвани) - не се провежда допълнителен късен БХС; 2) с
междинен риск 1:100-1:1000 (10% от всички изследвани) - провежда се допълнителен
късен БХС + фетална морфология и 3) с висок риск > 1:100 (2% от всички изследвани) -
избор на хорионбиопсия или амниоцентеза.
Най-висока откриваемост при най-нисък процент фалшиво положителни резултати се
постигат от интегрирания модел (Табл. 34.4)

Таблица 34.4 Сравнение на различни подходи за биохимичен скрининг

Г.с. Вид показатели Фалшивo- Откриваемост

скрининг положителни
резултати
(%)

11-14 комбиниран NT, Fβ-hCG, 5 80

PAPP-A

15-20 двоен AFP, Fβ-hCG 5 71

троен AFP, Fβ-hCG, 5 77

uE3

Интегриран NT, PAPP-A 1,2 93

+
AFP, Fβ-hCG,

34.4. Инвазивни методи за ПНД

34.4.1. Техники за взимане на материали за ПНД
Под инвазивни методи се разбират вътрематочните интервенции под ултразвуков контрол
при стерилни условия с цел получаване материал от плода за хистологични, биохимични,
цитогенетични или молекулярно-генетични изследвания. Най-често прилаганата

13
инвазивна пренатална техника е късната амниоцентеза, следвана от хорионбиопсията, а
много-рядко се използва кордоцентезата. Историческа стойност имат феталната биопсия и
фетоскопията (Табл. 34.5).

Таблица 34.5 Инвазивни техники за взимане на материал за ПНД

Техника Срок за Риск за Приложение

провеждане прекъсване на
бременността
Амниоцентеза Ранна – 10-16 г.с. 0,5-1% Широко прилагана техника
Късна – 15 – 18
г.с.
Хорионбиопси 10-12 г.с. 1–2% Ограничено приложение -
я изисква специализирани
умения
Кордоцентеза 20-24 г.с. 1-3% Ограничено приложение -
изисква специализирани
умения
Фетална II триместър 3% Ограничена употреба –
биопсия високоспециализиран а
техника

Амниоцентеза се извършва в 15-18 г.с. Обикновено се аспирират около 20 мл амниотична

течност като първите няколко милилитра се отстраняват, за да се намали риска от майчина
контаминация. Пробата се транспортира на стайна температура като трябва да се избягват
температурните амплитуди. При невъзможност за транспорт амниотичната течност може
да се съхрани на 4○С в хладилник до другия ден. Средно за около 14 дни има достатъчно
размножени клетки за хромозомен, ДНК или биохимичен анализ. Наличието на кръв в
пробата забавя култивирането на амниоцитите, тъй като пречи на адхезията им към
стените на съда за култивиране. Присъствието на съсирена кръв води до лоши резултaти
поради ангажирането на амниоцитите в съсирека. Ранната амниоцентеза се провежда в 14-
16 г.с. като се взема по-малко течност и времето за култивиране се удължава с 2-3 дни.
Хорионбиопсията се провежда обикновено между 10 и 12 г.с. Под ултразвуков контрол
трансвагинално или трансабдоминално се аспирират 5-10 мг въси от външния
трофобластен слой като не се нарушава целостта на амниотичната кухина. Диагностиката
е сравнително бърза – възможно е резултатите да са готови за 1-3 дни (богат източник на
ДНК). Недостатък на метода е по-висок риск от аборт (2-3%) и аномалии на крайниците
при биопсия преди 9 г.с.
Кордоцентеза. Осъществява се пункция на пъпната връв на плода под ултразвуков
контрол и аспирация на фетална кръв. Обикновено се използва при случаи на Rhesus –
изоимунизация, за бърз анализ на кариотипа на плода и изясняване на мозаични състояния.

14
Фетална биопсия. Индикации за биопсия на кожата на плода има при определени кожни
заболявания, за биопсия на феталния черен дроб при орнитинтранскарбамилазен дефицит.
Трябва да се отбележи, че ДНК-анализът на хорионни въси или амниоцити измести
нуждата от фетални биопсии.
Фетоскопия. Само в исторически план се отбелязва възможността за провеждане на
фетоскопия, която в наши дни е изцяло заместена от съвременните ехографски апарати с
3D и 4D опции. Представлява визуализация на фетуса чрез ендоскопия с цел уточняване на
минимални аномалии, насочващи към определена диагноза, фетална биопсия за
диагностициране на някои наследствени заболявания като напр. епидермолизис булоза или
вродени грешки на обмяната с органоспецифична ензимна локализация.
34.4.2. Генетични методи за ПНД
34.4.2.1. Цитогенетична пренатална диагностика
В зависимост от срока на бременността могат да се използват клетки от амниоцити,
хорионни въси, плацента и лимфоцити от пъпната връв.
Анализ на клетки от амниотична течност.
Амниоцитите са няколко типа: 1) същински амниоцити (олющени от амниотичните
обвивки на плода); 2) епителни клетки и кожни фибробласти; 3) клетки от пикочния тракт
и 4) клетки от устната кухина и чревния тракт на плода.
Амниоцитите са с нисък митотичен индекс и изискват предварително култивиране. Те
растат като адхезират към стената на съда и образуват монослойни колонии. Всяка
колония произлиза от отделен амниоцит. Прилагат се два основни метода за култивиране -
flask метод и in situ метод.
Flask метод. Амниоцитите се сепарират от амниотичната течност чрез центрофугиране.
Клетъчния седимент се ресуспендира с хранителна среда и се разпределя най-малко в два
отделни съда за култивиране (flasks) с вентилиращи се капачки. Работи се в стерилни
боксове с II степен на безопасност. Културите се поставят в хоризонтално положение в
термостат на 37○С, с 95% влажност и 5% съдържание на СО 2. Фласките не се третират в
продължение на 5-7 дни, за да се даде възможност на амниоцитите да се захванат за
стената на съда. Средата се подменя при установяване под инвертен микроскоп на
разрастване на колонии – най-често на 6-тия – 7-мия ден. Обработката на фласките започва
при наличие на 5-6 добре оформени колонии с натрупване на клетки в митоза (кръгли
блестящи клетки) – най-често 9-ти – 10-ти ден. Отстранява се средата и се добавя
колцемид за блокиране на делителното време за около 2 часа. После следва обработка с
трипсинов разтвор за дезинтегриране на клетъчния монослой и получаване на суспензия от
амниоцити. Следващите стъпки в обработката с малки разлики повтарят протокола за
третиране на лимфоцитни култури. От оцветените препарати се анализират общо 25
метафази от различните култури.
Ин ситу метод. Амниоцитите се посяват върху специални покривни стъкла (ламели),
които се поставят в петриеви панички в термостат. Обработката започва, когато колониите
са субконфлуиращи и има достатъчно клетки в пролиферация. Добавя се колцемид за
около 2 часа, след което се отстранява средата и наливат 2 мл хипотоничен разтвор.
Следващата стъпка е префиксация с бавно администриране на пресен фиксатор за около 10
минути. Следва двукратна фиксация и изсушаване на ламелата. Ламелата се залепя върху
15
предметно стъкло с колониите нагоре и се оцветява. Анализът се извършва върху
метафазни пластинки от три културални петрита, като се анализират общо 10 колонии.
Получаване на метафазни хромозоми от хорионни въси.
Клетките от хорионните въси, които се използват за хромозомен анализ имат различен
произход. Цитотрофобластни клетки, които се диференцират през периода на
бластогенезата и мезенхимни клетки, които се диференцират във вътреклетъчната маса на
зародиша. Прилагат се два метода за получаване на метафазни хромозоми за
цитогенетично изследване – директен (без предварително култивиране) и индиректен
(изискващ култивиране).
Директен метод за обработка на хорионни въси. Директният метод се основава на
наличието на спонтанно делящи се клетки в цитотрофобластния слой на хорионните въси.
Качеството на препаратите не е добро в сравнение с хромозомите от дългосрочните
култури. Често са подходящи само за броен хромозомен анализ. Съществуват много
модификации на метода, предложен от Brambati и Simoni (1983), главните от които са две:
1) непосредствена фиксация на клетките и 2) фиксация след краткосрочно култивиране
(24-48 часа). Част от хорионните въси се инкубират за 3 часа с хранителна среда. Добавя се
колцемид за 1,5 час, с пипета се отстранява средата и се замества с 5 мл хипотоничен
разтвор, като се инкубира за 5-10 минути. Пробата се фиксира бавно чрез премахване на
хипотоничния разтвор и добавяне на пресен фиксатор. Фиксаторът се отстранява и въсите
се третират с 60% ЛОК. Внимателно се аспирира и се накапва върху нагрети около 40 ○С
предметни стъкла, като суспензията внимателно се разнася. Стъклото се оставя да изсъхне
и се оцветява. Анализират се по 11-20 пластинки.
Индиректен метод за получаване на метафазни пластинки от хорионни въси (с
предварително култивиране).
Прилагат се два главни подхода: 1) ензимна дисоциация и 2) механична мацерация
Ензимна дисоциация. Използват се два ензима - колагеназа и трипсин за дигестия на
пробата до клетъчна суспензия за последващо култивиране. Това допринася за по-бърз
клетъчен растеж. Хорионните въси се изплакват в PBS-разтвор и се инкубират в трипсинов
разтвор за 1-2 минути. Клетките се отделят с центрофугиране и се обработват с колагеназа.
Пробата се разклаща периодично за по-добро действие на ензима. След пълната
дисоциация на тъканта се добавя хранителна среда за спиране на ензимното действие.
Следват няколко центрофуги за проплакване на клетките с хранителна среда. Последният
клетъчен седимент се посява в най-малки два отделни съда за култивиране.
Механична мацерация. Хорионните въси се изчистват щателно от кръв, майчина децидуа и
други замърсявания и се нарязват със стерилен скалпел на много малки парченца. Добавя
се около 2 мл среда към раздробената тъкан, разпределя в стерилни фласки за инкубиране.
На следващия ден се добавят по 4 мл хранителна среда и се оставят в термостат за около 6-
7 дни. При достигане на около 75% конфлуентност на колониите, културите са готови за
обработка. Средата се отстранява и колониите се изплакват неколкократно с разтвор на
Версен. Следва няколкоминутна трипсинова обработка и контрол на дезинтеграцията на
клетъчния монослой под инвертен микроскоп. Добавя се хранителна среда и суспензията
се разпределя в петриеви панички, съдържащи ламели. След установяване на
задоволителен клетъче растеж, културите се обработват съгласно протокола за ин ситу
амниотични култури.
16
Получаване на метафазни хромозоми от лимфоцити от пъпна връв. Посявката,
култивирането и обработката на фетални лимфоцити не се отличават от техниката на
постнаталния цитогенетичен метод за хромозомен анализ на лимфоцити от периферна
кръв.
Проблеми на пренаталната хромозомна диагностика.
Основните проблеми на пренаталната хромозомна диагностика са: контаминация с
майчини клетки; псевдомозаицизъм и мозаицизъм; де ново възникващи структурни
преустройства; неидентифицируеми маркерни хромозоми.
Контаминация с майчини клетки. Материалът може да бъде контаминиран с клетки от
майчин произход. При продължително култивиране майчините клетки могат да
пролиферират и да доведат до диагностични грешки. Установяването на комбинация от
клетки с кариотип 46, ХХ и 46, ХУ от амниотична култура се среща с честота 1,5‰ на
1000. По- голямата част от тези случаи са резултат от контаминация с майчини клетки при
нормално развиващ се плод от мъжки пол и всъщност представляват псевдомозаицизъм.
Той е резултат от свръхрастеж на малки фрагменти майчина тъкан, пренесени с иглата от
амниоцентезата. Като се има предвид, че майчина контаминация може да се открие само
при плодовете от мъжки пол, реалната честота е около 3 ‰ на 1000. Много по-рядка
причина за установяване на mos 46, ХХ /46, ХУ в плода е синдрома на "изчезващия”
близнак. В този случай единият близнак се резорбира, но остават витални клетки от него,
които по-късно се намножават в клетъчната култура. Контаминация може да се избегне
при кратковременно култивиране или при приготвяне на препарати по директния метод.
Мозаицизъм. Мозаицизмът бива няколко вида: 1) конституционален (истински
мозаицизъм); 2) ограничен в плацентата; 3) псевдомозаицизъм
1) При истинският мозаицизъм се касае за наличие на две или повече клетъчни линии в
тъканите на плода поради постзиготна мутация. По-рядка причина за установяването на
мозаичен кариотип в плода е химеризъм. При химеризма две зиготи се сливат на много
ранен етап от развитието си и дават началото на един ембрион (тетрагаметна химера).
Фенотипният спектър на химеричните пациенти варира от нормални мъжки или женски
гениталии до двойствени гениталии. В последния случай е необходима генитопластика,
при което съществува риск от инфертилитет и гонадобластома, асоциирани с химеризма.
Няма увреждане на интелектуалното развитие.
2) Мозаицизъм, ограничен в плацентата – дискордантност на хромозомния набор в
клетките от зародишните обвивки и от самия ембрион (Фиг. 34.1). Ограниченият в
плацентата мозицизъм е източник на грешка в 1-2% от случаите.

17
Фиг. 34.1 Различни типове хромозомен мозаицизъм във фетоплацентарната единица

3) Честота на псевдомозаицизма е 0,6-1%. Различават се три типа псевдомозаицизъм:

 Ограничен до един участък от колонията
 Засягащ всички метафазни пластинки на една колония
 Засягащ няколко колонии в едно петри
Лабораторна оценка на мозаицизма.
• I ниво мозицизъм – единична клетка с хромозомна мутация. Обикновено не се
съобщава - псевдомозаицизъм
• II ниво - повече от една клетка с идентична мутация от една фласка или от
единична ин ситу култура в петри – най-вероятно псевдомозаицизъм (само в 1% от
случаите е истински фетален мозаицизъм)
• III ниво – две или повече клетки с идентична мутации от две или повече култури.
Най-вероятно се касае за истински мозаицизъм
Структурни хромозомни преустройства, възникващи де ново. В тези случаи само с
хромозомен анализ не е невъзможно да се изключат микроструктурни хромозомни
преустройства. Рискът за раждане на дете с някаква аномалия се оценява на около 10%.
Честота на де ново възникналите хромозомни преустройства се оценява на 0,06-0,2%.
Маркерни хромозоми. Свръхбройна маркерна хромозома с неизвестна природа може да
присъства в мозаична форма, в пълна форма, да има или да няма сателити, като може да
бъде с размер на акроцентрик от група G до група D. Препоръчва се изследване на
кариотипа на родителите за установяване на произхода на маркера и мозаичното състояние
(пълна или частична форма). За идентифициране на маркерната хромозома се използват
различни оцветителни техники (G, Q, NOR, DA/DAPI). Особено информативен е FISH –
анализът с използване на набор от специфични ДНК – сонди.

18
34.4.2.2. Молекулярно-цитогенетични методи за ПНД на хромозомни заболявания
FISH-техниката намира приложение и при пренаталната диагностика на хромозомните
болести и микроделеционни синдроми. Разработени са набори от ДНК сонди (Multivysion,
Aneuvysion), с които може да се направи бърз скрининг (до 2-3 дни) за най-честите
анеуплоидии. Макар и високо надежден, лесен за изпълнение и много информативен,
методът не се прилага често поради високата му цена. Алтернативен метод за скрининг на
анеуплоидии е бързият ДНК тест, основаващ се на анализ на STRs.
Cравнителната геномна хибридизация е молекулярно-цитогенетична техника за
детекция на небалансирани геномни промени. Важно е да се отбележи, че CGH не дава
информация за плоидността или локализацията на реаранжираните секвенции, отговорни
за промяната в броя копия. CGH методът е базиран на конкурентна хибридизация между
ДНК от изследваната проба (т.нар. тест ДНК) и ДНК от нормални клетки (референтна
ДНК), върху нормални метафазни хромозоми. CGH има няколко силни страни: позволява
анализ на целия геном за допълнителен или липсващ генетичен материал в единичен
експеримент; не изисква метафази от пациента и може да бъде проведен при наличие на
малък брой високопречистени клетки.
34.4.2.3. Молекулярно-генетични методи за ПНД на хромозомни болести
QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction – количествена
флуоресцентна полимеразна верижна реакция). QF-PCR включва амплификация на
микросателитни ДНК – секвенции, състоящи се от тандемни повтори, известни като STRs
(Short Tandem Repeats – къси тандемни повтори). STRs представляват ди-, три- или
тетрануклеотиди, повторени вариабилен брой пъти при различните индивиди. Използват
се флуоресцентни праймери и автоматичен ДНК - секвенатор, което позволява
визуализация и количествено определяне на PCR – продуктите като пикове на
амплификация. Напр. при амплифицирана референтна ДНК от хетерозиготен индивид
(имащ два алела с различна дължина) ще се визуализират 2 пика в едно поле; при тризомия
ще е налице допълнителен пик или единият от двата ще е двойно по-голям, при монозомия
ще се появи само един пик (Фиг. 34.2).

Фиг. 34.2 QF-PCR анализ

19
34.4.2.4. Молекулярно-генетични методи за ПНД на моногенни болести
Петдесет години след провеждането на първата пренатална ДНК-диагностика (за
сърповидноклетъчна анемия) от Kan и Dozy ДНК-базираната диагностика на моногенните
болести е широко разпространена. Благодарение на приложението на PCR-реакцията ПД
на моногенните болести стана бърза, евтина и високо чувствителна. На ПД подлежат
моногенните болести, водещи до тежка, често смъртоносна патология, по отношение на
които засега липсват или са все още малко достъпни методите за лекарствена терапия
(Табл. 34.6).

Таблица 34.6 Някои сравнително чести болести, за които е възможна ПД

Болест Честота Унаследяване Ген Мутации

Муковисцидоза 1/2000 АР CFTR много (70% D

(Европа) F508)

Сърповидноклетъчна До над 3% АР ß-globin Единична

анемия (ендемично) точкова мутация

Вродена надбъбречна 1/15000 АР 21- много

хиперплазия hydroxylase

Мускулна дистрофия 1/3000 мъже ХР dystrophin много (2/3

тип Дюшен делеции)

Синдром на 1/1200 мъже ХР FMR1 Амплификации

чупливата Х на
хромозома тринуклеотиден
повтор

Миотонична 1/8500 АД DM Амплификации

дистрофия на на на
Steinert тринуклеотиден
повтор

Фамилна амилоид- До над 3% АД TTR Единична

полиневропатия тип I (ендемично) точкова мутация

Ефективността на ДНК диагностиката в значителна степен се предопределя от спазването

на следните основни правила: точна клинична диагноза на пробанда, своевременно
изследване с молекулярни методи на болния и на семейството с висок риск, правилна

20
оценка на риска за раждане на болно дете, избор на оптималния срок за ПД, получаване на
материал от плода за ПД на генните болести.
Tочна клинична диагноза на пробанда. Липсата на точна клинична диагноза на
моногенно заболяване на практика прави невъзможно прилагането на молекулярни
методи. В диагностично отношение проблем могат да представляват клинични фенотипи
със значителна генетична хетерогенност, което може да доведе до изследване на погрешен
ген.
Правилна оценка на риска за раждане на болно дете
По правило, за да бъде оправдана една ПД, рискът от нея трябва да е по-малък от риска за
раждане на болно дете. Правилната клинична диагноза предполага и правилна оценка на
риска за раждане на болно дете. Известно е, че при автозомно-рецесивни заболявания той
е 25%, за автозомно-доминантни – 50%, за полово скачени болести – 50% при момчетата и
почти 0% при момичетата. Проблем представляват болестите с отклонения от типичния
менделов тип на унаследяване (митохондриално унаследяване, динамични мутации,
мозаицизъм и др.).
Избор на оптимален срок за ПД. ПД може да се проведе във всеки един етап от
развитието – от стадий зигота или от полярно телце. За оптимален срок се счита първия
триместър на бременността.
Получаване на материал за молекулярна ПД. Изследването е възможно върху всякакви
клетки от плода, получени със стандартните инвазивни техники, описани по горе.
Ясни препоръки след ПД. Резултатът от ДНК диагностицирането може да бъде
потвърждаване или отхвърляне на диагнозата. При всички случай в най-къс срок жената
(семейството) трябва да се осведоми за диагностичните резултати и съответно за степента
на риска за раждане на болно дете, на хетерозиготен носител или на здраво дете.
Окончателното решение за запазване или прекъсване на бременността винаги се взима от
пациентката. При решение за прекъсване на бременността настоятелно се препоръчва
потвърждаване на диагнозата чрез молекулярни или други подходящи методи.
Съществуват два основни подхода за ПД – пряка (директен анализ на мутацията)
диагностика, основана на непосредственото идентифициране на мутации в даден ген, и
косвена диагностика, в основата на която лежи изследването на полиморфни ДНК
маркери, скачени с мутацията (Табл. 34.7).

Таблица 34.7 Възможни са два различни типа анализ за ДНК диагноза

Директен анализ Индиректен анализ

Предварителни Клониран ген Точна диагноза

условия: Известна мутация Картиран ген
Известни скачени
маркери
ДНК от индексен

21
 пациент

Предимства: 100% точност Приложим за широк

спектър болести
Бърз
Не е необходима ДНК от
индексен пациент

Недостатъци: Генът трябва да е секвениран Точност< 100%

Техники: Southern blot (делеции, Southern blot (RFLP);

дупликации, експанзия на
тринуклеотидни повтори);

PCR (точкови мутации, делеции, PCR (микросателитен

експанзия на тринуклеотидни RFLP).
повтори).

В основата на директната диагностика лежи идентифицирането на мутации в самия ген.

Преимуществата на метода са високата (почти 100%) точност на диагностиката и
възможността за анализ на информативността при семействата и за откриване на
хетерозиготни носители, когато няма болно дете.
При индиректния ДНК анализ като маркери обикновено се използват участъци от
хомоложни хромозоми, различаващи се по първична структура. Тези диагностични
полиморфни места са или вътре в гена, или в непосредствена близост до него. В най-
простия вариант това е замяна на един нуклеотид, която прави ДНК фрагмента по-
устойчив или обратно, чувствителен към определена рестриктаза (ендонуклеаза),
разпознаваща и разрязваща ДНК молекулата в строго определна последователност от 4 и
повече нуклеотиди. Наличието или отсъствието на рестрикционно място в тъждествени
локуси на хомоложни хромозоми позволява достатъчно надежно да се маркират
мутантният и нормалният ген и да се проследи предаването в потомството. Друг тип ДНК
полиморфизъм са късите тандемни ди-, три-, тетра- и повече повтори, също разположени
във или близко до гена, дължината на които варира в различните хомоложни хромозоми. В
първият вариант тъждествените гени (хомоложни хромозоми) се различават по наличие
или отсъствие на места за рестрикция, а в другия – по дължината на тандемните повтори.
И в двата случая мутантните и нормалните алели се маркират с помощта на тези
полиморфизми. Важно е хомоложните локуси при един и същ индивид да носят различни
молекулни маркери, т.е. индивидът да е хетерозиготен по анализирания маркер. Именно
хетерозиготността по молекулните полиморфизми определя информативността на едно
или друго семейство с висок риск за раждане на дете с генна патология. Единичните
нуклеотидни замени, т.е. полиморфизъм от тип I, се характеризира с ниска
хетерозиготност, която не превишава 50%. Информативността на количествените
полиморфизми (тип II) е значително по-висока и може да достигне 80-90% и повече. В
зависимост от разпределението на маркерните алели върху хомоложните хромозоми на

22
болния и на неговите родители семейството може да бъде напълно информативно,
частично информативно или неинформативно за ДНК диагностика.
Прецизност на молекулярната диагностика, възможни източници на грешки
В ПД с молекулярни методи е важно да се отчитат два основни източника на грешки:
контаминация на пробата от плода с майчини клетки и възможност за кросинговър при
използване на косвен метод.
Достоверността на молекуларната диагностика по директния метод, т.е. посредством
идентифициране на мутация в самия ген е много висока и се приближава до абсолютната -
99,9%. Оценката на резултатите от молекулярната диагностика по косвен метод е
значително по-сложна. При отчитане на вътрегенните полиморфизми точността на
косвената диагностика е достатъчно висока, тъй като честотата на вътрегенния
кросинговър обикновено не превишава 0,1% за повечето известни гени. Правят
изключение само големите гени на дистрофина, хемофилия А, неврофиброматозата и още
някои. При дистрофина грешката може да достигне 2%, което съответства на висока
честота на вътрегенен кросинговър (около 2%) в този огромен ген (2,2 милиона н.к.).
Важно е да се отчита степента на родство между болния и пробанда, на когото се прави
ПД. Стойността на възможната грешка нараства, ако маркираният алел се определя не при
сибса на плода, а при други негови роднини. Особено внимателно трябва да се оценяват
резултатите от косвената диагностика с използването на извънгенни полиморфни локуси.
В тези случай може да се провежда само при едновременно анализиране на няколко
полиморфни гена, фланкиращи мутантния ген. За молекулярната диагностика се използват
маркери, при които честотата на рекомбинация с мутантните алели на гена не надвишава
десети или стотни от процента.
С рутинно използваните методи като FISH, QF-PCR, MLPA (multiplex ligation-dependent
probe amplification–множествено лигиращо- зависима амплификация на пробите) или
класическата цитогенетика, не могат да се открият промени в генома и причините за
аномалиите остават с неясна етиология. Това би могло да се дължи на микроструктурни
аберации, които се пропускат от по-горе изброените методи. Чрез микрочипов ДНК-анализ
биха могли да се идентифицират микроструктурни изменения и да се докаже генетична
причина при случаи с нормална находка от другите изследвания.
34.4.2.5. ПНД чрез молекулно кариотипиране
Array CGH може да се извърши върху ДНК, изолирана от единични клетки, клетки от
хорионни въси или амниоцити. Молекулното кариотипиране е бърз и високорезолютивен
подход за диагностициране на голям брой генетични синдроми, свързани със количествени
промени в генома. Този метод може да се прилага в клиниката и дава надеждни резултати
за кратко време (около 5 дни), което го прави отлична алтернатива за пренатална
генетична диагноза. Освен с ДНК, изолирана от амниоцити, микрочипов ДНК-анализ може
да се проведе и с извънклетъчна ДНК, която се намира в супернатанта след
центрофугиране на амниотичната течност и има достатъчна информативност. Изолирана
от 10 мл. амниотична течност извънклетъчна ДНК е достатъчна за анализ на хромозомни
дисбаланси и може да добави допълнителна молекулна информация към рутинното
пренатално кариотипиране.

23
34.4.2.6. Нови техники за пренатална диагостика
Изолиране на фетални клетки от майчината кръв. Малко на брой фетални клетки
попадат в майчиното кръвообращение (еритробласти, трофобласти, лимфоцити и др.).
Тези клетки могат да се използват за провеждане на диагностични анализи. Това е една от
най-обещаващите техники безопасна, неинвазивна и достатъчно евтина. Недостатъци на
метода са трудности при идентифицирането и изолирането на феталните клетки в кръвта
на бременната, не са подходящи за цитогенетичен анализ.

24