‫‪‬‬ ‫تصفیه تیروزیناز از قارچ خوراکی‬

‫‪‬‬ ‫خالصه‬

‫‪‬‬ ‫عصاره همگن قارچ بود ابتدا توسط سولفات آمونیوم اشباع شد‪ .‬رسوب مورد ‪ ).‬دوسپورا ‪ ( Agaricus‬یک روش آماده سازی ساده برای خالص سازی توسعه داده شد تیروزیناز از قارچ خوراکی‬

‫و برای تولید رسوب بدون مالنین شسته شد‪ .‬محلول پروتئین به دست آمده دیالیز شد در برابر آب جاری به مدت ‪ 4‬ساعت‪ ،‬سپس بر )‪ (DE-52‬مخلوط شد ‪ DEAE-Cellulose‬نظر به طور کامل با‬

‫تغلیظ و کروماتوگرافی شد ‪ .‬بر اساس سنجش فعالیت‪ ،‬فراکسیون شسته شده توسط ‪ 150‬میلی موالر محلول نمک برای خالص سازی بیشتر انتخاب شد‪ .‬را فراکسیون های جمع ‪ DE-52‬روی ستون‬

‫تیروزیناز خالص تولید شده یک باند درست در کنار نمونه تجاری به دست )‪ (PAGE‬الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید ‪ Sephadex G-200.‬آوری شده ادغام و کروماتوگرافی شدند روی یک ستون‬

‫آمده از شرکت سیگما ‪ 128‬کیلو دالتون ‪ .‬را شکل لیوفیلیزه شده از تیروزیناز خالص دارای یک تصفیه بود درجه ‪ 104‬و کرزوالز قوی را نشان داد و فعالیت های کاتکوالز در مقایسه با فعالیت های‬

‫_ تجاری تیروزیناز موجود‬

‫‪‬‬ ‫معرفی‬

‫‪‬‬ ‫عالوه بر این‪ ،‬با وجود پیشرفت چشمگیر در شیمی‪ ،‬هنوز معرف کارآمدی برای سنتز برخی از مواد ‪ ( Dordick , 1991).‬تقاضای فزاینده ای برای آنزیم های مختلف در صنایع مدرن وجود دارد‬
‫شیمیایی وجود ندارد‪ .‬ارتو ‪-‬هیدروکسیالسیون ترکیبات فنلی نمونه خوبی از چنین واکنش هایی است (اسمیت و مارس‪ .)2001 ،‬این واکنش به راحتی و به طور مکرر در تقریبا همه موجودات اتفاق‬
‫کومسترول ‪ ،‬اسیدهای پلی فنولیک و تانن ها می شود‪ .‬و همکاران ‪ .)2003 ،‬با این حال‪ ،‬شیمی ‪ L-dopa،‬می افتد و منجر به تشکیل مواد بیوشیمیایی مهم مانند انتقال دهنده های عصبی خانواده‬
‫‪ (EC.1.14.‬نتوانسته است یک معرف مناسب برای این واکنش به ظاهر ساده معرفی کند‪ .‬در نتیجه‪ ،‬دانشمندان به تغییر شکل زیستی توجه کرده اند‪ .‬اکسپت تیروزین هیدروکسیالز ‪ ،‬تیروزیناز‬
‫بنابراین‪ ،‬تالش زیادی برای استفاده از این آنزیم در تبدیل ‪ ( Kazandjian and Kilbanov , 1985).‬تنها آنزیم شناخته شده ای است که این واکنش را بدون زحمت و کارآمد انجام می دهد )‪18.1‬‬
‫‪ (Casella et al ., 2004).‬زیستی ترکیبات فنلی مورد نظر به مواد ارتو دی هیدروکسی متناظر آنها در محیط های آبی و غیرآبی انجام شده است‬

‫‪‬‬ ‫تیروزیناز (همچنین به نام مونوفنول مونواکسیژناز ؛ پلی فنل اکسیداز ؛ کاتکول اکسیداز ؛ اکسیدوردوکتاز اکسیژن ) یک آنزیم مسی است که مسئول تشکیل رنگدانه های پوست‪ ،‬مو و چشم است‬
‫این دو واکنش متوالی به نام کرزوالز و کاتکوالز را انجام می دهد که در شکل ‪ 1‬نشان داده شده است‪ .‬تیروزیناز در سراسر درخت فیلوژنیک یافت می ‪( Pasi and Nazzaro-Porro , 1981).‬‬
‫شود و از منابع مختلف مانند قارچ ها‪ ،‬میوه ها و تومورهای مالنوم پستانداران استخراج شده است‪ .‬با این حال‪ ،‬قارچ خوراکی به عنوان یک منبع تمیز‪ ،‬غنی شده و ارزان این آنزیم در نظر گرفته می‬
‫نزدیک به سطح اسکلت پروتئین است‪ .‬از این رو‪ ،‬برای بسترهای کوچک و بزرگ قابل دسترسی است ( مارومو و ویت‪ .)1986 ،‬گزارش های قابل توجهی )‪ (MT‬شود‪ .‬محل فعال تیروزیناز قارچ‬
‫مانند ‪، MT‬وجود دارد که نشان دهنده پتانسیل باالی این آنزیم برای صنایع غذایی‪ ،‬دارویی و کشاورزی و همچنین اهداف تحلیلی و زیست محیطی است ‪ .‬و همکاران ‪ .)2003 ،‬عالوه بر این‬
‫را به ابزاری ‪ MT‬تیروزیناز پستانداران دارای ساختار تترامری است و می تواند برای اهداف بالینی استفاده شود ( گلدر و همکاران ‪ 1376 ،‬و بهاراو و همکاران ‪ .)1996 ،‬همه این ویژگی ها‬
‫ایجاد کنیم‪ ( Agaricus) .‬مناسب برای بیوتکنولوژی امروزی تبدیل کرده است‪ .‬برای این منظور‪ ،‬تصمیم گرفتیم روش ساده ای را برای (شکل ‪ )2‬خالص سازی این آنزیم از قارچ خوراکی تازه‬
‫‪ ).‬دوسپورا‬

‫‪‬‬ ‫مواد و روش ها‬

‫‪‬‬ ‫)‪ (DE-52‬از داروخانه خریداری شد و دی اتیل آمینو اتیل سلولز ‪ G- 200‬و ‪). Sephadex G-50‬ایاالت متحده آمریکا( ‪ Sigma Chemical Co.‬و آلبومین سرم گاوی از آن خریداری شد ‪MT‬‬

‫و ‪-4([-4‬متیل بنزو) آزو ]‪ ( MePAPh ) -2 ،1-‬بدست آمد‪ -4([-4 .‬متیل فنیل ) آزو ]‪-‬فنل ™‪ Merck‬از )‪ (PMSF‬فنیل متیل سولفونیل فلوراید ‪).‬میدستون ‪ ،‬انگلستان ( ™ ‪ Whatman‬از‬

‫قارچ خوراکی تازه از بازار خرید و منجمد ‪ ( Haghbeen and Tan, 1998).‬در شکل ‪ 1‬اختصاص داده شد‪ ،‬به عنوان تهیه شد قبًال شرح داده شد "‪ "II‬و "‪ "I‬به عنوان ‪ ( MeBACat )،‬بنزندیول‬

‫شد در ‪ 20-‬درجه سانتی گراد همه مواد شیمیایی و معرف های دیگر‪ ،‬مورد نیاز برای الکتروفورز و آماده سازی بافر‪ ،‬گرفته شد از نمونه های معتبر آب دوبار تقطیر برای تهیه محلول های مورد‬

‫‪.‬نظر استفاده شد‬

‫‪‬‬ ‫‪ MT‬سنجش فعالیت های‬

‫‪‬‬ ‫با عرض ‪ 1‬سانتی‌متر را ‪ UV-Vis‬و دمای ثابت ‪ 20±0.1‬درجه سانتی گراد اجرا شد ‪ .‬حجم نهایی تمام مخلوط‌های واکنش ‪ 3‬میلی‌لیتر بود که سه چهارم کووت معمولی ‪ pH 6.8‬میلی موالر ) در‬
‫همانطور که ‪ MT‬سرعت واکنش آنزیمی ‪ Beckman (DU Series 70)،‬تازه آماده شده برای هر دو فعالیت کرزوالز و کاتکوالز استفاده شد ‪ .‬با استفاده از یک اسپکتروفتومتر ‪. MT‬پر می‌کرد‬

‫( ‪ MeBACat‬و )نانومتر ‪ MePAPh ( λmax = 352‬بنابراین‪ ،‬فعالیت‌های کرزوالز و کاتکوالز به ترتیب از طریق کاهش ‪ ( Haghbeen and Tan, 2003).‬قبًال توضیح داده شد بررسی شد‬

‫‪.‬مورد سنجش قرار گرفت‪ .‬نتایج ارائه شده در این مقاله‪ ،‬میانگین اندازه‌گیری‌های حداقل سه‌گانه است )نانومتر ‪λmax = 364‬‬

‫‪‬‬ ‫استخراج پروتئین‬

‫‪‬‬ ‫همگن شد‪ .‬سوسپانسیون به مدت ‪ 30‬دقیقه در دمای اتاق هم زده شد و از طریق ‪ PMSF‬حاوی ‪ 1‬میلی‌موالر )‪ ، pH 8/5‬میلی‌موالر ‪ Tris-HCl (50‬گرم از قارچ منجمد در ‪ 300‬میلی‌لیتر بافر ‪250‬‬
‫‪.‬به مدت ‪ 30‬دقیقه در دمای ‪ 4‬درجه سانتیگراد با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ شد ‪×g‬یک توری پنبه ای فیلتر شد‪ .‬فیلتر در ‪13500‬‬
‫‪‬‬ ‫‪.‬مایع رویی حاصل جدا شد و در معرض رسوب سولفات آمونیوم قرار گرفت ‪ J-21.‬سانتریفیوژ بکمن مدل‬

‫‪‬‬ ‫رسوب سولفات آمونیوم‬

‫‪‬‬ ‫پودر سولفات آمونیوم به مایع رویی جمع آوری شده از مرحله قبلی اضافه شد تا محلول ‪ 35‬درصد اشباع شود‪ .‬محلول حاصل به مدت ‪ 30‬دقیقه در یک سطل یخ هم زده شد‪ ،‬سپس به مدت ‪ 30‬دقیقه‬
‫و دمای ‪ 4‬درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد‪ .‬سولفات آمونیوم به مایع رویی به‌دست‌آمده اضافه شد تا محلول ‪ 70‬درصد اشباع شود‪ .‬محلول به مدت ‪ 2‬ساعت روی یخ هم زده شد‪ ،‬سپس ‪×g‬در ‪1500‬‬
‫‪.‬حل شد )‪ ، pH 5.8‬میلی موالر ‪ Tris-HCl (50‬به مدت ‪ 30‬دقیقه در ‪ × 1500‬گرم و ‪ 4‬درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد‪ .‬مایع رویی دور ریخته شد و رسوب حاصل در‬

‫‪‬‬ ‫نمک زدایی و کروماتوگرافی‬

‫‪‬‬ ‫به عنوان )‪ ، pH 5.8‬میلی موالر ‪ Tris-HCl (50‬با استفاده از بافر )‪، Pharmacia‬سانتی متر ‪ G-50 (45×2.6‬به منظور نمک زدایی محلول پروتئینی به دست آمده از مرحله قبل‪ ،‬روی ستون‬

‫‪،‬نانومتر بررسی شد‪ .‬سپس ‪ λmax = 280‬فاز متحرک کروماتوگرافی شد‪ .‬خروجی ستون به روش اسپکتروفتومتری در‬
‫‪‬‬ ‫بررسی شدند ‪ .‬فراکسیون های با فعالیت باال ادغام شدند‪ .‬نمک زدایی نیز با ‪ MeBACat‬و ‪ MePAPh‬فراکسیون‌های جمع‌آوری‌شده به ترتیب از نظر فعالیت‌های کرزوالز و کاتکوالز در حضور‬
‫‪ .‬در دمای ‪ 4‬درجه سانتیگراد در طول شب انجام شد )‪ ، pH 6.8‬میلی موالر ‪ Tris-HCl (50‬دیالیز به دست آمد‪ .‬دیالیز بر روی بافر‬

‫‪‬‬ ‫کروماتوگرافی تبادل یونی‬

‫‪‬‬ ‫عبور داده شد‪ .‬سپس پروتئین ها با استفاده از )‪ ، pH 6.8‬میلی موالر ‪ Tris - HCl (50‬بارگذاری شد و توسط بافر )‪ (DE-52‬محلول پروتئین دیالیز شده از مرحله قبل بر روی ستون تبادل یونی‬
‫‪ .‬از ستون شسته شدند ‪ .‬فراکسیون های پروتئینی جمع آوری شده در شوینده نمکی ‪ 150‬میلی موالر ادغام و با لیوفیلیزاسیون تغلیظ شدند ‪ NaCl‬محلول‬

‫‪‬‬ ‫فیلتراسیون ژل‬

‫‪‬‬ ‫بارگذاری شد‪ .‬ستون با )‪ Pharmacia‬میلی متر ‪ Sephadex G-200 (10×100‬حل کرده و روی ستون ‪ PBS‬برای خالص سازی بیشتر نمونه لیوفیلیزه به دست آمده از مرحله قبل‪ ،‬آن را در‬
‫‪.‬و نتایج سنجش فعالیت مورد ارزیابی قرار گرفت ‪ PAGE‬شسته شد‪ .‬فراکسیون های بعدی جمع آوری و از نظر وجود پروتئین بررسی شدند‪ .‬کیفیت تیروزیناز خالص شده توسط ‪PBS‬‬

‫‪‬‬ ‫الکتروفورز و تعیین غلظت پروتئین‬

‫‪‬‬ ‫انجام شد (‪ .)1970‬بر این اساس‪ ،‬محلول پروتئین قرار گرفت به الکتروفورز در ‪ %10‬تفکیک و ‪ %4‬انباشته ‪ Laemmli‬به روش )‪ (PAGE‬الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید‬
‫‪‬‬ ‫پلی آکریل آمید در میدان الکتروفورتیک ثابت ‪ 200‬ولت‪ .‬نوارهای پروتئینی توسط‬
‫‪‬‬ ‫مشاهدات با رنگ آمیزی نیترات نقره دوبار بررسی شد ‪ Coomassi .‬آبی درخشان ‪ G250‬رنگ آمیزی با‬
‫‪‬‬ ‫‪.‬روش ‪ .‬غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد تعیین شد (برادفورد‪)1976 ،‬‬

‫‪‬‬ ‫نتایج‬
‫‪‬‬ ‫حذف مالنین ها‬
‫‪‬‬ ‫مالنین‌های همراه که معموًال در طول آماده‌سازی عصاره همگن ساخته می‌شوند‪ ،‬می‌توانند به طور گسترده از مخلوط پروتئین با استفاده از مواد تبادل یونی حذف شوند‪ .‬برای جزئیات بیشتر به بخش‬
‫‪.‬بحث مراجعه کنید‬

‫‪‬‬ ‫کروماتوگرافی تبادل یونی‬

‫‪‬‬ ‫فعالیت کاتکوالز و محتوای تیروزیناز باالیی را نشان دادند ‪ .‬این نتایج به ترتیب در شکل های ‪ 3‬و ‪ 4‬نشان داده شده ‪ DE-52‬فراکسیون های شسته شده با محلول نمک (‪ 150‬میلی موالر ) از ستون‬
‫‪.‬است‬

‫‪‬‬ ‫ژل کروماتوگرافی‬

‫‪‬‬ ‫خالص شده در این مرحله یک باند منفرد در کنار ‪. MT‬بارگذاری شدند ‪ Sephadex G-200‬بخش‌های جمع‌آوری‌شده مورد نظر از مرحله کروماتوگرافی تبادل یونی مخلوط‪ ،‬تغلیظ و روی ستون‬
‫‪ .‬نمونه تجاری در حدود ‪ 128‬کیلو دالتون تولید کرد‬

‫‪‬‬ ‫درجه افزایش فعالیت و تصفیه‬

‫‪‬‬ ‫پروتئین جمع آوری شده پس از حذف مالنین ها و نمک زدایی دارای فعالیت کاتکوالز ‪( 258/6‬نرخ در میلی لیتر) و درجه خالص سازی ‪ 6/6‬بود‪ .‬به طور مشابه‪ ،‬بخش‌های جمع‌آوری‌شده از مرحله‬
‫خالص جمع‌آوری‌شده از مرحله کروماتوگرافی ژل ‪ ،‬فعالیت‌های کاتکوالز به ترتیب ‪ ۲۷۶/۶‬و ‪ ۷۷/۸‬و درجه‌های خالص‌سازی ‪ ۲۹‬و ‪ ۱۰۴‬را نشان دادند‪ .‬نتایج ‪ MT‬کروماتوگرافی تبادل یونی و‬
‫‪.‬دقیق در جدول ‪ 1‬خالصه شده است‬

‫‪‬‬ ‫بحث‬
‫‪‬‬ ‫هیلی و ( وجود دارد که به طور مکرر در ادبیات ذکر شده است ‪ MT‬اگرچه روش های متعددی برای استخراج وجود دارد و تصفیه تیروزینازها از منابع مختلف‪ .‬تنها چند روش برای خالص سازی‬
‫تجاری ‪ MT‬این روش ها در کنار روشی که توسط سیگما برای تهیه ‪ et al. ، 2004).‬استروثکمپ ‪1981 ،‬؛ توسن و لرچ ‪1987 ،‬؛ کوگا و همکاران ‪1992 ،‬؛ اسپین ‪ .‬و همکاران ‪ ;1997 ،‬فنول‬
‫و روش توسعه یافته در این آزمایشگاه در شکل ‪ 2‬نشان داده شده است‪ .‬قارچ خوراکی حاوی مقدار قابل توجهی از ترکیبات فنلی مختلف است که عبارتند از‪ ( Haghbeen , 1998) :‬استفاده می شود‬
‫در طول فرآیند همگن شدن به راحتی اکسید می شود‪ .‬با اکسیداسیون و پلیمریزاسیون متوالی محتوای فنلی عصاره قارچ‪ ،‬ماکرومولکول‌های مالنین تشکیل می‌شوند‪ .‬جداسازی مالنین های ناخواسته‬
‫‪.‬است ‪ MT‬از محتوای پروتئین عصاره اولین یا احتماًال مهمترین کار در خالل تصفیه‬

‫‪‬‬ ‫همانطور که در شکل ‪ 2‬نشان داده شده است‪ ،‬نلسون و میسون روش (نلسون و میسون‪ )1970 ،‬با استون شروع می شود برای جمع آوری عصاره همگن شده بشویید مواد فنلی در حالل آلی در ابتدا‪.‬‬
‫اعمال می شود‪ .‬استفاده از ارگانیک حالل می تواند از تشکیل مالنین تا حد زیادی جلوگیری کند اما خطر دناتوره شدن پروتئین ها را ™‪ Sigma‬ترفند تقریبا مشابه‪ ،‬رسوب حالل‪ ،‬است در روش‬
‫‪.‬کروماتوگرافی برای جداسازی مالنین ها (داکورت و کلمن‪ (PO 4 ) 2 )1970 ،‬استفاده کرده بودند ‪ Ca3‬افزایش می دهد ‪ .‬به همین دلیل داک ورث و کلمن از‬

‫‪‬‬ ‫برای متوقف کردن تمام واکنش های شیمیایی ممکن‪ ،‬جولی و همکاران قارچ همگن در نیتروژن مایع داشت ( جولی و همکاران ‪ .)1974 ،‬سپس همه را رسوب داده بودند محتوای پروتئین عصاره‬
‫توسط یک سدیم اشباع محلول بنزوات‪ -‬سولفات آمونیوم‪ .‬این روش است همچنین از دو اشکال آشکار رنج می برد‪ .‬اول‪ ،‬آنها قارچ همگن در نیتروژن مایع در دمای بسیار پایین تحت این شرایط‪،‬‬
‫فنلی ترکیبات ممکن است در محیط مایع حل نشوند و روی سطح پروتئین و بقایای سلولی جذب می شوند‪ .‬دوم‪ ،‬پس از انجام مرحله همگن سازی در نیتروژن مایع‪ ،‬خمیر به دست آمده باید به محیط‬
‫آبی منتقل شود‪ ،‬که ناگزیر باعث تحریک می شود‪ .‬تشکیل مالنین‬

‫‪‬‬ ‫دو راه حل دیگر معرفی شده است در کارهای اخیرتر در اثر اول‪ ،‬نونز‪ -‬نونز‪ -‬دلیکادو و همکاران (‪ )1996‬پروتئین های آبگریز و ‪ MT،‬برای مقابله با مشکل تشکیل مالنین در طول تصفیه‬
‫و همکاران (‪ )1997‬الف را اعمال کرده اند دیافیلتراسیون در برابر ‪، Rescigno‬به سیستم میسلی استخراج کنید‪ .‬که در اثر دوم ‪ Triton X-114‬محتوای فنلی را به دام انداخته اند با استفاده از‬
‫محلول اسید اسکوربیک‪ .‬وجود اسید اسکوربیک از اکسیداسیون فنل ها جلوگیری می کند با نگه داشتن آنها به شکل کاهش یافته در طول مرحله استخراج تا حذف کامل آنها‪ .‬این راه حل ها معایب‬
‫خاص خود را دارند‪ .‬را روش قبلی نیاز به تشکیل و به دام انداختن میسل دارد ترکیبات فنلی و پروتئین های آبگریز موجود در آن‪ ،‬که به خودی خود دست و پا گیر است‪ .‬در دیافیلتراسیون روش‪،‬‬
‫‪.‬مقدار زیادی اسید اسکوربیک یا دیگری باید از عامل کاهنده استفاده شود که این روش را گران تر می کند‬

‫‪‬‬ ‫اما آزمایشات در این آزمایشگاه نشان داد که اینطور است خالص شدن از شر هر دو آالینده فنلی و مالنین امکان پذیر است در مرحله کروماتوگرافی تبادل یونی این روش با همگن کردن مواد‬
‫در دمای ‪ 4‬درجه سانتیگراد‪ .‬بنابراین‪ ،‬بدون ارگانیک در این مرحله از حالل استفاده شد‪ .‬با این حال‪ ،‬انجام این مرحله در دمای سرد و به همان سرعت ضروری ‪ PBS‬خوراکی آغاز شد قارچ در‬
‫بود تا جایی که ممکن است‪ .‬پس از حذف بقایای سلولی‪ ،‬محتوای پروتئین عصاره همگن شده رسوب داده شد ‪ %35‬و ‪ %70‬نقطه اشباع سولفات آمونیوم‪ .‬پروتئین های سنگین جمع آوری شده بسیار‬
‫‪.‬ضعیف نشان دادند فعالیت کاتکوالز و کنار گذاشته شدند‬

‫‪‬‬ ‫کاهش محتوای نمک یک پروتئین ضروری است مخلوط را قبل از بارگذاری روی یک تبادل یونی ستون بنابراین‪ ،‬پروتئین های جمع آوری شده تا ‪ ٪70‬اشباع شده است سولفات آمونیوم بر روی‬
‫با انجام این کار‪ ،‬نه تنها آمونیوم سولفات با بافر جایگزین شد‪ ،‬اما مقدار زیادی از ترکیبات فنلی نیز شسته شد‪ .‬عالوه بر این‪ ،‬اجزای پروتئین ‪ Sephadex G-50.‬یک کروماتوگرافی انجام شد ستون‬
‫‪.‬در طول شستشو تکه تکه شدند‪ .‬با این حال‪ ،‬این مرحله می تواند جایگزین شود دیالیز کردن مخلوط پروتئین در برابر آب جاری یا بافر اگر تفکیک الزم نیست‬

‫‪‬‬ ‫همانطور که قبًال در این مقاله ذکر شد‪ ،‬امکان حذف هر دو فنولیک وجود ‪ DE-52.‬شکل ‪ 3‬و ‪ 4‬نتایج تبادل یون را نشان می دهد کروماتوگرافی پروتئین جمع آوری شده مخلوط بر روی یک ستون‬
‫بارگذاری می ‪ DE-52‬وقتی مخلوط پروتئین و مالنین بر روی ستون ‪ DE-52.‬دارد و ناخالصی مالنین از مخلوط پروتئین در این مرحله در واقع‪ ،‬مالنین ها بسیار باال نشان می دهند تمایل به پلیمر‬
‫می چسبد‪ .‬لذا پیشنهاد می گردد برای ‪ DE-52‬شسته می شود فقط پروتئینی که آزاد می شود‪ .‬به عبارت دیگر‪ ،‬مالنین محکم به ‪ NaCl‬شود و این است که به طور متوالی توسط محلول مولی‬
‫و آزادسازی پروتئین ها و دوباره دیالیز ‪ DE-52‬مربع چین در شکل ‪ ،2‬با یک مرحله سه مرحله ای‪ .‬دیالیز‪ ،‬مخلوط شدن با ‪ a‬نشان داده شده در ‪ Sephadex G-50،‬جایگزینی مرحله‬

‫‪‬‬ ‫روش های روزنبلوم (‪ )1972‬شامل کاربرد است کروماتوگرافی هیدروکسیالپاتیت مشخص است که هیدروکسیل آپاتیت یک جاذب پروتئین ‪ Moss and‬و )‪ Jolly et al ., (1974‬مرحله نهایی در‬
‫یک مخلوط است از چهار ایزوآنزیم و همه آنها قادر به انجام هر دو واکنش کرزوالز و کاتکوالز ‪ .‬بنابراین نیازی ‪ . MT‬قوی است که می باشد معموًال برای جداسازی ایزوآنزیم ها استفاده می شود‬
‫به جای هیدروکسیل آپاتیت در مرحله ‪ Sephadex G-200‬استفاده از ‪ MT،‬به کاهش بازده نهایی نیست به یک ایزوآنزیم ‪ ،‬مگر اینکه واقعًا مورد نیاز باشد‪ .‬با توجه به با میانگین وزن مولکولی‬
‫خالص شده نمونه در شکل ‪ 5‬و نتایج حاصل از آن نشان داده شده است کل مراحل تصفیه در خالصه شده است جدول ‪ .1‬از نتایج قابل درک است که مقدار کل پروتئین به ‪ PAGE MT‬نهایی نتیجه‬
‫کاهش یافته بود ‪ 0.64‬درصد از پروتئین استخراج شده اولیه در حالی که کاتکوالز آن است فعالیت به ده برابر افزایش یافته بود فعالیت اولیه در خاتمه ذکر این نکته ضروری است که نتایج مشابهی‬
‫‪ MT‬آسان تر است با نظارت بر واکنش کاتکوالز آن ‪ .‬کاتکوالز _ واکنش ‪ MT‬مشاهده شد ‪ .‬با این حال‪ ،‬پیروی از مراحل تصفیه ‪ MePAPh‬خالص شده در حضور ‪ MT‬برای فعالیت کرزوالز‬
‫حدود ده برابر سریعتر از واکنش کرزوالز آن‬

‫‪‬‬ ‫تصدیق‬
‫‪‬‬ ‫‪.‬پشتیبانی و به عنوان فاز اول پروژه شماره ‪ 203‬انجام شد )‪ (NIGEB‬این تحقیق کامًال توسط مؤسسه ملی مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی‬